本發(fā)明涉及一種腫瘤細胞捕捉方法及設備，特別是一種利用多肽在微流控芯片中捕獲循環(huán)腫瘤細胞的方法及相應系統(tǒng)，屬于生物、醫(yī)藥技術(shù)領域。

背景技術(shù)：

現(xiàn)在，癌癥仍然是全球致死率最高的疾病之一，癌癥的轉(zhuǎn)移更是導致其治療困難的一大主因。從原發(fā)灶脫落的癌細胞隨血液或淋巴流布全身，一旦條件成熟，這些癌細胞會像種子一樣在身體的任何組織器官生長起來，破壞臟器功能，最終導致病人死亡。90％的癌癥病人都是死于腫瘤轉(zhuǎn)移，因此，對惡性腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的研究是攻克腫瘤疾病的關鍵所在。傳統(tǒng)的腫瘤轉(zhuǎn)移檢測方法只有在轉(zhuǎn)移病灶引起異常癥狀或影像學檢查發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)移灶時才確診轉(zhuǎn)移發(fā)生，而此時往往已經(jīng)失去有效治療的時機。開發(fā)新的創(chuàng)傷小靈敏度高特異性好的腫瘤轉(zhuǎn)移檢測方法是目前腫瘤研究中的熱點，這其中通過外周血腫瘤細胞水平來判斷腫瘤轉(zhuǎn)移風險是眾多研究者努力的方向。循環(huán)腫瘤細胞(circulating tumor cells，CTCs)是自發(fā)或因診療操作由實體瘤或轉(zhuǎn)移灶釋放進入外周血循環(huán)的腫瘤細胞。CTCs在血液中極少，在癌癥已經(jīng)發(fā)生轉(zhuǎn)移的病人體內(nèi)，大約每10⁹個血細胞中存在一個CTC，因此CTCs的分離與檢測在技術(shù)上極具挑戰(zhàn)性。理想的檢測CTCs的方法應該具有較高的靈敏度和可重復性，而且應該容易應用到臨床。由于到現(xiàn)在為止還沒有一個特異的指標可以將CTCs和正常的血液細胞區(qū)分開，所以導致CTCs的檢測變得復雜。微流控芯片用于分離和檢測CTCs有著很大的優(yōu)勢，它可以順利地從全血中捕獲較多數(shù)量的CTCs。

目前利用生物學方法捕獲循環(huán)腫瘤細胞主要是通過針對循環(huán)腫瘤細胞表面獨特抗原的抗體或核酸適配體實現(xiàn)循環(huán)腫瘤細胞的捕獲并與血液中其他細胞分離。但是抗體的生產(chǎn)價格昂貴，用于大量生產(chǎn)時會很大地增加成本，而且抗體的分子量大，在用于捕獲細胞時會由于空間位阻而導致抗體與細胞上特異的靶分子接觸受阻；而核酸適配體的穩(wěn)定性不足，易被核酸酶降解。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的主要目的在于提供一種基于靶向多肽的循環(huán)腫瘤細胞捕獲方法及微流芯片，其可實現(xiàn)對于不同類型循環(huán)腫瘤細胞的特異性捕捉，從而克服現(xiàn)有技術(shù)中的不足。

為實現(xiàn)前述發(fā)明目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案包括：

一種基于靶向多肽的循環(huán)腫瘤細胞捕獲微流芯片，其包括：

用以使可能含目標循環(huán)腫瘤細胞的液體樣品流經(jīng)的流道，

以及，固定連接于所述流道內(nèi)的循環(huán)腫瘤細胞特異性結(jié)合多肽，用以從所述液體樣品中捕捉所述目標循環(huán)腫瘤細胞。

進一步的，所述循環(huán)腫瘤細胞特異性結(jié)合多肽經(jīng)化學鍵合方式固定連接在所述流道的內(nèi)壁上。

進一步的，所述系統(tǒng)還包括紅細胞裂解試劑，用以去除血液樣品中的紅細胞。

其中，所述微流控芯片可以采用業(yè)界所知的任何合適形式或結(jié)構(gòu)的。

在一較佳實施方案之中，所述微流芯片內(nèi)分布有一條以上流道，其中至少一流道具有由兩個以上曲線形結(jié)構(gòu)單元組成的波浪形曲線結(jié)構(gòu)。

尤為優(yōu)選的，所述曲線形結(jié)構(gòu)單元的曲率為0.3-0.4mm，寬度為80-120μm，高度為30-40μm。

在一具體實施方案之中，所述微流芯片包括通過不可逆鍵合而固定連接的蓋片和載板，蓋片和載板之間分布有復數(shù)條流道。

其中，所述多肽可以是能與相應循環(huán)腫瘤細胞特異性結(jié)合的任意靶向性多肽，例如A549細胞靶向多肽A-1(參閱專利ZL201110340669.1)。

一種基于靶向多肽的循環(huán)腫瘤細胞捕獲方法，其包括：

提供微流芯片，并在所述芯片的流道內(nèi)固定連接循環(huán)腫瘤細胞特異性結(jié)合多肽，

以及，使可能含目標循環(huán)腫瘤細胞的液體樣品于所述流道內(nèi)流動，使目標循環(huán)腫瘤細胞與所述多肽結(jié)合，從而捕獲目標循環(huán)腫瘤細胞。

進一步的，若所述液體樣品為血液樣品，則需將其中的紅細胞去除后，再將所述液體樣品輸入所述芯片，并使所述液體樣品于所述流道內(nèi)流動。

在一實施方案之中，所述方法可以包括：通過在血液樣品中加入紅細胞裂解試劑而去除其中的紅細胞。

在一更為具體的實施方案之中，一種利用靶向多肽在微流芯片中捕獲循環(huán)腫瘤細胞的方 法可以包括如下步驟：

a)將血液樣品進行紅細胞裂解處理，實現(xiàn)腫瘤細胞的富集；

b)將循環(huán)腫瘤細胞特異性結(jié)合多肽連接于微流芯片內(nèi)；

c)將處理過的血液樣本流經(jīng)微流芯片，進行循環(huán)腫瘤細胞的捕獲。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點包括：通過采用小分子量的靶向多肽捕捉循環(huán)腫瘤細胞，不僅可以實現(xiàn)不同類型細胞類的特異性捕捉，且因多肽的空間位阻小，其更易于與目標細胞上的靶分子充分接觸并結(jié)合，同時多肽易于獲取，可以為循環(huán)腫瘤細胞的檢測提供了一個成本低廉且易于大規(guī)模生產(chǎn)的有效工具。

附圖說明

圖1是本發(fā)明一典型實施方案之中一種利用靶向多肽在微流芯片中捕獲循環(huán)腫瘤細胞的原理圖；

圖2a-圖2b是本發(fā)明一較佳實施方案之中的一種微流芯片內(nèi)的流道結(jié)構(gòu)示意圖及流道的局部放大示意圖；

圖3a-圖3b是本發(fā)明一實施例之中所捕獲循環(huán)腫瘤細胞的顯微圖片。

具體實施方式

目前業(yè)界一般采用親和力較高的抗體或適配體與微流芯片相結(jié)合來捕獲細胞，但是其存在前文所述的諸多不足。然而，對于另一種能夠特異性識別及結(jié)合細胞的物質(zhì)，即多肽而言，長期以來研究人員一直認為其親和力不夠高因而不常采用。但是本案發(fā)明人經(jīng)大量實踐后意外發(fā)現(xiàn)，采用多肽，特別是能與相應循環(huán)腫瘤細胞特異性結(jié)合的靶向性多肽與微流芯片結(jié)合，其能實現(xiàn)對循環(huán)腫瘤細胞的高效、準確的捕捉，基于這一發(fā)現(xiàn)，本案發(fā)明人提出了本發(fā)明的技術(shù)方案。

下面通過結(jié)合附圖及實施例對本發(fā)明的技術(shù)方案作進一步的詳細說明。

本實施例中的一種循環(huán)腫瘤細胞特異性結(jié)合多肽修飾的微流控芯片(亦可稱為微流芯片或簡稱為芯片)的制作過程如下：

一、微流芯片的設計、制備及醛基化修飾

1、微流芯片的設計

芯片采用了彎曲流道設計來顯著增加流體中細胞和流道捕捉表面的接觸頻率。請參閱圖 2a中所示，在一較佳實施例中，微流芯片內(nèi)分布有若干波浪形流道，其中，每一流道包含若干(例如15.5個)曲線形結(jié)構(gòu)單元，再請參閱圖2b，在每一結(jié)構(gòu)單元中R為流道曲率，W為流道寬度，其中R優(yōu)選為0.35mm，W優(yōu)選為100μm，高度優(yōu)選為35μm。

2、微流芯片的制備：在一實施例中，該微流芯片上層為蓋片(材質(zhì)可以為PDMS)，下層為載板，例如玻璃載玻片，兩者通過不可逆鍵合完成封裝。

在一更為具體的實施例中，微流芯片的蓋片上的通道利用硅片模板澆注而成。硅片模板制作方法如下：將硅片進行氧洗，然后將菲林板貼在玻璃板上，吹凈后涂上六甲基乙硅氧烷(HMDS)作用15min，以1500rad/min轉(zhuǎn)速勻膠，前烘100℃6min，曝光27s后顯影3min，沖洗后進行后烘110℃8min，最后進行深硅刻蝕，刻蝕厚度為35μm，獲得PDMS塊體。

將PDMS塊體從模板上剝離下來，在PDMS塊體通道兩端用打孔器打出小孔后，再與清洗干凈的載玻片分別置于PLASMA Cleaner(等離子表面處理儀)中，抽真空至儀器內(nèi)氣壓為500mTorr，打開PLASMA作用8分鐘；

將PDMS塊體與載玻片貼合，并置于干燥箱90℃烘烤5分鐘，使之永久鍵合，形成微流芯片。

3、微流芯片的醛基化修飾

1)在室溫避光條件下向所述微流芯片內(nèi)以10μL/min的流速通入2％(v/v)3-氨丙基甲基二乙氧基硅烷的乙醇溶液；

2)以10μL/min的流速通入乙醇溶液清洗20分鐘；

3)以10μL/min的流速通入去離子水清洗30分鐘；

4)將芯片中的液體吹干后置于干燥箱110℃烘烤60分鐘；

5)待芯片冷卻后以10μL/min的流速通入戊二醛反應液2小時(戊二醛反應液配制：50％戊二醛2.5mL，42.5mL PBS,氰基硼氫化鈉0.1g,pH 7.4)；

6)以10μL/min的流速通入去離子水清洗30分鐘，將芯片中的液體吹干后置于4℃保存。

二、循環(huán)腫瘤細胞特異性結(jié)合多肽的修飾

1)將0.5mM的A549細胞靶向多肽A-1(A-1多肽為通過篩選獲得，見專利ZL201110340669.1)的PBS溶液通入微流道內(nèi)，4℃孵育過夜；

2)以10μL/min的流速通入PBS清洗10分鐘后，3％(w/v)BSA封閉1小時；

3)以10μL/min的流速通入PBS清洗10分鐘后置于4℃?zhèn)溆谩?/p>

在一實施例中，利用該芯片進行循環(huán)腫瘤細胞捕捉的方法包括：

1、樣品處理

首先，將血液樣本進行紅細胞裂解。取1mL新鮮抗凝血，摻入10⁴個A549細胞，加入10mL紅細胞裂解液(購自TBDscience，貨號NH4CL2009)輕輕吹打混勻，室溫裂解2分鐘。轉(zhuǎn)速500g、4℃離心5分鐘，棄紅色上清。加入5mL PBS(磷酸鹽緩沖液)重懸沉淀，500g 4℃離心3分鐘，棄上清，重復1次，共洗滌2次，將細胞沉淀重懸于200μL PBS。通過此步驟達到一定程度的循環(huán)腫瘤細胞富集。

2、循環(huán)腫瘤細胞的捕獲

請參閱圖1所示是本實施例中循環(huán)腫瘤細胞捕獲過程的示意圖，其中，a為血液樣本中的循環(huán)腫瘤細胞，b為血液樣本中其它的有核細胞，c為聚二甲基硅氧烷PDMS的蓋片,d為循環(huán)腫瘤細胞靶向多肽,e為微流控芯片下部的載玻片基片。

更為具體的，該過程可以包括：通過注射泵將處理過的血液樣本注入所述微流控芯片，靜置1分鐘，使通入的細胞能與流道表面的多肽充分接觸，然后通過注射泵控制，以1μL/min的流速通入PBS清洗5min。分別統(tǒng)計通入PBS清洗前后流道內(nèi)的A549(GFP)細胞數(shù)，從而計算捕獲效率。測試結(jié)果顯示，在PBS清洗前后，A549(GFP)細胞的捕獲率為71％。

又及，請參閱圖3a所示為顯微鏡明場條件下清洗后被捕獲下來的A549(GFP)細胞和T細胞，圖3b所示為熒光與明場疊加的圖，證明所捕獲的細胞為A549細胞。

應當理解，上述實施例僅為說明本發(fā)明的技術(shù)構(gòu)思及特點，其目的在于讓熟悉此項技術(shù)的人士能夠了解本發(fā)明的內(nèi)容并據(jù)以實施，并不能以此限制本發(fā)明的保護范圍。凡根據(jù)本發(fā)明精神實質(zhì)所作的等效變化或修飾，都應涵蓋在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。