本發(fā)明涉及用于各種組合物、試劑盒和方法的新穎化合物，包括(舉例來說)在聚合酶儲存緩沖液中或在如聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)的反應(yīng)中涉及核酸合成的組合物和方法。還描述了用于制備改性的化合物的方法。
背景技術(shù)：
：許多公知的重組DNA技術(shù)涉及復(fù)制或聚合和/或擴(kuò)增DNA。一個(gè)此類實(shí)例為聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)。在PCR期間，該反應(yīng)在熱穩(wěn)定DNA聚合酶存在下，在低溫和高溫(例如，55℃和95℃)兩個(gè)溫度之間反復(fù)地循環(huán)。在高溫下在反應(yīng)過程中耗費(fèi)的總時(shí)間段取決于循環(huán)總數(shù)、每次循環(huán)的高溫步驟持續(xù)時(shí)間和變溫速度(即，熱循環(huán)儀從一個(gè)溫度改變到另一個(gè)溫度下的速率)。盡管用于PCR的DNA聚合酶是高度熱穩(wěn)定的，但是它們在高溫下隨著時(shí)間推移傾向于變得失活。此外，這些聚合酶通過被引入到具有次最佳輔因子濃度或具有次最佳pH水平或包括化學(xué)或生物抑制劑的存在的反應(yīng)混合物環(huán)境中也可變得失活。在此類條件下，穩(wěn)定酶的一種方法為添加穩(wěn)定劑，如表面活性劑。表面活性劑(如清潔劑)為使活性形式酶和其液體環(huán)境之間的界面穩(wěn)定的表面活性化合物。舉例來說，TaqDNA聚合酶的活性已通過添加如NP-40或20(Bachmann等人《核酸研究(Nuc.AcidsRes.)》18(5)：1309(1990))的非離子清潔劑穩(wěn)定。然而，在一些應(yīng)用中，20-穩(wěn)定的DNA聚合酶具有低的擴(kuò)增效率或?qū)е路翘禺愋援a(chǎn)物的擴(kuò)增。此外，一些清潔劑需要高濃度。而且，還已知一些清潔劑(例如，NP-40)具有毒性。因此，需要改進(jìn)在溶液中熱穩(wěn)定DNA聚合酶的穩(wěn)定性的化合物，且具體來說在不需要對目前所使用清潔劑賦予任何缺點(diǎn)情況下改進(jìn)酶穩(wěn)定性的化合物。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本文提供了用于各種組合物、試劑盒和方法的新穎化合物。此類用途可包括(但不限于)用于儲存緩沖液和核酸合成或擴(kuò)增反應(yīng)中。在一些實(shí)施例中，提供了通過對相關(guān)起始材料化學(xué)改性合成的離子型和兩性離子型清潔劑化合物。在一些實(shí)施例中，此類新穎化合物在具有熱穩(wěn)定聚合酶的組合物中。在一些實(shí)施例中，此類組合物為穩(wěn)定的熱穩(wěn)定酶組合物。在一個(gè)實(shí)施例中，酶為從水生棲熱菌(Thermusaquaticus)(Taq聚合酶)純化的DNA聚合酶。在一些實(shí)施例中，酶為通過重組手段產(chǎn)生的DNA聚合酶。在另一實(shí)施例中，酶為與抗體(多種抗體)和/或可可逆地抑制所述聚合酶的寡核苷酸結(jié)合的DNA聚合酶。本文所提供的新穎化合物可以用于多種用途并且可以包括在各種組合物中，如(舉例來說)如聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)的核酸擴(kuò)增反應(yīng)。在某些實(shí)施例中，改性的化合物具有以下結(jié)構(gòu)式：其中：R1為H、(C1-C30)烷基、(C1-C30)取代的烷基、(C1-C30)雜烷基、(C1-C30)取代的雜烷基、芳基、取代的芳基、雜芳基、取代的雜芳基、苯基、取代的苯基，其中取代的芳基或取代的苯基被至少一種(C1-C30)烷基、(C1-C30)取代的烷基、(C1-C30)雜烷基或(C1-C30)取代的雜烷基取代；R2和/或R3各自獨(dú)立地為H、CH3、CH(CH3)2、CH2(C6H5)或C(CH3)3；R4和/或R5各自獨(dú)立地為H、CH3、CH(CH3)2、C6H5、CH2(C6H5)、C(CH3)3、CH2CH(CH3)2、CHCH2CH(CH3)2、CH2C6H5OH、CH2C＝CHNH(C6H5)、CH2C＝CHN＝CHNH、CH2COOH、CH2CONH2、(CH2)2CONH2、(CH2)2COOH、CH2SH、(CH2)nNH、(CH2)nN、CH2OH、CH(OH)CH3、(CH2)2SCH3、(CH2)3NHC(NH2)＝NH，或者可替代地R3與R5一起形成5-或6-元環(huán)，其任選地被至少一種(C1-C30)烷基、(C1-C30)取代的烷基、(C1-C30)雜烷基、(C1-C30)取代的雜烷基取代；以及，每個(gè)n獨(dú)立為任何正整數(shù)，其包括但不限于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29和30。在某些實(shí)施例中，R1為C8烷基。在某些實(shí)施例中，R1為C12烷基。在其它實(shí)施例中，R1為C16烷基。在某些實(shí)施例中，R2和/或R3各自獨(dú)立地選自H和CH3。在某些實(shí)施例中，R4和/或R5各自獨(dú)立地選自H、(CH2)nNH、(CH2)nN，或者可替代地R3與R5一起形成5-或6-元環(huán)。在某些實(shí)施例中，提供了具有式1的新穎化合物。在一些實(shí)施例中，新穎化合物BrijL-23-脯胺酸具有以下結(jié)構(gòu)式：并且/或者提供了其衍生物。還提供了用于聚合和/或擴(kuò)增核酸的方法，其包含將目標(biāo)核酸與至少一種聚合酶、引物、dNTP以及至少一種具有式I的新穎化合物混合，并且聚合和/或擴(kuò)增目標(biāo)核酸。在此類方法的一些實(shí)施例中，利用了至少一種引物。在某些實(shí)施例中，提供了包含至少一種聚合酶、dNTP、至少一種引物以及至少一種具有式I的新穎化合物的核酸擴(kuò)增反應(yīng)混合物。在一些實(shí)施例中，反應(yīng)混合物可另外包含可檢測標(biāo)記。在某些實(shí)施例中，該方法另外包括用于檢測可檢測標(biāo)記以定量擴(kuò)增的核酸的一個(gè)或多個(gè)步驟。在某些實(shí)施例中，提供了在熱循環(huán)過程期間通過將具有式I的新穎清潔劑包括在其中抑制聚合酶失活的方法。在某些實(shí)施例中，提供了用于提供具有聚合酶活性的酶和至少一種具有式I的新穎清潔劑并且在使得酶的聚合酶活性穩(wěn)定的條件下將其合并以形成混合物的方法。在某些實(shí)施例中，聚合酶是熱穩(wěn)定的。在某些實(shí)施例中，本文中所描述的方法提供具有與當(dāng)在常規(guī)(例如，已知)清潔劑，如(舉例來說)NP-40和/或20存在下時(shí)類似(例如，大致相同)擴(kuò)增效率或提高的擴(kuò)增效率的擴(kuò)增反應(yīng)。在一些實(shí)施例中，本文中所描述的新穎化合物可(舉例來說)在儲存緩沖液或擴(kuò)增反應(yīng)中替代NP-40和/或20(例如，如作為主混合物或預(yù)混合組合物的一部分而提供)。在某些實(shí)施例中，本文所描述的至少一種新穎化合物在組合物或反應(yīng)混合物中的有效濃度等于或小于如NP-40和/或20的常規(guī)清潔劑所需要的有效濃度。在一些此類實(shí)施例中，至少一種(一種或多種)新穎化合物在反應(yīng)混合物中的有效濃度可以小于如NP-40和/或20的常規(guī)(一種或多種)清潔劑所需要的有效濃度的至多、約，或至少一、二、三、四、五、六、七、八、九或十倍。在一些實(shí)施例中，至少一種新穎化合物如BrijL-23-脯胺酸的有效濃度0.0001％至10％。舉例來說，在一些實(shí)施例中，BrijL-23-脯胺酸在組合物或反應(yīng)混合物中的濃度為0.0001％、0.001％、0.01％、0.1％、1％或10％。在一些優(yōu)選實(shí)施例中，BrijL-23-脯胺酸在所述組合物或反應(yīng)混合物中的濃度為0.01％至5％，如0.01％、0.02％、0.03％、0.04％、0.05％、0.06％、0.07％、0.08％、0.09％、0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1％、2％、3％、4％和5％。還提供了產(chǎn)生新穎化合物的方法。在某些實(shí)施例中，本文提供了包含具有式I的新穎化合物中的至少一種(如BrijL-23-脯胺酸)的組合物。在某些實(shí)施例中，提供了包含至少一種聚合酶和具有式I的新穎化合物中至少一種(如BrijL-23-脯胺酸)的組合物。在一些實(shí)施例中，聚合酶是熱穩(wěn)定的。還提供了包含試劑的試劑盒，所述試劑包括進(jìn)行此類方法或制備此類混合物所必需的此類化合物等。附圖說明本文中示出的所有擴(kuò)增曲線圖以圖形方式將目標(biāo)核酸擴(kuò)增表示為作為循環(huán)次數(shù)(x軸)的函數(shù)的ΔRn(y軸)。圖1.在不同濃度下使用根據(jù)本文公開的方法和組合物的某些示例性實(shí)施例擴(kuò)增的1Kb和3KbPCR產(chǎn)物滴定新穎化合物Dt1和Dt2。圖2.在根據(jù)本文公開的方法和組合物的某些示例性實(shí)施例的新穎化合物Dt1和Dt2的存在下視紫質(zhì)基因的擴(kuò)增。圖3.在0.004％和0.0002％下新穎化合物DT2與用于根據(jù)本文公開方法和組合物的某些示例性實(shí)施例擴(kuò)增的0.1-1KbPCR產(chǎn)物的20的比較。圖4.在0.004％和0.002％下新穎化合物DT2與用于根據(jù)本文公開方法和組合物的某些示例性實(shí)施例擴(kuò)增的1-2KbPCR產(chǎn)物的20的比較。圖5.PCR活性：新穎化合物Dt2與用于根據(jù)本文公開方法和組合物的某些示例性實(shí)施例擴(kuò)增的視紫質(zhì)基因產(chǎn)物的單獨(dú)Brij-58的比較。圖6.使用根據(jù)本文公開方法和組合物的某些示例性實(shí)施例擴(kuò)增的Rhod-1043目標(biāo)序列滴定新穎化合物Dt2和Dt4。圖7.Dt4與20的比較：根據(jù)本文公開方法和組合物的某些示例性實(shí)施例的β-2微球蛋白(B2M)、甘油醛3-磷酸脫氫酶(GAPDH)、大核糖體蛋白(RPLPO)以及葡糖苷酸酶β(GUSB)的擴(kuò)增。圖8.Dt4與20(對數(shù)量級)的比較：根據(jù)本文公開的方法和組合物的某些示例性實(shí)施例的B2M、GAPDH、RPLPO和GUSB的擴(kuò)增。圖9.Dt4與20的比較：根據(jù)本文公開方法和組合物的某些示例性實(shí)施例的如由Cq表示的各種PCR產(chǎn)物的擴(kuò)增效率。圖10.Dt1、Dt3、Dt5、Dt6和Dt7與20的比較；根據(jù)本文公開的方法和組合物的某些示例性實(shí)施例執(zhí)行的擴(kuò)增。圖11.根據(jù)本文公開的方法和組合物的某些示例性實(shí)施例比較Dt4與Brij-58和20(每個(gè)均為0.001％和0.0008％)活性的次黃嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(HPRT1)擴(kuò)增反應(yīng)的擴(kuò)增曲線。圖12.根據(jù)本文公開方法和組合物的某些示例性實(shí)施例比較Dt4與Brij-58以及20(每個(gè)均為0.0006％和0.0004％)活性的HPRT1擴(kuò)增反應(yīng)的擴(kuò)增曲線。圖13.根據(jù)本文公開的方法和組合物的某些示例性實(shí)施例，比較Dt4與Brij-58和20(每個(gè)均為0.001％和0.0008％)活性的肽基脯胺?；悩?gòu)酶A(PPIA)擴(kuò)增反應(yīng)的擴(kuò)增曲線。圖14.根據(jù)本文公開方法和組合物的某些示例性實(shí)施例比較Dt4與Brij-58和20(每個(gè)均為0.0006％和0.0004％)活性的PPIA擴(kuò)增反應(yīng)的擴(kuò)增曲線。圖15.根據(jù)本文公開方法和組合物的某些示例性實(shí)施例比較Dt4與Brij-58和20(每個(gè)均為0.0002％和0.0001％)活性的PPIA擴(kuò)增反應(yīng)的擴(kuò)增曲線圖。圖16.根據(jù)本文公開方法和組合物的某些示例性實(shí)施例比較0.002％Dt4與0.01％20活性的B2M擴(kuò)增反應(yīng)的擴(kuò)增曲線。圖17.根據(jù)本文公開的方法和組合物的某些示例性實(shí)施例擴(kuò)比較0.002％Dt4與0.01％20活性的GAPDH擴(kuò)增反應(yīng)的擴(kuò)增曲線。圖18.根據(jù)本文公開方法和組合物的某些示例性實(shí)施例比較0.002％Dt4與0.01％20活性的RPLPO擴(kuò)增反應(yīng)的擴(kuò)增曲線。圖19.根據(jù)本文公開的方法和組合物的某些示例性實(shí)施例，在兩個(gè)月內(nèi)以約一周為間隔獲取的表明聚合酶在5X緩沖液中穩(wěn)定性的擴(kuò)增反應(yīng)(Cq)(ACTB(肌動蛋白-β)、GAPDH、PPIA和RPLPO的擴(kuò)增反應(yīng))的圖形表示。圖20.根據(jù)本文公開的方法和組合物的某些示例性實(shí)施例，在兩個(gè)月內(nèi)以約一周為間隔獲取的表明聚合酶在5X緩沖液中穩(wěn)定性的擴(kuò)增反應(yīng)(ΔRn)(ACTB(肌動蛋白-β)、GAPDH、PPIA和RPLPO的擴(kuò)增反應(yīng))的圖形表示。圖21.根據(jù)本文公開的方法和組合物的某些示例性實(shí)施例，在兩個(gè)月內(nèi)以約一周為間隔獲取的表明聚合酶在5X緩沖液中穩(wěn)定性的擴(kuò)增反應(yīng)(Cq)(ACTB(肌動蛋白-β)、GAPDH、PPIA和RPLPO的擴(kuò)增反應(yīng))圖形表示的兩個(gè)不同Dt4批次與20的(Cq，RPLPO、ACTB、PPIA、GAPDH、PGK1(磷酸甘油酸激酶1)、B2M、GUSB和HPRT1的擴(kuò)增反應(yīng))的比較。圖22.根據(jù)本文公開的方法和組合物的某些示例性實(shí)施例，在兩個(gè)月內(nèi)以約一周為間隔獲取的表明聚合酶在5X緩沖液中穩(wěn)定性的擴(kuò)增反應(yīng)(Cq)(ACTB(肌動蛋白-β)、GAPDH、PPIA和RPLPO的擴(kuò)增反應(yīng))圖形表示的兩個(gè)不同Dt4批次與20的(ΔRn，RPLPO、ACTB、PPIA、GAPDH、PGK1(磷酸甘油酸激酶1)、B2M、GUSB和HPRT1的擴(kuò)增反應(yīng))的比較。圖23.根據(jù)本文公開的方法和組合物的某些示例性實(shí)施例，在多種分析中比較Dt4擴(kuò)增。圖24.根據(jù)本文公開的方法和組合物的某些示例性實(shí)施例，使用市售的PlatinumTaq(1)經(jīng)配制包括新穎化合物BrijL-23-脯胺酸的PlatinumTaq(2)，和經(jīng)配制包括20的PlatinumTaq(3)比較各種目標(biāo)(面板1-44)的PCR擴(kuò)增。每個(gè)板代表使用包含以上描述的各種酶配制物(1、2或3)的反應(yīng)混合物擴(kuò)增的特定目標(biāo)序列(1至44)。圖25.根據(jù)本文公開方法和組合物的某些示例性實(shí)施例，PlatinumTaq和經(jīng)配制包括BrijL-23-脯胺酸或20的rTaq的靈敏度。使用包含50ng、5ng、500pg或50pgDNA的反應(yīng)擴(kuò)增基因組DNA。使用各種配制物(如所描述的那些)執(zhí)行擴(kuò)增反應(yīng)?！癋m.Pla.Taq”為具有20的PlatinumTaq(10u/μl)的配制物?！癈atalogPla.Taq”為市售PlatinumTaq的配制物。“Pla.Taq776”為具有BrijL-23-脯胺酸的PlatinumTaq(10u/μl)的配制物?！癋m.Taq”為具有的rTaq(5u/μl)的配制物?！癈atalogTaq”為市售rTaq的配制物?！癟aq776”為具有BrijL-23-脯胺酸的rTaq(5u/μl)的配制物。圖26.根據(jù)本文公開的方法和組合物的某些示例性實(shí)施例，使用市售PlatinumTaq(1)、市售rTaq(A)、經(jīng)配制包括新穎化合物BrijL-23-脯胺酸的PlatinumTaq(2)、經(jīng)配制包括新穎化合物BrijL-23-脯胺酸的rTaq(B)、經(jīng)配制包括20的PlatinumTaq(3)和經(jīng)配制包括20的rTaq(C)擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物TOPO-TA克隆的比較。具體實(shí)施方式本文提供了用于各種用途的新穎化合物，其包括但不限于在用于穩(wěn)定酶儲存和/或核酸聚合和/或擴(kuò)增反應(yīng)的組合物中使用。因此，在一些實(shí)施例中，提供了用于儲存聚合酶和用于擴(kuò)增目標(biāo)核酸的組合物、方法和試劑盒。在一些實(shí)施例中，提供了利用起始化合物(例如，更簡單的化合物)化學(xué)合成的離子型和兩性離子型清潔劑。在一些實(shí)施例中，提供了新穎化合物，如Dt1、Dt2、Dt3、Dt4、Dt5、Dt6、Dt7、Dt8、Dt9、Dt10、Dt11和Dt12(以下所述)。在一些實(shí)施例中，提供了新穎化合物BrijL-23-脯胺酸。這些新穎化合物可以用于各種步驟，包括(舉例來說)核酸聚合和/或擴(kuò)增反應(yīng)，如聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)。在一些實(shí)施例中，一種或多種具有式I的新穎化合物(如BrijL-23-脯胺酸)的存在，可使聚合酶在組合物或反應(yīng)混合物內(nèi)穩(wěn)定、降低聚合酶在反應(yīng)混合物內(nèi)的抑制和/或增加聚合酶在反應(yīng)混合物內(nèi)的聚合和/或擴(kuò)增效率。由此，提供了包含至少一種聚合酶和具有式I的新穎化合物中至少一種(如BrijL-23-脯胺酸)的組合物和反應(yīng)混合物。此類組合物或反應(yīng)混合物可另外包含一種或多種dNTP和至少一種核酸擴(kuò)增引物(例如，PCR引物)。在一些實(shí)施例中，此類組合物還可包括一種或多種組分，如三羥甲基氨基甲烷、EDTA、甘油、DTT、KCl、Mg2+、明膠(例如，魚明膠)、Kathon或牛血清白蛋白(BSA)。在某些實(shí)施例中，本文中提供了包含具有式I的新穎化合物中的至少一種的組合物。在某些實(shí)施例中，提供了包含至少一種聚合酶和式I的新穎化合物中至少一種的組合物。在一些實(shí)施例中，聚合酶是熱穩(wěn)定的。還提供了包含此類反應(yīng)混合物組分和還任選地包含用于進(jìn)行此類方法或用于制備此類混合物必需的其它試劑的試劑盒(單獨(dú)地或作為預(yù)先混合的配制物中任一者)。本文中描述了新穎化合物及其制備和使用方法。術(shù)語“新穎化合物”通常是指具有式I的化合物。在某些實(shí)施例中，術(shù)語“清潔劑”可以是指一種或多種新穎化合物，任選地包括一種或多種“常規(guī)清潔劑”。如本文所使用，術(shù)語“常規(guī)清潔劑”可以是指已知的化合物和/或根據(jù)式I除了本文中所描述的那些之外的任何化合物。在一些實(shí)施例中，術(shù)語“新穎化合物”可以是指僅有新穎化合物或一種或多種新穎化合物與一種或多種常規(guī)添加劑(如清潔劑)的組合。類似地，使用術(shù)語“至少一種新穎化合物”可以是指單獨(dú)的一種或多種新穎化合物、與另一種新穎化合物一起和/或與一種或多種常規(guī)添加劑，如清潔劑一起。因此，在一些實(shí)施例中，本文所描述的組合物和/或反應(yīng)混合物可另外包含一種或多種常規(guī)清潔劑，如舉例來說但不限于非離子型清潔劑、Brij-58、CHAPS、正十二烷基-b-D-麥芽糖苷、NP-40、十二烷基硫酸鈉(SDS)、X-15、X-35、X-45、X-100、X-102、X-114、X-165、X-305、X-405、X-705、20和/或其它清潔劑也可以是合適的，正如可以由本領(lǐng)域的技術(shù)人員所測定(參見，例如，美國專利申請公布第2008/0145910號；美國專利申請公布第2008/0064071號；美國專利第6,242,235號；美國專利第5,871,975號；以及用于示例性清潔劑的美國專利第6,127,155號；所有這些以全文引用的方式并入本文中)。附加的清潔劑也可以是合適的，如將由本領(lǐng)域技術(shù)人員測定。在某些實(shí)施例中，新穎化合物具有以下結(jié)構(gòu)式：其中：R1為H、(C1-C30)烷基、(C1-C30)取代的烷基、(C1-C30)雜烷基、(C1-C30)取代的雜烷基、芳基、取代的芳基、雜芳基、取代的雜芳基、苯基、取代的苯基，其中取代的芳基或取代的苯基被至少一種(C1-C30)烷基、(C1-C30)取代的烷基、(C1-C30)雜烷基或(C1-C30)取代的雜烷基取代；R2和/或R3各自獨(dú)立地為H、CH3、CH(CH3)2、CH2(C6H5)或C(CH3)3；R4和/或R5各自獨(dú)立地為H、CH3、CH(CH3)2、C6H5、CH2(C6H5)、C(CH3)3、CH2CH(CH3)2、CHCH2CH(CH3)2、CH2C6H5OH、CH2C＝CHNH(C6H5)、CH2C＝CHN＝CHNH、CH2COOH、CH2CONH2、(CH2)2CONH2、(CH2)2COOH、CH2SH、(CH2)nNH、(CH2)nN、CH2OH、CH(OH)CH3、(CH2)2SCH3、(CH2)3NHC(NH2)＝NH，或者可替代地R3與R5一起形成5-或6-元環(huán)，其任選地被至少一種(C1-C30)烷基、(C1-C30)取代的烷基、(C1-C30)雜烷基、(C1-C30)取代的雜烷基取代；以及，每個(gè)n獨(dú)立為任何正整數(shù)，其包括但不限于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29和30。在某些實(shí)施例中，R1為C8烷基。在某些實(shí)施例中，R1為C12烷基。在其它實(shí)施例中，R1為C16烷基。在某些實(shí)施例中，R2和/或R3各自獨(dú)立地選自H和CH3。在某些實(shí)施例中，R4和/或R5各自獨(dú)立地選自H、(CH2)nNH、(CH2)nN，或者可替代地R3與R5一起形成5-或6-元環(huán)。在某些實(shí)施例中，R1為C12烷基。在某些實(shí)施例中，R2和R4為H。在某些實(shí)施例中，R3與R5一起形成5-元環(huán)，并且每個(gè)n獨(dú)立為任何正整數(shù)，其包括但不限于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29以及30。在某些實(shí)施例中，新穎化合物為BrijL-23-脯胺酸和/或其衍生物。在某些實(shí)施例中，新穎化合物具有以下結(jié)構(gòu)式：具有式I的化合物可以通過利用更簡單的起始化合物材料制備以將新的和/或改進(jìn)的化合物(例如，表面活性劑或清潔劑)及其性能提供到其中。在一些實(shí)施例中，中間體可以使用LC-MS分析來分析并且在未純化情況下用于執(zhí)行接下來的合成步驟。在一些實(shí)施例中，提供了包含本文所描述的新穎化合物的穩(wěn)定酶組合物和酶。在一些實(shí)施例中，該酶為DNA或RNA聚合酶。。在一些實(shí)施例中，該酶是熱穩(wěn)定的。在一些實(shí)施例中，該酶是經(jīng)純化的。在一些實(shí)施例中，該酶是天然的。在一些實(shí)施例中，該酶是重組體。在一些實(shí)施例中，DNA聚合酶為熱穩(wěn)定的DNA聚合酶。在一些實(shí)施例中，DNA聚合酶從水生棲熱菌中分離。在一些實(shí)施例中，該酶可以是融合蛋白質(zhì)，如融合聚合酶。在一些實(shí)施例中，本文中所描述的新穎化合物和酶提供在緩沖液中。在一些實(shí)施例中，緩沖液包含一種或多種組分，如核苷三磷酸(dNTP)、MgCl2+、DTT、EDTA、三羥甲基氨基甲烷、甘油、KCl、明膠和Kathon。在一些優(yōu)選實(shí)施例中，所述核苷三磷酸的濃度每個(gè)為μM約0.15mM至2mM(例如，0.4mM)。在一些優(yōu)選實(shí)施例中，所述MgCl2+的濃度為約1mM至15mM(例如，3mM)。在一些優(yōu)選實(shí)施例中，所述DTT的濃度為約0.5mM至5mM(例如，1mM)。在一些優(yōu)選實(shí)施例中，所述EDTA的濃度為約0.05mM至1mM(例如，0.1mM或0.15mM)。在一些優(yōu)選實(shí)施例中，所述三羥甲基氨基甲烷的濃度為約5mM至500mM(例如，20mM、30mM、40mM、200mM或300mM)。在一些優(yōu)選實(shí)施例中，所述三羥甲基氨基甲烷的pH為約7.5至8.5。在一些優(yōu)選實(shí)施例中，所述甘油的濃度為約10％至60％(例如，30％、35％、40％、45％或50％)。在一些優(yōu)選實(shí)施例中，所述KCl的濃度為約50mM至1000mM(例如，100mM或500mM)。在一些優(yōu)選實(shí)施例中，所述明膠的濃度為約0.02％至1％(例如，0.05％或0.5％)。在一些優(yōu)選實(shí)施例中，所述Kathon的濃度為約0.015％至0.05％(例如，0.016％或0.04％)。在一些實(shí)施例中，另外提供酶抑制劑，如本文中所描述的那些。在一些實(shí)施例中，酶(如熱穩(wěn)定的DNA聚合酶)儲存于包含本文所描述的新穎化合物(例如，BrijL-23-脯胺酸)的組合物中。在一些實(shí)施例中，該酶穩(wěn)定一段延長的時(shí)間段。舉例來說，在一些實(shí)施例中，該酶儲存于包含本文所描述的新穎化合物的組合物中至少一個(gè)月、兩個(gè)月、三個(gè)月、四個(gè)月、五個(gè)月、十個(gè)月、16個(gè)月、24個(gè)月、30個(gè)月或36個(gè)月。在一些實(shí)施例中，該酶在約-70℃至約環(huán)境溫度(例如，25℃)的溫度下儲存于包含本文所描述的新穎化合物的組合物中。在一些實(shí)施例中，該酶在約4℃、-4℃或-20℃下儲存于包含本文所描述的新穎化合物的組合物中。在一些實(shí)施例中，提供了用于制備本文所描述的新穎化合物的方法。在一些實(shí)施例中，此類方法可包括將化合物A(如過程1所示)(例如，1eq.)、甲基三苯氧基磷碘化物(例如，4eq.)以及N,N-二甲基甲酰胺(DMF)(例如，6mL)依次合并到鋁箔覆蓋的圓底燒瓶(例如，50mL)。然后，將該反應(yīng)在適當(dāng)溫度(例如，室溫)下在適當(dāng)氣氛(例如，氬氣)下攪拌足夠的時(shí)間段(例如，3天)。在足夠的時(shí)間段(例如，3天)之后，可以監(jiān)測反應(yīng)的進(jìn)程(例如，使用分析液相色譜/質(zhì)譜(LC-MS))。中間產(chǎn)物圖案的出現(xiàn)可確認(rèn)改性清潔劑的形成?？梢曰蚩刹?通常)分離這一預(yù)期的中間產(chǎn)物(中間體B)?？梢詫被狨}酸鹽(例如，2eq.)和Et3N(例如，2eq.)添加到該中間產(chǎn)物。反應(yīng)混合物可以在適當(dāng)溫度(例如，65℃)下加熱一段適當(dāng)時(shí)間(例如，3天至4天)。反應(yīng)的進(jìn)程可以使用分析LC-MS監(jiān)測。然后，通常將反應(yīng)混合物冷卻到適當(dāng)溫度(例如，室溫)并且濃縮(例如，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上)至適當(dāng)體積(例如，約2mL)。然后，濃縮的粗混合物可通過制備型HPLC純化。然后，可以將期望的餾分匯集并濃縮(例如，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上)以獲得所期望的產(chǎn)物(例如，如在過程1中以產(chǎn)生化合物Dt1,Dt3、Dt5、Dt7、Dt9、Dt11和Dt12)。該產(chǎn)物然后可以進(jìn)行水解反應(yīng)(例如，使用2NNaOH)。然后可以攪拌該反應(yīng)混合物(例如，在室溫下)直至如通過分析LC-MS測定的耗盡所有起始物質(zhì)。這可以接著進(jìn)行中和(例如，用Amberlite)以產(chǎn)生最終的陽離子產(chǎn)物(例如，Dt1、Dt3、Dt5、Dt7、Dt9、Dt11和Dt12)、兩性離子產(chǎn)物(例如Dt2、Dt4、Dt6、Dt10)或陰離子產(chǎn)物(Dt8)。因此，以下示出用于研發(fā)具有式I的新穎化合物的示例性方法：其中R1、R2、R3、R4、R5和n為如上文所描述，并且X選自由以下各者組成的群組：H、CH3、CH2CH3、CH2(C6H5)和C(CH3)3。具有式I的新穎化合物可以是(舉例來說)離子型的(例如，陽離子型、陰離子型、兩性離子型)。以下示出使用過程1制備的示例性新穎化合物：其中n為如上文所描述的。在某些實(shí)施例中，每個(gè)n獨(dú)立為5、6、7、8、9、10、15、20、25或30。以下示出使用過程2研發(fā)新穎化合物的示例性方法。以上示出使用過程2制備的具有式I的示例性新穎化合物(BrijL-23-脯胺酸)，作為最終產(chǎn)物(參見框中化合物)。關(guān)于過程2的反應(yīng)物和中間體以及由此制備的新穎化合物的附加信息在表1中示出：表1在某些實(shí)施例中，提供了用于聚合和/或擴(kuò)增核酸的方法，其包含將目標(biāo)核酸與至少一種聚合酶、引物、dNTP以及至少一種具有式I的新穎化合物混合，并且聚合和/或擴(kuò)增目標(biāo)核酸。在某些實(shí)施例中，該方法可包括至少一種引物。在某些實(shí)施例中，提供了核酸擴(kuò)增反應(yīng)混合物，所述混合物包含至少一種聚合酶、dNTP、至少一種引物和至少一種具有式I的新穎化合物(如BrijL-23-脯胺酸)。在某些實(shí)施例中，組合物和/或反應(yīng)混合物可另外包含可檢測標(biāo)記。在某些實(shí)施例中，該方法包括用于檢測和/或定量可檢測標(biāo)記以檢測和/或定量擴(kuò)增的核酸的一個(gè)或多個(gè)步驟。在某些實(shí)施例中，提供了在儲存和/或熱循環(huán)過程期間通過將具有式I的新穎化合物包括其中抑制聚合酶失活的方法。在某些實(shí)施例中，提供了用于提供具有聚合酶活性的酶和至少一種具有式I的新穎化合物，并且在使得該酶的聚合酶活性穩(wěn)定的條件下將其合并以形成混合物的方法。在某些實(shí)施例中，聚合酶是熱穩(wěn)定的。在某些實(shí)施例中，本文中所描述的方法提供具有與在如(舉例來說)NP-40和/或20的常規(guī)(例如，已知)清潔劑存在下時(shí)，類似的酶穩(wěn)定性(例如，大致相同)或提高的酶穩(wěn)定性的組合物。在某些實(shí)施例中，當(dāng)本文中所描述的方法提供具有與在如(舉例來說)NP-40和/或20的常規(guī)(例如，已知)清潔劑存在下時(shí)，類似擴(kuò)增效率(例如，大致相同)或提高擴(kuò)增效率的擴(kuò)增反應(yīng)。在一些實(shí)施例中，本文中所描述的新穎化合物可在儲存緩沖液、主混合物和/或擴(kuò)增反應(yīng)中替代NP-40和/或20。在某些實(shí)施例中，至少一種具有式I的新穎化合物(例如，Dt1、Dt2、Dt3、Dt4、Dt5、Dt6、Dt7、Dt8、Dt9、Dt10、Dt11、Dt12和/或BrijL-23-脯胺酸)在反應(yīng)混合物中的“有效濃度”(例如，將支撐如PCR的擴(kuò)增反應(yīng)的量)可以比常規(guī)清潔劑(例如，NP-40和/或20)所需要的濃度更高、相同或更低。在一些此類實(shí)施例中，至少一種新穎化合物(例如，Dt4和/或BrijL-23-脯胺酸)在反應(yīng)混合物中的有效濃度可以小于常規(guī)清潔劑(如NP-40和/或20)所需要的濃度的至多約或至少一倍、兩倍、三倍、四倍、五倍、六倍、七倍、八倍、九倍或十倍。舉例來說，NP-40或20通常包括在約0.01％或更小(例如，如通過從儲備溶液稀釋成反應(yīng)混合物測定的)的反應(yīng)中。在某些實(shí)施例中，本文所描述的新穎化合物可以在比常規(guī)清潔劑更低的濃度(例如，以百分比(即，w/v或v/v))下使用(例如，與0.01％20相比用于Dt4的0.002％；圖11至18)。在某些實(shí)施例中，提供了聚合和/或擴(kuò)增核酸的方法，其包含將所關(guān)注的核酸(例如，目標(biāo)核酸)與至少一種聚合酶、引物、dNTP和至少一種式I的新穎化合物混合，并且聚合和/或擴(kuò)增該目標(biāo)核酸。在某些實(shí)施例中，該方法包括至少一種引物。在某些實(shí)施例中，提供了包含至少一種聚合酶、dNTP、至少一種引物以及至少一種具有式I的改性化合物的(一種或多種)核酸擴(kuò)增反應(yīng)混合物。在其它實(shí)施例中，提供了用于使用此類(一種或多種)混合物的方法?？梢允褂酶鞣N反應(yīng)和體系中的任一項(xiàng)擴(kuò)增目標(biāo)核酸。如本文中所用，術(shù)語“擴(kuò)增”(amplification)、“核酸擴(kuò)增”或“擴(kuò)增(amplifying)”是指產(chǎn)生多個(gè)核酸模板的拷貝或產(chǎn)生多個(gè)與核酸模板互補(bǔ)的核酸序列拷貝。術(shù)語(包括術(shù)語“聚合”)還可以指延伸核酸模板(例如，通過聚合)。擴(kuò)增反應(yīng)可以是聚合酶介導(dǎo)的延伸反應(yīng)，例如聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)。然而，任何已知擴(kuò)增反應(yīng)都可以適用于如本文所描述進(jìn)行使用。通常是指目標(biāo)核酸“指數(shù)”增加的術(shù)語“擴(kuò)增”在本文中可以用于描述核酸的所選目標(biāo)序列數(shù)量的線性和指數(shù)增加兩者。術(shù)語“擴(kuò)增反應(yīng)混合物”和/或“主混合物”可以是指包含用于擴(kuò)增目標(biāo)核酸的各種(一些或所有)試劑的水溶液。此類反應(yīng)還可以使用固體支撐物(例如陣列)來進(jìn)行。該反應(yīng)還可以根據(jù)用戶所期望的以單一或多重形式執(zhí)行。這些反應(yīng)通常包括酶、水性緩沖液、鹽、擴(kuò)增引物、目標(biāo)核酸以及核苷三磷酸。根據(jù)情況，該混合物可以是完全或不完全擴(kuò)增反應(yīng)混合物。用于擴(kuò)增目標(biāo)核酸的方法可以是本領(lǐng)域的技術(shù)人員可獲得的任何方法?？梢岳檬鼓繕?biāo)核酸序列的拷貝倍增的任何體外手段。這些手段包括線性、對數(shù)和/或任何其它擴(kuò)增方法。盡管本發(fā)明一般論述包括定量PCR(qPCR)和終點(diǎn)PCR(epPCR)的PCR作為核酸擴(kuò)增反應(yīng)，但是預(yù)期本文中描述的改性的清潔劑應(yīng)在其它類型的核酸擴(kuò)增反應(yīng)中有效，包括聚合酶介導(dǎo)的擴(kuò)增反應(yīng)(如解旋酶依賴性擴(kuò)增(HDA)、重組酶-聚合酶擴(kuò)增(RPA)和滾鏈擴(kuò)增(RCA))以及連接酶介導(dǎo)的擴(kuò)增反應(yīng)(如連接酶檢測反應(yīng)(LDR)、連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(LCR)和每個(gè)的間隙型式)兩者以及如LDR和PCR的核酸擴(kuò)增反應(yīng)的組合(參見(舉例來說)美國專利6,797,470)。舉例來說，改性的化合物可以用于(舉例來說)各種連接介導(dǎo)的反應(yīng)，其中舉例來說與PCR引物相反，采用連接探針。附加的示例性方法包括聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR；參見，例如美國專利第4,683,202號；第4,683,195號；第4,965,188號；和/或第5,035,996號)、等溫程序(使用一種或多種RNA聚合酶(參見，例如PCT公布第WO2006/081222號)、鏈置換(參見，例如美國專利第RE39007E號)、引物分子的部分破壞(參見，例如PCT公布第WO2006/087574號))、連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(LCR)(參見，例如Wu等人，《基因組學(xué)(Genomics)》4:560-569(1990))，和/或Barany等人《美國國家科學(xué)院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)》88:189-193(1991))、QβRNA復(fù)制酶系統(tǒng)(參見例如PCT公布第WO1994/016108號)、基于RNA轉(zhuǎn)錄的系統(tǒng)(例如，TAS、3SR)、滾環(huán)擴(kuò)增(RCA)(參見，例如美國專利第5,854,033號；美國專利申請公布第2004/265897號；Lizardi等人《自然·遺傳學(xué)(Nat.Genet.)》19:225-232(1998)；和/或Banér等人《核酸研究(NucleicAcidRes.)》,26:5073-5078(1998))以及鏈置換擴(kuò)增(SDA)(Little等人《臨床化學(xué)(Clin.Chem.)》45:777-784(1999))。這些系統(tǒng)與本領(lǐng)域技術(shù)人員可獲得的許多其它系統(tǒng)一起可以適用于聚合和/或擴(kuò)增如本文中所述使用的目標(biāo)核酸?！皵U(kuò)增效率”可以是指可以經(jīng)定量以測定拷貝數(shù)的任何產(chǎn)物(例如，所述術(shù)語可以是指PCR擴(kuò)增子、LCR連接產(chǎn)物和/或類似產(chǎn)物)。不論在具體擴(kuò)增反應(yīng)中充當(dāng)期望的具體化合物是否可以通過進(jìn)行至少兩個(gè)獨(dú)立的擴(kuò)增反應(yīng)測定，每個(gè)反應(yīng)分別在不存在和存在每個(gè)反應(yīng)中均發(fā)生的定量擴(kuò)增的化合物下進(jìn)行?；衔锏母鞣N濃度或組合還可以在獨(dú)立的反應(yīng)混合物中測試以測定對擴(kuò)增效率的影響。擴(kuò)增和/或聚合效率可以通過本領(lǐng)域中已知的各種方法來測定，其包括(但不限于)測定校準(zhǔn)稀釋曲線和斜率計(jì)算，使用如Hellemans等人,《基因組生物學(xué)(GenomeBiology)》8:R19(2007)中所述的qBase軟件測定，使用如Livak和Schmittgen，《方法(Methods)》25:402(2001)所述的ΔΔCq(ΔΔCq)計(jì)算測定，或通過如Pfaffl，《核酸研究(Nucl.AcidsRes.)》29:e45(2001)所述的方法，所有這些都以其全文引用的方式并入本文中。用于聚合和/或擴(kuò)增核酸的示例性方法包括(舉例來說)聚合酶介導(dǎo)的延伸反應(yīng)。舉例來說，聚合酶介導(dǎo)的延伸反應(yīng)可以是聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)。在其它實(shí)施例中，核酸擴(kuò)增反應(yīng)為多重反應(yīng)。舉例來說，適用于如本文所述用于聚合和/或擴(kuò)增并且檢測核酸的示例性方法可以商購(參見，例如美國專利第4,889,818號；第5,079,352號；第5,210,015號；第5,436,134號；第5,487,972號；第5,658,751號；第5,210,015號；第5,487,972號；第5,538,848號；第5,618,711號；第5,677,152號；第5,723,591號；第5,773,258號；第5,789,224號；第5,801,155號；第5,804,375號；第5,876,930號；第5,994,056號；第6,030,787號；第6,084,102號；第6,127,155號；第6,171,785號；第6,214,979號；第6,258,569號；第6,814,934號；第6,821,727號；第7,141,377號；和/或第7,445,900號，所有這些都在此以其全文引用的方式并入本文中)。分析通常通過使用具有5'到3'核酸酶活性的核酸聚合酶、能夠雜交到目標(biāo)多核苷酸的引物和能夠相對于所述引物雜交到所述目標(biāo)多核苷酸3'的寡核苷酸探針，對所述目標(biāo)多核苷酸執(zhí)行核酸擴(kuò)增來進(jìn)行。寡核苷酸探針通常包括可檢測標(biāo)記(例如，熒光報(bào)告體分子)和能夠淬滅所述報(bào)告體分子的熒光的淬滅劑分子。通常，可檢測標(biāo)記和淬滅劑分子是單探針的一部分。隨著擴(kuò)增進(jìn)行，聚合酶消化探針以將可檢測標(biāo)記與淬滅劑分子分離。在反應(yīng)期間監(jiān)測可檢測標(biāo)記(例如熒光)，其中標(biāo)記的檢測對應(yīng)于核酸擴(kuò)增的發(fā)生(例如信號越高，擴(kuò)增量越大)。分析的變體(例如LNATM外加分析)在本領(lǐng)域中是已知的并且將適用于本文中所述的方法中。適用于如本文所述使用的另一個(gè)示例性系統(tǒng)在置換雜交法中利用雙鏈探針(參見，例如Morrison等人《分析生物化學(xué)(Anal.Biochem.)》，18:231-244(1989)；和/或Li等人《核酸研究(NucleicAcidsRes.)》，30(2，e5)(2002))。在此類方法中，探針通常包括兩個(gè)不同長度的互補(bǔ)寡核苷酸，其中一個(gè)包括可檢測標(biāo)記并且另一個(gè)包括猝滅劑分子。當(dāng)未結(jié)合到目標(biāo)核酸時(shí)，猝滅劑遏制可檢測標(biāo)記的信號。在與目標(biāo)核酸置換雜交之后，探針變成可檢測的?？梢允褂枚鄠€(gè)探針，每個(gè)含有不同的可檢測標(biāo)記，以使得可以在單一反應(yīng)中查詢多個(gè)目標(biāo)核酸。適用于如本文所述用于聚合和/或擴(kuò)增并且檢測目標(biāo)核酸的附加例示性方法涉及“分子信標(biāo)”，其是單鏈發(fā)夾狀寡核苷酸探針。在目標(biāo)序列存在下，探針去折疊、結(jié)合并且發(fā)射信號(例如發(fā)熒光)。分子信標(biāo)通常包括至少四個(gè)組分：1)“環(huán)”，與目標(biāo)序列互補(bǔ)的18-30核苷酸區(qū)域；2)兩個(gè)5-7核苷酸“莖”，在環(huán)的任一端上所見并且彼此互補(bǔ)；3)在5'端處，可檢測標(biāo)記；以及4)在3'端處，猝滅劑部分，其當(dāng)探針在閉環(huán)形狀(例如，不結(jié)合到目標(biāo)核酸)中時(shí)阻止可檢測標(biāo)記發(fā)射信號。因此，在互補(bǔ)目標(biāo)存在下，信標(biāo)的“莖”部分分離出來，導(dǎo)致探針雜交到目標(biāo)。還已知其它類型的分子信標(biāo)并且它們可以適用于本文所述的方法中。分子信標(biāo)可以用于各種分析系統(tǒng)中。一個(gè)此類系統(tǒng)是基于核酸序列的擴(kuò)增用于在無溫度循環(huán)的情況下將RNA聚合和/或擴(kuò)增到雙鏈DNA的單步驟等溫法。NASBA反應(yīng)通常需要禽成髓細(xì)胞瘤病毒(AMV)、逆轉(zhuǎn)錄酶(RT)、T7RNA聚合酶、RNA酶H以及兩個(gè)寡核苷酸引物。在擴(kuò)增之后，可以使用分子信標(biāo)檢測經(jīng)擴(kuò)增的目標(biāo)核酸。分子信標(biāo)的其它用途在本領(lǐng)域中是已知的并且將適用于本文中所述的方法中。ScorpionsTM系統(tǒng)為可以用于本文所描述的方法中的另一種示例性分析形式。ScorpionsTM引物為雙功能性分子，其中引物與可檢測標(biāo)記(例如，螢光團(tuán))和猝滅可檢測標(biāo)記熒光的不可檢測猝滅劑部分一起共價(jià)鍵聯(lián)到探針。在存在目標(biāo)核酸的情況下，可檢測標(biāo)記和猝滅劑分離，這導(dǎo)致從可檢測標(biāo)記發(fā)射的信號增加。通常，在擴(kuò)增反應(yīng)中所用的引物包括在5'端的探針元件以及在發(fā)夾環(huán)開始時(shí)的“PCR阻斷劑”元件(例如，六乙二醇(HEG)單體(Whitcombe等人《自然·生物技術(shù)(Nat.Biotech.)》17：804-807(1999))。探針通常包括具有在一個(gè)末端的可檢測標(biāo)記并且在另一個(gè)末端的淬滅劑的自身互補(bǔ)莖序列。在初始擴(kuò)增循環(huán)(例如，PCR)中，引物雜交到目標(biāo)并且由于聚合酶的作用而發(fā)生延伸。ScorpionsTM系統(tǒng)可以使用多個(gè)可不同標(biāo)記以在探針之間加以區(qū)分的探針，用于檢查并且鑒別點(diǎn)突變。使用PCR作為實(shí)例，在完成一個(gè)延長循環(huán)之后，新合成的目標(biāo)區(qū)將連接到與探針相同的鏈。在第二個(gè)變性和退火循環(huán)之后，探針和目標(biāo)雜交。然后發(fā)夾序列雜交到新產(chǎn)生的PCR產(chǎn)物的一部分。這導(dǎo)致可檢測標(biāo)記與猝滅劑分離并引起信號發(fā)射。所述經(jīng)標(biāo)記探針的其它用途在本領(lǐng)域中是已知的并且將適用于本文中所述的方法中。本文所提供新穎化合物還可以用于在某一組條件(例如，某一溫度或pH)下抑制或基本上抑制核酸聚合酶的聚合酶活性的組合物和/或反應(yīng)混合物。聚合酶活性的抑制可以用于如在“熱啟動”技術(shù)中減少不期望的次級擴(kuò)增產(chǎn)物的形成。在一些熱啟動技術(shù)中，DNA聚合酶活性重要的組分(例如，二價(jià)離子和/或DNA聚合酶自身)可以不添加至反應(yīng)混合物中，直至混合物的溫度足夠高以防止非特異性引物退火。示例性熱啟動技術(shù)可包括(舉例來說)基于寡核苷酸的系統(tǒng)、基于抗體的系統(tǒng)、基于化學(xué)的系統(tǒng)和/或這些系統(tǒng)中任一項(xiàng)的組合(例如，雙重三重、四重等熱啟動系統(tǒng))。舉例來說，鎂或DNA聚合酶可以封存在蠟珠中，其隨著反應(yīng)溫度增加熔化，僅在高溫下釋放所封存的組分。根據(jù)其它技術(shù)，舉例來說通過DNA聚合酶的可逆化學(xué)改性、將抗體或多個(gè)抗體結(jié)合至DNA聚合酶或結(jié)合到DNA聚合酶的寡核苷酸分子，使DNA聚合酶可逆地失活或改性。在一些實(shí)施例中，逆轉(zhuǎn)所述化學(xué)改性或者在較高反應(yīng)溫度下變性(一個(gè)或多個(gè))抗體分子或寡核苷酸分子，從而釋放功能性DNA聚合酶。雙重?zé)釂臃磻?yīng)系統(tǒng)通常包含至少兩個(gè)不同的熱啟動裝置，其在某一組條件(例如，在某一溫度或pH)下抑制或基本上抑制核酸聚合酶的聚合酶活性。此類溫度依賴性熱啟動裝置可包括(但不限于)：在較低溫下阻斷DNA聚合酶活性的抗體或抗體的組合、在較低溫度下阻斷DNA聚合酶活性的寡核苷酸、在高溫下離解的DNA聚合酶的可逆化學(xué)改性、在較低溫度下提供降低活性的DNA聚合酶的胺基酸改性、包括超穩(wěn)定DNA結(jié)合域和拓?fù)洚悩?gòu)酶的融合蛋白、抑制DNA聚合酶的溫度依賴性配體、在較低溫度下隔離引物的單鏈結(jié)合蛋白、可逆改性的引物和/或在具體溫度下改變構(gòu)形的改性的dNTP。如這些的方法詳細(xì)地描述在各種參考文獻(xiàn)中，其包括(舉例來說)Chou等人，《核酸研究(Nucl.AcidsRes.)》20：1717-1723(1992)；Dang等人，《分子生物學(xué)雜志(J.Mol.Biol.)》264：268(1996)；D'Aquila等人，《核酸研究(Nucl.AcidsRes.)》19：3749(1991)；美國專利第5,338,671號；美國專利第5,587,287號；美國專利第5,677,152號；美國專利第5,773,258號；美國專利8,470,531；和/或美國專利公布2010-0317062Al；所有這些在此以全文的方式并入本文中。如將由本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所理解，其它熱啟動技術(shù)在本領(lǐng)域中也是已知的并且可以適合與本文中所描述的新穎化合物一起使用，?？梢杂糜谒_的核酸擴(kuò)增反應(yīng)中的核酸聚合酶可以是起作用進(jìn)行所期望反應(yīng)的任何核酸聚合酶，舉例來說例如原核生物的、真菌的、病毒的、噬菌體、植物和/或真核生物的核酸聚合酶。如本文所用，術(shù)語“DNA聚合酶”是指使用核酸鏈作為模板從頭合成DNA鏈的酶。DNA聚合酶使用現(xiàn)存DNA或RNA作為DNA合成的模板并且沿著其所讀取的模板鏈催化脫氧核糖核苷酸的聚合。新合成的DNA鏈與模板鏈互補(bǔ)。DNA聚合酶可將游離核苷酸僅添加到新形成鏈的3'-羥基端。其經(jīng)由將核苷單磷酸從脫氧核苷三磷酸(dNTP)轉(zhuǎn)移至生長寡核苷酸鏈的3'-羥基合成寡核苷酸。這導(dǎo)致新鏈沿著5'到3'的方向伸長。因?yàn)镈NA聚合酶可僅添加核苷酸到預(yù)先存在的3'-OH基團(tuán)上，所以為了開始DNA合成反應(yīng)，DNA聚合酶需要可以向其可添加第一核苷酸的引物。合適的引物可包含RNA或DNA的寡核苷酸或其嵌合體(例如，RNA/DNA嵌合引物)。DNA聚合酶可以是天然存在的DNA聚合酶或具有上文提及的活性的天然酶的變異體。舉例來說，其可以包括具有鏈置換活性的DNA聚合酶、缺乏5'到3'核酸外切酶活性的DNA聚合酶、具有逆轉(zhuǎn)錄酶活性的DNA聚合酶或具有核酸內(nèi)切酶活性的DNA聚合酶。合適的核酸聚合酶還可包含全酶、全酶的功能性部分、嵌合聚合酶或可實(shí)現(xiàn)核酸分子的合成的任何經(jīng)改性聚合酶。在本發(fā)明內(nèi)，DNA聚合酶還可包括聚合酶、末端轉(zhuǎn)移酶、逆轉(zhuǎn)錄酶、端粒酶和/或多核苷酸磷酸化酶。聚合酶的非限制性實(shí)例可包括(舉例來說)T7DNA聚合酶、真核粒線體DNA聚合酶γ、原核DNA聚合酶I、II、III、IV和/或V；真核聚合酶α、β、δ、ε、η、ζ、ι和/或κ；大腸桿菌DNA聚合酶I；大腸桿菌DNA聚合酶IIIα和/或ε亞基；大腸桿菌聚合酶IV、大腸桿菌聚合酶V；棲熱水生菌DNA聚合酶I；嗜熱脂肪芽孢桿菌；DNA聚合酶I；廣古菌聚合酶；末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶(TdT)；釀酒酵母聚合酶4；跨損傷合成聚合酶；逆轉(zhuǎn)錄酶；和/或端粒酶?？梢允褂玫暮线m的熱穩(wěn)定DNA聚合酶的非限制性實(shí)例包括Taq、Tfl、Tfi、Pfu和VentTMDNA聚合酶、任何經(jīng)基因工程化的DNA聚合酶、具有降低的或不顯著的3'到5'核酸外切酶活性的任何DNA聚合酶(例如，SuperScriptTMDNA聚合酶)和/或經(jīng)基因工程化的DNA聚合酶(例如，具有活性位點(diǎn)突變F667Y或F667Y的等效物(例如，在Tth中)的那些、FS、ThermoSequenaseTM)、金、TherminatorI、TherminatorII、TherminatorIII、Therminatorγ(全部可購自馬薩諸塞州貝弗利的新英格蘭生物實(shí)驗(yàn)室(NewEnglandBiolabs,Beverly,MA))和/或其任何衍生物和片段。如本領(lǐng)域的技術(shù)人員將了解，其它核酸聚合酶也可以是合適的。在另一方面，本公開提供用于聚合和/或擴(kuò)增所關(guān)注核酸序列(例如，目標(biāo)序列)的反應(yīng)混合物。在一些實(shí)施例中，反應(yīng)混合物可另外包含可檢測標(biāo)記。所述方法還可以包括一個(gè)或多個(gè)用于檢測可檢測標(biāo)記以定量經(jīng)擴(kuò)增核酸的步驟。如本文中所用，術(shù)語“可檢測標(biāo)記”是指指示擴(kuò)增的各種信號傳導(dǎo)分子中的任一個(gè)。舉例來說，綠和其它DNA結(jié)合染料是可檢測標(biāo)記。此類可檢測標(biāo)記可包含或可以是(舉例來說)核酸插入劑或非插入劑。如本文中所用，插入劑是能夠非共價(jià)插入到雙鏈核酸分子的堆疊堿基對之間的試劑或部分。非插入劑是不插入到雙鏈核酸分子中的試劑。核酸結(jié)合劑可直接地或間接地產(chǎn)生可檢測信號。所述信號可以使用(舉例來說)熒光和/或吸光度直接地可檢測，或使用(舉例來說)可檢測地受與雙鏈核酸的接近性影響的任何合適的部分或配體間接地可檢測，例如連接到核酸結(jié)合劑的被取代的標(biāo)記部分或結(jié)合配體。核酸結(jié)合劑在結(jié)合到雙鏈核酸時(shí)通常必需產(chǎn)生可與當(dāng)相同試劑在溶液中或結(jié)合到單鏈核酸時(shí)所產(chǎn)生的信號相區(qū)別的可檢測信號。舉例來說，如溴化乙錠的插入劑在插入到雙鏈DNA中時(shí)發(fā)出的熒光比在結(jié)合到單鏈DNA、RNA或在溶液中時(shí)強(qiáng)烈(參見，例如美國專利第5,994,056號；第6,171,785號；和/或第6,814,934號)。類似地，放線菌素D在結(jié)合到單鏈核酸時(shí)在紫外/可見光譜的紅色部分中發(fā)熒光，并且當(dāng)結(jié)合到雙鏈核酸時(shí)在紫外/可見光譜的綠色部分中發(fā)熒光。并且在另一實(shí)例中，已經(jīng)報(bào)導(dǎo)了光反應(yīng)性的補(bǔ)骨脂素4-氨甲基-4-5',8-三甲基補(bǔ)骨脂素(AMT)在插入到雙鏈DNA中之后展現(xiàn)在長波長下的吸收和熒光減少(Johnson等人《光化學(xué)和光生物學(xué)(Photochem.&Photobiol.)》，33：785-791(1981))。舉例來說，美國專利第4,257,774號描述了熒光插入劑(例如，乙錠鹽、道諾霉素(daunomycin)、麥帕克林(mepacrine)和吖啶橙、4',6-二脒基-α-苯基吲哚)與DNA的直接結(jié)合。非插入劑(例如，如本文中所述的小溝結(jié)合物，例如Hoechst33258、偏端霉素(distamycin)、紡錘菌素(netropsin))也可以是適用的。舉例來說，Hoechst33258(Searle等人《核酸研究(Nucl.AcidsRes.)》18(13)：3753-3762(1990))在增加目標(biāo)量的情況下展現(xiàn)出有所改變的熒光。小溝結(jié)合劑在本文中其它地方更詳細(xì)地加以描述。其它DNA結(jié)合染料對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說是可獲得的并且可以單獨(dú)或與分析系統(tǒng)的其它試劑和/或組分組合使用。示例性DNA結(jié)合染料尤其可包括(舉例來說)吖啶(例如，吖啶橙、吖啶黃)、放線菌素D(Jain等人《分子生物學(xué)雜志(J.Mol.Biol.)》68：21(1972))、氨茴霉素、BOBOTM-1、BOBOTM-3、BO-PROTM-1、色霉素、DAPI(Kapuseinski等人《核酸研究(Nucl.AcidsRes.)》(112)：3519(1979))、道諾霉素、偏端霉素(例如，偏端霉素D)、在美國專利第7,387,887號中所述的染料、玫瑰樹堿、乙錠鹽(例如，溴化乙錠)、氟庫滿寧、如美國專利第4,257,774號中所述的熒光插入劑、(緬因州羅克蘭的康伯司生物科學(xué)羅克蘭公司(CambrexBioScienceRocklandInc.,Rockland,Me.))、赫斯特33258(Embrey和Embrey，《核酸研究(Nucl.AcidsRes.)》18：3753-3762(1990))、赫斯特33342、乙菲啶、JO-PROTM-1、LIZ染料、LO-PROTM-1、麥帕克林、光神霉素、NED染料、紡錘菌素、4',6-二脒基-α-苯基吲哚、普羅黃素、POPOTM-1、POPOTM-3、PO-PROTM-1、碘化丙啶、多吡啶釕、S5、金、綠I(美國專利第5,436,134號和第5,658,751號)、綠II、藍(lán)、綠、43、44、45、藍(lán)、11、13、15、16、20、23、噻唑橙(威斯康星州密爾沃基的奧德里奇化學(xué)公司(AldrichChemicalCo.,Milwaukee,Wis.))、TOTOTM-3、和(俄勒岡州尤金分子探針公司有限公司(MolecularProbes,Inc.,Eugene,OR))。舉例來說，綠I(參見，例如美國專利第5,436,134號；第5,658,751號；和/或第6,569,927號)已經(jīng)用于監(jiān)測PCR反應(yīng)。如本領(lǐng)域的技術(shù)人員將了解，其它DNA結(jié)合染料也可以是合適的。對于如本文中所述的用途，一種或多種可檢測標(biāo)記和/或淬滅劑可以附接到一個(gè)或多個(gè)引物和/或探針(例如，可檢測標(biāo)記)?？蓹z測標(biāo)記在游離時(shí)或在結(jié)合到目標(biāo)核酸中的一個(gè)時(shí)可發(fā)射信號。可檢測標(biāo)記還可以在接近另一種可檢測標(biāo)記時(shí)發(fā)射信號?？蓹z測標(biāo)記還可以與猝滅劑分子一起使用以使得信號僅僅在與猝滅劑分子不足夠接近時(shí)才可檢測。舉例來說，在一些實(shí)施例中，分析系統(tǒng)可引起可檢測標(biāo)記從淬滅分子中釋放?？梢允褂萌舾煽蓹z測標(biāo)記中的任一個(gè)來標(biāo)記在本文中所述方法中所使用的引物和探針。如上文所提到，在一些實(shí)施例中，可檢測標(biāo)記可以附接到可以并入到引物中的探針，或者可以其它方式結(jié)合到擴(kuò)增的目標(biāo)核酸(例如，可檢測核酸結(jié)合劑，如插入或非插入染料)。當(dāng)使用一個(gè)以上可檢測標(biāo)記時(shí)，每一個(gè)的光譜特性應(yīng)該不同以使得所述標(biāo)記可以彼此區(qū)分，或以使得可檢測標(biāo)記一起發(fā)射任一可檢測標(biāo)記單獨(dú)不發(fā)射的信號。示例性可檢測標(biāo)記包括例如熒光染料或熒光團(tuán)(例如，可以通過光激發(fā)以發(fā)射熒光或磷光的化學(xué)基團(tuán))、能夠猝滅來自熒光供體染料的熒光信號的“受體染料”等。尤其如將由本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員已知的，合適的可檢測標(biāo)記可包括(舉例來說)熒光素(例如，5-羧基-2,7-二氯熒光素；5-羧基熒光素(5-FAM)；5-羥基色胺(5-HAT)；6-JOE；6-羧基熒光素(6-FAM)；FITC；6-羧基-1,4-二氯-2',7'-二氯熒光素(TET)；6-羧基-1,4-二氯-2',4',5',7'-四氯熒光素(HEX)；6-羧基-4',5'-二氯-2',7'-二甲氧基熒光素(JOE)；Alex熒光團(tuán)(例如，350、405、430、488、500、514、532、546、555、568594、610、633、635、647、660、680、700、750)；熒光團(tuán)(例如，492/515、493/503、500/510、505/515、530/550、542/563、558/568、564/570、576/589、581/591、630/650-X、650/665-X、665/676、FL、FLATP、FI-神經(jīng)酰胺、R6GSE、TMR、TMR-X共軛物、TMR-X、SE、TR、TRATP、TR-XSE)，香豆素(例如，7-氨基-4-甲基香豆素、AMC、AMCA、AMCA-S、AMCA-X、ABQ、CPM甲基香豆素、香豆素毒傘素、羥基香豆素、CMFDA、甲氧基香豆素)，鈣黃綠素，鈣黃綠素AM，鈣黃綠素藍(lán)，鈣染料(例如，鈣深紅色、鈣綠色、鈣橙色、卡爾科弗盧爾(calcofluor)白色)，級聯(lián)藍(lán)，級聯(lián)黃色；CyTM染料(例如，3、3.18、3.5、5、5.18、5.5、7)，青色GFP、環(huán)狀A(yù)MP氟傳感器(FiCRhR)，熒光蛋白(例如，綠色熒光蛋白(例如GFP.EGFP)、藍(lán)色螢光蛋白(例如，BFP、EBFP、EBFP2、Azurite、mKalama1)、青色螢光蛋白(例如，ECFP、蔚藍(lán)、CyPet)、黃色螢光蛋白(例如，YFP、Citrine、Venus、YPet)、FRET供體/受體對(例如，熒光素/四甲基羅丹明、IAEDANS/熒光素、EDANS/二甲氨基偶氮苯甲酰、熒光素/熒光素、FL、熒光素/QSY7和QSY9)、和LysoSensorTM(例如，藍(lán)DND-22、藍(lán)-白DPX、黃HCK-123、綠DND-26、紅DND-99、LysoSensorTM藍(lán)DND-167、LysoSensorTM綠DND-189、LysoSensorTM綠DND-153、LysoSensorTM黃/藍(lán)DND-160、LysoSensorTM黃藍(lán)10,000MW聚葡萄糖)、俄勒岡綠(例如，488、488-X、500、514)；若丹明(例如，110、123、B、B200、BB、BG、B額外、5-羧基四甲基若丹明(5-TAMRA)、5GLD、6-羧基羅丹明6G、麗絲胺、麗絲胺若丹明B、Phallicidine、鬼筆環(huán)肽、紅、Rhod-2、ROX(6-羧基-X-若丹明)、5-ROX(羧基-X-若丹明)、磺酰羅丹明BcanC、磺酰羅丹明GExtra、TAMRA(6-羧基四甲基若丹明)、四甲基羅丹明(TRITC)、WT)、德克薩斯紅、德克薩斯紅-X、VIC和在(例如)美國專利申請公布第2009/0197254(以全文引用的方式并入本文中)號中描述其它標(biāo)記))。如本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員將已知，還可以使用其它可檢測標(biāo)記(參見，例如美國專利申請公布第2009/0197254號(以全文引用的方式并入本文中))?？梢允褂眠@些系統(tǒng)和可檢測標(biāo)記以及許多其它系統(tǒng)和可檢測標(biāo)記中的任一個(gè)來檢測擴(kuò)增的目標(biāo)核酸。一些可檢測標(biāo)記可以基于序列(在本文中也稱作“基因座特異性可檢測標(biāo)記”)，例如5'-核酸酶探針。此類探針可包含一種或多種可檢測標(biāo)記。各種可檢測標(biāo)記在本領(lǐng)域中是已知的，舉例來說(本文中所描述的探針(還參見美國專利第5,538,848號(以全文引用的方式并入本文中))各種莖環(huán)分子信標(biāo)(參見，例如美國專利第6,103,476和5,925,517號和Tyagi和Kramer，《自然·生物技術(shù)(NatureBiotechnology)》14：303-308(1996))、無莖或線性信標(biāo)(參見，例如PCT公布第WO99/21881號；美國專利第6,485,901號)、PNA分子信標(biāo)(參見，例如美國專利第6,355,421和6,593,091號)、線性PNA信標(biāo)(參見，例如Kubista等人，國際光學(xué)工程學(xué)會(SPIE)4264:53-58(2001))、無FRET探針(參見，例如美國專利第6,150,097號)、探針(美國專利第6,548,250號)、莖環(huán)和雙螺旋ScorpionsTM探針(Solinas等人，《核酸研究(NucleicAcidsResearch)》29：E96(2001)和美國專利第6,589,743號)、凸出環(huán)探測器(美國專利第6,590,091號)、偽節(jié)點(diǎn)探針(美國專利第6,589,250號)、環(huán)式(cyclicons)(美國專利第6,383,752號)、MGBEclipseTM探針(Epoch生物科學(xué))、發(fā)夾探針(美國專利第6,596,490號)、肽核酸(PNA)發(fā)光探針(Svanvik等人《分析生物化學(xué)(AnalBiochem.)》281：26-35(2001))、自組裝納米顆粒、舉例來說在以下各者中描述的二茂鐵改性的探針：美國專利第6,485,901號；Mhlanga等人，《方法(Methods)》25：463-471(2001)；Whitcombe等人，《自然·生物技術(shù)(NatureBiotechnology)》17：804-807(1999)；Isacsson等人，《分子細(xì)胞探針(MolecularCellProbes.)》14：321-328(2000)；Svanvik等人，《分析生物化學(xué)(AnalBiochem.)》281：26-35(2000)；Wolffs等人，《生物技術(shù)(Biotechniques)》766：769-771(2001)；Tsourkas等人，《核酸研究(NucleicAcidsResearch.)》30：4208-4215(2002)；Riccelli等人，《核酸研究(NucleicAcidsResearch.)》30：4088-4093(2002)；Zhang等人，《生物化學(xué)與生物物理學(xué)報(bào)(ActaBiochimicaetBiophysicaSinica)》(上海)34：329-332(2002)；Maxwell等人，《美國化學(xué)學(xué)會雜志(J.Am.Chem.Soc.)》124：9606-9612(2002)；Broude等人，《生物技術(shù)趨勢(TrendsBiotechnol.)》20：249-56(2002)；Huang等人，《化學(xué)研究·毒理(ChemRes.Toxicol.)》15：118-126(2002)；以及Yu等人，《美國化學(xué)學(xué)會雜志(J.Am.Chem.Soc.)》14：11155-11161(2001)；(www.qiagen.com),(French等人《分子細(xì)胞探針(Mol.Cell.Probes)》15：363-374(2001))，置換探針(Li等人《核酸研究(NucleicAcidsRes.)》30：e5(2002))、雜交探針(Cardullo等人《美國國家科學(xué)院院刊(Natl.Acad.Sci.USA)》85：8790-8794(1988))，MGB警報(bào)(www.nanogen.com)，Q-PNA(Fiandaca等人《基因組研究(GenomeRes.)》11：609-611(2001))、(www.Promga.com)，LUXTM引物(Nazarenko等人《核酸研究(NucleicAcidsRes.)》30：e37(2002))，DzyNA引物(Todd等人《臨床化學(xué)(Clin.Chem.)》46：625-630(2000))?？蓹z測標(biāo)記也可包含淬滅可檢測標(biāo)記熒光的無可檢測猝滅劑部分，其包括(舉例來說)黑洞猝滅劑(Biosearch)、Iowa猝滅劑(IDT)、QSY猝滅劑(分子探針)和4-二甲胺基偶氮苯-4-磺?；撬猁}/羧酸鹽和二甲氨基偶氮苯甲?；撬猁}/羧酸鹽猝滅劑(Epoch)?？蓹z測標(biāo)記還可以包含兩個(gè)探針，其中舉例來說熒光團(tuán)在一個(gè)探針上，而淬滅劑在另一個(gè)探針上，其中兩個(gè)探針在目標(biāo)上雜交在一起淬滅信號，或其中在目標(biāo)上雜交經(jīng)由改變熒光改變了信號特征。示例性系統(tǒng)還可包括PRET、水楊酸鹽/DTPA配體系統(tǒng)(參見，例如Oser等人《應(yīng)用化學(xué)英語版(Angew.Chem.Int.Engl.)》29(10)：1167(1990))置換雜交、同源探針和/或在歐洲專利第EP070685號和/或美國專利第6,238,927號中描述的分析?？蓹z測標(biāo)記還可以包含用SO3替代羧酸酯基團(tuán)的熒光素的磺酸酯衍生物，亞磷酰胺形式的熒光素、亞磷酰胺形式的Cy5(可購自Amersham的實(shí)例)。以上引用的所有參考文獻(xiàn)都在此以其全文引用的方式并入本文中。其它實(shí)施例提供了在熱循環(huán)過程期間通過將具有式I的新穎化合物包括在其中抑制聚合酶失活的方法。還提供了用于提供具有聚合酶活性的酶和至少一種具有式I的新穎化合物并且在使得穩(wěn)定所述酶的聚合酶活性使上述混合形成混合物以的方法。聚合酶可以本領(lǐng)域技術(shù)人員可獲得的任何聚合酶，包括但不限于本文中所描述的那些聚合酶。在某些實(shí)施例中，聚合酶是熱穩(wěn)定的。本文中所述的新穎化合物和方法可以用于檢測和/或定量測試樣本的各種目標(biāo)核酸。目標(biāo)核酸是設(shè)計(jì)分析系統(tǒng)來鑒別它或檢測它存在(或不存在)于測試樣本中和/或?qū)λM(jìn)行定量的任何核酸。此類核酸可以包括(舉例來說)傳染劑(例如，病毒、細(xì)菌、寄生蟲等)、疾病過程(例如癌癥、糖尿病等)或用于測量免疫反應(yīng)的那些核酸。示例示性“測試樣本”包括不同類型的樣本，例如生物樣本。示例性生物樣本包括(舉例來說)體液(例如，血、唾液、脊髓液)、組織樣本、食物(例如，肉)或飲料(例如，牛奶)產(chǎn)品等。經(jīng)表達(dá)核酸可以包括(舉例來說)其表達(dá)(或缺乏其表達(dá))與如傳染病(例如，細(xì)菌、病毒、真菌、原蟲感染)或癌癥的醫(yī)學(xué)病況相關(guān)的基因。本文中所述的方法還可以用于檢測藥物、食物或飲料產(chǎn)品中的污染物(例如，細(xì)菌、病毒、真菌和/或原蟲)。本文中所述的方法還可以用于在存在野生型等位基因的情況下檢測稀有等位基因(例如，在存在106-109個(gè)野生型等位基因情況下的一個(gè)突變體等位基因)。所述方法可用于(舉例來說)檢測微小殘留病(例如，在緩解期間的稀有殘余癌細(xì)胞，尤其是在p53基因中或先前在腫瘤內(nèi)鑒別到的其它腫瘤抑制因子基因的突變)，和/或測量突變負(fù)荷(例如，存在于正常組織(例如血液或尿液)中的特異性體細(xì)胞突變的頻率)。還提供了用于執(zhí)行本文中所述的方法的試劑盒。如本文中所用，術(shù)語“試劑盒”是指一組封裝的相關(guān)組分，通常是一種或多種化合物或組合物。所述試劑盒可包含一對用于聚合和/或擴(kuò)增樣本的至少一種目標(biāo)核酸的寡核苷酸、一種或多種新穎化合物(例如，和/或常規(guī)清潔劑，或包含上述中任一項(xiàng)的混合物)、生物催化劑(例如，DNA聚合酶)和/或?qū)?yīng)的標(biāo)記有可檢測標(biāo)記的一種或多種探針。所述試劑盒還可包括含有用于對照反應(yīng)中的預(yù)定義目標(biāo)核酸的樣本。所述試劑盒還可以任選地包括儲備溶液、緩沖液、酶、可檢測標(biāo)記或檢測所需試劑、可以用于完成擴(kuò)增反應(yīng)的管子、膜等。在一些實(shí)施例中，包括多個(gè)引物組。在一個(gè)實(shí)施例中，試劑盒可包括以下各者中的一種或多種：舉例來說，緩沖液(例如，三羥甲基氨基甲烷)、一種或多種鹽(例如，KCl)、甘油、dNTP(dA、dT、dG、dC、dU)、重組BSA(牛血清白蛋白)、染料(例如,ROX被動參考染料)、一種或多種清潔劑(例如，Dt4)、一種或多種熱啟動PCR機(jī)構(gòu)、聚乙二醇(PEG)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)和/或明膠(例如，魚或牛來源)。本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)理解，還涵蓋具體系統(tǒng)和試劑盒的其它實(shí)施例。本公開另外涉及(具有式1的)新穎化合物BrijL-23-脯胺酸：還提供了包含聚合酶(如熱穩(wěn)定聚合酶)和BrijL-23-脯胺酸的組合物。在一些實(shí)施例中，提供了包含此化合物的儲存緩沖液。舉例來說，用于酶(如熱穩(wěn)定聚合酶或逆轉(zhuǎn)錄酶)的儲存緩沖液可包含此化合物。在一些實(shí)施例中，還提供了包含儲存或反應(yīng)組合物的試劑盒，所述組合物包含聚合酶(如熱穩(wěn)定聚合酶)和BrijL-23-脯胺酸。在一些實(shí)施例中，用于提高聚合酶(如熱穩(wěn)定聚合酶)的效率的方法，所述方法包含以下步驟：將目標(biāo)核酸與至少一種聚合酶、至少一種引物、dNTP和BrijL-23-脯胺酸混合；并且擴(kuò)增所述目標(biāo)核酸。在一些實(shí)施例中，所述提高的核酸合成效率與當(dāng)聚合酶在存在NP-40和/或20的情況下替代所述化合物時(shí)的核酸合成效率相同或大于該情況下的核酸合成效率。在某些實(shí)施例中，所述化合物的有效濃度小于常規(guī)清潔劑(例如，NP-40或20)所需要有效濃度的至少約一倍至約十倍。在一些實(shí)施例中，如使用標(biāo)準(zhǔn)穩(wěn)定性測試協(xié)定(例如，如在以下實(shí)例2中)測量，BrijL-23-脯胺酸在緩沖液(例如，5X緩沖液)中穩(wěn)定至少約一個(gè)月至約三年。還提供了通過以下方式檢測樣本中目標(biāo)核酸的方法：形成反應(yīng)混合物(例如，包含至少一種聚合酶、至少一種引物、dNTP、BrijL-23-脯胺酸和可檢測標(biāo)記)、擴(kuò)增目標(biāo)核酸和檢測由可檢測標(biāo)記產(chǎn)生的信號，所述可檢測標(biāo)記指示在樣本中所述目標(biāo)核酸的存在和/或量。還提供了在熱循環(huán)過程中通過在熱循環(huán)過程期間使所述聚合酶與BrijL-23-脯胺酸接觸抑制聚合酶的失活的方法。在一些實(shí)施例中，聚合酶失活的抑制與當(dāng)聚合酶在存在NP-40和/或20的情況下替代BrijL-23-脯胺酸時(shí)的聚合酶失活的抑制相同或大于該情況下的聚合酶失活抑制。在一些實(shí)施例中，通過在一定條件下將具有聚合酶活性的酶與BrijL-23-脯胺酸合并以形成混合物以使得穩(wěn)定所述酶(例如，熱穩(wěn)定聚合酶)的所述聚合酶活性，而提供穩(wěn)定聚合酶活性的方法。在某些實(shí)施例中，提供了包含穩(wěn)定酶(如熱穩(wěn)定聚合酶)和BrijL-23-脯胺酸的組合物。在一些實(shí)施例中，提供了包含穩(wěn)定酶(如熱穩(wěn)定聚合酶)和BrijL-23-脯胺酸的儲存緩沖液。在一些實(shí)施例中，聚合酶活性的穩(wěn)定性程度與當(dāng)聚合酶在存在NP-40和/或20情況下替代BrijL-23-脯胺酸時(shí)聚合酶活性的穩(wěn)定性相同或大于該情況下的聚合酶活性的穩(wěn)定性。還提供了包含至少一種聚合酶(例如，熱穩(wěn)定聚合酶)、dNTP和BrijL-23-脯胺酸的核酸擴(kuò)增反應(yīng)混合物。還提供了通過以下方式聚合目標(biāo)核酸的方法：將目標(biāo)核酸與反應(yīng)混合物中的至少一種聚合酶(例如，熱穩(wěn)定聚合酶)和BrijL-23-脯胺酸合并；并且聚合目標(biāo)核酸。在一些實(shí)施例中，還可以通過以下方式提供用于擴(kuò)增目標(biāo)核酸的方法：將目標(biāo)核酸與作為反應(yīng)混合物(例如，另外包含dNTP和/或其它試劑)一部分的至少一種聚合酶和BrijL-23-脯胺酸合并；并且聚合目標(biāo)核酸。在某些實(shí)施例中，可以檢測目標(biāo)核酸的聚合或擴(kuò)增(例如，使用可以是(舉例來說)引物或探針一部分的可檢測標(biāo)記)。還可以定量所述目標(biāo)核酸的此類聚合和/或擴(kuò)增?？梢杂米魅绫疚乃枋龅氖纠詿岱€(wěn)定聚合酶包括(但不限于)T7DNA聚合酶、真核線粒體DNA聚合酶γ、原核DNA聚合酶I、原核DNA聚合酶II、原核DNA聚合酶III、原核DNA聚合酶IV、原核DNA聚合酶V、真核聚合酶α、真核聚合酶β、真核聚合酶γ、真核聚合酶δ、真核聚合酶ε、真核聚合酶η、真核聚合酶ζ、真核聚合酶ι、真核聚合酶κ、大腸桿菌DNA聚合酶I、大腸桿菌DNA聚合酶IIIα亞基、大腸桿菌DNA聚合酶IIIε亞基、大腸桿菌聚合酶IV、大腸桿菌聚合酶V、水生棲熱菌DNA聚合酶I、嗜熱脂肪芽孢桿菌DNA聚合酶I、廣古菌聚合酶、末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶(TdT)、釀酒酵母聚合酶4、貫穿損害合成聚合酶、逆轉(zhuǎn)錄酶、熱穩(wěn)定聚合酶、端粒酶、TaqDNA聚合酶、TfiDNA聚合酶、TflDNA聚合酶、PfuDNA聚合酶和VentTMDNA聚合酶、具有降低的3'到5'核酸外切酶活性的聚合酶、SuperScriptTMDNA聚合酶、經(jīng)基因工程化的DNA聚合酶、具有活性位點(diǎn)突變F667Y的聚合酶、具有活性位點(diǎn)F667Y等效物的聚合酶、Tth聚合酶、FS、ThermoSequenaseTM、TherminatorI、TherminatorII、TherminatorIII和/或Therminatorγ和/或其衍生物和/或其片段或其衍生物本文中提供的其它方法包括(舉例來說)用于通過用于以下來檢測樣本中目標(biāo)核酸的方法：形成包含至少一種聚合酶、至少一種引物、dNTP、BrijL-23-脯胺酸和可檢測標(biāo)記的反應(yīng)混合物；擴(kuò)增所述目標(biāo)核酸；以及檢測由所述可檢測標(biāo)記產(chǎn)生的信號，所述可檢測標(biāo)記指示所述樣本中所述目標(biāo)核酸的存在。某些方法可利用一種或多種熱啟動技術(shù)，如(舉例來說)基于寡核苷酸的系統(tǒng)、基于抗體的系統(tǒng)、基于化學(xué)的系統(tǒng)和/或這些熱啟動機(jī)構(gòu)中任何兩種或更多種的組合(例如，基于抗體和基于寡核苷酸的熱啟動一起)。還提供用于了制備BrijL-23-脯胺酸的方法，如通過活化BrijL-23以產(chǎn)生BrijL-23-甲磺酸酯；由BrijL-23-甲磺酸酯制備BrijL-23-碘化物；由BrijL-23-碘化物制備BrijL-23-脯胺酸-叔丁酯；水解BrijL-23-脯胺酸-叔丁酯以產(chǎn)生BrijL-23-脯胺酸；以及任選地中和BrijL-23-脯胺酸(使用例如)。如本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將清楚的，本文中所描述的其它實(shí)施例也涵蓋在本文中。在一些實(shí)施例中，提供了包含BrijL-23-脯胺酸的組合物。在某些實(shí)施例中，此類組合物包含以0.000001％、0.00001％、0.0001％、0.001％、0.01％、0.1％、1％、10％、15％、20％或30％的濃度的BrijL-23-脯胺酸。在一些優(yōu)選實(shí)施例中，BrijL-23-脯胺酸以0.001％至10％的濃度存在于此類組合物中。在一些更優(yōu)選的實(shí)施例中，BrijL-23-脯胺酸以.01％至1％的濃度存在于此類組合物中。為了更清楚并簡明地描述和指出本公開的主題，提供以下說明書和所附權(quán)利要求書中所用的特定術(shù)語的以下定義。在整個(gè)本說明書中，特定術(shù)語的舉例說明應(yīng)該被視為非限制性實(shí)例。除非上下文另外明確規(guī)定，否則單數(shù)形式“一”、“一個(gè)”以及“所述”包括多個(gè)指示物。如本文在整個(gè)說明書以及權(quán)利要求書中所使用的近似類語言可以應(yīng)用于修飾可以許可的方式變化而不會導(dǎo)致其相關(guān)的基本功能改變的任何定量表示。因此，由術(shù)語如“約”修飾的值不限于指定的精確值。必要時(shí)，提供了范圍并且那些范圍包括在其之間的所有子范圍。在本公開中，除非另外特別陳述，或除非如本領(lǐng)域技術(shù)人員按照本發(fā)明了解，單數(shù)為唯一功能性實(shí)施例，否則使用單數(shù)可包括復(fù)數(shù)。因此，舉例來說，“一”可意指超過一個(gè)，且“一個(gè)實(shí)施例”可意指該描述適用于多個(gè)實(shí)施例。短語“和/或”表示表明以組合和單獨(dú)、可替代的方式涵蓋特定組合的簡寫方式。應(yīng)了解，在本發(fā)明教導(dǎo)中論述的溫度、濃度、時(shí)間等之前存在暗示的“約”，使得微小并且非實(shí)質(zhì)的偏差在本文中本發(fā)明教導(dǎo)的范圍內(nèi)。另外，“包含(comprise/comprises/comprising)”、“含有(contain/contains/containing)”以及“包括(include/includes/including)”的使用并不旨在成為限制性的。應(yīng)理解，以上一般描述和詳細(xì)描述兩者僅是例示性和解釋性的并且并不限制本發(fā)明。除非在上述說明書中特別指出，否則在上述說明書中敘述“包含”各種組分的實(shí)施例還涵蓋如上述“由所述組分組成”或“主要由所述組分組成”；在說明書中敘述“由各種組分組成”的實(shí)施例還涵蓋如“包含所述組分”或“主要由所述組分組成”；并且在說明書中敘述“主要由各種組分組成”的實(shí)施例還涵蓋如“由所述組分組成”或“包含所述組分”(該互換性不適用于在權(quán)利要求中這些術(shù)語的使用)。如本文所使用，術(shù)語“核苷酸”或“核苷酸堿基”指的是核苷磷酸。其包括(但不限于)天然核苷酸、合成核苷酸、改性的核苷酸或替代物置換部分或通用類核苷酸(例如，肌核苷)。核苷磷酸可以是核苷單磷酸、核苷二磷酸或核苷三磷酸。在核苷磷酸中的糖部分中可以是戊糖(如核糖)，并且磷酸酯酯化位點(diǎn)可對應(yīng)于附接至核苷戊糖的C-5位置的羥基。核苷酸可以是(但不限于)脫氧核苷三磷酸(dNTP)或核苷三磷酸(NTP)。核苷酸可以使用字母(字母標(biāo)識)表示。舉例來說，A指示腺苷(即，含有核堿基、腺嘌呤的核苷酸)、C指示胞嘧啶、G指示鳥苷、T指示胸苷、U指示尿嘧啶并且I指示肌苷。N表示任何核苷酸(例如，N可以是A、C、G、T/U或I中的任一項(xiàng))。還可以是使用天然產(chǎn)生和合成的類似物，尤其包括(舉例來說)次黃嘌呤、2-胺基腺嘌呤、2-硫尿嘧啶、2-硫代胸腺嘧啶、5-甲基胞嘧啶、N4-甲基胞嘧啶、5,N4-乙烯基胞嘧啶、4-氨基吡唑[3,4-d]嘧啶和6-氨基-4-羥基[3,4-d]嘧啶。寡核苷酸的核苷酸單元也可具有交聯(lián)的功能(例如，烷基化劑)。如本文所使用，術(shù)語“寡核苷酸”或“多核苷酸”是指核苷的酸寡聚物或其衍生物。寡聚物可以是DNA、RNA或其類似物(例如，硫代磷酸類似物)。寡聚物還可包括改性的堿基和/或主鏈(例如，改性的磷酸鍵或改性的糖部分)。將穩(wěn)定性和/或其它優(yōu)點(diǎn)賦予寡聚物的合成的主鏈的非限制性實(shí)例可包括硫代磷酸鍵、肽核酸、鎖核酸(Singh等人《化學(xué)通訊(Chem.Commun.)》4：455-456(1998))、木糖核酸和/或其類似物。寡核苷酸可以是任何長度“n”。舉例來說,n可以是1、2、4、6、8、12、16、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40等數(shù)目的核苷酸中的任一種。多核苷酸結(jié)構(gòu)(N)n表示由n個(gè)數(shù)的核苷酸N組成的寡核苷酸(例如，(I)8表示具有序列IIIIIIII的寡核苷酸；或者(A)12表示具有序列AAAAAAAAAAAA的寡核苷酸)。其它類型的寡核苷酸或多核苷酸還可以是適于如本領(lǐng)域的技術(shù)人員由本公開將理解的用途。如本文所使用，術(shù)語“核酸”是指核苷酸或其衍生物的聚合物。如本文所使用，術(shù)語“目標(biāo)核酸”是指核酸擴(kuò)增反應(yīng)在中期望被擴(kuò)增的核酸。舉例來說，所述目標(biāo)核酸包含核酸模板。如本文所使用，術(shù)語“序列”是指寡核苷酸或核酸的核苷酸序列。在整個(gè)說明書中，不論何時(shí)寡核苷酸/核酸由一連串字母表示，核苷酸都在從左到右的5'至3'次序中。舉例來說，由序列(I)n(A)n表示，其中n＝1、2、3、4等的寡核苷酸表示其中(一個(gè)或多個(gè))5'末端核苷酸為肌苷并且(一個(gè)或多個(gè))3'末端核苷酸為腺核苷的寡核苷酸。如本文所使用，術(shù)語“反應(yīng)混合物”是指用于進(jìn)行化學(xué)分析或生物分析的試劑或試劑溶液的組合。在一些實(shí)施例中，反應(yīng)混合物包含進(jìn)行核酸(DNA)合成/擴(kuò)增反應(yīng)的所有必需組分。如上所述，此類反應(yīng)混合物可包括至少一種適合于聚合和/或擴(kuò)增所關(guān)注的核酸序列的擴(kuò)增引物對和至少一種清潔劑。如上所述，合適的反應(yīng)混合物還可包括含有執(zhí)行擴(kuò)增反應(yīng)所需要的組分(例如，通常不包括所述引物對)的“主混合物”。主混合物可以與一種或多種清潔劑合并以形成反應(yīng)混合物。如將由本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解，本文中還涵蓋了反應(yīng)混合物的其它實(shí)施例。如本文所使用，術(shù)語“試劑溶液”或“適于執(zhí)行DNA合成反應(yīng)的溶液”是指通常用于執(zhí)行擴(kuò)增反應(yīng)或DNA合成的任何或所有溶液。它們包括(但不限于)用于DNA擴(kuò)增方法的溶液、用于PCR擴(kuò)增反應(yīng)的溶液等。適于DNA合成反應(yīng)的溶液可包含緩沖液、鹽和/或核苷酸。其可另外包含引物和/或以待擴(kuò)增的DNA模板。一種或多種試劑溶液通常包括在反應(yīng)混合物或本文所描述的主混合物中。如本文所使用，術(shù)語“引物”或“引物序列”是指與目標(biāo)核酸序列(例如，以待擴(kuò)增的DNA模板)雜交以引發(fā)核酸合成反應(yīng)的短的線性寡核苷酸。所述引物可以是RNA寡核苷酸、DNA寡核苷酸或嵌合序列(例如，包含RNA和DNA)。引物可含有天然、合成或改性的核苷酸。引物長度的上限和下限憑經(jīng)驗(yàn)確定。引物長度的下限是在雜交時(shí)與目標(biāo)核酸在核酸擴(kuò)增反應(yīng)條件下形成穩(wěn)定雙螺旋所需的最低長度。極短引物(通常是小于3個(gè)核苷酸長)并不與目標(biāo)核酸在此類雜交條件下形成熱力學(xué)上穩(wěn)定的雙螺旋。上限通常是由在目標(biāo)核酸中除預(yù)定核酸序列以外的區(qū)域中形成雙螺旋的可能性來確定的。一般，合適的引物長度處于約以下各者任一項(xiàng)的范圍內(nèi)，舉例來說3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40個(gè)(等)核苷酸長。如本文所使用，“烷基”是指任選地為直鏈或支鏈的烴，并且可以是完全飽和、單或多不飽和。此外，如本文所使用的術(shù)語“烷基”另外包括在烴鏈片段的一個(gè)或多個(gè)碳原子處的一種或多種取代物。如本文所使用，“芳基”是指具有單環(huán)或多個(gè)稠合環(huán)的芳族部分，其中每個(gè)均任選地且獨(dú)立被H、鹵素、氰基、疊氮基、磺酸、堿或磺酸的銨鹽、羧酸、羧酸的生物相容性鹽、硝基、烷基、全氟烷基、烷氧基、烷硫基、氨基、單烷基氨基、二烷基氨基或烷基酰胺基取代。如本文所使用，“取代的”是指其中一個(gè)或多個(gè)氫原子被一個(gè)或多個(gè)非氫原子、官能團(tuán)或部分替換的分子。舉例來說，未被取代的氮為-NH2，而被取代的氮-NHCH3。示例性取代基包括(但不限于)鹵基(例如，氟和氯)、烷基、烯烴、炔、硫酸酯、砜、磺酸酯、氨基、銨、酰胺基、腈、烷氧基、苯氧基、芳族、苯基、多環(huán)芳族和雜環(huán)。以下實(shí)例進(jìn)一步描述某些具體實(shí)施例。這些實(shí)施例僅提供作為例子并且不旨在以任何方式限制權(quán)利要求的范圍。實(shí)例實(shí)例1新穎化合物的研發(fā)新穎化合物Dt1、Dt2、Dt3、Dt4、Dt5、Dt6、Dt7、Dt8、Dt9、D10、Dt11和Dt12使用以下所述過程1研發(fā)：其中R1、R2、R3、R4、R5和n為如上文所描述，并且X選自由以下各者組成的群組：H、CH3、CH2CH3、CH2(C6H5)和C(CH3)3。具有式I的新穎化合物可以是(舉例來說)離子型(例如，陽離子型、陰離子型、兩性離子型)。如在過程1中示出，依次將化合物A(1eq.)、甲基三苯氧基磷碘化物(4eq.)和N,N-二甲基甲酰胺(6mL)添加至50mL鋁箔覆蓋的圓底燒瓶中。然后使所述反應(yīng)在室溫下在氬氣氛圍下攪拌3天。在3天之后，使用分析LC-MS監(jiān)測反應(yīng)的進(jìn)程。中間產(chǎn)物圖案的出現(xiàn)將確認(rèn)其形成。不分離該預(yù)期的中間產(chǎn)物(中間體B)。將氨基酸酯鹽酸鹽(2eq.)和Et3N(2eq.)添加至從前述步驟中獲得的該中間產(chǎn)物中。將反應(yīng)混合物在65℃下加熱3至4天。使用分析LC-MS監(jiān)測反應(yīng)的進(jìn)程。將所述反應(yīng)混合物冷卻到室溫并且然后在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上濃縮至約2mL。所述濃縮的粗混合物通過制備型HPLC純化。將所有所期望的餾分合并并且在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上濃縮以獲得所期望的產(chǎn)物(離子型化合物Dt1、Dt3、Dt5、Dt7、Dt9、Dt11、Dt12)。然后，使用2NNaOH將該產(chǎn)物進(jìn)行水解反應(yīng)。使反應(yīng)混合物在室溫下攪拌直至如在分析LC-MS上觀察到的所有的起始物質(zhì)被耗盡，接著用中和以獲得如下文所示的最終陽離子化合物(例如，Dt1、Dt3、Dt5、Dt7、Dt9、Dt11和Dt12)、兩性離子化合物(例如，Dt2、Dt4、Dt6、Dt10)或陰離子化合物(Dt8)：以及其中n為如上文所描述的。在某些實(shí)施例中，每個(gè)n獨(dú)立為5、6、7、8、9、10、15、20、25或30。通過聚合酶測試Dt1和Dt2支持核酸擴(kuò)增的能力。在0.1％NP-40和0.1％20(對照反應(yīng))、Dt1或Dt2存在下通過使用Taq聚合酶的PCR，擴(kuò)增1kb和3kb(分別為Rhod-1043和Rhod-3637)的兩個(gè)不同核酸目標(biāo)。如圖1所示，Dt1和Dt2兩者以類似于20的方式支持所述擴(kuò)增反應(yīng)。當(dāng)Dt1以0.008％和0.0006％之間的濃度包括于50μl反應(yīng)中時(shí)，其支持1kb擴(kuò)增子(Rhod-1043)和3Kb擴(kuò)增子(Rhod-3637)的擴(kuò)增。當(dāng)Dt2以0.04％和0.0001％(在0.0008％下觀察到一些擴(kuò)增)之間的濃度包括于50μl反應(yīng)中時(shí)，其支持1kb擴(kuò)增子(Rhod-1043)和3kb擴(kuò)增子(Rhod-3637)的擴(kuò)增。還使用視紫質(zhì)基因引物測試Dt1以擴(kuò)增約4Kb擴(kuò)增子(Rhod-3920、Rhod-4181和Rhod-4089)(圖2；“儲存B”：20mMTris-HCl(pH8.0)、0.1mMEDTA、50％甘油、1mMDTT、蒸餾水)。PCR條件是94℃下兩分鐘；94℃下15秒、60℃下30秒、72℃下4分鐘30秒進(jìn)行35次循環(huán)；并且在72℃下延長十分鐘。當(dāng)Dt1以0.008％和0.001％之間的濃度包括于50μl反應(yīng)中時(shí)，其支持Rhod-3920和Rhod-4181的擴(kuò)增。當(dāng)Dt1以0.008％和0.001％之間的濃度包括于50μl反應(yīng)中時(shí)，其支持Rhod-4089的擴(kuò)增。圖3示出，在擴(kuò)增0.1Kb至1Kb擴(kuò)增子中0.004％Dt1和0.002％Dt1與0.004％20相當(dāng)。圖4示出，在擴(kuò)增1-2kb擴(kuò)增子中0.004％Dt1和0.002％Dt1與0.004％20相當(dāng)。圖5提供在Brij-58和Dt1之間的比較。如其中所示，Dt1(0.04％至0.006％)以類似于Brij-58(0.04％至0.0004％)或20(0.002％)的方式支持?jǐn)U增。數(shù)據(jù)表明，這不是由于用于改性的Brij-58起始物質(zhì)的污染。圖6比較Dt1和Dt2的活性。如其中所示，兩個(gè)改性的化合物支持?jǐn)U增。當(dāng)Dt1以在0.04％至0.001％之間的濃度包括于反應(yīng)混合物中時(shí)，其被示出支持?jǐn)U增。當(dāng)Dt2以0.04％至0.006％之間的濃度包括于反應(yīng)混合物中時(shí)，其被示出支持?jǐn)U增。圖7和圖8提供在擴(kuò)增四個(gè)不同目標(biāo)(B2M、GAPDH、RPLPO和GUSB)中在Dt4和20之間的比較。如其中所示，在0.01％Dt4或0.01％20存在下的擴(kuò)增提供類似的結(jié)果。圖9提供在擴(kuò)增各種不同的目標(biāo)中在Dt4和20之間的比較。如其中所示，在Dt4或20存在下的擴(kuò)增提供類似的結(jié)果，圖10示出在Dt1、Dt3、Dt5、Dt6和Dt7存在下擴(kuò)增的結(jié)果。如其中所示，盡管在這些實(shí)驗(yàn)的反應(yīng)條件下，由以最高含量的每種清潔劑，由Dt4接著由Dt1支持?jǐn)U增。Dt5和Dt7展現(xiàn)出類似的活性，接著是Dt6。圖11至圖15示出在擴(kuò)增HPRT1或PPIA中比較Dt4與Brij-58和20在各種濃度下的活性的擴(kuò)增曲線圖。如其中所示，在所有濃度測試(0.001％至0.0001％)中Dt4以類似于Brij-58和20兩者的方式支持所述擴(kuò)增反應(yīng)。圖16至圖18示出，在各種反應(yīng)中Dt4可以在比20更低的濃度下使用(例如，相比于0.01％20的0.002％Dt4)。圖19和圖20展現(xiàn)，Dt4在“5X”緩沖液(三羥甲基氨基甲烷(pH8.0)、KCl和BSA)中穩(wěn)定(例如，Dt4保持其支持?jǐn)U增的能力)至少兩個(gè)月。圖21和圖22提供相比于20，兩個(gè)Dt4不同批次支持各種目標(biāo)擴(kuò)增的能力的比較圖23示出，Dt4在各種分析中支持?jǐn)U增。實(shí)例2BrijL-23-脯胺酸的研發(fā)和使用以下示出另一種具有式I化合物：可以使用如下文所示的制備BrijL-23-脯胺酸過程2：簡言之，過程2的步驟一包括活化BrijL-23，對所述BrijL-23-甲磺酸酯進(jìn)行后處理并且使其干燥過夜。在步驟2中，形成BrijL-23-碘化物，對其后處理并干燥過夜。步驟3在過夜反應(yīng)中形成胺，接著純化所述產(chǎn)物、匯集含有所述產(chǎn)物的餾分、使用旋轉(zhuǎn)式蒸發(fā)儀蒸發(fā)并且干燥過夜。然后，用HCl對BrijL-23-脯胺酸-叔丁酯進(jìn)行水解約八小時(shí)。使用旋轉(zhuǎn)式蒸發(fā)儀蒸發(fā)并且干燥過夜，得到最終新穎化合物BrijL-23-脯胺酸。對BrijL-23-脯胺酸執(zhí)行加速的和實(shí)時(shí)穩(wěn)定性測試。BrijL-23-脯胺酸儲存在-20℃下。在42℃和24℃(環(huán)境溫度)下進(jìn)行加速老化穩(wěn)定性研究。使用修正的阿倫尼斯(Arrhenius)方程獲得的加速老化時(shí)間轉(zhuǎn)化率結(jié)果示出在表2：表2溫度T1T2T3T4T5T6T7T8-20℃3個(gè)月6個(gè)月9個(gè)月12個(gè)月15個(gè)月18個(gè)月21個(gè)月24個(gè)月-24℃4.3天8.5天12.8天17.7天21.3天25.6天29.8天34.1天-42℃1天2天3天4天5天6天7天8天*T0＝在-20℃下第0天的樣本不同批次的BrijL-23-脯胺酸(2次試驗(yàn))產(chǎn)物用于加速老化穩(wěn)定性測試。在避光的玻璃瓶中在指定溫度(24℃和42℃)下培育材料。對于24℃的取樣點(diǎn)，將每個(gè)中試批次的一個(gè)試劑瓶從培育箱中取出并且將試管立即儲存于-20℃冰箱中。在收集所有24℃的抽樣時(shí)間點(diǎn)(T1-T8)之后，通過LCMSQC方法檢查在樣本轉(zhuǎn)化成液體溶液之后的所有加速老化樣本(24℃和42℃)。所述24℃研究進(jìn)行七周。結(jié)果呈現(xiàn)在表3中。實(shí)時(shí)穩(wěn)定性測試的結(jié)果呈現(xiàn)在表4中。表3加速穩(wěn)定性測試*＊批次量方法在溶液中的百分比溶液的透明度110mgLCMS，Lyoph5％透明2227mgLCMS，Lyoph20％透明3146mgLCMS，Lyoph20％透明41gLCMS，Lyoph20％透明5629mgBiotage，Lyoph10％透明61gBiotage，pump-contact10％透明表4實(shí)時(shí)PCR穩(wěn)定性測試*＊＊***rTaq或PlatinumTaq在新穎清潔劑BrijL-23-脯胺酸中配制，在-20℃下儲存四個(gè)月并且測試儲存緩沖液的功能和透明度。根據(jù)加速和實(shí)時(shí)穩(wěn)定性測試兩者，BrijL-23-脯胺酸被發(fā)現(xiàn)不沉淀并且維持其化學(xué)特性。通過聚合酶測試BrijL-23-脯胺酸支持核酸擴(kuò)增的能力。在0.1％NP-40和0.1％20(對照反應(yīng))或BrijL-23-脯胺酸(2μl清潔劑/50μl反應(yīng)，35個(gè)循環(huán))存在下，通過使用Taq聚合酶的PCR擴(kuò)增四十四個(gè)核酸目標(biāo)。如圖24所示，BrijL-23-脯胺酸以類似于在20中配制的市售PlatinumTaq和PlatinumTaq的方式支持44個(gè)不同的擴(kuò)增反應(yīng)。還測試了PlatinumTaq和在BrijL-23-脯胺酸或20中配制的rTaq的靈敏度(50ng、5ng、500pg的1.2kb擴(kuò)增子；使用1μl聚合酶的50μl反應(yīng))。如圖25所示，配制物的靈敏度等效于1.2kb擴(kuò)增子。還比較了750bpPCR產(chǎn)物的TOPO-TA克隆，所述PCR產(chǎn)物使用市售的PlatinumTaq(1)、市售rTaq(A)、在新穎清潔劑BrijL-23-脯胺酸中配制的PlatinumTaq(2)、在新穎清潔劑BrijL-23-脯胺酸中配制的rTaq(B)、在20中配制的PlatinumTaq(3)或在20中配制的Taq(C)擴(kuò)增。如圖26所示，在不同組合物中觀察到等效的克隆性能。在公開內(nèi)列舉的所有參考文獻(xiàn)均以全文引用的方式并入本文中。雖然已經(jīng)就優(yōu)選實(shí)施例描述于了某些實(shí)施例，但應(yīng)理解的是對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員將對其進(jìn)行變化及修改。因此，希望所附權(quán)利要求書覆蓋落入以下權(quán)利要求書范圍內(nèi)的所有此類等效變化。當(dāng)前第1頁1 2 3