本發(fā)明屬于醫(yī)藥化工領(lǐng)域，涉及一種阿利吉侖的5-位差向異構(gòu)體，還涉及該差向異構(gòu)體的制備方法及用途。
背景技術(shù)：
：阿利吉侖(如結(jié)構(gòu)式I)是一種新型的非肽類直接腎素抑制劑，有關(guān)的藥效學(xué)、藥代動力學(xué)和臨床研究結(jié)果在期刊文獻(xiàn)DrugsoftheFuture,Vol.26,No.12,pp1139-1143(2001)中有詳細(xì)的陳述，其特點是通過劑量依賴性地降低腎素活性，從源頭上減少腎素-血管緊張素系統(tǒng)(RAS)的主要活性肽—血管緊張素II的生成，有效的降低輕中度高血壓患者的血壓水平。阿利吉侖以其富馬酸鹽的形式于2007年3月首次在美國上市，商品名為TEKTURNATM，經(jīng)臨床研究證實具有良好的降壓作用，已成為副作用少、用藥安全的全新型抗高血壓的新藥。已有專利文獻(xiàn)US5,559,111、EP0678503、WO02/02508、WO2007/045420、WO2011/019789和US7,009,078等報道了阿利吉侖的合成方法。其中，專利WO02/02508采用了以下合成路線：專利WO2007/045420則采用了另外一種合成路線：阿利吉侖合成的關(guān)鍵在于采用不對稱合成的方法構(gòu)建分子中的四個手性中心，從而獲得4位羥基為S構(gòu)型、5位氨基為S構(gòu)型、2位和7位異丙基為S構(gòu)型的單一光學(xué)對映體。其中，對于5位氨基手性中心的構(gòu)建過程，在上述已知合成方法均得到解決。如上述專利WO02/02508所示合成方法中，將化合物7的雙鍵與次溴酸進(jìn)行立體選擇性的加成反應(yīng)，得到(3S,5R,1’S,3’S)構(gòu)型的化合物4，并進(jìn)一步經(jīng)立體專一反應(yīng)獲得阿利吉侖；又如上述專利WO2007/045420所示合成方法中，將化合物16的雙鍵與次溴酸進(jìn)行立體選擇性的加成反應(yīng)，并進(jìn)一步經(jīng)立體專一反應(yīng)獲得阿利吉侖。眾所周知，無論合成方法中采用何種化學(xué)反應(yīng)進(jìn)行5位氨基手性中心的構(gòu)建，其5位S構(gòu)型的選擇性均不可能是100％，或多或少可能產(chǎn)生5位R構(gòu)型的異構(gòu)體，從而在最終生成得到(2S,4S,5S,7S)構(gòu)型的阿利吉侖時或多或少混入(2S,4S,5R,7S)構(gòu)型的異構(gòu)體。該異構(gòu)體2、4、7位的構(gòu)型均與目標(biāo)分子阿利吉侖一致，僅5位構(gòu)型不一致，化學(xué)上稱為“5-位差向異構(gòu)體”。與其它的化學(xué)合成藥物一樣，藥物活性物質(zhì)(API)的純度是阿利吉侖商業(yè)化利用的一個關(guān)鍵指標(biāo)。在API的生產(chǎn)過程中可能會引入起始原料、反應(yīng)中間體及副產(chǎn)物、降解產(chǎn)物等稱為有關(guān)物質(zhì)的雜質(zhì)，其中有些雜質(zhì)對患者可能是有害的，為了用藥安全，國際人藥注冊協(xié)調(diào)委會(ICH)要求API必須具有足夠的純度，其雜質(zhì)的含量需控制在藥物質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的限度之內(nèi)。對于阿利吉侖這類單一光學(xué)對映體藥物，具有多個光學(xué)異構(gòu)體，這些異構(gòu)體的化學(xué)分子式與阿利吉侖相同，各項理化性質(zhì)也相同或相似，但它們進(jìn)入人體后的藥效及對人體的毒性與阿利吉侖可能存在較大不同。ICH要求將這些可能的光學(xué)異構(gòu)體作為雜質(zhì)進(jìn)行限度研究，以保障藥物的藥效和毒性。如在API生產(chǎn)的ICHQ7A指導(dǎo)原則中，對原輔料及生產(chǎn)條件提出規(guī)范化的要求，在生產(chǎn)API的某個特定階段需要對中間體或成品中的雜質(zhì)進(jìn)行檢驗，檢驗方法常為高效液相色譜(HPLC)法。 應(yīng)用HPLC法檢驗樣品中雜質(zhì)的含量，通常采用外標(biāo)法或者加校正因子的自身對照法，其前提條件是獲得被測雜質(zhì)的對照品。基于前述原因，為保障阿利吉侖上市藥品的藥效一致性和毒性最小，最佳的方法是采用高效液相色譜法檢驗其雜質(zhì)如5-位差向異構(gòu)體的含量，而高效液相色譜法所采用的外標(biāo)法或者加校正因子的自身對照法，均需要使用5-位差向異構(gòu)體作為對照品。但是，目前為止還沒有有關(guān)阿利吉侖的5-位差向異構(gòu)體的報道，因此有必要開發(fā)阿利吉侖5-位差向異構(gòu)體的合成方法以獲得對照品，以及開發(fā)一種分析方法用于API的生產(chǎn)過程中的質(zhì)量控制。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的是獲得阿利吉侖的5-位差向異構(gòu)體，并以該差向異構(gòu)體作對照品，對阿利吉侖、其鹽或其水合物中5-位差向異構(gòu)體含量進(jìn)行檢測，從而對阿利吉侖、其鹽或其水合物的API純度進(jìn)行控制。為達(dá)到上述目的，提供了如下技術(shù)方案：本發(fā)明第一方面涉及一種阿利吉侖5-位差向異構(gòu)體、其鹽或水合物，其中，阿利吉侖的5-位差向異構(gòu)體的分子結(jié)構(gòu)如式Ⅱ所示，化學(xué)名稱為：(2S,4S,5R,7S)-5-氨基-N-(2-胺甲酰基-2-甲基丙基)-4-羥基-2-異丙基-7-(4-甲氧基-3-(3-甲氧基丙氧基)芐基)-8-甲基壬酰胺。本發(fā)明第二方面涉及本發(fā)明第一方面阿利吉侖5-位差向異構(gòu)體、其鹽或水合物的制備方法，其包括以下步驟：以如下所示的化合物(3S,5R,1’S,3’S)-4為合成的起始原料，其化學(xué) 名稱為：(3S,5R)-5-[(1S,3S)-1-溴-3-[[4-甲氧基-3-(3-甲氧基丙氧基)苯基]甲基]-4-甲基戊基]二氫-3-異丙基-2(3H)-呋喃酮；a)將化合物(3S,5R,1’S,3’S)-4與疊氮化鈉反應(yīng)得如下所示的化合物(3S,5R,1’R,3’S)-5；b)將化合物(3S,5R,1’R,3’S)-5與3-氨基-2,2-二甲基丙胺反應(yīng)得如下所示的化合物4R,5R-2；c)將化合物4R,5R-2與一種氧化劑反應(yīng)得如下所示的化合物5R-3；d)將化合物5R-3與金屬硼氫化物反應(yīng)得化合物5R-2及化合物4R,5R-2的消旋體混合物；e)將d)中的混合物通過催化氫化得化合物5R-1和化合物4R,5R-1的消旋體混合物；f)將e)中的消旋體混合物分離制備得到式II化合物。本發(fā)明第二方面任一項的制備方法中，包括以下(1)-(21)中的任意一項或多項：(1)步驟a)中，反應(yīng)時還加入第一溶劑，所述第一溶劑為N,N-二甲基甲酰胺、三丙二醇、吡啶或N-甲基吡咯烷酮，優(yōu)選為三丙二醇；(2)步驟a)中，化合物(3S,5R,1’S,3’S)-4與疊氮化鈉的摩爾比為1:3～1:10，優(yōu)選為1:5；(3)步驟a)中，反應(yīng)溫度為60～100℃，優(yōu)選為80～90℃；優(yōu)選反應(yīng)48～72小時；(4)步驟a)中，反應(yīng)完畢后加入水和第一有機(jī)溶劑進(jìn)行萃取，所述第一有機(jī)溶劑為甲基叔丁基醚、二氯甲烷或乙酸乙酯；萃取出的有機(jī)層經(jīng)濃縮、硅膠柱層析純化得化合物(3S,5R,1’R,3’S)-5；(5)步驟b)中，反應(yīng)時還加入第二溶劑，所述第二溶劑為甲基叔丁基醚、四氫呋喃、N-甲基吡咯烷酮或氯仿，優(yōu)選為甲基叔丁基醚；(6)步驟b)中，反應(yīng)時還加入有機(jī)堿；具體地，所述有機(jī)堿選自吡啶、2-羥基吡啶、三乙胺和金剛烷胺中的一種或多種；優(yōu)選，所述有 機(jī)堿為2-羥基吡啶；(7)步驟b)中，反應(yīng)溫度為40～110℃，優(yōu)選為60～100℃，更優(yōu)選為70～90℃；(8)步驟b)中，反應(yīng)完畢后加入水和第二有機(jī)溶劑進(jìn)行萃取，其中，第二有機(jī)溶劑為甲基叔丁基醚、二氯甲烷或乙酸乙酯；萃取出的有機(jī)層經(jīng)濃縮、硅膠柱層析純化得化合物4R,5R-2；(9)步驟c)中，還加入第三溶劑，所述第三溶劑為氯仿或二氯甲烷；(10)步驟c)中，反應(yīng)溫度為-30～10℃，優(yōu)選為-20～0℃；(11)步驟c)中，所述的氧化劑選自三氧化鉻-吡啶絡(luò)合物、二氧化錳、三正丁氧基鋁和戴斯-馬丁過碘烷中的一種或多種，優(yōu)選為戴斯-馬丁過碘烷；(12)步驟c)中，氧化反應(yīng)完畢后加入飽和碳酸氫鈉和硫代硫酸鈉溶液，分離的有機(jī)層經(jīng)濃縮、柱層析純化得化合物5R-3；(13)步驟d)中，還加入了第四溶劑，所述第四溶劑為甲醇、乙醇或四氫呋喃；(14)步驟d)中，反應(yīng)溫度為-10～60℃，優(yōu)選為0～50℃；(15)步驟d)中，所述金屬硼氫化物選自硼氫化鉀、硼氫化鈉和硼氫化鋰中的一種或多種；(16)步驟d)中，反應(yīng)完畢后加入氯化銨溶液和二氯甲烷進(jìn)行萃取，萃取出的有機(jī)層經(jīng)濃縮、柱層析(例如硅膠柱層析)純化得化合物5R-2及化合物4R,5R-2的消旋體混合物；(17)步驟e)中，催化劑為鈀碳，優(yōu)選含鈀重量為5％或10％的鈀碳；(18)步驟e)中，還加入第五溶劑，所述第五溶劑為甲基叔丁基醚、乙醇、甲醇、四氫呋喃、乙酸乙酯、乙酯異丙酯或二氯甲烷，優(yōu)選為甲醇或四氫呋喃；(19)步驟e)中，催化氫化反應(yīng)的壓力為1～10bar，優(yōu)選為1～3bar；(20)步驟e)中，催化氫化反應(yīng)完畢后依次加入飽和碳酸氫鈉溶液和鹽水，分離的有機(jī)層經(jīng)濃縮、硅膠柱層析純化得化合物5R-1及化合物4R,5R-1的消旋體混合物；(21)步驟f)中，分離方法為將步驟e)獲得的消旋體混合物在制備液相色譜儀上進(jìn)行分離制備；具體地，使用的色譜柱為ChiralpakIA或類似型號的制備柱；更具體地，以正己烷和乙醇(優(yōu)選，乙醇含0.2％w/w二乙胺)為流動相，其中正己烷與乙醇的體積比為80:20～60:40，優(yōu)選為70:30。在本發(fā)明的實施方案中，作為起始原料的化合物(3S,5R,1’S,3’S)-4按照專利WO02/02508中實施例C1所述的方法制備獲得。上述第一、二方面的“其鹽”是指阿利吉侖5-位差向異構(gòu)體藥學(xué)上可接受鹽。本發(fā)明第三方面還涉及一種檢測樣品中阿利吉侖5-位差向異構(gòu)體、其鹽或水合物存在的方法，包括以權(quán)利要求3所述阿利吉侖5-位差向異構(gòu)體為對照品。本發(fā)明第三方面任一項的方法，其中，所述樣品含有阿利吉侖、其鹽或水合物，或者所述樣品含有制備阿利吉侖過程中的中間體。本發(fā)明第三方面任一項的方法，其中，所述檢測為定量檢測；具體地，所述檢測采用高效液相色譜；更具體地，所述檢測采用高效液相色譜的外標(biāo)法或加校正因子的自身對照法檢測阿利吉侖5-位差向異構(gòu)體的含量。本發(fā)明第三方面任一項的方法，包括以下(1)～(5)中的任意一項或者多項：(1)色譜柱以碳八或碳十八鍵合硅膠為填充劑，例如YMC-PackODS-A型色譜柱(4.6mm×150mm,3μm)或等效柱；(2)流動相A、流動相B以下表含量相配進(jìn)行梯度洗脫；流動相A和流動相B為不同體積比的緩沖溶液-乙腈混合液；具體地，緩沖溶 液配制方法為：將5.65重量份己烷磺酸鈉一水合物和2.75重量份磷酸二氫鈉一水合物溶于1000ml水，形成的緩沖溶液用85％的磷酸調(diào)節(jié)pH值至2.3；更具體地，緩沖溶液-乙腈混合液中緩沖溶液與乙腈的體積比為(10:90)-(90:10)；優(yōu)選，流動相A中緩沖溶液與乙腈的體積比為20:80；優(yōu)選，流動相B中緩沖溶液與乙腈的體積比為80:20；(3)檢測波長為200～300nm，優(yōu)選為230nm；(4)流速為0.5～1.5ml/min，優(yōu)選為1.0ml/min；(5)柱溫為25～35℃，優(yōu)選為30℃。本發(fā)明第三方面的另一方法中，將阿利吉侖和阿利吉侖5-位差向異構(gòu)體單獨及混合進(jìn)樣，分別得到阿利吉侖的保留時間、阿利吉侖5-位差向異構(gòu)體的保留時間和兩者的分離度數(shù)據(jù)。本發(fā)明一個實施方式中，阿利吉侖的保留時間約為10.9min，阿利吉侖5-位差向異構(gòu)體的保留時間約為11.2min，兩者色譜峰的分離度約為1.56。本發(fā)明第四方面提供了所述阿利吉侖5-位差向異構(gòu)體、其鹽或水合物在檢測阿利吉侖、其鹽或水合物中雜質(zhì)或光學(xué)異構(gòu)體含量中的用途。本發(fā)明第五方面提供了所述阿利吉侖5-位差向異構(gòu)體、其鹽或水合物在檢測阿利吉侖、其鹽或水合物的純度中的用途。本發(fā)明第六方面提供了所述阿利吉侖5-位差向異構(gòu)體、其鹽或水合物在阿利吉侖、其鹽或水合物的質(zhì)量控制中的用途。上述第三至六方面中，“阿利吉侖、其鹽”的“鹽”指阿利吉侖藥學(xué)上可接受鹽，“阿利吉侖5-位差向異構(gòu)體、其鹽”的“鹽”指阿利吉侖5-位差向異構(gòu)體藥學(xué)上可接受鹽。本發(fā)明中，術(shù)語“外標(biāo)法”是指：將對照品阿利吉侖5-位差向異構(gòu)體配成已知濃度的對照品溶液，以HPLC法測定對照品溶液中阿利吉侖5-位差向異構(gòu)體的峰面積；以HPLC法測定阿利吉侖或其藥學(xué)上可接受鹽的樣品中阿利吉侖5-位差向異構(gòu)體的峰面積；通過峰面積比值等于阿利吉侖5-位差向異構(gòu)體的濃度比計算得到阿利吉侖、其鹽或水合物中阿利吉侖5-位差向異構(gòu)體的含量。本發(fā)明中，術(shù)語“加校正因子的自身對照法”是指：1)以阿利吉侖和阿利吉侖5-位差向異構(gòu)體作為樣品，配制系列不同濃度的溶液，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線求得斜率，通過斜率計算阿利吉侖5-位差向異構(gòu)體的校正因子；2)以HPLC法測定阿利吉侖、其鹽或水合物的樣品中含有的阿利吉侖的峰面積和阿利吉侖5-位差向異構(gòu)體的峰面積；3)通過校正因子來計算阿利吉侖5-位差向異構(gòu)體在阿利吉侖、其鹽或水合物中的含量。本發(fā)明的有益效果：本發(fā)明首次獲得了阿利吉侖的5-位差向異構(gòu)體(5R-1)，從而實現(xiàn)了以5R-1為對照品對阿利吉侖或其藥學(xué)上可接受的鹽中5R-1含量進(jìn)行檢測，從而能夠?qū)Π⒗獊龌蚱渌帉W(xué)上可接受鹽的API純度、雜質(zhì)含量進(jìn)行測定和控制。本發(fā)明還以5R-1為對照品對阿利吉侖或其藥學(xué)上可接受鹽的制備中間體的5R-1含量進(jìn)行檢測，從而對阿利吉侖或其藥學(xué)上可接受鹽的制備和生產(chǎn)過程進(jìn)行控制。附圖說明圖1：化合物5R-1的ESI-MS圖譜。圖2：化合物5R-1的1H-NMR圖譜。圖3：化合物5R-1的13C-NMR圖譜。圖4：化合物5R-1的1H-1HCOSY圖譜。圖5：化合物5R-1的HSQC圖譜。圖6：阿利吉侖半富馬酸鹽樣品溶液的HPLC圖譜。圖7：化合物5R-1對照品溶液的HPLC圖譜。圖8：化合物5R-1與阿利吉侖半富馬酸鹽混合溶液的HPLC圖譜。具體實施方式下面將結(jié)合實施例對本發(fā)明的實施方案進(jìn)行詳細(xì)描述，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員將會理解，下列實施例僅用于說明本發(fā)明，而不應(yīng)視為限定本發(fā)明的范圍。實施例中未注明具體條件者，按照常規(guī)條件或制造商建議的條件進(jìn)行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可以通過市購獲得的常規(guī)產(chǎn)品。在以下實施例中，所述分離制備，在ShimadzulC20A型制備液相色譜儀上進(jìn)行，其中采用ChiralpakIA或類似型號的制備柱為色譜柱；所述濃縮，是在R-200型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上進(jìn)行；所述的HPLC色譜圖，是在waterse2695高效液相色譜儀上測定；質(zhì)譜在JEOLAccuTOFCS(JMST100CS)型質(zhì)譜儀上測定；核磁共振1H譜和13C譜在BrukerAVANCEIII400型核磁共振儀上測定；所述的旋光度，是在WZZ-2S型自動旋光儀上測定，其中，樣品的比旋度的計算公式為：[α]D20=100×αl×c]]>式中D為鈉光譜的D線，l為測定管長度(dm)，α為測得的旋光度。實施例1(3S,5R)-5-[(1R,3S)-1-疊氮基-3-[[4-甲氧基-3-(3-甲氧基丙氧基)苯基]甲基]-4-甲基戊基]二氫-3-異丙基-2(3H)-呋喃酮((3S,5R,1’R,3’S)-5)的制備以如下所示的化合物(3S,5R,1’S,3’S)-4為合成的起始原料，其化學(xué)名稱為：(3S,5R)-5-[(1S,3S)-1-溴-3-[[4-甲氧基-3-(3-甲氧基丙氧基)苯基]甲基]-4-甲基戊基]二氫-3-異丙基-2(3H)-呋喃酮?；衔?3S,5R,1’S,3’S)-4通過專利WO02/02508中實施例C1所述的方法制備。將化合物(3S,5R,1’S,3’S)-4(10.0g，20mmol)、疊氮化鈉(6.5g，100mmol)和三丙二醇(80ml)及水(53ml)的混合物于80℃攪拌反應(yīng)48小時，反應(yīng)混合物冷卻至室溫，加入二乙胺基-1-丙胺(8ml)，再于室溫攪拌反應(yīng)3小時。將反應(yīng)混合物倒入水(200ml)中，用甲基叔丁基醚(3×200ml)萃取，有機(jī)相依次用0.5N的鹽酸(200ml)、5％的碳酸氫鈉(200ml)、水(3×200ml)、鹽水(200ml)洗。有機(jī)相用無水硫酸鈉(200g)干燥后，過濾并減壓濃縮，柱層析純化(柱層析硅膠，流動相：乙酸乙酯/正己烷＝1:5)，得如下所示的化合物(3S,5R,1’R,3’S)-5(6.9g，產(chǎn)率75.0％)為淡黃色油狀物。1H-NMR(400MHz,CDCl3,ppm-1)δ:0.82-0.98(m,12H),1.44-1.50(m,2H),1.68-1.83(m,3H),1.96-2.22(m,5H),2.47-2.53(m,1H),2.67-2.71(dd,1H),3.11-3.16(m,1H),3.30(s,3H),3.52(t,2H),3.78(s,3H),4.05(t,2H),4.16-4.21(m,1H),6.59-6.92(m,3H)。ESI-MS(m/z):484.3(MNa+)。實施例2(2S,4R,5R,7S)-N-(3-氨基-2,2-二甲基-3-氧丙基)-5-疊氮基-4-羥基-2-異丙基-7-(4-甲氧基-3-(3-甲氧基丙氧基)芐基)-8-甲基壬酰胺(4R,5R-2)的制備將(3S,5R,1’R,3’S)-5(4.0g，8.6mmol)，3-氨基-2,2-二甲基丙酰胺(5.0g，43mmol)，2-羥基吡啶(1.0g，10.5mmol)，三乙胺(0.5g)和甲苯(50ml)混合后，攪拌回流溶解。浴溫80–90℃，攪拌反應(yīng)20小時，減壓蒸干溶劑，加入二氯甲烷(60ml)和水(50ml)攪拌溶解，水相用二氯甲烷(30ml)萃取兩次，合并有機(jī)相，并且用水(30ml)洗滌3次后，用無水硫酸鈉干燥后蒸干，得到油狀物，將油狀物用硅膠柱層析純化(流動相：乙酸乙酯/石油醚＝1/1)得到如下所示的化合物4R,5R-2(3.9g，78.5％產(chǎn)率)為無色油狀物。1H-NMR(400MHz,CDCl3,ppm-1)δ:0.88-0.98(m,12H),1.20(s,6H),1.44-1.63(m,3H),1.69-1.93(m,5H),2.05-2.31(m,4H),2.65-2.70(dd,1H),3.02-3.05(m,1H),3.34-3.46(m,6H),3.56(t,2H),3.82(s,3H),4.09(t,2H),5.62(brs,1H),6.05(brs,1H),6.49(brs,1H),6.70-6.79(m,3H)。ESI-MS(m/z):578.3(MH+)。實施例3(2S,5R,7S)-5-疊氮基-N-(2-胺甲?；?2-甲基丙基)-2-異丙基-7-(4-甲氧基-3-(3-甲氧基丙氧基)芐基)-8-甲基-4-氧壬酰胺(5R-3)的制備在化合物4R,5R-2(4.0g，6.9mmol)的二氯甲烷(100ml)溶液中加入戴斯-馬丁過碘烷(2.9g，6.9mmol)，加入時保持溫度在-20℃。加畢，緩慢升溫至0℃并且將反應(yīng)液在0℃攪拌3小時。向反應(yīng)液中分別加入飽和碳酸氫鈉和硫代硫酸鈉水溶液(各20ml)，待反應(yīng)液變澄清之后向反應(yīng)液中加入二氯甲烷(50ml)，攪拌后分出有機(jī)相，并且再用二氯甲烷(50ml)萃取水相兩次，合并所有有機(jī)相，并且將有機(jī)相用無水硫酸鈉干燥后蒸干，殘余物經(jīng)硅膠柱層析純化，得到如下所示的化合物5R-3的粗品(4.5g，100％產(chǎn)率)，為黃色油狀物。ESI-MS(m/z):576.1(MH+)。實施例4(2S,5R,7S)-5-疊氮基-4-羥基-N-(2-胺甲?；?2-甲基丙基)-2-異丙基-7-(4-甲氧基-3-(3-甲氧基丙氧基)芐基)-8-甲基壬酰胺(5R-2和4R,5R-2消旋體混合物)的制備將實施例3中得到的中間體5R-3(4.4g，6.9mmol)的粗品溶于甲醇(50ml)，并且加熱到50℃，向溶液中分批加入硼氫化鈉(0.52g，13.8mmol)。加畢，反應(yīng)液在50℃繼續(xù)攪拌30分鐘后，冷卻到室溫。向反應(yīng)液中加入飽和氯化銨水溶液(20ml)，攪拌后分離出有機(jī)相，再用二氯甲烷(50ml)萃取水相兩次。合并所有有機(jī)相，用無水硫酸鈉干燥后蒸干，得到殘留物，將殘留物用硅膠柱層析純化(流動相：乙酸乙酯/石油醚＝1/1)得到如下所示的5R-2和4R,5R-2的混合物(2.8g，70.0％產(chǎn)率)，為無色油狀物。ESI-MS(m/z):578.1(MH+)。實施例5(2S,4S,5R,7S)-5-氨基-N-(2-胺甲?；?2-甲基丙基)-4-羥基-2-異丙基-7-(4-甲氧基-3-(3-甲氧基丙氧基)芐基)-8-甲基壬酰胺(5R-1)的制備將實施例4中得到的5R-2和4R,5R-2的消旋體混合物(2.8g，4.8mmol)溶于甲醇(50ml)中，并向此溶液中加入鈀碳(含鈀10％，0.5g)。向此反應(yīng)液通入氫氣，保持氫氣壓力為2.0bar攪拌過夜。將反應(yīng)混合物過濾，濾液蒸干溶劑，得到的殘留物在制備液相色譜儀上進(jìn)行分離制備，其中采用ChiralpakIA制備柱為色譜柱，以正己烷:乙醇(含0.2％二乙胺)＝70:30為流動相，減壓蒸干溶劑得到5R-1(0.5g，18.7％產(chǎn)率)，為白色固體。對所得的化合物5R-1進(jìn)行旋光度測定：取本品約0.2g，精密稱定，置25ml量瓶中，加乙醇使溶解并稀釋至刻度，搖勻得供試液。取供試液在自動旋光儀上測定旋光度，重復(fù)讀數(shù)3次，取算術(shù)平均值。測定的結(jié)果如表1所示。表1按照比旋度的計算公式計算，化合物5R-1的比旋度為[α]D20＝+20.4° (乙醇，C＝5.40mg/ml)；作為參考，阿利吉侖的比旋度為[α]D20＝-11.4°(乙醇，C＝8.21g/ml)。對所得的化合物5R-1，進(jìn)行質(zhì)譜(見圖1)、核磁共振氫譜(見圖2)、碳譜(見圖3)、1H-1HCOSY譜(見圖4)、HSQC譜(見圖5)的測定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：1H-NMR(400MHz,CDCl3,ppm-1)δ:0.84-0.99(m,12H),1.09-1.20(m,7H),1.41-1.47(m,2H),1.53-1.61(m,2H),1.75-1.83(m,2H),2.05-2.23(m,5H),2.62-2.67(m,1H),2.74-2.76(m,1H),3.28-3.47(m,6H),3.57(t,2H),3.83(s,3H),4.09(t,2H),5.85-6.00(brs,1H),6.35-6.45(brs,1H),6.61(brs,1H),6.67-6.78(m,3H).13C-NMR(400MHz,CDCl3,ppm-1)δ:17.7,19.6,21.1,24.0,24.2,28.8,29.6,30.5,31.7,32.6,36.4,42.8,43.1,47.1,50.8,53.8,56.0,58.6,66.1,69.4,71.2,111.8,114.6,121.4,134.2,147.6,148.2,176.0,179.9.ESI-MS(m/z):552.4(MH+)。1H-1HCOSY測試的結(jié)果見圖4，HSQC測試的結(jié)果見圖5。以上結(jié)果均與目標(biāo)化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)相符合。實施例6高效液相色譜法中外標(biāo)法檢測阿利吉侖或其鹽的5R-1含量(1)阿利吉侖半富馬酸鹽樣品溶液的制備：取阿利吉侖半富馬酸鹽樣品(參照專利US7,009,078中實施例G1方法制備得到)適量，精密稱定后，加入水-乙腈(3:1)溶解并定容，得到0.3mg/mL的阿利吉侖半富馬酸鹽樣品溶液。(2)化合物5R-1對照品溶液的制備：取實施例5所得化合物5R-1適量，精密稱定，加入水-乙腈(3:1)溶解并定容，得到0.3mg/mL的化合物5R-1對照品溶液。(3)加化合物5R-1的混合溶液的配制：分別精密稱取阿利吉侖半富馬酸鹽樣品及化合物5R-1對照品適量，加入水-乙腈(3:1)溶解 并定容至刻度。(4)以上三種溶液采用高效液相色譜測定，測定條件為：高效液相色譜儀型號：waterse2695色譜柱類型：YMC-PackODS-A型色譜柱(4.6mm×150mm,3μm)；檢測波長：230nm；流速：1.0ml/min；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：10μl；稀釋劑：水-乙腈(3:1)；流動相：緩沖溶液配制方法：取己烷磺酸鈉一水合物5.65g和磷酸二氫鈉一水合物2.75g，加水1000ml溶解，用85％磷酸調(diào)節(jié)pH值至2.3。以體積比20:80的緩沖溶液-乙腈混合液為流動相A；以體積比80:20的緩沖溶液-乙腈混合液為流動相B，流動相A、B按表2配比進(jìn)行梯度洗脫：表2(5)計算結(jié)果：阿利吉侖半富馬酸鹽樣品溶液色譜圖見圖6，化合物5R-1對照品溶液色譜圖見圖7，加化合物5R-1混合溶液的色譜圖見圖8。由圖8可知，化合物5R-1、阿利吉侖的保留時間分別約為10.9min、 11.2min，兩者的分離度約為1.56。按照下式采用外標(biāo)法計算樣品溶液中化合物5R-1的含量，結(jié)果見表3。式中，A樣為樣品溶液中化合物5R-1的峰面積；W對為配制對照品溶液時化合物5R-1的稱樣量(mg)；V樣為樣品溶液的定容體積(ml)；A對為對照品溶液中化合物5R-1的峰面積；V對為對照品溶液的定容體積(ml)；W樣為樣品溶液的稱樣量(mg)。表3實施例7高效液相色譜法中加校正因子的自身對照法檢測阿利吉侖或其藥學(xué)上可接受鹽中5R-1的含量(1)阿利吉侖半富馬酸鹽樣品溶液的制備：取阿利吉侖半富馬酸鹽樣品(參照專利US7,009,078中的實施例G1所述的方法制備得到)適量，精密稱定，加入水-乙腈(3:1)溶解并定容至刻度，得到每ml 含阿利吉侖半富馬酸鹽對照品0.3mg的溶液。(2)化合物5R-1對照品溶液的制備：取實施例5所得化合物5R-1適量，精密稱定，加入水-乙腈(3:1)溶解并定容至刻度，得到每ml含化合物5R-10.3mg的對照品溶液。(3)加化合物5R-1的混合溶液的配制：分別精密稱取阿利吉侖半富馬酸鹽對照品及化合物5R-1對照品適量，加入水-乙腈(3:1)溶解并定容至刻度。(4)采用高效液相色測定以上溶液，測定條件參照實施例6。以系列樣品溶液的5R-1濃度為橫坐標(biāo)、5R-1峰面積為縱坐標(biāo)繪制5R-1標(biāo)準(zhǔn)曲線，以系列對照品溶液的阿利吉侖濃度為橫坐標(biāo)、阿利吉侖峰面積為縱坐標(biāo)繪制阿利吉侖標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到化合物5R-1標(biāo)準(zhǔn)曲線和阿利吉侖標(biāo)準(zhǔn)曲線及對應(yīng)的斜率值K。按照下式計算得到化合物5R-1相對于阿利吉侖的校正因子f值為0.9965。f＝K阿利吉侖/K5R-1采用上述高效液相色譜法測定樣品溶液和0.3mg/mL的對照品溶液，按照下式計算樣品溶液中化合物5R-1的含量，結(jié)果見表4。式中，A5R-1為樣品溶液中化合物5R-1的峰面積；f5R-1為化合物5R-1相對于阿利吉侖的校正因子(0.9965)；A樣為樣品溶液中阿利吉侖的峰面積。表4項目數(shù)值A(chǔ)5R-12270A樣3179032樣品溶液中化合物5R-1含量0.071％盡管本發(fā)明的具體實施方式已經(jīng)得到詳細(xì)的描述，本領(lǐng)域技術(shù)人員將會理解。根據(jù)已經(jīng)公開的所有教導(dǎo)，可以對那些細(xì)節(jié)進(jìn)行各種修改和替換，這些改變均在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。本發(fā)明的全部范圍由所附權(quán)利要求及其任何等同物給出。當(dāng)前第1頁1 2 3