本發(fā)明屬于生物
技術領域：
，具體涉及一種雜交構樹轉錄因子BpSEM及其編碼基因與應用。
背景技術：
：植物體的任何一個細胞在適宜條件下，都有長成完整個體的潛在能力，這種潛在能力就叫植物細胞的“全能性”。植物干細胞具有兩大特性：一是有很強的自我更新能力，能在無限的時間內保持未分化狀態(tài)和增殖的能力；二是分化的多能性，能夠分化出多種多樣的植物前體細胞的能力，這些特化的細胞產生新的植物器官，是植物根、莖、葉和花等器官發(fā)生的源泉。植物的頂端分生組織和側生分生組織中存在著由多種基因編碼的蛋白組成的信號調節(jié)通路，保證分生組織的正常發(fā)育，實現(xiàn)干細胞在自我更新和產生分化細胞之間的平衡。轉錄因子(transcriptionfactor)是指能夠與真核基因啟動子區(qū)域中順式作用元件發(fā)生特異性相互作用，協(xié)助RNA聚合酶II與之結合，調節(jié)RNA合成速率的蛋白。它們控制真核生物正常發(fā)育和生理功能基因的協(xié)同表達。植物發(fā)育是十分復雜的過程。DNA與蛋白質在這個過程中發(fā)揮著主要的作用，通過它們之間的相互作用來實現(xiàn)對基因表達的調控。蛋白質實現(xiàn)了生物的多樣性，因此發(fā)育調控的復雜性也必定與蛋白質的結構和功能的多樣性密不可分。轉錄調控是真核生物基因表達調控的重要機制。真核生物的生長發(fā)育、逆境反應及信號轉導都是由于基因調控而有序表達的結果，而基因表達的此種時空特異性，主要是由于轉錄因子通過與基因啟動子和增強子內的DNA順式元件相互作用來修飾改變靶基因存在的染色質結構，以及通過轉錄因子之間及其轉錄產物之間的直接和間接作用來調節(jié)靶基因的轉錄和表達。因此，轉錄因子在植物逆境信號傳遞過程中起著中心調節(jié)的作用，轉錄因子也逐漸成為植物抗逆機理研究的核心內容。植物的抗逆性狀是多基因控制的數(shù)量性狀。植物的抗逆性(即植物對干旱、高鹽、低溫及病蟲害的耐受性)不是由一個基因控制的，其性狀受許多基因和環(huán)境的影響。轉錄因子可以調控多個與抗逆性狀相關的基因的表達，通過增強一些關鍵調節(jié)因子的作用來促進這些抗逆基因發(fā)揮相應的作用，使植物的抗逆性得到改善。在提高植物應對逆境脅迫的分子育種中，與導入或改良個別功能基因來提高某種抗性的方法相比，敲除或增強一個關鍵的轉錄因子的調控能力，是提高植物抗逆性的有效方法和途徑。雜交構樹(Broussonetiakazinoki×B.papyrifera)是中國科學院植物研究所利用小構樹(B.kazinoki)與構樹(B.papyrifera)雜交后經多代選育出的新品種。雜交構樹是綠 化、用材與飼料兼用的具有突出抗逆性的復合型多功能樹種，是集造林、造紙、治沙、飼料、生態(tài)保護于一體的速生樹種。具有生長速度快、豐產性強、耐砍伐、適應性強和開發(fā)利用機制達等特點。技術實現(xiàn)要素：本發(fā)明所要解決的技術問題是如何提高植物的抗逆性。為解決上述問題，本發(fā)明首先提供了一種的轉錄因子。本發(fā)明所提供的轉錄因子，名稱為BpSEM，來源于雜交構樹(Broussonetiakazinoki×B.papyrifera)，為如下a)或b)或c)的蛋白質：a)氨基酸序列是序列表中序列1所示的蛋白質；b)在序列表中序列1所示的蛋白質的N端和/或C端連接標簽得到的融合蛋白質；c)將序列表中序列1所示的氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白質。其中序列表中的序列1可由292個氨基酸組成。為了使a)中的蛋白質便于純化，可在序列表序列1所示的蛋白質的氨基末端或羧基末端連接上如表1所示的標簽。表1、標簽的序列標簽殘基序列Poly-Arg5-6(通常為5個)RRRRRPoly-His2-10(通常為6個)HHHHHHFLAG8DYKDDDDKStrep-tagII8WSHPQFEKc-myc10EQKLISEEDL上述c)中的蛋白質BpSEM，所述一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加為不超過10個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加。上述c)中的蛋白質BpSEM可人工合成，也可先合成其編碼基因，再進行生物表達得到。上述c)中的蛋白質BpSEM的編碼基因可通過將序列表序列2的第193-1071位所示的DNA序列中缺失一個或幾個氨基酸殘基的密碼子，和/或進行一個或幾個堿基對的錯義突變，和/或在其5′端和/或3′端連上表1所示的標簽的編碼序列得到。與所述BpSEM相關的生物材料也屬于本發(fā)明的保護范圍。本發(fā)明所提供的與所述BpSEM相關的生物材料，可為下述A1)至A20)中的任一種：A1)編碼所述BpSEM的核酸分子；A2)含有A1)所述核酸分子的表達盒；A3)含有A1)所述核酸分子的重組載體；A4)含有A2)所述表達盒的重組載體；A5)含有A1)所述核酸分子的重組微生物；A6)含有A2)所述表達盒的重組微生物；A7)含有A3)所述重組載體的重組微生物；A8)含有A4)所述重組載體的重組微生物；A9)含有A1)所述核酸分子的轉基因植物細胞系；A10)含有A2)所述表達盒的轉基因植物細胞系；A11)含有A3)所述重組載體的轉基因植物細胞系；A12)含有A4)所述重組載體的轉基因植物細胞系；A13)含有A1)所述核酸分子的轉基因植物組織；A14)含有A2)所述表達盒的轉基因植物組織；A15)含有A3)所述重組載體的轉基因植物組織；A16)含有A4)所述重組載體的轉基因植物組織；A17)含有A1)所述核酸分子的轉基因植物器官；A18)含有A2)所述表達盒的轉基因植物器官；A19)含有A3)所述重組載體的轉基因植物器官；A20)含有A4)所述重組載體的轉基因植物器官。上文中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因組DNA或重組DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。上述與所述BpSEM相關的生物材料中，A1)所述核酸分子可為如下1)或2)或3)所示的基因：1)其編碼序列是序列表中序列2的第193-1071位脫氧核糖核苷酸所示的DNA分子；2)與1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且編碼所述BpSEM的DNA分子；3)在嚴格條件下與1)或2)限定的核苷酸序列雜交，且編碼所述BpSEM的DNA分子。其中，序列表中序列2由1280個核苷酸組成，其編碼序列是序列表中序列2的第193-1071位核苷酸，編碼序列表中序列1所示的蛋白質。本領域普通技術人員可以很容易地采用已知的方法，例如定向進化和點突變的方 法，對本發(fā)明的編碼BpSEM的核苷酸序列進行突變。那些經過人工修飾的，具有與本發(fā)明分離得到的BpSEM的核苷酸序列75％或者更高同一性的核苷酸，只要編碼BpSEM且與植物抗逆性相關，均是衍生于本發(fā)明的核苷酸序列并且等同于本發(fā)明的序列。這里使用的術語“同一性”指與天然核酸序列的序列相似性?！巴恍浴卑ㄅc本發(fā)明的編碼序列表的序列1所示的氨基酸序列組成的蛋白質的核苷酸序列具有75％或更高，80％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或計算機軟件進行評價。使用計算機軟件，兩個或多個序列之間的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用來評價相關序列之間的同一性。所述表達盒包括啟動子、編碼所述BpSEM的核酸分子和終止子。所述啟動子可為CaMV35S啟動子。所述重組載體可為將所述BpSEM的編碼基因(即序列表序列2的第193-1071位所示的DNA分子)通過含有所述BpSEM的編碼基因的表達盒插入出發(fā)質粒得到的重組質粒。所述重組載體具體可為先將序列表序列5所示的雙鏈DNA分子插入載體pCAMBIA1300的HindⅢ和XbaI識別位點之間，然后將所述BpSEM的編碼基因(即序列表的序列2自5'末端第193-1071位所示的雙鏈DNA分子)插入XbaⅠ和KpnⅠ酶切位點之間得到的重組載體。所述重組微生物可通過將所述重組載體導入出發(fā)微生物得到。所述出發(fā)微生物可為酵母、細菌、藻類或真菌。所述細菌可為革蘭氏陽性細菌或革蘭氏陰性細菌。所述革蘭氏陰性細菌可為根癌農桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)。所述根癌農桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)具體可為根癌農桿菌GV3101。所述轉基因植物細胞系均不包括繁殖材料。所述轉基因植物理解為不僅包含將所述BpSEM的編碼基因轉化受體植物得到的第一代轉基因植物，也包括其子代。對于轉基因植物，可以在該物種中繁殖該基因，也可用常規(guī)育種技術將該基因轉移進入相同物種的其它品種，特別包括商業(yè)品種中。所述轉基因植物包括種子、愈傷組織、完整植株和細胞。所述BpSEM在調控植物抗逆性或制備調控植物抗逆性產品中的應用也屬于本發(fā)明的保護范圍。上述任一所述BpSEM相關的生物材料在調控植物抗逆性或制備調控植物抗逆性產品中的應用也屬于本發(fā)明的保護范圍。所述BpSEM作為轉錄因子的應用也屬于本發(fā)明的保護范圍。為解決上述技術問題，本發(fā)明還提供了一種培育轉基因植物的方法。本發(fā)明所提供的一種培育轉基因植物的方法，包括如下步驟：向受體植物中導入 編碼所述BpSEM的核酸分子，得到抗逆性高于所述受體植物的抗逆性轉基因植物。上述培育轉基因植物的方法中，所述編碼所述BpSEM的核酸分子可為如下1)或2)或3)所示的DNA分子：1)其編碼序列是序列表中序列2的第193-1071位脫氧核糖核苷酸所示的DNA分子；2)與1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且編碼所述BpSEM的DNA分子；3)在嚴格條件下與1)或2)限定的核苷酸序列雜交，且編碼所述BpSEM的DNA分子。上文中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因組DNA或重組DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。其中，序列表中序列2由1280個核苷酸組成，其編碼序列是序列表中序列2的第193-1071位核苷酸，編碼序列表中序列1所示的蛋白質。上述任一所述抗逆性具體可為抗旱性。上述任一所述植物可為雙子葉植物或單子葉植物。所述雙子葉植物具體可為十字花科植物；所述十字花科植物可為擬南芥。本發(fā)明提供了一個雜交構樹轉錄因子BpSEM及其編碼基因。實驗證明，BpSEM定位于細胞核中；BpSEM基因在雜交構樹愈傷組織中高表達，表現(xiàn)出其控制細胞胚性的功能；將本發(fā)明的轉錄因子BpSEM的編碼基因在擬南芥中過表達，和野生型擬南芥相比，獲得的純合轉基因植物的抗旱性明顯提高，說明本發(fā)明提供的轉錄因子BpSEM及其編碼基因可以提高植物的抗逆性。不僅對于鑒定和維持雜交構樹及其他植物的干細胞系具有重要的理論和實際意義，而且還可用于農牧業(yè)和生態(tài)環(huán)境治理所需的抗性植物品種的培育與鑒定，在農業(yè)和經濟能源作物領域具有較高的實際應用價值和廣闊的應用前景。附圖說明圖1為雜交構樹幼苗總RNA的瓊脂糖凝膠電泳檢測結果。圖2為3’RACE產物的瓊脂糖凝膠電泳檢測結果。其中，泳道M為TRANS2000DNA分子量標準(北京全式金生物技術有限公司)的DNA分子量標準，泳道1為3’RACEPCR擴增產物。圖3為5’RACE產物的瓊脂糖凝膠電泳檢測結果。其中，泳道M為TRANS2000DNA分子量標準(北京全式金生物技術有限公司)的DNA分子量標準，泳道1為5’RACEPCR擴增產物。圖4為PCR擴增BpSEM全長cDNA的瓊脂糖凝膠電泳檢測結果。其中，泳道M為 TRANS2000DNA分子量標準(北京全式金生物技術有限公司)的DNA分子量標準，泳道1為PCR擴增產物。圖5為BpSEM基因在不同組織中的表達結果。圖6為BpSEM基因的亞細胞定位結果。其中，圖6A和圖6E為轉化的煙草表皮細胞在藍光通道下(觀察DAPI，確認細胞核的位置)的形態(tài)，圖6B和圖6F為轉化的煙草表皮細胞在熒光通道下(GFP熒光蛋白的觀察)的形態(tài)，圖6C和圖6G為明視場下的形態(tài)，圖6D和圖6H為三個視場的疊加。圖7為BpSEM的轉錄激活活性分析結果。其中，圖7A表示各種轉基因酵母在平板上的位置；圖7B表示轉基因酵母在不含His和Trp的SD培養(yǎng)基上的生長狀況；圖7C表示轉基因酵母的β-半乳糖苷酶活性。具體實施方式下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。下述實施例中的不含His和Trp的SD培養(yǎng)基是北京泛基諾科技有限公司的產品，產品編號為YGM003A-17。下述實施例中的雜交構樹是利用小構樹與構樹雜交后經多代選育出的新品種，公眾可以中國科學院植物研究所獲得，也可從北京喬納森科技發(fā)展有限公司處購買獲得。下述實施例中的pCAMBIA1302載體是北京鼎國昌盛生物科技有限責任公司的產品，產品目錄號為MCV034-N。下述實施例中的農桿菌EHA105是北京鼎國昌盛生物科技有限責任公司的產品，產品目錄號為MCC028。下述實施例中的含有GAL4結合域的酵母表達載體pBridge是美國Clontech公司的產品，產品目錄號為630404。下述實施例中的含有His3和LacZ報道子的酵母AH109株系是美國Clontech公司的產品，產品目錄號為K1612-1。下述實施例中的pBridge-JcERF在文獻“M.Tang,J.Sun,Y.Liu,F.Chen,S.Shen,IsolationandfunctionalcharacterizationoftheJcERFgene,aputativeAP2/EREBPdomain-containingtranscriptionfactor,inthewoodyoilplantJatrophacurcas,PlantMol.Biol.63(2007)419–428..”中公開過，公眾可以中國科學院植物研究所獲得。下述實施例中的煙草品種NicotianatabacumcvXanth在文獻“HoiPX,QuyTD,NghiaPT,TutejaN:TransferofgeneencodingforDNAunwindinghelicase(pdh45)intotobaccoplants(NicotianatabacumL.cvXanthi)byusingAgrobacteriumandAnalysisoftheTransformedplants.TAPCHISINHHOC2015,25(3):83-92.”中公開過，在下文中煙 草品種NicotianatabacumcvXanth簡稱為煙草。實施例1、轉錄因子BpSEM的獲得一、BpSEM基因3’端序列的克隆1、植物材料處理及總RNA的提取以雜交構樹幼苗(整株幼苗)為材料，提取雜交構樹幼苗的總RNA，進行1％瓊脂糖凝膠電泳檢測。結果如圖1所示：從圖中看以看出：所提取的RNA有兩條明顯的電泳條帶，從上到下依次為28SRNA和18SRNA。表明獲得了純度較高、較完整的總RNA。2、BpSEM基因3’端序列的克隆(1)以步驟1提取的雜交構樹幼苗的總RNA為模板，用PrimeScriptTM1stStrandcDNASynthesizedKit試劑盒(Takara公司)并參照試劑盒說明書的要求，反轉合成其第一鏈cDNA。反應體系及反應條件如下：Oligo-dT(10pmol/μl)1μl，TotalRNA(≤1μg)2μl，dNTPMixture(10mmol/leach)1.0μl，5×Buffer4.0μl，RNaseInhibitor(40U/μl)0.5μl，PrimeScriptRTase(200U/μl)0.5μl，RNase-freedistilledwater11μl；65℃5min,42℃45min,70℃15min。將合成的第一鏈cDNA貯存于-20℃?zhèn)溆谩?2)以步驟(1)獲得的第一鏈cDNA為模板，采用引物F1(5′-AAAGCAGCACAAGATGGACACCAACAAGTG-3′)與引物OligodT-adaptor5′-GATTTCTGTCCGACGACTTTTTTTTTTTTTTTTTT-3′進行PCR擴增，得到3’RACEPCR擴增產物。PCR反應體系為：cDNA模板、F1引物與OligodT-adaptor各1μl，10×Buffer2.5μl，dNTPMixture(10mmol/leach)2μl，Taq酶0.25μl，ddH2O12.25μl；反應條件為：94℃預變性5min；94℃30s，55℃30s，72℃60s，共36個循環(huán)；最后72℃延伸10min。(3)反應結束后，對3’RACEPCR擴增產物進行1％瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果如圖2所示。其中，泳道M為TRANS2000DNA分子量標準(北京全式金生物技術有限公司)的DNA分子量標準，泳道1為3’RACEPCR擴增產物。結果表明：經PCR擴增獲得了長度約為1000bp的目的片段。(5)回收并純化3’RACE產物，將其連接到PMD-18T載體上，連接產物轉化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，篩選陽性克隆進行菌液PCR鑒定，提取陽性克隆的質粒進行測序，并對測序結果進行BLAST分析。結果表明，該片段的長度為1006bp，其脫氧核糖核苷酸序列如序列表中序列3所示。二、BpSEM基因5’端序列的克隆(1)根據上述步驟一獲得的BpSEM基因3’端cDNA序列設計引物：R1:5′- TGATGAATATTATTAGTAGTAGAAGTAGCATT-3′。(2)以步驟一提取的經低溫處理的雜交構樹幼苗的總RNA為模板，采用Promega公司的5’RACE試劑盒并參照試劑盒說明書，反轉錄合成其第一鏈cDNA。反應體系及條件如下：1μlRNA，1μl5'-CDSprimerA，1μlSMARTIIAoligo，1μlDTT(20mM)，1μldNTPMix(10mM)，1μlMMLVReverseTranscriptase，2μl5XFirst-StrandBuffer，2μlsterileH2O；70℃2min，冰上2min，42℃1.5h，72℃7min。(3)以步驟(2)獲得的第一鏈cDNA為模板，采用引物R1與引物UPM(Promega公司：Long(0.4μM)：5'-CTAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3'，Short(2μM)：5'-CTAATACGACTCACTATAGGGC-3')配對進行PCR擴增，得到5’RACEPCR擴增產物。PCR反應體系為：1μl50XAdvantage2PolymeraseMix，34.5μlPCR-GradeWater，5μl10XAdvantage2PCRBuffer，1μldNTPMix(10mM)，1μl50XAdvantage2PolymeraseMix，5μlUPM，1μl引物R，2.5μlcDNA模板；反應條件為：94℃30s；68℃30s，70℃60s，共40個循環(huán)；最后70℃延伸10min。(4)反應結束后，對5’RACEPCR擴增產物進行1％瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果如圖3所示。其中，泳道M為TRANS2000DNA分子量標準(北京全式金生物技術有限公司)的DNA分子量標準，泳道1為5’RACEPCR擴增產物。結果表明，經PCR擴增獲得了長度約為500bp的目的片段。(5)回收并純化5’RACE產物，將其連接到PMD-18T載體上，連接產物轉化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，篩選陽性克隆進行菌液PCR鑒定，提取陽性克隆的質粒進行測序，對測序結果進行BLAST分析。結果表明，該片段的長度為532bp，其脫氧核糖核苷酸序列如序列表中序列4所示。三、BpSEM全長cDNA序列的獲得及PCR檢測1、BpSEM全長cDNA序列的獲得利用上述步驟一和步驟二獲得的長度為1006bp和532bp片段之間的重疊區(qū)，借助Contig軟件拼接得到的全長cDNA序列，其脫氧核糖核苷酸序列如序列表中序列2所示，將序列2所示的基因命名為BpSEM，其中，自5’端第193-1071為ORF，編碼由292個氨基酸殘基組成的蛋白質，該蛋白命名為BpSEM，該蛋白的氨基酸序列為序列1。2、PCR檢測(1)根據BpSEM基因全長cDNA序列設計如下引物：F2：5′-GACCATCCCACATAACATTTTCACTTTC-3′；R2：5′-GTGTCAAGACCATCGTCATATATAATAATCACAC-3′。(2)以上述步驟一提取的經低溫處理的雜交構樹幼苗的總RNA經反轉錄合成的第 一鏈cDNA為模板，采用F2和R2進行PCR擴增，得到PCR擴增產物。(3)對PCR擴增產物進行1％瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果如圖4所示。其中，泳道M為TRANS2000DNA分子量標準(北京全式金生物技術有限公司)的DNA分子量標準，泳道1為PCR擴增產物。結果表明，經PCR擴增獲得了長度約為1200bp的片段。(4)回收并純化該產物，將其連接到PMD-18T載體上，連接產物轉化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，篩選陽性克隆進行菌液PCR鑒定，提取陽性克隆的質粒進行測序。測序結果表明，該PCR擴增產物具有序列2所示的核苷酸序列。實施例2、BpSEM在雜交構樹不同組織和細胞中的表達模式分析分別提取雜交構樹不同組織和細胞(正常生長8周的雜交構樹幼苗的頂芽、側芽、根、葉片，雜交構樹的雄花、雌花和果實，及對雜交構樹誘導的胚性愈傷)的總RNA，反轉錄獲得cDNA，并采用定量PCR方法分析BpSEM基因在不同組織和細胞中的表達模式。具體步驟如下：1、引物的設計根據雜交構樹BpSEM的cDNA序列設計其特異性引物QF和QR：并以Bpactin基因作為反應的內參，引物序列如下：QF：5′-TGAGCTAACCCTCAACTCCTACG-3′；QR：5′-TCACACAATCATCATAAATAGAGCATG-3′；Bpactin-F：5′-CCGTGCTCAATGGGATACTTC-3′；Bpactin-R：5′-CCCTCGTCTGTGACAATGGTAC-3′。2、定量PCR分別以正常生長8周的雜交構樹幼苗的頂芽、側芽、根、葉片，雜交構樹的雄花、雌花和果實，及對雜交構樹誘導的胚性愈傷的cDNA為模板，采用上述步驟1設計的引物進行Q-PCR擴增。反應體系為：SYBRGreenMix10μL，QF0.4μL，QR0.4μL，ddH2O7.2μL，cDNA模板2μL(將反轉錄產物稀釋10倍后作為模板)總體積：20μL。實時定量PCR反應采用兩步法完成；反應程序為：95℃60s；95℃15s,65℃45s；40個循環(huán)。所得數(shù)據及Ct值的分析用Mx3000p軟件進行。結果如圖5所示：從圖中看以看出：BpSEM基因在雜交構樹胚性愈傷中的表達水平最高，表現(xiàn)出干細胞維持的特性；在葉片、頂芽、側芽等細胞分裂活動旺盛的區(qū)域，BpSEM基因的表達也相對較高；在雜交構樹其他成熟組織中，如根和果實，BpSEM基因的表達量較低。實施例3、轉錄因子BpSEM的功能驗證一、轉錄因子BpSEM的亞細胞定位1、用限制性內切酶NcoI和SpeI分別對實施例1中的BpSEM基因(序列2)和載體pCAMBIA1302進行雙酶切，連接，得到重組表達載體，將其命名為重組載體pCAMBIA1302-BpSEM。并對其進行測序。經過測序表明：重組載體pCAMBIA1302-BpSEM為將序列表中序列2自5'末端第193-1071位所示的DNA分子替換載體pCAMBIA1302的NcoI和SpeI酶切位點間的DNA片段，且保持載體pCAMBIA1302的其他序列不變得到的載體。2、將5μg上述重組載體pCAMBIA1302-BpSEM轉入到農桿菌EHA105中，得到重組菌pCAMBIA1302-BpSEM/EHA105；將5μg空載體pCAMBIA1302轉入到農桿菌EHA105中，得到重組菌pCAMBIA1302/EHA105。3、將重組菌pCAMBIA1302-BpSEM/EHA105和重組菌pCAMBIA1302/EHA105分別轉化煙草表皮細胞進行瞬時表達，分別得到轉入重組載體pCAMBIA1302-BpSEM的轉基因細胞(圖6A-D)和轉入空載體pCAMBIA1302的轉基因細胞(圖6E-H)。4、將上述轉化后的細胞培養(yǎng)24-48小時后，于DAPI(10mM)中染色10～20min，在激光共聚焦掃描顯微鏡(Bio-RadMRC1024)下觀察并照相。結果如圖6所示：其中，圖6A和圖6E為轉化的煙草表皮細胞在藍光通道下(觀察DAPI，確認細胞核的位置)的形態(tài)，圖6B和圖6F為轉化的煙草表皮細胞在熒光通道下(GFP熒光蛋白的觀察)的形態(tài)，圖6C和圖6G為明視場下的形態(tài)，圖6D和圖6H為三個視場的疊加。從圖中可以看出，轉入空載體pCAMBIA1302的轉基因細胞中表達的蛋白分布在整個細胞內，如圖6F和圖6H；而轉入重組載體pCAMBIA1302-BpSEM的轉基因細胞中表達的蛋白則定位于細胞核內，如圖6B和圖6D。結果表明：BpSEM定位于細胞核內。二、轉錄因子BpSEM的轉錄激活活性分析1、用限制性內切酶BamHI和SalI分別對實施例1中擴增得到的BpSEM基因(序列2)和含有GAL4結合域的酵母表達載體pBridge進行雙酶切，連接，得到的重組載體pBridge-BpSEM。并對其進行測序。測序結果表明：重組載體pBridge-BpSEM為將序列表中序列2自5'末端第193-1071位所示的DNA分子替換酵母表達載體pBridge的BamHI和SalI酶切位點間的DNA片段，且保持酵母表達載體pBridge的其他序列不變得到的載體。2、將重組載體pBridge-BpSEM導入到含有His3和LacZ報道子的酵母AH109株系中，得到含有重組載體pBridge-BpSEM的轉基因酵母；將pBridge載體導入到含有His3和LacZ報道子的酵母AH109株系中，得到含有 pBridge的轉基因酵母，作為陰性對照；將重組載體pBridge-JcERF導入到含有His3和LacZ報道子的酵母AH109株系中，得到含有pBridge-JcERF的轉基因酵母，作為陽性對照。3、將上述步驟2獲得的含有重組載體pBridge-JcERF的轉基因酵母、含有pBridge的轉基因酵母和含有pBridge-JcERF的轉基因酵母分別在不含His和Trp的SD培養(yǎng)基(SD/-His-Trp)上進行培養(yǎng)。結果如圖7所示。圖7A表示各種轉基因酵母在平板上的位置，圖7B表示轉基因酵母在不含His和Trp的SD培養(yǎng)基上的生長狀況，圖7C表示轉基因酵母的β-半乳糖苷酶活性。結果表明，含有pBridge的轉基因酵母在不含His和Trp的SD培養(yǎng)基上不能生長，而含有重組載體pBridge-BpSEM的轉基因酵母和含有pBridge-JcERF的轉基因酵母均能夠在不含His和Trp的SD培養(yǎng)基上生長并顯藍色。說明BpSEM具有轉錄激活活性。實施例4、轉基因植物的獲得一、重組質粒的構建以載體pCAMBIA1300(CAMBIA公司產品)為骨架載體，在HindIII和XbaI酶切位點之間插入序列表的序列5所示的雙鏈DNA分子(CaMV35S啟動子)，XbaⅠ和KpnⅠ酶切位點之間插入序列表的序列2自5'末端第193-1071位所示的雙鏈DNA分子，得到重組質粒甲。以載體pCAMBIA1300(CAMBIA公司產品)為骨架載體，在HindIII和XbaI酶切位點之間插入序列表的序列5所示的雙鏈DNA分子(CaMV35S啟動子)，得到重組質粒乙。二、轉基因植株的獲得1、將步驟一得到的重組質粒甲導入根癌農桿菌GV3101，得到重組農桿菌。2、取步驟1得到的重組農桿菌，通過浸花法轉染哥倫比亞生態(tài)型擬南芥，然后培育植株并收獲種子，即為T1代種子。3、將步驟2得到的種子播種于含300mg/L潮霉素的MS固體培養(yǎng)基，篩選抗性植株(T1代植株)。4、提取T1代植物的基因組DNA，進行PCR鑒定。PCR鑒定的引物對如下：QF：5′-TGAGCTAACCCTCAACTCCTACG-3′；QR：5′-TCACACAATCATCATAAATAGAGCATG-3′。如果PCR鑒定為陽性(PCR擴增得到約280bp的擴增產物)，該植株即為轉基因植株。每個植株的后代即為一個株系。5、將步驟4中PCR鑒定為陽性的植株自交并收獲種子(T2代種子)。6、將步驟5得到的種子培育為植株(T2代植株)并單株收種子(T3代種子)。7、將T3代種子播種到含300mg/L潮霉素的MS固體培養(yǎng)基，篩選抗性不分離的純合單株(即篩選其T3代種子不發(fā)生抗性分離的T2代植株，該植株為純合的轉基因植株)，將其種子(T3代種子)進行步驟三的各項檢測和鑒定。三、轉空載體植株的獲得用重組質粒乙代替重組質粒甲進行步驟二，得到轉空載體植株。四、抗旱性待測種子如下：L4株系(100粒T3代種子)、L15株系(100粒T3代種子)、轉空載體植株(100粒T3代種子)和哥倫比亞生態(tài)型擬南芥(100粒種子)。L4株系和L15株系為隨機取的兩個純合的轉基因株系。在裝有相同重量土的花盆中播種待測種子并培養(yǎng)，從播種開始計時，第1-14天正常管理，第15-25天干旱處理(干旱處理即持續(xù)不澆水)，第26天開始正常管理(恢復澆水，簡稱復水)。第28天結束時(復水3天后)統(tǒng)計存活率。哥倫比亞生態(tài)型擬南芥的存活率為5％，轉空載植株的存活率為5％，L4株系的存活率為100％，L15株系的存活率為99％。結果表明，與哥倫比亞生態(tài)型擬南芥相比，L4株系和L15株系的抗旱性顯著增加。當前第1頁1 2 3