本發(fā)明屬于新藥設計及合成領域，具體地，涉及一種肟類衍生物、其制備方法及將其作為FXR拮抗劑的應用。
背景技術：
：心腦血管疾病是當前危害人類生命和健康最嚴重的病癥之一，為中老年人的常見病和多發(fā)病，在許多國家是發(fā)病率和死亡率的首位。動脈粥樣硬化是許多心腦血管疾病的基礎，大量的實驗和臨床資料證明動脈粥樣硬化和血脂代謝的異常密切相關。因此，血脂調(diào)節(jié)成為當前該類新藥研究的重要領域。通過前瞻性、隨即和對照的臨床研究，已經(jīng)證明一些他汀類藥物可以減少動脈粥樣硬化和冠心病的發(fā)生，降低了冠心病所致的死亡率，降低了心肌梗死的發(fā)生率。進一步研究還證明降脂藥物的治療可以減少粥樣硬化斑塊內(nèi)脂質(zhì)的含量，加固纖維脂而穩(wěn)定斑塊，減少斑塊破裂而引發(fā)的心肌梗死和腦梗死等等嚴重事件。此外，調(diào)血脂藥還可恢復受損血管內(nèi)皮細胞的功能，加強纖溶性和防止血栓形成，并且延緩人的動脈粥樣硬化的進展并消退已形成的斑塊。因此，積極使用調(diào)血脂藥物治療是減輕動脈粥樣硬化和減少冠心病的發(fā)生的重要措施。目前臨床和常用的調(diào)節(jié)血脂的藥物品種較多，例如他汀類，苯氧芳酸類，離子交換樹脂或膽酸螯合劑，煙酸類以及其他調(diào)血脂類藥物。其中他汀類藥物尤為引人注意。他汀類藥物是膽固醇合成酶的抑制劑。3-羥基-3-甲基戊二酸單酰輔酶A(簡稱：HMG-CoA)在HMG-CoA還原酶的作用下轉(zhuǎn)變?yōu)榧籽觚埶?，他汀類藥為化學結(jié)構的開放酸部分與HMG-CoA相似，它可競爭性抑制甲氧龍酸的形成，從而降低了膽固醇的合成，因而可以降低血液中膽固醇和低密度脂蛋白(簡稱：LDL-C)水平。臨床研究證明，冠心病患者即使血清中膽固醇和低密度脂蛋白的水平不很高或正常，他汀類藥物可以預防動脈粥樣硬化斑塊的發(fā)生、發(fā)展和減少冠心病的嚴重臨床事件。然而，長期服用除了他汀類藥物有上腹不適等消化系統(tǒng)癥狀外，相當部分病人還會產(chǎn)生肝功能損害，轉(zhuǎn)氨酶升高，肌肉疼痛，肌酸激酶升高等副反應。法尼醇X受體(簡稱：FXR)是配體激活的轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)節(jié)靶基因的表達；研究發(fā)現(xiàn)膽汁酸為其天然配體，參與膽汁酸的代謝,因此也被稱為膽汁酸受體，而鵝脫氧膽酸(簡稱：CDCA)為其最合適的天然配體。GW4064是第一個人工合成的FXR配體。FXR除參與機 體內(nèi)膽汁酸的代謝，還對脂代謝和糖代謝等起著重要的調(diào)節(jié)作用。膽固醇代謝成膽汁酸主要有兩條通路:1.經(jīng)典通路是由膽固醇-7α-羥化酶(簡稱：CYP7A1)催化，而且受膽汁酸的負反饋調(diào)節(jié)；2.替代通路是由膽固醇-27α-羥化酶(簡稱：CYP27A1)催化，占人體總膽汁酸合成的18％，且作為經(jīng)典通路的補充。經(jīng)典代謝通路過程是膽固醇的氧化產(chǎn)物與肝X受體(簡稱：LXR)結(jié)合并誘導其與維甲酸X受體(簡稱：RXR)形成二聚體，結(jié)合到DNA的LXR的反應原件上，激CYP7A1的表達，然后CYP7A1催化膽固醇生成膽汁酸，膽汁酸與FXR結(jié)合并誘導其與RXR形成二聚體，結(jié)合到DNA的FXR反應原件上，激活小異源二聚體配體(SHP)的表達，而SHP與肝受體類似物-1(LRH-1)結(jié)合抑制CYP7A1的表達，從而維持膽固醇的代謝平衡。FXR對甘油三酯代謝的調(diào)控機制體現(xiàn)在抑制甘油三酯的合成：FXR經(jīng)SHP途徑下調(diào)固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白1c(簡稱：SREBP-1c)，而SREBP-1c是參與脂肪合成基因的主要轉(zhuǎn)錄因子，可激活多種參與脂肪酸和甘油三酯合成的酶的轉(zhuǎn)錄，包括脂肪酸合成酶(簡稱：FAS)、乙酰輔酶A羧化酶(簡稱：ACC)等。最近的研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)XR可以誘導脂肪細胞的分化，從而促進TG在脂肪細胞的儲存。也有文獻報道FXR拮抗劑降低甘油三酯(TG)的作用是通過下調(diào)SREBP-1c的方式實現(xiàn)的。目前，報道的FXR拮抗劑大部分為甾體類化合物，包括Z-guggulsterone(簡稱GS)、CDRI/80-574、sulfatedsterol和scalaranesesterterpene等。迄今為止，非甾體類FXR拮抗劑包括AGN34、取代的異噁唑衍生物。其中天然產(chǎn)物GS是FXR的一個高效拮抗劑，它能夠減少小鼠體內(nèi)低密度脂蛋白(LDL)和甘油三酯(TG)的水平但不能夠改善高膽固醇病人的血漿脂密度。FXR作為近幾年來調(diào)節(jié)血脂領域出現(xiàn)的新靶點，憑借其獨特的調(diào)節(jié)血脂機制，吸引了眾多科研工作者的目光。因此，針對FXR研發(fā)出對混合型高脂血癥有效的藥物具有很大意義。前期的酰胺類化合物、其制備方法及應用(專利CN102838505A)和酯類化合物、其制備方法和應用(專利CN102093246A)兩篇專利中已發(fā)明了大量化合物并證實體內(nèi)降血脂作用，其中候選藥物-化合物SIPI-7623(即專利CN102838505A說明書第4頁的化合物5)表現(xiàn)出較好的降血脂作用，本專利中的發(fā)明以前期為基礎，發(fā)明了一種肟類衍生物，重點進行了體外FXR拮抗活性的研究，證實具有FXR拮抗作用，而大鼠體內(nèi)實驗證實具有降血脂作用，且優(yōu)于對比化合物SIPI-7623。技術實現(xiàn)要素：為開拓臨床藥物的資源，本發(fā)明以SIPI-7623為先導物，合成了一系列其類似物，通 過與相應的鹽酸羥胺及其衍生物進行肟化反應，從而提供了一種肟類FXR拮抗劑，用于降血脂藥物的開發(fā)。本發(fā)明的第一方面是提供了如式(I)所示化合物或其藥學上可接受的鹽，其中：虛線Cy表示不稠合苯環(huán)或稠合苯環(huán)；R1、R2獨立地選自氫、鹵素、苯基、芐基、芐氧基、C1-C3的烷基或C1-C3的烷氧基；R3選自氫、甲基；X選自O、S。一種優(yōu)選的實施方式，上述式(I)所示化合物，其R1、R2獨立地選自氫、鹵素、苯基、芐基或芐氧基。更優(yōu)選地，R1、R2獨立地選自鹵素、芐基。一種優(yōu)選的實施方式，上述式(I)所示化合物，所述鹵素選自氟、氯、溴或碘。一種優(yōu)選的實施方式，上述式(I)所示化合物，虛線Cy為不稠合苯環(huán)，其結(jié)構式如式(I-A)，一種優(yōu)選的實施方式，上述式(I)所示化合物，虛線Cy為稠合苯環(huán)，其結(jié)構式如式(I-B)，在本發(fā)明的第一方面中，更優(yōu)先發(fā)明的化合物為：上述式(I)所示化合物的結(jié)構中，包含有酚羥基，此酚羥基具有弱酸性，其可以與適當?shù)膲A形成鹽；所述的適當?shù)膲A選自堿金屬或堿土金屬的氫氧化物；較佳地可以選自氫氧化鈉、氫氧化鉀或氫氧化鈣等。上述式(I)所示化合物或其藥學上可接受的鹽容易分離，可采用常規(guī)分離方法提純；例如式(I)所示化合物可經(jīng)柱層析純化，式(I)所示化合物與堿性化合物所成的鹽經(jīng)重結(jié)晶純化。在本發(fā)明第二方面，本發(fā)明提供了如上式(I)所示化合物的制備方法，包括以下步驟：步驟a)、將式(II)所示化合物與式(III)所示化合物在堿存在下反應得式(IV)所示化合物；步驟b)、最后將式(IV)所示化合物與R3-NH2·HCl在弱堿性條件和一定溫度下反應得式(I)所示化合物。反應式見以下路線1：路線1上述路線1的反應式中，所述的虛線Cy，R1，R2及R3的定義同上述式(I)所示化合物定義的一致。上述路線1中，步驟a)中所述的堿選自碳酸鈉、碳酸鉀、三乙胺、N,N-二異丙基乙胺； 優(yōu)選無水碳酸鉀。在一種優(yōu)選的操作方式中，步驟a)選用無水K2CO3作為堿，四氫呋喃作為溶劑下反應。上述路線1中，步驟b)所用弱堿為三乙胺、N,N-二異丙基乙胺、無水碳酸鉀、吡啶、N-甲基嗎啉、乙酸鈉等，優(yōu)先選用無水乙酸鈉。式(II)所示化合物的合成，可以通過路線2制備：步驟c)、式(V)所示酚化合物在堿性條件下和式(VI)所示氯化物反應后得式(VII)所示化合物；步驟d)、將式(VII)所示化合物堿性條件下水解及得式(II-A)所示羧酸化合物；步驟e)、將式(II-A)所示化合物通入H2S后制得式(II-B)所示巰基羧酸化合物；路線2上述路線2中，各步驟的反應條件優(yōu)選為，步驟c).無水K2CO3、DMF、80℃；步驟d).NaOH、醇類溶劑、80℃；步驟e).H2S、DMF、CDI。上述路線2中，所述步驟d)中所述醇類溶劑為甲醇、乙醇、異丙醇、正丁醇、異丁醇等，優(yōu)先選用甲醇。在本發(fā)明的第三方面，本發(fā)明提供了降血脂藥物組合物，其中包括第一方面所述的式(I)所述的化合物或其藥學上可接受的鹽以及藥學上可接受的載體。根據(jù)治療目的，可將藥物組合物制成各種類型的給藥單位劑型，如片劑、丸劑、粉劑、液體、懸浮液、乳液、顆粒劑、膠囊、栓劑和針劑(溶液及懸浮液)等。在本發(fā)明的第四方面，本發(fā)明提供了將如式(I)所示化合物或其藥學上可接受的鹽、或其藥物組合物作為FXR拮抗劑的應用。此外，本發(fā)明提供了將如式(I)所示化合物或其藥學上可接受的鹽、或其藥物組合物在調(diào)節(jié)血脂中的應用。本發(fā)明的如式(I)所示的化合物及其藥學上可接受的鹽在藥物組合物中的含量無特殊限制，可在很寬的范圍內(nèi)進行選擇，通?？蔀橘|(zhì)量百分比1-70％，較佳的為質(zhì)量百分比1-30％。本發(fā)明中，所述的藥物組合物的給藥方法沒有特殊限制?？筛鶕?jù)病人年齡、性別和其它條件及癥狀，選擇各種劑型的制劑給藥。例如，片劑、丸劑、溶液、懸浮液、乳液、顆粒劑和膠囊是口服給藥；針劑可以單獨給藥，或者和注射用輸送液(如葡萄糖溶液及氨基酸溶液)混合進行靜脈注射，如有必要可以單純用針劑進行肌肉、皮內(nèi)、皮下或腹內(nèi)注射；栓劑為給藥到直腸。本發(fā)明中，可以根據(jù)服藥方法、病人年齡、性別和其它條件以及癥狀適當?shù)剡x擇用藥劑量。通常的給藥劑量可為：約0.1～300mg藥物活性成分/kg體重/天。一般來說，每個給藥單位劑型可含1～200mg的藥物活性成分。以下將通過具體實施例進一步闡述本發(fā)明，但并不用于限制本發(fā)明的保護范圍。在不脫離本發(fā)明構思的前提下，本領域技術人員可在權利要求范圍內(nèi)對制備方法和使用儀器作出改進，這些改進也應視為本發(fā)明的保護范圍。因此，本發(fā)明專利的保護范圍應以所附權利要求為準。附圖說明圖1-4顯示是本發(fā)明的化合物1的降血脂藥效學研究的實驗結(jié)果。實驗選用了正常大鼠作為空白對照，同時選用高脂大鼠模型作為對照；陽性藥物選取降脂藥-辛伐他汀(Simvastatin，簡稱Sim)以及本研究課題組前期研究中發(fā)現(xiàn)的候選降脂藥物-編號為SIPI-7623(專利CN102838505A中的化合物5)的化合物，測定了化合物1對于高脂大鼠的降血脂藥效。圖1、圖2、圖3及圖4分別顯示了采用日立自動生化分析儀7080測定實驗大鼠血清中的膽固醇(簡稱：TC)、甘油三酯(簡稱：TG)、高密度脂蛋白(簡稱HDL-C)和低密度脂蛋白(簡稱LDL-C)的測試結(jié)果。具體實施方式實施例1：中間體5-(2,5-二氯苯氧基)-2,2–二甲基戊酸制備將2,5-二氯苯酚(1.63g，10mmol)、無水K2CO3(1.66g，12mmol)加入含無水DMF(25mL)的100ml圓底燒瓶中，常溫攪拌0.5h后，再將5-氯-2，2-二甲基戊酸乙酯(2.32g，12mmol)和四正丁基碘化銨(37mg，0.1mmol)加入混合液中，于90℃下攪拌過夜。冷卻后往反應液加入水(150mL)，用DCM(40mL×3)萃取，合并有機相，旋出DCM。將濃縮液中加入乙醇(40mL)和NaOH(0.8g，20mmol)于80℃回流2h，再旋出乙醇，加入水 (150mL)，用DCM(40mL×3)萃取，合并有機相，旋出DCM，經(jīng)柱層析得中間體5-(4-乙基苯氧基)-2，2–二甲基戊酸(2.0g)，收率76.1％。MS(ESI):m/z＝315.0[M+Na]+；1HNMR(400MHz,CDCl3)δ7.28–7.25(m,1H),6.86(dd,J＝7.0,2.2Hz,2H),3.99(t,J＝6.2Hz,2H),1.92–1.70(m,4H),1.26(s,6H).同法制備中間體5-(2,5-二氟苯氧基)-2,2–二甲基戊酸、5-(2-苯基苯氧基)-2,2–二甲基戊酸、5-(3-苯基苯氧基)-2,2–二甲基戊酸、5-(2-芐氧基苯氧基)-2,2–二甲基戊酸、5-(2-萘氧基)-2,2-二甲基戊酸。實施例2：中間體5-(2,5-二氯苯氧基)-2,2–二甲基戊-S-酸制備將CDI(10.0mmol)和5-(2,5-二氯苯氧基)-2,2–二甲基戊酸(10.0mmol)溶于DMF(20mL)中，室溫攪拌1h后通入H2S反應3h。加入水(100mL)和乙酸乙酯(30mL×3)萃取，經(jīng)柱層析得中間體5-(2,5-二氯苯氧基)-2,2–二甲基戊-S-酸，2.41g，MS(ESI):m/z＝308[M+H]+.同法制備中間體5-(2-苯基苯氧基)-2,2–二甲基戊-S-酸、5-(2-萘氧基)-2,2-二甲基戊-S-酸。實施例3：中間體2-(3,5-二羥基苯基)-2氧代乙基-5-(2,5－二氯苯氧基)2,2-二甲基戊酸制備將5-(2,5-二氯苯氧基)-2,2-二甲基戊酸(2.91g,10.0mmol)和K2CO3(1.37g,10.0mmol)加于四氫呋喃(30mL)中室溫攪拌0.5h后，向攪拌液中滴加α-溴代-3,5-二羥基苯乙酮(2.31g,10.0mmol)的四氫呋喃溶液(10mL)，繼續(xù)攪拌12h。旋出溶劑，稀鹽酸酸化，加入乙酸乙酯(25mL×3)萃取，有機相用水洗，無水硫酸鈉干燥，抽濾后濾液經(jīng)硅膠柱層析分離純化，得中間體3.59g，ESI-MSm/z:442[M+H]+.同法制備中間體2-(3,5-二羥基苯基)-2氧代乙基-5-(2,5－二氟苯氧基)2,2-二甲基戊酸、2-(3,5-二羥基苯基)-2氧代乙基-5-(2-苯基苯氧基)2,2-二甲基戊酸、2-(3,5-二羥基苯基)-2氧代乙基-5-(3－苯基苯氧基)2,2-二甲基戊酸、2-(3,5-二羥基苯基)-2氧代乙基-5-(2－芐氧基苯氧基)2,2-二甲基戊酸、2-(3,5-二羥基苯基)-2-氧代乙基-5-(2-萘氧基)-2,2-二甲基戊酸。實施例4：中間體S-(2-(3,5-二羥基苯基)-2-氧代乙基)-5-(2,5-二氯苯氧基)-2,2-二甲基硫代戊酸的制備將5-(2,5-二氯苯氧基)-2,2-二甲基戊-S-酸(3.07g,10.0mmol)和K2CO3(1.37g,10.0mmol)加于四氫呋喃(30mL)中室溫攪拌0.5h后，向攪拌液中滴加α-溴代-3,5-二羥基苯乙酮(2.31g,10.0mmol)的四氫呋喃溶液(10mL)，繼續(xù)攪拌12h。旋出溶劑，稀鹽酸酸化，加入乙酸乙酯(25mL×3)萃取，有機相用水洗，無水硫酸鈉干燥，抽濾后濾液經(jīng)硅膠柱層析分離純化，得中間體3.46g，ESI-MSm/z:458[M+H]+.同法制備中間體S-(2-(3,5-二羥基苯基)-2-氧代乙基)5-(2-苯基苯氧基)-2,2-二甲基硫代戊酸、S-2-(3,5-二羥基苯基)-2-氧代乙基-5-(2-萘氧基)-2,2-二甲基硫代戊酸。實施例5：化合物1的制備將2-(3,5-二羥基苯基)-2氧代乙基-5-(2,5－二氟苯氧基)-2,2-二甲基戊酸(0.408g，1.0mmol)溶于甲醇(15mL)中，室溫攪拌下加入鹽酸羥胺(0.076g,1.0mmol)和無水乙酸鈉(0.090g,1.2mmol)，加畢后60℃反應3h。旋出溶劑，加入乙酸乙酯(25mL)萃取，有機相用水洗，無水硫酸鈉干燥，抽濾后濾液經(jīng)硅膠柱層析分離純化，得目標化合物0.28g，收率66.2％。ESI-MSm/z:422[M-H]+.1HNMR(400MHz,DMSO)δ11.57(s,1H),9.32(s,2H),7.23(ddd,J＝11.1,9.0,5.4Hz,1H),7.02(ddd,J＝10.2,6.9,3.0Hz,1H),6.74(td,J＝8.4,3.9Hz,1H),6.40(d,J＝2.2Hz,2H),6.21(t,J＝2.2Hz,1H),5.11(s,2H),3.90(t,J＝7.3Hz,2H),1.53–1.48(m,4H),1.03(s,6H).實施例6：化合物2的制備將2-(3,5-二羥基苯基)-2氧代乙基-5-(2,5－二氟苯氧基)2,2-二甲基戊酸(0.408g，1.0mmol)溶于甲醇(15mL)中，室溫攪拌下加入甲氧基胺鹽酸鹽(0.100g,1.0mmol)和無水乙酸鈉(0.090g,1.2mmol)，加畢后60℃反應3h。旋出溶劑，加入乙酸乙酯(25mL)萃取，有機相用水洗，無水硫酸鈉干燥，抽濾后濾液經(jīng)硅膠柱層析分離純化，得目標化合物0.30g， 收率68.6％。ESI-MSm/z:436[M-H]+,438[M+H]+,460[M+Na]+.1HNMR(400MHz,DMSO)δ9.37(s,2H),7.23(ddd,J＝11.1,9.0,5.5Hz,1H),7.02(ddd,J＝10.2,6.9,3.1Hz,1H),6.74(ddd,J＝12.0,6.4,3.2Hz,1H),6.40(d,J＝2.2Hz,2H),6.24(t,J＝3.2Hz,1H),5.09(s,2H),3.90(s,5H),1.54–1.44(m,4H),1.02(s,6H).實施例7：化合物3的制備將2-(3,5-二羥基苯基)-2氧代乙基-5-(2,5－二氯苯氧基)-2,2-二甲基戊酸(0.441g，1.0mmol)溶于甲醇(15mL)中，室溫攪拌下加入鹽酸羥胺(0.076g,1.0mmol)和無水乙酸鈉(0.090g,1.2mmol)，加畢后60℃反應3h。旋出溶劑，加入乙酸乙酯(25mL)萃取，有機相用水洗，無水硫酸鈉干燥，抽濾后濾液經(jīng)硅膠柱層析分離純化，得目標化合物0.31g，收率68.0％。ESI-MSm/z:454[M-H]+,478[M+Na]+.1HNMR(300MHz,DMSO)δ11.55(s,1H),9.30(s,2H),7.43(d,J＝8.4Hz,1H),7.16(s,1H),7.01(d,J＝8.4Hz,1H),6.40(s,2H),6.21(s,1H),5.10(s,2H),3.93(s,2H),1.60–1.45(m,4H),1.03(s,6H).實施例8：化合物4的制備將2-(3,5-二羥基苯基)-2氧代乙基-5-(2,5－二氯苯氧基)2,2-二甲基戊酸(0.441g，1.0mmol)溶于甲醇(15mL)中，室溫攪拌下加入甲氧基胺鹽酸鹽(0.100g,1.0mmol)和無水乙酸鈉(0.090g,1.2mmol)，加畢后60℃反應3h。旋出溶劑，加入乙酸乙酯(25mL)萃取，有機相用水洗，無水硫酸鈉干燥，抽濾后濾液經(jīng)硅膠柱層析分離純化，得目標化合物0.26g，收率55.3％。ESI-MSm/z:468[M-H]+,492[M+Na]+.1HNMR(300MHz,DMSO)δ9.36(s,2H),7.43(d,J＝8.4Hz,1H),7.16(s,1H),7.01(d,J＝8.4Hz,1H),6.40(s,2H),6.24(s,1H),5.08(s,2H),3.93(s,2H),3.89(s,3H),1.62–1.41(m,4H),1.02(s,6H).實施例9：化合物5的制備將2-(3,5-二羥基苯基)-2氧代乙基-5-(2-苯基苯氧基)2,2-二甲基戊酸(0.448g，1.0mmol)溶于甲醇(15mL)中，室溫攪拌下加入鹽酸羥胺(0.076g,1.0mmol)和無水乙酸鈉(0.090g,1.2mmol)，加畢后60℃反應3h。旋出溶劑，加入乙酸乙酯(25mL)萃取，有機相用水洗，無水硫酸鈉干燥，抽濾后濾液經(jīng)硅膠柱層析分離純化，得目標化合物0.27g，收率58.3％。ESI-MSm/z:462[M-H]+,464[M+H]+,486[M+Na]+.1HNMR(300MHz,DMSO)δ11.56(s,1H),9.31(s,2H),7.47(d,J＝7.2Hz,2H),7.42–7.25(m,5H),7.02(d,J＝7.6Hz,2H),6.40(d,J＝2.0Hz,2H),6.22(s,1H),5.08(s,2H),3.82(t,J＝4.6Hz,2H),1.51–1.32(m,4H),0.96(s,6H).實施例10：化合物6的制備將2-(3,5-二羥基苯基)-2氧代乙基-5-(2-苯基苯氧基)2,2-二甲基戊酸(0.441g，1.0mmol)溶于甲醇(15mL)中，室溫攪拌下加入甲氧基胺鹽酸鹽(0.100g,1.0mmol)和無水乙酸鈉(0.090g,1.2mmol)，加畢后60℃反應3h。旋出溶劑，加入乙酸乙酯(25mL)萃取，有機相用水洗，無水硫酸鈉干燥，抽濾后濾液經(jīng)硅膠柱層析分離純化，得目標化合物0.35g，收率73.4％。ESI-MSm/z:476[M-H]+,478[M+H]+,500[M+Na]+.1HNMR(300MHz,DMSO)δ9.36(s,2H),7.47(d,J＝6.8Hz,2H),7.43–7.22(m,5H),7.02(d,J＝7.8Hz,2H),6.39(d,J＝2.1Hz,2H),6.25(d,J＝4.2Hz,1H),5.05(s,2H),3.85(s,3H),3.82(t,J＝5.2Hz,2H),1.50–1.26(m,4H),0.95(s,6H).實施例11：化合物7的制備將2-(3,5-二羥基苯基)-2氧代乙基-5-(3-苯基苯氧基)2,2-二甲基戊酸(0.448g，1.0mmol)溶于甲醇(15mL)中，室溫攪拌下加入鹽酸羥胺(0.076g,1.0mmol)和無水乙酸鈉(0.090g,1.2mmol)，加畢后60℃反應3h。旋出溶劑，加入乙酸乙酯(25mL)萃取，有機相用水洗，無水硫酸鈉干燥，抽濾后濾液經(jīng)硅膠柱層析分離純化，得目標化合物0.30g，收率64.8％。ESI-MSm/z:462[M-H]+,464[M+H]+,486[M+Na]+.1HNMR(400MHz,DMSO)δ11.60(s,1H),9.34(s,2H),7.69–7.65(m,2H),7.46(t,J＝7.5Hz,2H),7.40–7.33(m,2H),7.21(d,J＝9.0Hz,1H),7.14(d,J＝4.0Hz,1H),6.92–6.85(m,1H),6.43(d,J＝2.2Hz,2H),6.23(t,J＝2.1Hz,1H),5.12(s,2H),3.89(t,J＝5.2Hz,2H),1.59–1.47(m,4H),1.05(s,6H).實施例12：化合物8的制備將2-(3,5-二羥基苯基)-2氧代乙基-5-(3-苯基苯氧基)2,2-二甲基戊酸(0.441g，1.0mmol)溶于甲醇(15mL)中，室溫攪拌下加入甲氧基胺鹽酸鹽(0.100g,1.0mmol)和無水乙酸鈉(0.090g,1.2mmol)，加畢后60℃反應3h。旋出溶劑，加入乙酸乙酯(25mL)萃取，有機相用水洗，無水硫酸鈉干燥，抽濾后濾液經(jīng)硅膠柱層析分離純化，得目標化合物0.30g，收率62.9％。ESI-MSm/z:476[M-H]+,478[M+H]+,500[M+Na]+.1HNMR(400MHz,DMSO)δ9.39(s,2H),7.67(d,J＝7.1Hz,2H),7.46(t,J＝7.5Hz,2H),7.41–7.34(m,2H),7.22(d,J＝9.0Hz,1H),7.17–7.12(m,1H),6.89(dd,J＝8.1,2.5Hz,1H),6.42(d,J＝2.2Hz,2H),6.25(t,J＝2.1Hz,1H),5.10(s,2H),3.89(s,5H),1.57–1.46(m,4H),1.04(s,6H).實施例13：化合物9的制備將2-(3,5-二羥基苯基)-2氧代乙基-5-(2-芐氧基苯氧基)2,2-二甲基戊酸(0.478g，1.0mmol)溶于甲醇(15mL)中，室溫攪拌下加入鹽酸羥胺(0.076g,1.0mmol)和無水乙酸鈉(0.090g,1.2mmol)，加畢后60℃反應3h。旋出溶劑，加入乙酸乙酯(25mL)萃取，有機相用水洗，無水硫酸鈉干燥，抽濾后濾液經(jīng)硅膠柱層析分離純化，得目標化合物0.36g，收率73.0％。ESI-MSm/z:494[M+H]+,516[M+Na]+.1HNMR(400MHz,DMSO)δ11.57(s,1H),9.32(s,2H),7.44(d,J＝6.9Hz,2H),7.37(t,J＝7.2Hz,2H),7.31(t,J＝7.2Hz,1H),7.03(d,J＝7.3Hz,1H),6.96–6.84(m,3H),6.41(d,J＝2.2Hz,2H),6.23(t,J＝2.1Hz,1H),5.11(s,2H),5.07(s,2H),3.83(t,J＝5.5Hz,2H),1.63–1.42(m,4H),1.02(s,6H).實施例14：化合物10的制備將2-(3,5-二羥基苯基)-2-氧代乙基-5-(2-芐氧基苯氧基)2,2-二甲基戊酸(0.441g，1.0mmol)溶于甲醇(15mL)中，室溫攪拌下加入甲氧基胺鹽酸鹽(0.100g,1.0mmol)和無水乙酸鈉(0.090g,1.2mmol)，加畢后60℃反應3h。旋出溶劑，加入乙酸乙酯(25mL)萃取，有機相用水洗，無水硫酸鈉干燥，抽濾后濾液經(jīng)硅膠柱層析分離純化，得目標化合物0.32g，收率63.1％。ESI-MSm/z:506[M-H]+,508[M+H]+,530[M+Na]+.1HNMR(400MHz,DMSO)δ9.37(s,2H),7.45(d,J＝8.4Hz,2H),7.37(t,J＝7.2Hz,2H),7.32(d,J＝7.2Hz,1H),7.03(d,J＝7.2Hz,1H),6.89(dd,J＝15.0,8.8Hz,3H),6.41(d,J＝2.2Hz,2H),6.26(t,J＝2.2Hz,1H),5.08(s,2H),5.07(s,2H),3.88(s,3H),3.83(t,J＝6.1Hz,2H),1.54–1.44(m,4H),1.00(s,6H).實施例15：化合物11的制備將2-(3,5-二羥基苯基)-2-氧代乙基-5-(2-萘氧基)-2,2-二甲基戊酸(0.478g，1.0mmol)溶于甲醇(15mL)中，室溫攪拌下加入鹽酸羥胺(0.076g,1.0mmol)和無水乙酸鈉(0.090g,1.2mmol)，加畢后60℃反應3h。旋出溶劑，加入乙酸乙酯(25mL)萃取，有機相用水洗，無水硫酸鈉干燥，抽濾后濾液經(jīng)硅膠柱層析分離純化，得目標化合物0.27g，收率61.8％。ESI-MSm/z:436[M-H]+,438[M+H]+,460[M+Na]+.1HNMR(400MHz,DMSO)δ11.58(s,1H),9.34(s,2H),7.81(t,J＝8.0Hz,3H),7.46(t,J＝7.4Hz,1H),7.34(t,J＝8.0Hz,1H),7.24(s,1H),7.13(d,J＝7.4Hz,1H),6.43(d,J＝2.2Hz,2H),6.25(t,J＝2.2Hz,1H),5.12(s,2H),3.92(t,J＝6.4Hz,2H),1.66–1.39(m,4H),1.06(s,6H).實施例16：化合物12的制備將2-(3,5-二羥基苯基)-2-氧代乙基-5-(2-萘氧基)-2,2-二甲基戊酸(0.478g，1.0mmol)溶于甲醇(15mL)中，室溫攪拌下加入甲氧基胺鹽酸鹽(0.100g,1.0mmol)和無水乙酸鈉(0.090g,1.2mmol)，加畢后60℃反應3h。旋出溶劑，加入乙酸乙酯(25mL)萃取，有機相用水洗，無水硫酸鈉干燥，抽濾后濾液經(jīng)硅膠柱層析分離純化，得目標化合物0.27g，收率61.8％。ESI-MSm/z:450[M-H]+,452[M+H]+,474[M+Na]+.1HNMR(400MHz,DMSO)δ9.39(s,2H),7.81(d,J＝15.2Hz,3H),7.46(t,J＝7.4Hz,1H),7.34(t,J＝7.4Hz,1H),7.24(d,J＝2.2Hz,1H),7.13(d,J＝7.4Hz,1H),6.43(d,J＝2.1Hz,2H),6.27(d,J＝4.2Hz,1H),5.10(s,2H),3.92(t,J＝4.1Hz,2H),3.90(s,3H),1.63–1.41(m,4H),1.05(s,6H).實施例17：化合物13的制備將S-(2-(3,5-二羥基苯基)-2-氧代乙基)5-(2,5-二氯苯氧基)-2,2-二甲基硫代戊酸(0.457g，1.0mmol)溶于甲醇(15mL)中，室溫攪拌下加入鹽酸羥胺(0.076g,1.0mmol)和無水乙酸鈉(0.090g,1.2mmol)，加畢后60℃反應3h。旋出溶劑，加入乙酸乙酯(25mL)萃取，有機相用水洗，無水硫酸鈉干燥，抽濾后濾液經(jīng)硅膠柱層析分離純化，得目標化合物0.29g，收率61.4％,ESI-MSm/z:473[M-H]+.實施例18：化合物14的制備將S-(2-(3,5-二羥基苯基)-2-氧代乙基)5-(2,5-二氯苯氧基)-2,2-二甲基硫代戊酸(0.457g，1.0mmol)溶于甲醇(15mL)中，室溫攪拌下加入甲氧基胺鹽酸鹽(0.100g,1.0mmol)和無水乙酸鈉(0.090g,1.2mmol)，加畢后60℃反應3h。旋出溶劑，加入乙酸乙酯(25mL)萃取，有機相用水洗，無水硫酸鈉干燥，抽濾后濾液經(jīng)硅膠柱層析分離純化，得目標化合物0.32g，收率65.7％,ESI-MSm/z:487[M-H]+.實施例19：化合物15的制備將S-(2-(3,5-二羥基苯基)-2-氧代乙基)5-(2-苯基苯氧基)-2,2-二甲基硫代戊酸(0.464g，1.0mmol)溶于甲醇(15mL)中，室溫攪拌下加入鹽酸羥胺(0.076g,1.0mmol)和無 水乙酸鈉(0.090g,1.2mmol)，加畢后60℃反應3h。旋出溶劑，加入乙酸乙酯(25mL)萃取，有機相用水洗，無水硫酸鈉干燥，抽濾后濾液經(jīng)硅膠柱層析分離純化，得目標化合物0.25g，收率52.2％,ESI-MSm/z:479[M-H]+.實施例20：化合物16的制備將S-(2-(3,5-二羥基苯基)-2-氧代乙基)5-(2-苯基苯氧基)-2,2-二甲基硫代戊酸(0.464g，1.0mmol)溶于甲醇(15mL)中，室溫攪拌下加入甲氧基胺鹽酸鹽(0.100g,1.0mmol)和無水乙酸鈉(0.090g,1.2mmol)，加畢后60℃反應3h。旋出溶劑，加入乙酸乙酯(25mL)萃取，有機相用水洗，無水硫酸鈉干燥，抽濾后濾液經(jīng)硅膠柱層析分離純化，得目標化合物0.28g，收率56.7％,ESI-MSm/z:494[M-H]+.實施例21：化合物17的制備將S-2-(3,5-二羥基苯基)-2-氧代乙基-5-(2-萘氧基)-2,2-二甲基硫代戊酸(0.438g，1.0mmol)溶于甲醇(15mL)中，室溫攪拌下加入鹽酸羥胺(0.076g,1.0mmol)和無水乙酸鈉(0.090g,1.2mmol)，加畢后60℃反應3h。旋出溶劑，加入乙酸乙酯(25mL)萃取，有機相用水洗，無水硫酸鈉干燥，抽濾后濾液經(jīng)硅膠柱層析分離純化，得目標化合物0.21g，收率46.3％,ESI-MSm/z:454[M-H]+.實施例22：化合物18的制備將S-2-(3,5-二羥基苯基)-2-氧代乙基-5-(2-萘氧基)-2,2-二甲基硫代戊酸(0.438g，1.0mmol)溶于甲醇(15mL)中，室溫攪拌下加入甲氧基胺鹽酸鹽(0.100g,1.0mmol)和無水乙酸鈉(0.090g,1.2mmol)，加畢后60℃反應3h。旋出溶劑，加入乙酸乙酯(25mL)萃取，有機相用水洗，無水硫酸鈉干燥，抽濾后濾液經(jīng)硅膠柱層析分離純化，得目標化合物0.25g，收率53.4％,ESI-MSm/z:468[M-H]+.實施例23：FXR拮抗活性測試實驗過程：所用試劑材料供應商如下：試劑材料供應商貨號FXR-LBD(GST)InvitrogenPV4835Streptavidin-XL665-5,000testscisbio610SAXLAMAbAntiGST-K-5,000testscisbio61GSTKLASRC1GL-TritonX-100BeyotimeST795KFSigma60240-250GSodiumMolybdateSigmaM1003-100GUltrapure1MTris-HClpH7.5invitrogen15567-0270.5MEDTApH8.0invitrogen15575-020GlycerolFLUKA49780-1LDTTShenggongDB00581.基本緩沖液的配制注：以下實驗中，mM為mmol/L，μM為μmol/L，nM為μmol/L。a.準備20mL1x基本緩沖液，混合后待用。緩沖液詳細列表如下：材料終濃度(mM)Tris-HCl20EDTA1glycerol10％TritonX-1000.0025％KF400BSA0.01％SodiumMolybdate10DTT5H2O補足到20ml2.化合物溶液的配制a.對于對照化合物Z-guggulsterone(簡稱GS)，先用100％DMSO稀釋成30mM母液，然后按3倍稀釋到所需終濃度。b.對于待檢測化合物，先用100％DMSO稀釋成20mM母液，然后按3倍稀釋到所需終濃度。c.對于激活化合物GW4064，用100％DMSO稀釋成520μM母液，然后加5nL到384孔板各孔中(不包括低值孔)待用，其終濃度達到130nM。3.1x蛋白混合液的配制a.按每孔需要10μL溶液計算，首先用1x基本緩沖液準備2xFXR-LBD/EuAnti-GST蛋白溶液，使GST-FXR-LBD蛋白溶液終濃度達到3nM。詳表如下：材料終濃度(mM)GST-FXR-LBD3EuAnti-GST(nl)50nl/孔b.按每孔需要10μL溶液計算，首先用1x基本緩沖液準備2xFXRBiotin-SRC1/SA-APC多肽溶液，使SRC1多肽溶液終濃度達到500nM。詳表如下：材料終濃度(mM)Biotin-Peptide500SA-APC50nl/孔c.把以上兩種2xGST-ER/EuAnti-GST溶液和2xpeptide/SA-APC溶液按體積1：1混合均勻，待用。d.將1x蛋白混合溶液加入384孔板每個孔，每孔加20μL。e.將384孔板放入離心機室溫1000轉(zhuǎn)離心10秒，取出。f.將384孔板在室溫放置3小時后讀數(shù)。4.TR-FRETassay讀數(shù)將384板放入EnVision多功能酶標儀讀數(shù)。5.結(jié)果處理a.讀數(shù)665nm和615nm值，并以615nm值做校正值，最終數(shù)值表示為665nm值/615nm值。b.計算抑制率(％)根據(jù)以下公式計算抑制率(％)X是每個濃度的“665nm值比615nm值”。Min是只加DMSO的空白對照孔的“665nm值比615nm值”平均值。Max是只加激活化合物和DMSO的高信號對照孔的“665nm值比615nm值”平均值。實驗結(jié)果：實驗結(jié)果見表格，其中本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)的候選降脂藥物-編號為SIPI-7623(專利CN102838505A中的化合物5)化合物的IC50為52uM，本發(fā)明化合物體外拮抗FXR活性好于對比化合物。實施例24：片劑的制備處方：用量化合物150mg微晶纖維素250mg交聯(lián)聚乙烯吡咯烷酮50mg預膠化淀粉100mg硬脂酸鎂5mg制備方法：按上述配方，將粉碎過篩后的化合物1、微晶纖維素、預膠化淀粉和交聯(lián)聚乙烯吡咯烷酮均勻混合，然后與5％乙醇溶液混合，制粒、干燥，之后再與潤滑劑混合，壓片即可。其中，所述的化合物粉碎過篩為過60目篩；所述的微晶纖維素、預膠化淀粉和交聯(lián)聚乙烯吡咯烷酮粉碎過篩為過80目篩；所述的制粒的顆粒粒徑大小為20目；所述的干燥的溫度較佳的為90℃控制水分質(zhì)量百分比3％以內(nèi)。實施例25：膠囊的制備制備方法：按上表配方，將藥物與輔料各原料混勻，填充至膠囊殼中即可。實施例26：注射劑制備制備方法：按上述配方，使用乳缽，將化合物或其鹽與潤濕劑研磨混合均勻，然后與助懸劑、防腐劑和注射用水均勻混合，再研磨即可。其中，所述的研磨的顆粒大小為0.5μm。實施例27：降血脂藥效學研究試劑及批號豬油市售膽固醇上海藍季科技發(fā)展有限公司批號：090720丙基硫氧嘧啶上海藍季科技發(fā)展有限公司批號：090505脫氧膽酸上海藍季科技發(fā)展有限公司批號：090615吐溫80CP國藥集團化學試劑有限公司批號：F200905071,2-丙二醇國藥集團化學試劑有限公司AR批號：T20070125方法脂肪乳劑制備方法：取豬油25g，放在200mL的燒杯里，放在煤氣灶上加熱,待溫度升到100℃時,加入10g膽固醇,溶化,再加入1g丙硫氧嘧啶,充分攪勻,然后加入25mL吐溫80,制成油相。同時在另一燒杯中加入30mL蒸餾水和1,2－丙二醇20mL,放在水浴鍋中加熱至60℃,然后加入2g脫氧膽酸鈉,充分攪拌直到完全溶解,制成水相。然后將水相加入油相,充分混勻,即制成脂肪乳劑。大鼠適應性喂養(yǎng)3天，根據(jù)體重進行分組，每組6只：分出6只作為空白對照組(Control)，其余大鼠每天上午9:00-11:00灌胃脂肪乳，1mL/100g體重，連續(xù)灌胃2周。再根據(jù)體重將給予脂肪乳劑的大鼠分為高脂模型組(Model)、陽性藥組和測試藥組。所有高脂模型組(Model)、陽性藥組和測試藥組的大鼠在給藥測試期間，均同時繼續(xù)灌胃脂肪乳劑，同時，陽性藥組給予辛伐他汀(Sim，10mg/kg)和SIPI-7623(80mg/kg)，測試藥組給予劑量分別為80mg/kg及20mg/kg的本發(fā)明的化合物1，高脂模型組給予等體積溶劑。于分組當日開始口服給藥，每天下午3:00-4:00給藥一次。每周一稱量體重，觀察大鼠情況。連續(xù)給藥14天，大鼠禁食12小時，眼眶采血1mL。進行血脂測定。采用日立自動生化分析儀7080測定實驗大鼠血清中的膽固醇(簡稱：TC)、甘油三酯(簡稱：TG)、高密度脂蛋白(簡稱HDL-C)和低密度脂蛋白(簡稱LDL-C)，測試結(jié)果分別見圖1、圖2、圖3及圖4。圖中，**代表統(tǒng)計學P<0.01，***代表統(tǒng)計學P<0.001。圖1-4顯示是本發(fā)明的化合物1的降血脂藥效學研究的實驗結(jié)果。實驗選用正常大鼠作為空白對照，并通過對大鼠進行持續(xù)用脂肪乳進行灌胃，建立高脂大鼠模型。陽性藥物選取降脂藥-辛伐他汀(Simvastatin，簡稱Sim)以及本研究課題組前期研究中發(fā)現(xiàn)的候選 降脂藥物-編號為SIPI-7623(專利CN102838505A中的化合物5)，測定了化合物1對于高脂大鼠的降血脂藥效。圖1、圖2、圖3及圖4的實驗結(jié)果顯示化合物7在高脂大鼠模型中可顯著降低大鼠血脂。實驗結(jié)果顯示了化合物1口服給藥80mg/kg時具有明顯降血脂效果，在給藥80mg/kg時降低血漿TC、TG和LDL-C的效果明顯優(yōu)于本研究課題組前期研究中發(fā)現(xiàn)的候選降脂藥物-編號為SIPI-7623的化合物；口服給藥20mg/kg時降低血漿TC、TG和LDL-C的效果與口服給藥80mg/kgSIPI-7623相當。當前第1頁1 2 3