專利名稱：鍵合環(huán)糊精類化合物的高效液相色譜有機(jī)相整體柱及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明提供了鍵合環(huán)糊精類化合物的高效液相色譜有機(jī)相整體柱的制備。整體柱基質(zhì)為多孔的體型的甲基丙烯酸縮水甘油酯-亞乙基二甲基丙烯酸酯聚合物。其特征在于將環(huán)糊精或其衍生物鍵合到整體柱基質(zhì)上，可以獲得用于小分子分離和手性拆分的高效液相色譜有機(jī)整體柱。
背景技術(shù)：
整體柱(monolithic column)又稱整體固定相(monolithic stationary phase)、棒柱(rod)、連續(xù)床(continuous bed)等，是在柱管內(nèi)原位聚合或固定化了的連續(xù)整體多孔結(jié)構(gòu)，可根據(jù)需要對(duì)整體材料的表面作相應(yīng)的衍生化，是一種新型的在管柱內(nèi)以原位(in situ)聚合的方式形成的用于分離分析或作為反應(yīng)器的多孔介質(zhì)。用于高效液相色譜的整體柱材料同樣包括無機(jī)和有機(jī)聚合物兩類。前者主要用溶膠-凝膠法制備；后者目前主要分為以下幾類聚丙烯酰胺類，聚甲基丙烯酸酯類和聚苯乙烯類。
文獻(xiàn)(Liao J L，Zhang R，Hjertén S.J.Chromatogr.，1991，58621-26；ZengC M，Liao J L，Nakazato K，et al.J.Chromatogr.，1996，753227-234)報(bào)道聚丙烯酰胺整體柱的水相聚合方法。另有文獻(xiàn)報(bào)道(Xie S F，Svec F，F(xiàn)réchet J MJ.J.Chromatogr.A，1997，77565-72；Xie S F，Svec F，F(xiàn)réchet J M J.J.Polym.Sci.A，1997，351013-1021)有機(jī)相聚合制備聚丙烯酰胺整體柱。這類整體柱的特點(diǎn)是有著良好的生物兼容性，適合分離生物大分子，如蛋白、核酸及多糖。
關(guān)于聚(甲基丙烯酸縮水甘油酯-亞乙基二甲基丙烯酸酯)整體柱的文獻(xiàn)為(Svec F，F(xiàn)réchet J M J.Anal.Chem.，1992，64820-822；Svec F，F(xiàn)réchet J MJ.J.Chromatogr.A，1995，70289-93)。對(duì)于聚合物中的環(huán)氧基團(tuán)，作者采用了兩種衍化方式1.泵入0.5mol/mL硫酸水溶液，水浴60℃反應(yīng)3h，這樣得到含二醇官能團(tuán)的多孔聚合物。2.注入2mL二乙胺，加熱反應(yīng)，得到含1-(N，N-二乙基胺)-2-羥基丙基官能團(tuán)的離子交換色譜柱可分離蛋白。
關(guān)于聚(苯乙烯-二乙烯基苯)整體柱，現(xiàn)有報(bào)道(Oberacher H，Parson W，Muhlmann R.Anal.Chem.，2001，735109-5115；Premstaller A，Oberacher H，Huber C G.Anal.Chem.，2000，724386-4393；Moore R E，Licklider L，SchumannD，et al.Anal.Chem.，1998，704879-4884)多為分析蛋白質(zhì)或核酸(單鏈和雙鏈)的。Fréchet小組報(bào)道(Petro M，Svec F，Gitsov I，et al.Anal.Chem.，1996，68315-321；Petro M，Svec F，F(xiàn)réchet J M J.J.Chromatogr.A，1996，75259-66；Wang Q C，Svec F，F(xiàn)réchet J M J.Anal.Chem.，1993，652243-2248)用所制的聚苯乙烯整體柱發(fā)展了在柱的沉淀-再溶色譜(“On-Column”Precipitation-Redissolution Chromatography)，并分離了苯乙烯的寡聚物和高聚物。
目前獲得手性拆分整體柱的方法主要是原位聚合法合成的另外一類分子印跡型的聚合物整體柱(Matsui J，Kato T，Takeuchi T，et al.Anal.Chem.，1993，652223-2224；黃曉冬(Huang X D)鄒漢法(Zhou H F)毛希琴(Mao X Q).色譜(Chinese Journal of Chromatography)，2002，20436-438)。本發(fā)明使用直接在基質(zhì)上鍵合手性選擇劑的方法，所獲得的整體柱，具有更廣的應(yīng)用范圍，可用于各種小分子分離、多種手性化合物的拆分分離、以及生物大分子分離。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的要解決的問題在于提供了鍵合環(huán)糊精類化合物的的高效液相色譜有機(jī)相整體柱及其制備方法。這種整體柱上鍵合有環(huán)糊精或其衍生物，可以在高效液相色譜中使用。
本發(fā)明提供了一種鍵合環(huán)糊精類化合物的的高效液相色譜有機(jī)相整體柱，這種整體柱上鍵合有環(huán)糊精或其衍生物，可以在高效液相色譜中使用。所述的環(huán)糊精或其衍生物推薦在被鍵合前有羥基存在，該羥基可以是未被取代的羥基，也可以是取代基團(tuán)上的羥基。所述的取代基團(tuán)推薦為C1～C6的烷基、羥烷基(其中烷基為C1～C6的烷基或烷基醚)。所述環(huán)糊精衍生物可以是羥丙基β-環(huán)糊精、2，6-二甲基β-CD、全甲基化β-CD、部分甲基化β-CD、羥乙基β-CD、2，3-二氧乙酰β-CD、1-(1-萘基)乙基氨甲酰β-CD、磺化β-CD、磺丁基β-CD、磺乙基β-CD、羧甲基β-CD、羧乙基β-CD、6A-甲胺基β-CD、6A，6D-二甲胺基β-CD、以及β-CD聚合物；所述的β-CD代表β-環(huán)糊精。所述的環(huán)糊精或其衍生物進(jìn)一步推薦為β-CD(β-環(huán)糊精)、羥乙基β-環(huán)糊精或HP-β-CD(β-環(huán)糊精羥丙基醚，又稱羥丙基β-環(huán)糊精)。所述的環(huán)糊精或其衍生物更進(jìn)一步推薦為β-CD或HP-β-CD。所述的整體柱基質(zhì)推薦為多孔的體型的甲基丙烯酸縮水甘油酯-亞乙基二甲基丙烯酸酯聚合物。
本發(fā)明提供了上述高效液相色譜有機(jī)相整體柱的制備方法，該方法是將所述的環(huán)糊精或其衍生物通過柱上衍生化的方式鍵合到整體柱基質(zhì)上。即先制備出整體柱基質(zhì)，再使衍生反應(yīng)混合物通過基質(zhì)與其發(fā)生反應(yīng)而得到。
其中所述的整體柱基質(zhì)推薦由甲基丙烯酸縮水甘油酯(GMA)與亞乙基二甲基丙烯酸酯(EDM4)在致孔劑十二醇和環(huán)己醇的存在下，用偶氮二異丁腈(AIBN)引發(fā)聚合得到。
其中GMA為單體，EDMA為交聯(lián)劑，十二醇和環(huán)己醇作為致孔劑，AIBN作為引發(fā)劑。GMA、EDMA、十二醇、環(huán)己醇至少為國(guó)產(chǎn)分析純，使用之前推薦經(jīng)過減壓蒸餾；AIBN推薦為分析純，使用之前推薦經(jīng)過重結(jié)晶。推薦的聚合用混合物的組成及配比為GMA∶EDMA＝2∶3-3∶2(質(zhì)量比)，十二醇∶環(huán)己醇＝9∶1-7∶3(質(zhì)量比)，單體和交聯(lián)劑∶致孔劑＝1∶3-1∶1(質(zhì)量比)，AIBN為單體和交聯(lián)劑的0.5-2％(質(zhì)量百分比)。推薦在混合均勻后通氦氣15min后使用。推薦每次都現(xiàn)配現(xiàn)用。推薦將聚合用混合物按比例混合之后灌入管中，兩端封住，垂直放于水浴中進(jìn)行聚合反應(yīng)。聚合反應(yīng)條件推薦如下聚合溫度55-60℃，優(yōu)選值為57℃；反應(yīng)時(shí)間10-48h。
聚合完畢后將制好的整體基質(zhì)柱裝入柱套(所述的柱套例如Z-MODULETMRadial Compression Separation System，購自Waters公司，Waters Corporation，MA01757，USA)，推薦利用乙醇，推薦流速·0.5mL/min沖洗2-3h，將未反應(yīng)掉的單體、交聯(lián)劑以及致孔劑完全沖洗干凈。之后，推薦用ACN為流動(dòng)相，流速推薦為1mL/min，推薦254nm檢測(cè)，推薦用聯(lián)苯、萘和苯甲酸乙酯作為小分子樣品，對(duì)整體柱基質(zhì)的柱效作初步的評(píng)價(jià)，推薦選擇柱效在400NTP/10cm以上的基體柱做進(jìn)一步的衍生化實(shí)驗(yàn)。
衍生化試劑配制方法推薦為β-CD或HP-β-CD溶于DMSO/ACN(體積比為2∶1-1∶3，優(yōu)選1∶1)混合溶液中，其中β-CD或HP-β-CD和DMSO/ACN的用量比推薦為3-15克/100毫升，加入BF3·Et2O(BF3的含量推薦為46.8-47.8％)，其中BF3·Et2O的用量推薦約1-10％(體積百分比)，優(yōu)選3.5％。將衍生化試劑利用HPLC泵注入整體基質(zhì)柱中，室溫下的實(shí)現(xiàn)循環(huán)在柱衍生化。推薦反應(yīng)48h后，利用HPLC泵將相同體積比的DMSO/ACN混合溶液注入整體柱中，將可能的衍生化產(chǎn)生的物質(zhì)和未反應(yīng)的衍生化試劑替換出來。
整體柱制備完成后，要進(jìn)行常規(guī)的柱效評(píng)價(jià)(推薦流動(dòng)相為ACN，流速1mL/min，樣品為萘等小分子化合物)，并評(píng)價(jià)衍生化前后，相同樣品在柱子上保留行為的變化。對(duì)于整體柱的手性拆分能力，可以利用安息香等手性樣品，流動(dòng)相推薦為ACN/H2O＝75∶25，在254nm下檢測(cè)。
本發(fā)明提供的高效液相色譜有機(jī)整體柱的制備方法，可以在室溫下將β-CD或HP-β-CD鍵合到整體基質(zhì)柱上，用于小分子樣品的分析，和手性拆分。本發(fā)明提供的液相色譜柱可用于小分子樣品分離分析、手性化合物拆分、和生物大分子分離。


1，圖1是β-CD整體柱分離萘、苯甲酸乙酯和帕佐沙星混合物的液相譜圖2，圖2是HP-β-CD整體柱分離聯(lián)苯、苯甲酸乙酯和聯(lián)萘酚混合物的液相譜圖。
3，圖3是HP-β-CD整體柱分離安息香的液相譜圖。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例一聚合用混合物的配置及整體基質(zhì)柱的制備合用混合物要現(xiàn)配現(xiàn)用，取GMA8g，EDMA12g，環(huán)己醇27g，十二醇3g和AIBN0.2g混合均勻，通氦氣15min后使用。聚合用混合物灌入內(nèi)徑8mm、有效長(zhǎng)度10cm的尼龍柱管中，兩端封好，垂直放于57℃的水浴中反應(yīng)12h。制好的整體基質(zhì)柱裝入柱套(Z-MODULETMRadial Compression SeparationSystem，購自Waters公司，Waters Corporation，MA 01757，USA)中，接到HPLC泵上，用乙醇以流速0.5mL/min，沖洗2-3h，完全除去未反應(yīng)完的單體、交聯(lián)劑和致孔劑。之后，用ACN為流動(dòng)相，流速為1mL/min，254nm檢測(cè)，用聯(lián)苯、萘和苯甲酸乙酯作為小分子樣品，對(duì)整體柱基質(zhì)的柱效作初步的評(píng)價(jià)，選擇柱效在400NTP/10cm以上的基體柱做進(jìn)一步的衍生化實(shí)驗(yàn)。
β-CD整體柱的制備方法配制衍生化溶液(流動(dòng)相)用無水Na2SO4處理24h的DMSO/ACN(體積比為1∶1)混合溶液100mL放置于250mL的燒杯中；邊攪拌邊加入BF3·Et2O(含量為46.8-47.8％)3.3mL；邊攪拌邊加入已干燥的β-CD6.17g(相當(dāng)于5.4×10-3mol)，待其完全溶解。將衍生化溶液用HPLC泵注入整體基質(zhì)柱中，室溫下令流動(dòng)相/衍生化試劑循環(huán)兩天，流速0.3mL/min；然后用DMSO/ACN(體積比為1∶1)的流動(dòng)相將柱子中的β-CD沖洗干凈，最后，用ACN沖洗。
高效液相實(shí)驗(yàn)條件如下使用紫外254nm檢測(cè)，室溫，用ACN/H2O＝75/25((體積比)為流動(dòng)相，流速為1mL/min。
樣品為用流動(dòng)相配制的萘、苯甲酸乙酯和帕佐沙星混合溶液。
β-CD整體柱分離萘、苯甲酸乙酯和帕佐沙星混合樣品的液相譜圖，如圖1所示。
實(shí)施例二聚合用混合物的配置及整體基質(zhì)柱的制備同實(shí)施例一。
HP-β-CD整體柱的制備方法在柱衍生化的方法與實(shí)施例一相似衍生化溶液為155mL的DMSO/ACN(體積比為1∶1)，含HP-β-CD 8.18g，BF3·Et2O(含量為46.8-47.8％)為5mL。室溫下，令衍生化溶液循環(huán)兩天；然后用DMSO/ACN(體積比為1∶1)的流動(dòng)相將柱子中的HP-β-CD沖洗，最后用ACN沖洗干凈，進(jìn)行衍生化后柱評(píng)價(jià)。
高效液相實(shí)驗(yàn)條件如下
使用紫外254nm檢測(cè)，室溫，用ACN/H2O＝75/25(體積比)為流動(dòng)相，流速為1.0mL/min。
樣品為用流動(dòng)相配制的聯(lián)苯、苯甲酸乙酯和聯(lián)萘酚混合溶液。
HP-β-CD整體柱分離聯(lián)苯、苯甲酸乙酯和聯(lián)萘酚混合物的液相譜圖，如圖2所示。
使用紫外254nm檢測(cè)，室溫，用ACN/H2O＝75/25(體積比)為流動(dòng)相，流速為0.8mL/min。
樣品為用流動(dòng)相配制的安息香對(duì)映體溶液。
HP-β-CD整體柱分離安息香對(duì)映體的液相譜圖，如圖3所示。
權(quán)利要求
1.一種高效液相色譜有機(jī)相整體柱，其特征是該有機(jī)相整體柱上鍵合有環(huán)糊精或其衍生物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的高效液相色譜有機(jī)相整體柱，其特征是所述環(huán)糊精或其衍生物在被鍵合前有羥基存在，該羥基可以是未被取代的羥基或取代基團(tuán)上的羥基，所述的取代基團(tuán)為C1～C6的烷基、羥烷基。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的高效液相色譜有機(jī)相整體柱，其特征是所述環(huán)糊精衍生物是羥丙基β-環(huán)糊精、2，6-二甲基β-CD、全甲基化β-CD、部分甲基化β-CD、羥乙基β-CD、2，3-二氧乙酰β-CD、1-(1-萘基)乙基氨甲酰β-CD、磺化β-CD、磺丁基β-CD、磺乙基β-CD、羧甲基β-CD、羧乙基β-CD、6A-甲胺基β-CD、6A，6D-二甲胺基β-CD、以及β-CD聚合物；所述的β-CD代表β-環(huán)糊精。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的高效液相色譜有機(jī)相整體柱，其特征是所述環(huán)糊精衍生物是羥丙基β-環(huán)糊精或羥乙基β-環(huán)糊精。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的高效液相色譜有機(jī)相整體柱，其特征在于所述的整體柱基質(zhì)為多孔的體型的甲基丙烯酸縮水甘油酯-亞乙基二甲基丙烯酸酯聚合物。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的高效液相色譜有機(jī)相整體柱的制備方法，其特征在于將環(huán)糊精或其衍生物通過柱上衍生化的方式鍵合到整體柱基質(zhì)上的。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的高效液相色譜有機(jī)相整體柱的制備方法，其特征在于所述的環(huán)糊精或其衍生物在三氟化硼(BF3)的催化下與整體柱基質(zhì)上的環(huán)氧基團(tuán)反應(yīng)。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的高效液相色譜有機(jī)相整體柱的制備方法，其特征在于環(huán)糊精或其衍生物是溶解在體積比為2∶1-1∶3的二甲基亞砜(DMSO)/乙腈(ACN)的混合溶液中，在BF3的催化下以在柱衍生化的方式與整體柱基質(zhì)上的環(huán)氧基團(tuán)反應(yīng)；BF3在DMSO/ACN的混合溶液中的含量在0.5-5％(質(zhì)量百分比)。
9.根據(jù)權(quán)利要求6所述的高效液相色譜有機(jī)相整體柱的制備方法，其特征在于DMSO/ACN的混合溶液須經(jīng)過除水處理。
10.根據(jù)權(quán)利要求6所述的高效液相色譜有機(jī)相整體柱的制備方法，其特征在于所述的整體柱基質(zhì)是由甲基丙烯酸縮水甘油酯(GMA)與亞乙基二甲基丙烯酸酯(EDMA)在致孔劑十二醇和環(huán)己醇的存在下，用偶氮二異丁腈(AIBN)引發(fā)聚合得到。
11.根據(jù)權(quán)利要求6或10所述的高效液相色譜有機(jī)相整體柱的制備方法，其特征在于聚合用混合物的組成及配比為GMA∶EDMA＝2∶3-3∶2(質(zhì)量比)，十二醇∶環(huán)己醇＝9∶1-7∶3(質(zhì)量比)，單體GMA和交聯(lián)劑EDMA∶致孔劑＝1∶3-1∶1(質(zhì)量比)，AIBN為單體和交聯(lián)劑的0.5-2％(質(zhì)量百分比)；聚合溫度為55-60℃，反應(yīng)時(shí)間為10-48h。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種鍵合環(huán)糊精類化合物的高效液相色譜有機(jī)相整體柱及其制備方法。整體柱基質(zhì)為多孔的體型的甲基丙烯酸縮水甘油酯－亞乙基二甲基丙烯酸酯聚合物。本發(fā)明提供的液相色譜柱可用于小分子樣品分離分析、手性化合物拆分、和生物大分子分離。
文檔編號(hào)C08B37/00GK1603817SQ20041006814
公開日2005年4月6日 申請(qǐng)日期2004年11月12日 優(yōu)先權(quán)日2004年11月12日
發(fā)明者許旭, 鮑笑嶺 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院上海有機(jī)化學(xué)研究所