專利名稱：糖鏈天冬酰胺衍生物的制造方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及糖鏈天冬酰胺衍生物的制造方法。
背景技術(shù)：
近年來，作為繼核酸(DNA)、蛋白質(zhì)之后的第三個(gè)鏈狀生命分子，糖鏈分子引人注目。人體是由約60兆個(gè)細(xì)胞構(gòu)成的一大細(xì)胞社會(huì)，所有的細(xì)胞表面都被糖鏈分子覆蓋。例如，ABO式血型就是由細(xì)胞表面糖鏈的不同決定的。
糖鏈具有參與細(xì)胞間識(shí)別和相互作用的功能，成為構(gòu)成細(xì)胞社會(huì)的要素。細(xì)胞社會(huì)的紊亂與癌、慢性疾病、感染病、老化等有關(guān)。
例如，已知細(xì)胞如果癌化，就會(huì)引起糖鏈的結(jié)構(gòu)變化。另外也知道霍亂弧菌或流感病毒等通過識(shí)別、結(jié)合某一特定糖鏈，侵入、感染細(xì)胞。
糖鏈由于單糖的序列、結(jié)合樣式以及部位、鏈長(zhǎng)度以及分支樣式、整體的高次結(jié)構(gòu)等的多樣性，所以與核酸或蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)相比，是非常復(fù)雜的結(jié)構(gòu)。因此，來自其結(jié)構(gòu)的生物學(xué)信息與核酸和蛋白質(zhì)相比，多種多樣。現(xiàn)狀是雖然人們認(rèn)識(shí)到糖鏈研究的重要性，但由于其結(jié)構(gòu)復(fù)雜和多樣性，與核酸和蛋白質(zhì)相比，研究進(jìn)展緩慢。
另一方面，已知從脫脂卵黃可以得到糖鏈天冬酰胺(例如參照專利文獻(xiàn)1)。根據(jù)專利文獻(xiàn)1，通過在脫脂卵黃中添加杏仁或杏種子，可以比以往更大量地獲得糖鏈天冬酰胺。但是，用這種方法得到的糖鏈天冬酰胺的純度為95％或92％，不能分離出純粹的糖鏈天冬酰胺。此外，從100kg脫脂卵黃中獲得的雙唾液酸低聚糖(11糖雙唾液酸低聚糖)的收量也只為29.5g或27.2g。
此外，還已知由從雞蛋的可溶級(jí)分中提取的糖肽(SGP唾液酸糖肽)獲得糖鏈天冬酰胺。該SGP是在由11個(gè)糖殘基構(gòu)成的復(fù)合型糖鏈的還原末端結(jié)合了由氨基酸6殘基構(gòu)成的肽鏈的天冬酰胺殘基的化合物。但是，SGP根據(jù)例如瀨古等[Biochem.Biophys.Acta、第1335卷、第23頁(1997)]的方法，從1個(gè)雞蛋黃中只能得到約8mg。
國(guó)際公開W096/02255號(hào)公報(bào)(權(quán)利要求8和權(quán)利要求10)本發(fā)明的目的在于提供糖鏈天冬酰胺衍生物的制造方法，與以往相比能非常容易且大量地獲得在醫(yī)藥品開發(fā)等領(lǐng)域中有用的各種分離的糖鏈天冬酰胺衍生物。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明涉及以下發(fā)明。
1.糖鏈天冬酰胺衍生物的制造方法，其為由脫脂卵黃制造糖鏈天冬酰胺衍生物的方法，其包括(a)用蛋白質(zhì)分解酶由脫脂卵黃制造糖鏈肽混合物的工序；(b)用肽分解酶由糖鏈肽混合物制造糖鏈天冬酰胺混合物的工序；(c)將脂溶性的保護(hù)基導(dǎo)入糖鏈天冬酰胺混合物中的糖鏈天冬酰胺，制造糖鏈天冬酰胺衍生物混合物的工序，(d)將糖鏈天冬酰胺衍生物混合物供給色譜，將各糖鏈天冬酰胺衍生物分離的工序。
2.上述的糖鏈天冬酰胺衍生物的制造方法，其中，脫脂卵黃是通過用有機(jī)溶劑對(duì)鳥類的卵的卵黃進(jìn)行脫脂處理而獲得的。
3.上述的糖鏈天冬酰胺衍生物的制造方法，其中，糖鏈天冬酰胺衍生物是11～5糖鏈天冬酰胺衍生物。
4.上述的糖鏈天冬酰胺衍生物的制造方法，其中，脂溶性的保護(hù)基為含有碳酸酯的基團(tuán)、酰基、烯丙基、Fmoc基或Boc基。
5.上述的糖鏈天冬酰胺衍生物的制造方法，其中，預(yù)先將(b)中得到的糖鏈天冬酰胺混合物中含有的糖鏈天冬酰胺水解，將一部分糖殘基切斷。
6.上述的糖鏈天冬酰胺衍生物的制造方法，其中，預(yù)先將(c)中得到的糖鏈天冬酰胺衍生物混合物中含有的糖鏈天冬酰胺衍生物水解，將一部分糖殘基切斷。
本發(fā)明的糖鏈天冬酰胺衍生物的制造方法的特征在于用蛋白質(zhì)分解酶由從卵黃例如鳥類卵黃得到的脫脂卵黃制得糖鏈肽混合物，然后用肽分解酶得到糖鏈天冬酰胺的混合物，其次將脂溶性的保護(hù)基導(dǎo)入(結(jié)合)該混合物中含有的該糖鏈天冬酰胺，得到糖鏈天冬酰胺衍生物的混合物，然后將該混合物分離為各糖鏈天冬酰胺衍生物。在本說明書中，“糖鏈天冬酰胺”是指結(jié)合了天冬酰胺狀態(tài)的糖鏈。此外“天冬酰胺結(jié)合型糖鏈”指的是存在于還原末端的N-乙酰葡糖胺通過N-糖苷鍵與蛋白質(zhì)多肽中天冬酰胺(Asn)的酸氨基連接的糖鏈組，以Man(β1-4)GlcNac(β1-4)GlcNac作為母核的糖鏈組。所謂“糖鏈天冬酰胺衍生物”指的是在天冬酰胺殘基上結(jié)合了脂溶性保護(hù)基狀態(tài)的糖鏈天冬酰胺。此外，在化合物的結(jié)構(gòu)式中，「AcHN」表示乙酰胺基。
本發(fā)明的糖鏈天冬酰胺衍生物的制造方法，具體地說，包括(a)用蛋白質(zhì)分解酶由脫脂卵黃制造糖鏈肽混合物的工序；和(b)用肽分解酶由糖鏈肽混合物制造糖鏈天冬酰胺混合物的工序；和(c)將脂溶性的保護(hù)基導(dǎo)入糖鏈天冬酰胺混合物中的糖鏈天冬酰胺，制造糖鏈天冬酰胺衍生物混合物的工序；和(d)將糖鏈天冬酰胺衍生物混合物供給色譜，將各糖鏈天冬酰胺衍生物分離的工序。
以下，對(duì)本發(fā)明的由脫脂卵黃制造糖鏈天冬酰胺衍生物的制造方法進(jìn)行具體說明。
本發(fā)明中使用的脫脂卵黃并無特別限定，可以是例如用有機(jī)溶劑對(duì)鳥類的卵的卵黃(優(yōu)選雞、鵪鶉、家鴨、野鴨、鴿子等的卵黃，特別優(yōu)選卵黃內(nèi)含有的人型糖鏈天冬酰胺，從人型2分支糖鏈天冬酰胺的量出發(fā)，特別優(yōu)選雞)進(jìn)行脫脂處理的卵黃。此時(shí)，作為有機(jī)溶劑，優(yōu)選甲醇、乙醇、二乙醚等。
作為(a)工序，是用蛋白質(zhì)分解酶將上述脫脂卵黃的蛋白質(zhì)切斷，得到脫脂卵黃所含的糖鏈肽(糖鏈天冬酰胺肽)的混合物。此時(shí)，作為使用的蛋白質(zhì)分解酶，可以使用例如プロナ一ゼ(和光純藥社制)、オリエンタ一ゼ(HBI社制)等一般的蛋白質(zhì)分解酶。
此外，優(yōu)選使用公知的方法，例如使用凝膠過濾柱、離子交換柱等的各種色譜以及使用高速液相色譜(HPLC)的精制法從糖鏈肽的混合物中將糖鏈肽以外的成分除去。
作為(b)工序，其為用肽分解酶將(a)工序得到的糖鏈肽的混合物的肽進(jìn)行分解，得到糖鏈肽所含有的糖鏈天冬酰胺的混合物。此時(shí)，作為所使用的肽分解酶，可以使用例如アクチナ-ゼ等一般的肽分解酶。
此外，優(yōu)選使用公知的方法，例如使用凝膠過濾柱、離子交換柱等的各種色譜以及使用高速液相色譜(HPLC)的精制法從糖鏈天冬酰胺的混合物中將糖鏈天冬酰胺以外的成分除去。
此外，從高效地獲得具有所希望的糖鏈結(jié)構(gòu)的糖鏈天冬酰胺衍生物的觀點(diǎn)出發(fā)，優(yōu)選進(jìn)一步將該混合物中含有的糖鏈天冬酰胺水解，預(yù)先將一部分糖殘基切斷。作為水解的方法，包括使用酸的方法或使用酶的方法等。
作為上述酸并無特別限定，可以使用例如鹽酸、硫酸、硝酸、三氟乙酸等無機(jī)酸和有機(jī)酸，陽離子交換樹脂，不溶性的固體試劑(二氧化硅凝膠等)等。此外，作為酶，優(yōu)選糖水解酶，也可以使用內(nèi)切型、外切型任何一種的反應(yīng)樣式的酶。作為該酶，并無特別限定，如果具有該活性，可以是市售的酶、新分離的酶、基因工學(xué)上創(chuàng)造的酶。
酶反應(yīng)可以按照公知的條件進(jìn)行，此時(shí)，可以用薄層色譜跟蹤反應(yīng)的進(jìn)行，在最多地得到化合物時(shí)，適當(dāng)?shù)赝Ｖ狗磻?yīng)。
作為(c)工序，是使用含有(b)工序得到的糖鏈天冬酰胺的混合物，將脂溶性的保護(hù)基導(dǎo)入其含有的糖鏈天冬酰胺中。作為該保護(hù)基，并無特別限定，可以使用例如9-芴基甲氧羰(Fmoc)基、叔丁氧羰(Boc)基、烯丙氧基碳酸酯(Alloc)基等含碳酸酯的基團(tuán)、乙酰(Ac)基等?；⑾┍?、芐基等保護(hù)基?？紤]到合成的效率和以下工序的分離精制的效率，優(yōu)選9-芴基甲氧羰(Fmoc)基、叔丁氧羰(Boc)基、烯丙氧基碳酸酯基等含碳酸酯的基團(tuán)、乙?；弱；?。此外，從可以直接將得到的糖鏈天冬酰胺衍生物用于所希望的糖肽的合成的觀點(diǎn)出發(fā)，作為該保護(hù)基，優(yōu)選廣泛用于肽合成的Fmoc基或Boc基，其中Fmoc基當(dāng)糖鏈中存在在唾液酸等比較酸性條件下不穩(wěn)定的糖時(shí)特別有效，因此更優(yōu)選。另外，保護(hù)基的導(dǎo)入可以按照公知的方法(例如參照Protecting groups in Organic Chemistry，JohnWiley & Sons INC.，New York 1991，ISBN 0-471-62301-6)進(jìn)行。
例如，使用Fmoc基時(shí)，通過向含有糖鏈天冬酰胺的混合物中加適量丙酮或DMF后，再加入9-芴甲基-N-琥珀酰亞胺碳酸酯和碳酸氫鈉進(jìn)行溶解，于25℃下進(jìn)行Fmoc基向天冬酰胺殘基的結(jié)合反應(yīng)，可以向該糖鏈天冬酰胺的天冬酰胺殘基導(dǎo)入Fmoc基。
通過以上操作可以獲得導(dǎo)入了脂溶性保護(hù)基的糖鏈天冬酰胺衍生物的混合物。
作為(d)工序，是將(c)工序得到的糖鏈天冬酰胺衍生物混合物供給到公知的色譜，特別是供給到分別取出型的色譜中，分離為各糖鏈天冬酰胺衍生物。在該工序中，可以直接使用得到的糖鏈天冬酰胺衍生物混合物，但從高效地獲得具有所希望的糖鏈結(jié)構(gòu)的糖鏈天冬酰胺衍生物的觀點(diǎn)出發(fā)，可以使用進(jìn)一步將該混合物中含有的糖鏈天冬酰胺衍生物供給水解，預(yù)先將一部分糖殘基切斷而得到的糖鏈天冬酰胺衍生物的混合物。糖殘基的切斷的程度與上述相同。此外，水解可以與上述同樣地進(jìn)行。
各糖鏈天冬酰胺衍生物的采用色譜的分離可以適當(dāng)?shù)赝ㄟ^單獨(dú)或多個(gè)組合使用公知的色譜進(jìn)行。
例如，將得到的糖鏈天冬酰胺衍生物混合物用凝膠過濾柱色譜精制后，用HPLC進(jìn)行精制。作為可以在HPLC中使用的柱子，反相類的柱合適，例如，可以使用ODS、Phenyl類、腈類、陰離子交換類的柱，具體來說，可以利用例如ファルマシア公司生產(chǎn)的モノQ柱、イヤトロン公司生產(chǎn)的イアトロビ一ズ柱等。分離條件等可以參照公知的條件進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整。通過以上操作可以由糖鏈天冬酰胺衍生物混合物得到所期望的各糖鏈天冬酰胺衍生物。
作為上述得到的糖鏈天冬酰胺衍生物，可以列舉例如11～5糖鏈天冬酰胺衍生物，優(yōu)選11～7糖鏈天冬酰胺衍生物，更優(yōu)選11～9糖鏈天冬酰胺衍生物，特別優(yōu)選下式表示的11糖鏈天冬酰胺衍生物。式中的Prot表示保護(hù)基。
進(jìn)而，通過對(duì)分離的糖鏈天冬酰胺衍生物進(jìn)行水解，可以高效地獲得具有所期望的糖鏈結(jié)構(gòu)的糖鏈天冬酰胺衍生物。例如在分離糖鏈天冬酰胺衍生物階段，對(duì)混合物中含有的糖鏈天冬酰胺衍生物的種類進(jìn)行限制，對(duì)糖鏈天冬酰胺衍生物進(jìn)行粗略分離，然后進(jìn)行水解，例如通過使用糖水解酶進(jìn)行水解，可以高效地獲得具有所期望的糖鏈結(jié)構(gòu)的糖鏈天冬酰胺衍生物。水解可以如上述那樣進(jìn)行。從更高效地獲得具有所期望的糖鏈結(jié)構(gòu)的糖鏈天冬酰胺衍生物的觀點(diǎn)出發(fā)，特別優(yōu)選糖殘基的切斷方式使用明確的糖水解酶進(jìn)行水解。
通過上述操作得到各糖鏈天冬酰胺衍生物后，再通過使用各種糖水解酶等對(duì)該衍生物進(jìn)行水解，除去糖鏈的非還原末端的糖殘基，例如，作為各個(gè)單一化合物可以得到糖鏈的末端的分支結(jié)構(gòu)不均一的各種各樣的糖鏈天冬酰胺衍生物。此外，通過使用各種糖水解酶，改變水解的順序或其種類，可以制造更多種類的糖鏈天冬酰胺衍生物。
此外，本發(fā)明提供能夠大量地得到各種分離的糖鏈天冬酰胺的糖鏈天冬酰胺的制造方法。該方法在按照上述糖鏈天冬酰胺衍生物的制造方法進(jìn)行的糖鏈天冬酰胺衍生物的制造工序后，還包括從得到的糖鏈天冬酰胺衍生物中除去保護(hù)基的工序。
由糖鏈天冬酰胺衍生物除去保護(hù)基可以根據(jù)公知的方法進(jìn)行(例如參照Protecting groups in Organic chemistry，John Wiley & SonsINC.，New York 1991，ISBN 0-471-62301-6)。例如，當(dāng)保護(hù)基為Fmoc基時(shí)，在N，N-二甲基甲酰胺(DMF)中，通過向糖鏈天冬酰胺衍生物中加入嗎啉進(jìn)行反應(yīng)，可以除去Fmoc基。而Boc基可以通過使弱酸反應(yīng)而除去。保護(hù)基除去后，根據(jù)需要可以適當(dāng)利用公知的方法，例如使用凝膠過濾柱、離子交換柱等的各種色譜，或利用HPLC進(jìn)行分離的方法進(jìn)行精制，可以得到糖鏈天冬酰胺。
此外，當(dāng)保護(hù)基為芐基時(shí)，芐基的除去可以按照公知的方法進(jìn)行(例如參照Protecting groups in Organic Chemistry，JohnWiley & Sons INC.，New York 1991，ISBN 0-471-62301-6)。
此外，從糖鏈天冬酰胺中除去天冬酰胺殘基可以根據(jù)公知的方法進(jìn)行。例如，使糖鏈天冬酰胺與無水肼反應(yīng)后，通過乙?；ヌ於０窔埢梢垣@得糖鏈。另外，將糖鏈天冬酰胺于堿性水溶液中加熱回流后，通過乙?；ヌ於０窔埢部梢垣@得糖鏈。除去天冬酰胺殘基后，根據(jù)需要可以適當(dāng)通過公知的方法，例如使用凝膠過濾柱、離子交換柱等的各種色譜，或利用HPLC的分離方法進(jìn)行精制。
這樣，通過本發(fā)明可以低成本且高效地大量制造具有所期望的糖鏈結(jié)構(gòu)的糖鏈天冬酰胺衍生物、糖鏈天冬酰胺以及糖鏈(以下有時(shí)將三者一并稱為糖鏈類)。
這樣的糖鏈類在醫(yī)藥品開發(fā)等領(lǐng)域非常有用。例如，作為醫(yī)藥品開發(fā)中的應(yīng)用例子，可以列舉例如癌的疫苗的合成。已知細(xì)胞一癌化，就會(huì)出現(xiàn)體內(nèi)沒有的糖鏈。此外還已知化學(xué)合成該糖鏈，作為疫苗給予個(gè)體，可以抑制癌的增殖。因此，如果通過本發(fā)明能夠制造希望的糖鏈類，就可以進(jìn)行對(duì)癌的治療有效的疫苗的合成。另外，再通過將化學(xué)反應(yīng)和利用糖轉(zhuǎn)移酶的反應(yīng)等組合使通過本發(fā)明得到的糖鏈類結(jié)合新的糖殘基而成為衍生物，也可以進(jìn)行新的疫苗的合成。
此外，例如，作為糖蛋白質(zhì)的紅細(xì)胞生成素(EPO)由于其紅細(xì)胞增殖能力，因此作為貧血的治療藥使用，已判明如果該EPO不與糖鏈結(jié)合就不體現(xiàn)活性。如上所述，由于在蛋白質(zhì)中存在通過糖鏈的結(jié)合而體現(xiàn)生理活性的物質(zhì)，例如，通過用不能使糖鏈結(jié)合的大腸菌體現(xiàn)系只大量調(diào)制蛋白質(zhì)，然后導(dǎo)入具有所希望的糖鏈結(jié)構(gòu)、本發(fā)明制造的糖鏈，可以給予生理活性的體現(xiàn)，此外，通過將具有各種糖鏈結(jié)構(gòu)、本發(fā)明制造的糖鏈導(dǎo)入任意的蛋白質(zhì)，可以合成具有新生理活性的新型的糖蛋白質(zhì)。
此外，通過使天然的糖蛋白質(zhì)中存在的糖鏈與本發(fā)明制造的糖鏈置換，也可以賦予新的生理活性。作為使糖蛋白質(zhì)具有的糖鏈與本發(fā)明得到的糖鏈置換的技術(shù)，可以列舉例如P.Sears and C.H.Wong，Science，2001，vol291，p2344～2350中記載的方法。即，可以列舉用β-N-乙酰氨基葡糖苷酶(Endo-H)處理糖蛋白質(zhì)，使之成為蛋白質(zhì)表面的天冬酰胺殘基上只結(jié)合1個(gè)N-乙酰葡糖胺殘基的狀態(tài)。然后，使用β-N-乙酰氨基葡糖苷酶(Endo-M)使本發(fā)明得到的糖鏈天冬酰胺中的所希望的糖鏈結(jié)合到上述N-乙酰葡糖胺殘基上的方法。此外，也可以預(yù)先使N-乙酰葡糖胺與tRNA結(jié)合，利用大腸菌等的體現(xiàn)系合成具有N-乙酰葡糖胺殘基的糖蛋白質(zhì)后，使用Endo-M導(dǎo)入本發(fā)明得到的糖鏈天冬酰胺中所希望的糖鏈。
此外，現(xiàn)在作為利用糖蛋白質(zhì)作為治療藥時(shí)的問題，可以列舉給藥的糖蛋白質(zhì)的代謝速度快。這是由于如果糖蛋白質(zhì)的糖鏈末端存在的唾液酸在活體內(nèi)被除去，則該糖蛋白質(zhì)立即被肝臟代謝。因此，必須給予一定程度量的糖蛋白質(zhì)。因此，如果利用本發(fā)明制造在糖鏈的末端新組裝了難于除去的唾液酸的糖鏈，利用Endo-M將該糖鏈導(dǎo)入對(duì)象蛋白質(zhì)，可以控制糖蛋白質(zhì)在活體內(nèi)的代謝速度，也可以降低給藥的糖蛋白質(zhì)的量。
具體實(shí)施例方式
以下舉出實(shí)施例進(jìn)行說明，但本發(fā)明并不限定于這些實(shí)施例。
實(shí)施例1在攪拌乙醇(EtOH)67ml的過程中打開并加入卵黃1個(gè)。攪拌約5小時(shí)后進(jìn)行過濾，再用EtOH 30ml進(jìn)行洗滌。在得到的結(jié)晶中再次加入EtOH 83ml，攪拌1晚后進(jìn)行過濾，用EtOH 30ml洗滌后使結(jié)晶干燥，得到脫脂卵黃(Delipidated Egg Yolk)約3g。
(a)將其溶解到磷酸緩沖液(pH＝7.0、30ml)后，加入NaN3(10mg)。再加入オリエンタ一ゼONS(HBI社制造、1.0g)，在50℃下靜置約24小時(shí)。用TLC確認(rèn)反應(yīng)結(jié)束后，用硅藻土(セライト)將反應(yīng)液過濾。通過濃縮使濾液減少，用凝膠過濾柱色譜(Sephadex G-25，2.5×100cm，H2O)進(jìn)行精制。收集含有目的糖的級(jí)分，進(jìn)行濃縮，然后進(jìn)行冷凍干燥。
(b)在得到的殘留物(約430mg)中加入Tris-鹽酸·氯化鈣緩沖溶液(pH＝7.5，43ml)、NaN3(21mg)，使其溶解。向其加入アクチナ-ゼE(43mg)，邊每隔12小時(shí)測(cè)定pH邊靜置24小時(shí)。24小時(shí)后，再次向反應(yīng)液中加入アクチナ-ゼE 21.5mg，再次邊測(cè)定pH邊使其反應(yīng)約48小時(shí)。用TLC確認(rèn)反應(yīng)結(jié)束后，進(jìn)行硅藻土過濾，通過濃縮使濾液減少，用凝膠過濾柱色譜(Sephadex G-25，2.5×100cm，H2O)進(jìn)行精制。收集含有作為目的物的糖的級(jí)分，進(jìn)行濃縮，然后進(jìn)行冷凍干燥。
(c)將得到的殘留物(約120mg)溶于水1.5ml，加入碳酸氫鈉26mg。向其加入溶有Fmoc-Osu[N-(9-芴甲氧基羰基)羥基琥珀酰亞胺]68mg的二甲基甲酰胺2.5ml，在室溫下反應(yīng)2小時(shí)。用TLC(異丙醇∶1M醋酸銨水溶液＝3∶2)確認(rèn)原料消失后，使用蒸發(fā)器進(jìn)行濃縮。在殘?jiān)屑尤胨?5ml、乙醚25ml，攪拌10分鐘后，進(jìn)行分液操作。進(jìn)而用乙醚15ml將水層洗滌后，進(jìn)行濃縮、冷凍干燥。使用ODS柱(ワコ一凝膠100C18)對(duì)其進(jìn)行梯度精制。收集含有糖鏈的級(jí)分，進(jìn)行濃縮，然后進(jìn)行冷凍干燥。
(d)用HPLC分取柱對(duì)該殘留物進(jìn)行精制(YMC-Pack R & D ODS，D-ODS-5-A，20×250mm，AN/25mM AcONH4緩沖液＝20/80，7.5ml/min.，波長(zhǎng)274nm)。分取約15分鐘后出來的主要峰后進(jìn)行濃縮，然后用ODS柱進(jìn)行脫鹽處理。進(jìn)行冷凍干燥，得到目的物的二唾液酸(ジシアロ)Fmoc糖鏈衍生物約13.3mg。
得到的化合物的1H-NMR數(shù)據(jù)如下所示。
1H-NMR(400MHz，D2O，30℃，HOD＝4.81)8.01(2H，d，J＝7.5Hz，F(xiàn)moc)，7.80(2H，d，J＝7.5Hz，F(xiàn)moc)，7.60(2H，dd，J＝7.5Hz，F(xiàn)moc)，7.53(2H，dd，J＝7.5Hz，F(xiàn)moc)，5.23(1H，s，Man4-H1)，5.09(1H，d，J＝9.4Hz，GlcNAc1-H1)，5.04(1H，s，Man4’-H1)，4.86(1H，s，Man3-H1)，4.70～4.66(m，GlcNAc2-H1G1cNAc5，5’-H1)，4.54(2H，d，J＝7.9Hz，Gal6，6’-H1)，4.44(1H，d，F(xiàn)mocCH)，4.34(1H，bd，Man 3-H2)，4.29(1H，bd，Man4’-H2)，4.20(1H，bd，Man4-H2)，2.77(2H，dd，NeuAc7，7’-H3eq)，2.80(1H，bdd，Asn-βCH)，2.62(1H，bdd，Asn-βCH)，2.14(18H，s×6，-Ac)，1.80(2H，dd，NeuAc7，7’-H3ax)
實(shí)施例2[二唾液酸糖鏈-Boc衍生物(11糖)]截止到(b)，與實(shí)施例1同樣地進(jìn)行。
(c)將得到的殘留物(約120mg)溶于0.1N NaOH水溶液1ml中。向其加入(Boc)2O(4ml，東京化成社制)，在室溫下反應(yīng)2小時(shí)。用TLC(異丙醇∶1M醋酸銨水溶液＝3∶2)確認(rèn)原料消失后，加入二氯甲烷2.5ml進(jìn)行分液。再用二氯甲烷2.5ml對(duì)水層進(jìn)行洗滌后，用40mMHCl調(diào)整為pH＝7.0。將水層濃縮后，用ODS柱進(jìn)行精制(梯度H2O 100％→H2O/AN＝99/1→H2O/AN＝95/5→H2O/AN＝90/10)。收集含有目的物二唾液酸糖鏈Boc衍生物的級(jí)分(用HPLC進(jìn)行確認(rèn))，進(jìn)行濃縮，然后進(jìn)行冷凍干燥。
(d)用HPLC對(duì)該殘留物進(jìn)行分離、精制(YMC-Pack ODS-AM，SH-343-5AM，20×250mm，AN/25mM AcONH4緩沖液＝5/95，7.0ml/min.，波長(zhǎng)215nm)。分取約11分鐘后出來的主要峰后進(jìn)行濃縮，然后用凝膠柱色譜(Sephadex G-25，H2O)進(jìn)行脫鹽處理。進(jìn)行冷凍干燥，得到目的物二唾液酸糖鏈Boc衍生物約10.0mg。
1H-NMR(400MHz，D2O，30℃，HOD＝4.81)δ5.19(s，1H，Man4-H1)，5.12(d，1H，J＝9.6，GlcNAc1-H1)，5.00(s，1H，Man4’-H-1)，4.61-4.71(m，3H)，4.49(d，2H，J＝7.6)，4.30-4.40(bs，1H，Asn-αCH)，4.31(s，1H，Man3-H-2)，4.25(bs，1H，Man4-H-2)，4.17(b s，1H，Man4-H-2)，2.84(dd，1H，Ja＝15.6，Jb＝4.4，Asn-βCH)，2.72(dd，2H，Ja＝12.4，Jb＝2.8，NeuAc7-H3ex)，2.60-2.75(m，1H，Asn-βCH)，2.13，2.12，2.11(eachs，18H，Acx6)，1.77(dd，2H，Ja＝12.0，Jb＝12.4，NeuAc7-H3ax)，1.48(s，9H，Boc)實(shí)施例3[二唾液酸-糖鏈Ac衍生物(11糖)]截止到(b)，與實(shí)施例1同樣地進(jìn)行。
(c)將得到的殘留物(約120mg)溶于精制水1ml中。向其加入K2CO3(72mg)，再加入醋酸酐(99ml)，攪拌約2小時(shí)。在室溫下反應(yīng)2小時(shí)后，用TLC(異丙醇∶1M醋酸銨水溶液＝3∶2)確認(rèn)原料消失后，加入二氯甲烷2.5ml進(jìn)行分液。再用二氯甲烷2.5ml對(duì)水層進(jìn)行洗滌后，用飽和NaHCO3水溶液調(diào)整為pH＝7.0。將水層濃縮后，用ODS柱進(jìn)行精制(梯度H2O 100％→H2O/AN＝99/1→H2O/AN＝95/5)。收集含有目的物二唾液酸糖鏈Ac衍生物的級(jí)分(用HPLC進(jìn)行確認(rèn))，進(jìn)行濃縮，然后進(jìn)行冷凍干燥。
(d)用HPLC對(duì)該殘留物進(jìn)行分離、精制(YMC-Pack ODS-AM，SH-343-5AM，20×250mm，AN/25mM AcONH4緩沖液＝1/99，7.0ml/min.，波長(zhǎng)215nm)。分取約11分鐘后出來的主要峰后進(jìn)行濃縮，然后用凝膠柱色譜(Sephadex G-25，H2O)進(jìn)行脫鹽處理。進(jìn)行冷凍干燥，得到目的物二唾液酸糖鏈Ac衍生物約8.5mg。
1H-NMR(400MHz，D2O，30℃，HOD＝4.81)
δ5.19(s，1H，Man4-H1)，5.11(d，1H，J＝9.6，GlcNAc1-H1)，5.00(s，1H，Man4’-H-1)，4.66(bs，3H)，4.54-4.57(dd，1H，Ja＝8.1，Jb＝4.5)，4.50(d，2H，J＝7.8)，4.31(s，1H，Man3-H-2)，4.25(bs，1H，Man4-H-2)，4.17(bs，1H，Man4-H-2)，2.85(dd，1H，Ja＝15.8，Jb＝4.3，Asn-βCH)，2.65-2.75(m，3H，NeuAc-H3ex，Asn-βCH)，2.13，2.12，2.08，2.06(eachs，21H，Acx7)，1.77(dd，2H，Ja＝12.1，Jb＝12.1，NeuAc7-H3ax)實(shí)施例4[二唾液酸糖鏈-Alloc衍生物(11糖)]截止到(b)，與實(shí)施例1同樣地進(jìn)行。
(c)將得到的殘留物(約120mg)溶于0.1N NaOH水溶液6ml中。向其加入(AllylOCO)2O(573ml，東京化成社制)，在室溫下反應(yīng)12小時(shí)。用TLC(異丙醇∶1M醋酸銨水溶液＝3∶2)確認(rèn)原料消失后，加入二氯甲烷12ml進(jìn)行分液。再用二氯甲烷12ml對(duì)水層進(jìn)行洗滌后，用40mM HCl調(diào)整為pH＝7.0。將水層濃縮后，用ODS柱進(jìn)行精制(梯度H2O 100％→H2O/AN＝99/1→H2O/AN＝95/5)。收集含有目的物二唾液酸糖鏈Alloc衍生物的級(jí)分(用HPLC進(jìn)行確認(rèn))，進(jìn)行濃縮，然后進(jìn)行冷凍干燥。
(d)用HPLC對(duì)該殘留物進(jìn)行分離、精制(YMC-Pack ODS-AM，SH-343-5AM，20×250mm，AN/25mM AcONH4緩沖液＝2/98，7.5ml/min.，波長(zhǎng)215nm)。分取約18分鐘后出來的主要峰后進(jìn)行濃縮，然后用凝膠柱色譜(Sephadex G-25，H2O)進(jìn)行脫鹽處理。進(jìn)行冷凍干燥，得到目的物二唾液酸糖鏈Alloc衍生物約8.7mg。
1H-NMR(400MHz，D2O，30℃，HOD＝4.81)δ6.01(ddd，1H，Ja＝17.2，Jb＝10.4，Jc＝5.2，-CH2-CH＝CH2)，5.37(d，1H，J＝17.2，-CH2-CH＝CH2)，5.30(dd，1H，Ja＝10.4，Jb＝1.6，-CH2-CH＝CH2)，5.19(s，1H，Man4-H1)，5.12(d，1H，J＝9.6，GlcNAc1-H1)，5.00(s，1H，Man4’-H-1)，4.60-4.71(m)，4.50(d，2H，J＝7.6)，4.35-4.45(bm，1H，Asn-αCH)，4.31(s，1H，Man3-H-2)，4.25(d，1H，J＝2.0，Man4-H-2)，4.17(d，1H，J＝2.4，Man4-H-2)，2.87(dd，1H，Ja＝15.6，Jb＝4.0，Asn-βCH)，2.72(bdd，2H，Ja＝12.4，Jb＝2.4，NeuAc7-H3ex)，2.64(dd，1H，Ja＝15.6，Jb＝10.0，Asn-βCH)，2.13，2.12，2.11，2.08，2.05(eachs，18H，Acx6)，1.77(dd，2H，Ja＝12.4，Jb＝12.0，NeuAc7-H3ax)，1.48(s，9H，Boc)根據(jù)本發(fā)明，可以與以往相比非常容易且大量地得到在醫(yī)藥品開發(fā)等領(lǐng)域中有用的各種分離的糖鏈天冬酰胺衍生物。
權(quán)利要求
1.糖鏈天冬酰胺衍生物的制造方法，其為由脫脂卵黃制造糖鏈天冬酰胺衍生物的方法，其包括(a)用蛋白質(zhì)分解酶由脫脂卵黃制造糖鏈肽混合物的工序；(b)用肽分解酶由糖鏈肽混合物制造糖鏈天冬酰胺混合物的工序；(c)將脂溶性的保護(hù)基導(dǎo)入糖鏈天冬酰胺混合物中的糖鏈天冬酰胺，制造糖鏈天冬酰胺衍生物混合物的工序，(d)將糖鏈天冬酰胺衍生物混合物供給色譜，將各糖鏈天冬酰胺衍生物分離的工序。
2.權(quán)利要求1所述的糖鏈天冬酰胺衍生物的制造方法，其中，脫脂卵黃是通過用有機(jī)溶劑對(duì)鳥類的卵的卵黃進(jìn)行脫脂處理而獲得的。
3.權(quán)利要求1所述的糖鏈天冬酰胺衍生物的制造方法，其中，糖鏈天冬酰胺衍生物是11～5糖鏈天冬酰胺衍生物。
4.權(quán)利要求3所述的糖鏈天冬酰胺衍生物的制造方法，其中，糖鏈天冬酰胺衍生物是11～7糖鏈天冬酰胺衍生物。
5.權(quán)利要求4所述的糖鏈天冬酰胺衍生物的制造方法，其中，糖鏈天冬酰胺衍生物是11～9糖鏈天冬酰胺衍生物。
6.權(quán)利要求5所述的糖鏈天冬酰胺衍生物的制造方法，其中，糖鏈天冬酰胺衍生物是11糖鏈天冬酰胺衍生物。
7.權(quán)利要求1所述的糖鏈天冬酰胺衍生物的制造方法，其中，脂溶性的保護(hù)基為含有碳酸酯的基團(tuán)或?；?。
8.權(quán)利要求7所述的糖鏈天冬酰胺衍生物的制造方法，其中，脂溶性的保護(hù)基為含有碳酸酯的基團(tuán)。
9.權(quán)利要求1所述的糖鏈天冬酰胺衍生物的制造方法，其中，脂溶性的保護(hù)基為Fmoc基或Boc基。
10.權(quán)利要求9所述的糖鏈天冬酰胺衍生物的制造方法，其中，脂溶性的保護(hù)基為Fmoc基。
11.權(quán)利要求1所述的糖鏈天冬酰胺衍生物的制造方法，其中，預(yù)先將(b)中得到的糖鏈天冬酰胺混合物中含有的糖鏈天冬酰胺水解，將一部分糖殘基切斷。
12.權(quán)利要求1所述的糖鏈天冬酰胺衍生物的制造方法，其中，預(yù)先將(c)中得到的糖鏈天冬酰胺衍生物混合物中含有的糖鏈天冬酰胺衍生物水解，將一部分糖殘基切斷。
全文摘要
糖鏈天冬酰胺衍生物的制造方法，其為由脫脂卵黃制造糖鏈天冬酰胺衍生物的方法，其包括(a)用蛋白質(zhì)分解酶由脫脂卵黃制造糖鏈肽混合物的工序；(b)用肽分解酶由糖鏈肽混合物制造糖鏈天冬酰胺混合物的工序；(c)將脂溶性的保護(hù)基導(dǎo)入糖鏈天冬酰胺混合物中的糖鏈天冬酰胺，制造糖鏈天冬酰胺衍生物混合物的工序，(d)將糖鏈天冬酰胺衍生物混合物供給色譜，將各糖鏈天冬酰胺衍生物分離的工序。
文檔編號(hào)C08B37/00GK1777679SQ20048000354
公開日2006年5月24日 申請(qǐng)日期2004年2月3日 優(yōu)先權(quán)日2003年2月4日
發(fā)明者深江一博 申請(qǐng)人:大塚化學(xué)株式會(huì)社