本發(fā)明涉及生物化學(xué)檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種芴基水楊醛聯(lián)肼類衍生物及其制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

隨著國(guó)家經(jīng)濟(jì)的快速發(fā)展和人民生活水平的不斷提高，個(gè)人身體健康的實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)、疾病的預(yù)防和治療逐漸成為人們更加關(guān)注的民生問題。相對(duì)于傳統(tǒng)的體外化學(xué)檢驗(yàn)的延遲性和放射線在線檢測(cè)的危害性，熒光在線顯像技術(shù)以其高效、綠色、實(shí)時(shí)性強(qiáng)的優(yōu)勢(shì)漸漸走入人們的視野，被廣泛應(yīng)用于細(xì)胞免疫學(xué)、微生物學(xué)、分子生物學(xué)、遺傳學(xué)、神經(jīng)生物學(xué)、病理學(xué)、腫瘤學(xué)、臨床檢驗(yàn)學(xué)、醫(yī)學(xué)、植物學(xué)等方面的科研和民生等領(lǐng)域。

熒光顯像技術(shù)的關(guān)鍵技術(shù)就是熒光物質(zhì)作為標(biāo)記探針(或染色劑)的選擇。理想的探針分子通過物理或化學(xué)作用，特異性吸附在特定的細(xì)胞和組織上，在低能量光學(xué)輻照下實(shí)現(xiàn)二維或三維的成像，通過與熒光顏色、強(qiáng)度和分布情況來判斷細(xì)胞或組織的健康情況。與普通的化學(xué)染色相比，熒光染色的靈敏度要高出100-1000倍，而且通過適當(dāng)?shù)墓δ苄揎椉纯蓪?shí)現(xiàn)對(duì)活體的在線分析。

脂滴是細(xì)胞內(nèi)中性脂的主要貯存場(chǎng)所，廣泛存在于細(xì)菌、酵母、植物、昆蟲以及動(dòng)物細(xì)胞中。脂滴的大小差別很大，直徑從40nm至100um不等。在醫(yī)療、健康領(lǐng)域，脂滴一直被認(rèn)為是一種類似于糖原的顆粒，只是用來貯存能量，當(dāng)細(xì)胞需要能量時(shí)，用來供給能量，是一個(gè)“惰性”的細(xì)胞內(nèi)含物，因而脂滴在很長(zhǎng)一段時(shí)間內(nèi)并未受到人們的重視。但是，最新的研究表明，脂滴并非細(xì)胞內(nèi)一個(gè)簡(jiǎn)單的能量貯存器，而是一個(gè)復(fù)雜、活動(dòng)旺盛、動(dòng)態(tài) 變化的多功能細(xì)胞器。脂滴能夠沿著細(xì)胞骨架運(yùn)動(dòng)，并與其它細(xì)胞器相互作用，可能在脂類代謝與存儲(chǔ)、膜轉(zhuǎn)運(yùn)、蛋白降解，以及信號(hào)傳導(dǎo)過程中起著重要的作用。另外，研究還表明，多種代謝性疾病，如肥胖、脂肪肝、心血管疾病及糖尿病、中性脂貯存性疾病和Niemann Pick C疾病，往往都伴隨著脂質(zhì)貯存的異常。因此，關(guān)于脂滴的生物學(xué)研究日益受到人們的重視。

除了在健康領(lǐng)域的應(yīng)用外，高脂滴含量低等植物的篩選在解決能源危機(jī)領(lǐng)域，逐步受到關(guān)注。在大部分海洋生物，如數(shù)億萬(wàn)計(jì)的藻類體內(nèi)也含有大量的脂滴結(jié)構(gòu)，其結(jié)構(gòu)與應(yīng)用類似于“石油”，如果將其進(jìn)行規(guī)?；鲞x育，將很容易地、快速地實(shí)現(xiàn)將自然界的無(wú)機(jī)能源轉(zhuǎn)化為有機(jī)產(chǎn)物，這在解決日益鄰近的能源危機(jī)上具有極其重要的意義。如何篩選出脂滴含量較高的藻類進(jìn)行培育，也是目前相關(guān)研究人員更加關(guān)注的問題。

分子熒光探針，作為人類較為成熟研究微觀世界的有效工具，也逐步被應(yīng)用在細(xì)胞細(xì)胞脂滴的結(jié)構(gòu)與生理過程研究。利用暗場(chǎng)下，探針分子對(duì)細(xì)胞亞結(jié)構(gòu)的特異性的識(shí)別能力和熒光性質(zhì)，直觀地觀測(cè)到各種生理活動(dòng)和過程中脂滴形貌、運(yùn)動(dòng)和分解等過程。

從結(jié)構(gòu)上分析，脂滴由磷脂單分子層及中性脂構(gòu)成的疏水核心構(gòu)成，并且表面分布有很多蛋白。相對(duì)于細(xì)胞內(nèi)大部分親水的環(huán)境而言，脂滴是相對(duì)較為疏水的油性區(qū)域，所以，很多脂溶性的熒光探針都可以對(duì)細(xì)胞脂滴進(jìn)行標(biāo)記和研究。但是，此類探針必須滿足三個(gè)基本條件，才能成為與目前成熟的脂滴研究相比較。第一，該類熒光探針是否可以自由出入細(xì)胞：雖然納米級(jí)別的包覆技術(shù)減少了對(duì)探針結(jié)構(gòu)的選擇性，但是大規(guī)模應(yīng)用下的成本升高也是個(gè)值得關(guān)注的問題，所以，自身能夠進(jìn)出的細(xì)胞的探針結(jié)構(gòu)顯得更具優(yōu)勢(shì)；第二，熒光探針的選擇性：并不是所有脂溶性探針都可以對(duì)脂滴進(jìn)行識(shí)別，這可能與脂滴核心外有一層單層磷脂分子及各種蛋白結(jié)構(gòu)有關(guān)；第三，熒光探針的開關(guān)比調(diào)節(jié)：大部分性能優(yōu)異的熒光探針都是采用“點(diǎn)亮”對(duì)脂滴客體進(jìn)行標(biāo)記的，而脂滴處的有機(jī)探針富集通常會(huì)造成熒光強(qiáng)度的衰減，從而很難實(shí)現(xiàn)高分辨的成像。其中，第三點(diǎn)成為困擾該 類探針發(fā)展的主要問題。

2001年，唐本忠院士基于其發(fā)現(xiàn)的1-甲基-1,2,3,4,5-五苯基噻咯(MPPS)在乙腈溶液中不發(fā)光，而在聚集后而產(chǎn)生強(qiáng)烈的熒光的“反?！爆F(xiàn)象，提出“聚集誘導(dǎo)發(fā)光(AIE)”的新觀念，通過“分子內(nèi)旋轉(zhuǎn)受限(RIR)”的工作機(jī)理是很好的解釋了這種現(xiàn)象產(chǎn)生的，而且已得到諸多實(shí)驗(yàn)結(jié)果和理論計(jì)算的支持，發(fā)展了一個(gè)貼有“中國(guó)牌”的、具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的材料和理論體系。AIE類材料解決了傳統(tǒng)的芳香環(huán)熒光生色團(tuán)在水溶性溶劑中聚集猝滅熒光問題，在生理緩沖溶液或水介質(zhì)中能夠?qū)崿F(xiàn)高亮度的熒光成像和示蹤，與背景中的不發(fā)光或弱發(fā)光單分子實(shí)現(xiàn)高分辨率的區(qū)分，很好的定位在目標(biāo)生物大分子。這種AIE熒光探針的“點(diǎn)亮(light-up)”模式為高靈敏度、對(duì)比度的生物研究提供了可能，在生物學(xué)、醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域具有劃時(shí)代的意義?；谶@類分子的設(shè)計(jì)理念，大量的“脂滴型”熒光分子探針被制備和發(fā)展起來，并表現(xiàn)的一定商用潛質(zhì)。但是，這些探針都有一個(gè)顯著的不足，就是在脂滴中的熒光行為(熒光主峰位或發(fā)光顏色)與探針在固態(tài)下的情況存在明顯差異，熒光位移很大。因?yàn)楹茈y估計(jì)發(fā)光顏色的變化幅度，就會(huì)導(dǎo)致此類結(jié)構(gòu)很難對(duì)復(fù)雜的體系和過程進(jìn)行熒光染色及標(biāo)記，無(wú)法滿足生物體系中更高的要求。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種芴基水楊醛聯(lián)肼類衍生物及其制備方法和應(yīng)用，解決現(xiàn)有技術(shù)中在脂滴中的熒光行為(熒光主峰位或發(fā)光顏色)與探針在固態(tài)下的情況存在明顯差異、熒光位移很大的問題。

本發(fā)明解決技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案是：一種芴基水楊醛聯(lián)肼類衍生物，其結(jié)構(gòu)通式如下：

其中Ar表示芳香基團(tuán)或其衍生結(jié)構(gòu)，取代基R₁～R₈分別選自氫、烷基、羥基、烷氧基、硝基、氰基、氨基、巰基、鹵素原子、苯基、甲苯基、萘基、呋喃基、噻吩基、吡咯基、吡啶基、吡喃基、喹啉基、吲哚基、羧酸或羧酸衍生物、咔唑基或苯胺基中的一種，烷基和烷氧基的碳原子數(shù)分別為1～12。

在本發(fā)明的芴基水楊醛聯(lián)肼類衍生物中，所述取代基R₁～R₈分別均為氫，Ar結(jié)構(gòu)為苯環(huán)或苯環(huán)衍生物，其優(yōu)選化合物結(jié)構(gòu)式為：

其中，A₁～A₄分別選自氫、烷基、羥基、烷氧基、硝基、氰基、氨基、巰基、鹵素原子、苯基、甲苯基、萘基、呋喃基、噻吩基、吡咯基、吡啶基、吡喃基、喹啉基、吲哚基、羧酸或羧酸衍生物、咔唑基或苯胺基中的一種，烷基和烷氧基的碳原子數(shù)分別為1～12。

在本發(fā)明的芴基水楊醛聯(lián)肼類衍生物中，所述取代基R₁～R₈分別均為氫，Ar結(jié)構(gòu)為萘環(huán)、蒽環(huán)、菲環(huán)或萘環(huán)、蒽環(huán)、菲環(huán)的衍生物，其優(yōu)選化合物結(jié)構(gòu)式為：

其中，B₁～B₈分別選自氫、烷基、羥基、烷氧基、硝基、氰基、氨基、巰基、鹵素原子、苯基、甲苯基、萘基、呋喃基、噻吩基、吡咯基、吡啶基、吡喃基、喹啉基、吲哚基、羧酸或羧酸衍生物、咔唑基或苯胺基中的一種，烷基和烷氧基的碳原子數(shù)分別為1～12。

在本發(fā)明的芴基水楊醛聯(lián)肼類衍生物中，所述取代基R₁～R₈分別均為氫，Ar結(jié)構(gòu)為呋喃、噻吩、吡咯、吡啶、吡喃、喹啉、吲哚、咔唑、苯胺基或嘧啶基，或者Ar結(jié)構(gòu)為呋喃、噻吩、吡咯、吡啶、吡喃、喹啉、吲哚、咔唑、苯胺基或嘧啶基的衍生物，其優(yōu)選化合物結(jié)構(gòu)為：

在本發(fā)明的芴基水楊醛聯(lián)肼類衍生物中，所述取代基R₁～R₈分別均為氫，Ar結(jié)構(gòu)為苯基乙烯結(jié)構(gòu)或苯基乙烯結(jié)構(gòu)的衍生物，其優(yōu)選化合物結(jié)構(gòu) 為：

在本發(fā)明的芴基水楊醛聯(lián)肼類衍生物中，Ar結(jié)構(gòu)為苯環(huán)結(jié)構(gòu)或苯環(huán)衍生物，所述取代基R₁～R₈中至少一取代基選自烷基、羥基、烷氧基、硝基、氰基、氨基、巰基、鹵素原子、苯基、甲苯基、萘基、呋喃基、噻吩基、吡咯基、吡啶基、吡喃基、喹啉基、吲哚基、羧酸或羧酸衍生物、咔唑基或苯胺基中的一種，烷基和烷氧基的碳原子數(shù)分別為1～12；

其優(yōu)選化合物結(jié)構(gòu)為：

在本發(fā)明的芴基水楊醛聯(lián)肼類衍生物中，Ar結(jié)構(gòu)為苯基乙烯結(jié)構(gòu)或苯基乙烯結(jié)構(gòu)的衍生物，所述取代基R₁～R₈中至少一取代基選自烷基、羥基、 烷氧基、硝基、氰基、氨基、巰基、鹵素原子、苯基、甲苯基、萘基、呋喃基、噻吩基、吡咯基、吡啶基、吡喃基、喹啉基、吲哚基、羧酸或羧酸衍生物、咔唑基或苯胺基中的一種，烷基和烷氧基的碳原子數(shù)分別為1～12；

上述化合物結(jié)構(gòu)式中，其中R₁～R₈、A₁～A₈、B₁～B₈以及R的優(yōu)選結(jié)構(gòu)可以為下圖中所示29種中的一種或氫原子：

-CH₃、

本發(fā)明還提供一種芴基水楊醛聯(lián)肼類衍生物的制備方法，包括如下步 驟：

A、將芴酮或芴酮衍生物與水合肼在第一反應(yīng)溶劑中加熱至20℃～150℃，反應(yīng)1小時(shí)～24小時(shí)，然后冷卻至室溫，去除溶劑后析出晶體或粉末，進(jìn)行重結(jié)晶后得到中間體聯(lián)肼；其中優(yōu)選加熱至45℃～90℃，反應(yīng)6小時(shí)～12小時(shí)，重結(jié)晶所用溶劑優(yōu)選四氫呋喃、乙醇、甲苯、DMF等，最優(yōu)選為乙醇；

B、將中間體聯(lián)肼與對(duì)應(yīng)的芳基水楊醛結(jié)構(gòu)化合物在第二反應(yīng)溶劑中加熱至20℃～150℃，反應(yīng)1小時(shí)～24小時(shí)，然后冷卻至室溫，去除溶劑后析出晶體或粉末，通過柱層析或重結(jié)晶得到芴基水楊醛聯(lián)肼類衍生物；其中優(yōu)選加熱至30℃～90℃，反應(yīng)6小時(shí)～12小時(shí)，重結(jié)晶所用溶劑優(yōu)選四氫呋喃、乙醇、甲苯、DMF等，最優(yōu)選為乙醇。

在本發(fā)明的制備方法中，在步驟A中的第一反應(yīng)溶劑和步驟B中的第二反應(yīng)溶劑選自甲醇、乙醇、乙酸、四氫呋喃、甲苯、苯、氯仿、二氯甲烷、N,N-二甲基甲酰胺(DMF)，N,N-二甲基乙酰胺(DMAC)和N-甲基吡咯烷酮(NMP)中的任意一種溶劑或任意幾種形成的混合溶劑；第一反應(yīng)溶劑和第二反應(yīng)溶劑分別優(yōu)選為乙醇或乙醇與其它溶劑形成的混合溶劑。

本發(fā)明的芴基水楊醛聯(lián)肼類衍生物可以作為制備細(xì)胞內(nèi)特異性脂滴染色的熒光探針的應(yīng)用，該熒光探針主要應(yīng)用于在體內(nèi)、體外及海洋中低等生物脂肪含量的測(cè)定方面以及用于病理和藥物療效研究等方面。

實(shí)施本發(fā)明的芴基水楊醛聯(lián)肼類衍生物及其制備方法和應(yīng)用，具有以下有益效果：該類化合物可以自由進(jìn)出細(xì)胞并特異性的在細(xì)胞內(nèi)脂滴處富集，由原來的無(wú)熒光變?yōu)閺?qiáng)烈熒光，同時(shí)在分子內(nèi)激發(fā)態(tài)質(zhì)子轉(zhuǎn)移機(jī)制(ESIPT)的作用下，展現(xiàn)了較大的斯托克斯位移，表現(xiàn)為黃色、橙紅或紅色熒光，同生物體外的固態(tài)熒光相比，基本沒有位移，可以準(zhǔn)確的判斷探針定域位置，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞脂滴結(jié)構(gòu)、行為和生理過程的監(jiān)測(cè)，在生物、醫(yī)療、健康和能源領(lǐng)域，具有極其廣闊的應(yīng)用前景。

具體為：

(1)選擇聯(lián)肼結(jié)構(gòu)作為共軛橋聯(lián)基元，一方面利用單雙鍵交替的形式保持探針分子的共軛程度，另一方面N原子的孤對(duì)電子具有較小的空間位阻，使其能夠在一定程度上自由轉(zhuǎn)動(dòng)從調(diào)節(jié)空間體積，保證其能容易直接透過細(xì)胞膜，對(duì)細(xì)胞內(nèi)亞結(jié)構(gòu)進(jìn)行選擇；

(2)外圍的共軛結(jié)構(gòu)中引入芴基的五元環(huán)結(jié)構(gòu)，使其吸電子能力增加，拓展光譜向波長(zhǎng)更長(zhǎng)的方向移動(dòng)，以便應(yīng)用于活體檢測(cè)；

(3)在聯(lián)肼兩端引入酚羥基結(jié)構(gòu)，與N的孤對(duì)電子形成ESIPT態(tài)(激發(fā)態(tài)下分子內(nèi)的質(zhì)子轉(zhuǎn)移)，有效的增加斯托克斯位移，防止分子的自吸收現(xiàn)象，并賦予分子顯著的AIE性能；酚羥基的水溶性也能夠顯著調(diào)節(jié)分子的脂水分配系數(shù)，從而增加探針直接透過細(xì)胞的幾率；

(4)由于分子獨(dú)特的剛性結(jié)構(gòu)導(dǎo)致熒光探針在脂滴內(nèi)的熒光情況與固體相似，便于在復(fù)雜體系內(nèi)實(shí)現(xiàn)指認(rèn)和定量分析。

附圖說明

圖1A為芴基水楊醛聯(lián)肼(FAS)在不同溶劑中的溶劑化效應(yīng)和聚集誘導(dǎo)發(fā)光效應(yīng)；

圖1B為FAS在不同含水量的四氫呋喃溶液中的溶劑化效應(yīng)和聚集誘導(dǎo)發(fā)光效應(yīng)；

圖2A為FAS細(xì)胞染色的明場(chǎng)照片；

圖2B為FAS細(xì)胞染色的熒光照片；

圖3為FAS在Hela細(xì)胞中熒光染色中濃度優(yōu)化實(shí)驗(yàn)照片；

圖4為FAS在Hela細(xì)胞中熒光染色中指定濃度下的時(shí)間優(yōu)化實(shí)驗(yàn)照片。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合附圖和實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明的芴基水楊醛聯(lián)肼類衍生物及其制 備方法和應(yīng)用作進(jìn)一步說明：

本發(fā)明提供一種芴基水楊醛聯(lián)肼類衍生物，其結(jié)構(gòu)通式如下：

其中Ar表示芳香基團(tuán)或其衍生結(jié)構(gòu)，取代基R₁～R₈分別選自氫、烷基、羥基、烷氧基、硝基、氰基、氨基、巰基、鹵素原子、苯基、甲苯基、萘基、呋喃基、噻吩基、吡咯基、吡啶基、吡喃基、喹啉基、吲哚基、羧酸或羧酸衍生物、咔唑基或苯胺基中的一種，烷基和烷氧基的碳原子數(shù)分別為1～12。

具體合成過程：

(1)

將芴酮結(jié)構(gòu)制備得到帶有取代基結(jié)構(gòu)的芴酮衍生物。

(2)

將芴酮或步驟(1)的產(chǎn)物芴酮衍生物采用適當(dāng)?shù)娜軇┖蜏囟戎苽渲匾? 的中間體產(chǎn)物芴基聯(lián)肼。

具體操作：將適量的芴酮或芴酮衍生物與水合肼在第一反應(yīng)溶劑中加熱至適當(dāng)溫度，反應(yīng)一段時(shí)間后冷卻至室溫，去除掉大部分溶劑后析出晶體或粉末，重結(jié)晶后即得到中間體聯(lián)肼，產(chǎn)率>90％，純度>95％。其中，第一反應(yīng)溶劑優(yōu)選選自甲醇、乙醇、乙酸、四氫呋喃、甲苯、苯、氯仿、二氯甲烷、N,N-二甲基甲酰胺(DMF)，N,N-二甲基乙酰胺(DMAC)和N-甲基吡咯烷酮(NMP)中的一種或幾種形成的混合溶劑，最優(yōu)選乙醇及其與其它溶劑的混合體系；加熱至的適當(dāng)溫度優(yōu)選20℃至150℃，其中最優(yōu)選為45℃至90℃；反應(yīng)時(shí)間優(yōu)選1小時(shí)至24小時(shí)，其中最優(yōu)選6小時(shí)至12小時(shí)；重結(jié)晶所用溶劑優(yōu)選四氫呋喃、乙醇、甲苯、DMF等，最優(yōu)選乙醇。

(3)

將步驟(2)中得到的中間體聯(lián)肼，即芴基水合肼，與對(duì)應(yīng)的芳基水楊醛結(jié)構(gòu)反應(yīng)制備目標(biāo)化合物。

具體操作：將適量的中間體聯(lián)肼與對(duì)應(yīng)的芳基水楊醛結(jié)構(gòu)在第二反應(yīng)溶劑中加熱至適當(dāng)溫度，反應(yīng)一段時(shí)間后冷卻至室溫，處理掉大部分溶劑后析出晶體或粉末，柱層析或重結(jié)晶后即得到目標(biāo)產(chǎn)物。其中，第二反應(yīng)溶劑優(yōu)選選自甲醇、乙醇、乙酸、四氫呋喃、甲苯、苯、氯仿、二氯甲烷、N,N-二甲基甲酰胺(DMF)，N,N-二甲基乙酰胺(DMAC)和N-甲基吡咯烷酮(NMP)中的一種或幾種形成的混合溶劑，最優(yōu)選乙醇及其與其它溶劑的混合體系；加熱至的適當(dāng)溫度優(yōu)選20℃至150℃，其中最優(yōu)選為30℃至90℃；反應(yīng)時(shí)間優(yōu)選1小時(shí)至24小時(shí)，其中最優(yōu)選6小時(shí)至12小時(shí)； 重結(jié)晶所用溶劑優(yōu)選四氫呋喃、乙醇、甲苯、DMF等，最優(yōu)選乙醇。

實(shí)施例1：芴基水楊醛聯(lián)肼的合成(FAS)

將10g芴酮與20ml水合肼(85％)在100ml下回流4h，冷卻后有大量針狀固體析出，過濾后用乙醇重結(jié)晶2次，得到淡黃色針裝晶體，純度99％，產(chǎn)率95％；取2g水合肼晶體與2ml水楊醛在20ml乙醇中回流4h，冷卻后得到淡黃色針裝晶體，過濾后，用75％的乙醇溶液清洗，得到FAS結(jié)構(gòu)，產(chǎn)率99％。MALDI-TOF(m/z):[M+]calcd.C₂₀H₁₄N₂O,298.34；found,299.34.Anal Calc.for C₂₀H₁₄N₂O:C,80.52；H,4.73；N,9.39；O,5.36.Found:C,80.62；H,4.71；N,9.19；O,5.36。

實(shí)施例2：FAS衍生物的合成(1)

取500mg水合肼晶體與等摩爾的間羥基水楊醛(或間溴代水楊醛)衍生物在10ml乙醇中60℃反應(yīng)4h，冷卻后得到淡黃色晶體，過濾后，用75％的乙醇溶液清洗，得到產(chǎn)品層析得到對(duì)應(yīng)的FAS衍生結(jié)構(gòu)，產(chǎn)率>90％。

m-FAS-OH：MALDI-TOF(m/z):[M+]calcd.C₂₀H₁₄N₂O₂,314.34；found,315.24.Anal Calc.for C₂₀H₁₄N₂O₂:C,76.42；H,4.49；N,8.91；O,10.18.Found:C,75.32；H,4.48；N,8.35；O,10.09。

p-FAS-Br：MALDI-TOF(m/z):[M+]calcd.C₂₀H₁₃BrN₂O,377.23；found,299.34.Anal Calc.for C₂₀H₁₃BrN₂O:C,63.68；H,3.47；Br,21.18；N,7.43；O,4.24.Found:C,63.58；H,3.40；N,7.42；O,4.19。

實(shí)施例3：FAS衍生物的合成(2)

取500mg水合肼晶體與等摩爾的N,N-二乙基氨基水楊醛在10ml乙醇中60℃反應(yīng)4h，冷卻后得到紅色油狀物，過濾后，用75％的乙醇溶液清洗，得到產(chǎn)品層析得到對(duì)應(yīng)的FAS衍生結(jié)構(gòu)，產(chǎn)率為85％。

p-FAS-N22：MALDI-TOF(m/z):[M+]calcd.C₂₄H₂₃N₃O:369.18；found,370.66；Anal Calc.for C₂₄H₂₃N₃O:C,78.02；H,6.27；N,11.37；O,4.33.found,C,77.93；H,6.10；N,11.25；O,4.45。

實(shí)施例4：芴基-四苯乙烯類水楊醛聯(lián)肼的制備(TPE-FAS)

采用Sizuki偶聯(lián)得到四苯乙烯基水楊醛衍生物結(jié)構(gòu)后，取500mg水合肼晶體與之在10ml乙醇中60℃反應(yīng)4h，冷卻后得到淡黃色粉末，過濾后，用75％的乙醇溶液清洗，得到產(chǎn)品層析得到對(duì)應(yīng)的FAS衍生結(jié)構(gòu)，產(chǎn)率為85％。

m-TPE-FAS:MALDI-TOF(m/z):[M+]calcd.C₄₀H₂₈N₂O:552.22；found,553.28；Anal Calc.for C₄₀H₂₈N₂O:C,86.93；H,5.11；N,5.07；O,2.89；found,C,86.87；H,5.01；N,5.08；O,2.79。

實(shí)施例5：芴基水楊醛聯(lián)肼FAS的光學(xué)性質(zhì)及其在在脂滴染色方面的 應(yīng)用

(a)FAS的基本光學(xué)性質(zhì)：如圖1A所示為FAS在不同極性下的熒光光譜，隨著極性的變化，F(xiàn)AS的醇式發(fā)射(450nm附近)和酮式發(fā)射(600nm附近)的比例發(fā)生明顯變化，為典型的ESIPT發(fā)射。而對(duì)于ESIPT分子，聚集態(tài)多為酮式發(fā)射，所以我們檢測(cè)了該處的聚集發(fā)光現(xiàn)象。如圖1B所示，向FAS的四氫呋喃溶劑中(溶解單分子態(tài))不斷加入一定比例的水，F(xiàn)AS由于溶解度問題慢慢聚集成納米顆粒，熒光強(qiáng)度明顯增強(qiáng)(600nm附近)，稱其為AIE性質(zhì)。FAS具有明顯的ESIPT和AIE性質(zhì)，具有熒光探針的潛質(zhì)。

(b)細(xì)胞染色實(shí)驗(yàn)：將FAS以一定濃度溶液DMSO溶液后滴入細(xì)胞培養(yǎng)液中，選擇Hela細(xì)胞作為研究對(duì)象，培養(yǎng)一段時(shí)間后采用熒光顯微鏡對(duì)其極性觀察，發(fā)現(xiàn)FAS可以順利的透過細(xì)胞壁，并定向的在細(xì)胞脂滴處富集，從而顯示出橘紅色熒光(600nm附近)。

圖2A為Hela細(xì)胞在明場(chǎng)中的照片，其中馕包狀為細(xì)胞的脂滴結(jié)構(gòu)；圖2B為染色后的細(xì)胞在330nm-385nm激發(fā)光的暗場(chǎng)下的熒光照片，二者對(duì)比顯示，F(xiàn)AS能夠特異性的對(duì)細(xì)胞脂滴進(jìn)行染色，而且其熒光峰位與固態(tài)熒光光譜無(wú)明顯差異。說明FAS可以不經(jīng)任何修飾直接進(jìn)入細(xì)胞實(shí)現(xiàn)靶向熒光染色，并未表現(xiàn)出明顯的熒光偏移，AIE和ESIPT現(xiàn)象得到了很好的利用。

(c)脂滴染色實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化：如圖3和圖4所示，我們對(duì)染色濃度和時(shí)間進(jìn)行了優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)FAS濃度在7.5μM，染色時(shí)間為30min時(shí)，細(xì)胞熒光脂滴成像的效果最好。

上述實(shí)施例為本發(fā)明較佳的實(shí)施方式，但本發(fā)明的實(shí)施方式并不受上述實(shí)施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實(shí)質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡(jiǎn)化，均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)

應(yīng)當(dāng)理解的是，對(duì)本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來說，可以根據(jù)上述說明加以改進(jìn)或變換，所有改進(jìn)或變換都屬于本發(fā)明所附權(quán)利要求的保護(hù)范圍之內(nèi)。