技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種混源單萜生物堿類化合物(hybrid monoterpenoid-alkaloid)化合物及其制備方法與應(yīng)用，特別是涉及一種對海洋污損生物藤壺Balanus amphitrite幼蟲具有極強(qiáng)的抑制活性的混源單萜生物堿類化合物及其制備方法與應(yīng)用。

背景技術(shù)：

海洋生物污損是有機(jī)分子、微生物、動物、植物、以及它們的副產(chǎn)物在海洋潛沒設(shè)施表面的危害性積聚。這種危害性積聚經(jīng)常發(fā)生在沒有保護(hù)的海洋潛沒設(shè)施的表面，包括海運(yùn)和旅游的船舶，海軍軍艦，熱交換器，海洋傳感器以及水產(chǎn)養(yǎng)殖基地等。生物污損引起了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，僅以美國海軍軍艦為例，每年在這方面的經(jīng)濟(jì)損失在18到26億美元之間，而美國海軍軍艦數(shù)量僅占全球船舶數(shù)量的0.5%，因此海洋生物污損是極其嚴(yán)重的自然危害。藤壺因其很強(qiáng)的黏附能力是目前所知的污損生物中非常普遍的代表性生物。自2008年全球取消了有毒防污劑有機(jī)錫的使用后，尋找安全高效的海洋防污劑成為國際上急需解決的課題。海洋天然產(chǎn)物被認(rèn)為是新型海洋防污劑的重要來源。實(shí)際上，在過去的幾十年里已經(jīng)從海綿，珊瑚和海藻等海洋生物中發(fā)現(xiàn)了很多有強(qiáng)抗污損活性的化合物。然而，從上述大型生物中發(fā)現(xiàn)的活性化合物由于受到量的限制而大大影響了其潛在的應(yīng)用。海洋微生物由于在實(shí)驗(yàn)室中可以大規(guī)模發(fā)酵，不易破壞自然環(huán)境，而成為活性海洋化合物的最重要來源。然而，近年來尚未見到從海洋微生物中獲得有重要抗污損活性的混源單萜生物堿類化合物作為防污劑的使用。（J.A. Callow, M.E. Callow, Nat. Commun. 2011, 2, 244–253； C.M. Kirschner, A.B. Brennan, Annu. Rev. Mater. Res.2012, 42, 1–19； M. Schultz, J. Bendick, E. Holm, W. Hertel, Biofouling2011, 27, 87–98；N. Fusetani, Nat. Prod. Rep.2004, 21, 94–104；N. Fusetani, Nat. Prod. Rep. 2011, 28, 400–410；P.-Y. Qian, Y. Xu, N. Fusetani, Biofouling2010, 26, 223–234。）

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種來源于海洋真菌的混源單萜生物堿類化合物及其制備方法與作為海洋防污劑的應(yīng)用，它能滿足現(xiàn)有技術(shù)的上述需求。菌種保藏信息：保藏單位名稱：中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心；保藏單位地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路 1 號院 3 號 中國科學(xué)院微生物研究所；保藏日期：2012年12月17日；保藏編號：CGMCC6959；分類命名：Scopulariopsis sp.。

本發(fā)明提供式I化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽:

，或其藥學(xué)上可接受的鹽。

本發(fā)明提供式I化合物的制備方法，其特征在于先在菌種培養(yǎng)基中對分離自柳珊瑚Carijoa sp.的內(nèi)生真菌Scopulariopsis sp. (TA01-33) 進(jìn)行菌種培養(yǎng)，再在發(fā)酵培養(yǎng)基中對該真菌進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，然后將所得發(fā)酵液過濾，除去菌體，將濾液濃縮后，用乙酸乙酯萃??；萃取液濃縮后分別進(jìn)行正相硅膠柱層析、Sephadex LH-20 凝膠柱層析后，再經(jīng)HPLC高效液相制備色譜，將所得洗脫液濃縮，即為式I化合物。

上述制備方法中菌種培養(yǎng)基優(yōu)選含有葡萄糖0.1%–5.0%（重量百分比，下同）、酵母膏0.01%–1%、蛋白胨0.01%–1%、瓊脂0.1%–3.0%、氯化鈉0.05%–5%，其余為水，培養(yǎng)溫度優(yōu)選為0–30°C，培養(yǎng)時間優(yōu)選為3–15天；發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)選含有葡萄糖0.1%–5.0%（重量百分比，下同）、酵母膏0.01%–1%、蛋白胨0.01%–1%、氯化鈉0.05%–5%，其余為水，培養(yǎng)溫度優(yōu)選為0–30°C，培養(yǎng)時間優(yōu)選為10–60天；所述的正相硅膠柱層析采用的固定相優(yōu)選200–300目硅膠，流動相優(yōu)選體積比為5%–95%的乙酸乙酯-石油醚混合溶劑；所述Sephadex LH-20 凝膠柱層析采用的流動相優(yōu)選體積比為石油醚:氯仿:甲醇=2:1:1的混合溶劑；所述HPLC高效液相制備色譜中采用的色譜柱為本領(lǐng)域常規(guī)ODS C18柱，優(yōu)選為Kromasil 10×250 mm, 7 μm，流速優(yōu)選為1.0–5.0 mL/min，流動相優(yōu)選體積比為5%–95%的甲醇-水混合溶劑。

本發(fā)明從海洋真菌中獲得的混源單萜二氫喹啉酮化合物對海洋污損生物藤壺Balanus amphitrite幼蟲具有極強(qiáng)的抑制活性，可用于開發(fā)海洋防污劑，應(yīng)用前景廣闊。

本發(fā)明的另一實(shí)施方案提供式I化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽在制備海洋防污劑中的應(yīng)用。

本發(fā)明中術(shù)語“藥學(xué)上可接受的鹽”是指非毒性的無機(jī)或有機(jī)酸和/或堿的加成鹽。可參見“Salt selection for basic drugs”, Int. J. Pharm. (1986), 33, 201–217。

為了便于對本發(fā)明的進(jìn)一步理解，下面提供的實(shí)施例對其做了更詳細(xì)的說明。但是這些實(shí)施例僅供更好的理解發(fā)明而并非用來限定本發(fā)明的范圍或?qū)嵤┰瓌t，本發(fā)明的實(shí)施方式不限于以下內(nèi)容。

實(shí)施例1

柳珊瑚內(nèi)生真菌Scopulariopsis sp.(TA01-33)的菌種培養(yǎng)

菌種培養(yǎng)所用的培養(yǎng)基含有葡萄糖1.0%（重量百分比，下同）、酵母膏0.2%、蛋白胨0.2%、瓊脂1.0%、氯化鈉3.0%，其余為水，使用時制成試管斜面，真菌菌株在30℃ 下培養(yǎng)5天。

柳珊瑚內(nèi)生真菌Scopulariopsis sp.(TA01-33)的發(fā)酵

發(fā)酵培養(yǎng)所用的培養(yǎng)基含有葡萄糖1.0%（重量百分比，下同）、酵母膏0.2%、蛋白胨0.2%、氯化鈉3.0%，其余為水；真菌菌株于28℃培養(yǎng)60天。

(3) 式I化合物的提取分離

取10 L步驟（2）得到的發(fā)酵液過濾，除去菌體，將濾液濃縮后，用等體積的乙酸乙酯萃取5次；萃取液濃縮后分別進(jìn)行正相硅膠柱層析（固定相為200–300目硅膠；流動相為30%乙酸乙酯/石油醚混合溶劑，體積比）、Sephadex LH-20 凝膠柱層析（石油醚：氯仿：甲醇=2：1：1的混合溶劑，體積比）后，再經(jīng)HPLC高效液相制備色譜分離（色譜柱為Kromasil 10×250 mm，7μm，流速為 2.0 mL/min，流動相為75%的甲醇-水混合溶劑，體積比），將所得洗脫液濃縮，得無色結(jié)晶，即為式I化合物。

式I化合物的結(jié)構(gòu)確證數(shù)據(jù): 無色結(jié)晶; [α]²⁴_D = +133.5 (c 0.017, MeOH); ¹H NMR (acetone-d₆, 400 MHz, TMS) 和 ¹³C NMR (acetone-d₆, 100 MHz, TMS), 見表1; 紅外IR(KBr) ν_max 3366, 2926, 1687, 1600, 1421 and 1107 cm^–1; 紫外UV (MeOH) λ_max (log ε): 204.8 (0.69), 211.2 (0.64), 252.8 (0.13), 281.6 (0.05) nm; 質(zhì)譜EIMS m/z 437 [M]^{+; 高分辨質(zhì)譜HREIMS m/z 437.2200 [M]+ (calcd for C₂₆H₃₁NO₅, 437.2197).}

表1 式I化合物的核磁數(shù)據(jù)

實(shí)施例2

（1）柳珊瑚內(nèi)生真菌Scopulariopsis sp.(TA01-33)的菌種培養(yǎng)

菌種培養(yǎng)所用的培養(yǎng)基含有葡萄糖0.1%–5.0%（重量百分比，下同）、酵母膏0.01%–1%、蛋白胨0.01%–1%、瓊脂0.1%–3.0%、氯化鈉0.05%–5%，其余為水，使用時制成試管斜面，真菌菌株在0–30℃下培養(yǎng)3–15天。

（2）柳珊瑚內(nèi)生真菌Scopulariopsis sp.(TA01-33)的發(fā)酵

發(fā)酵培養(yǎng)所用的培養(yǎng)基含有葡萄糖0.1%–5.0%（重量百分比，下同）、酵母膏0.01%–1%、蛋白胨0.01%–1%、氯化鈉0.05%–5%，其余為水，真菌菌株于0–30℃培養(yǎng)10–60天。

(3) 式I化合物的提取分離

取5–50 L步驟（2）所得的發(fā)酵液過濾，除去菌體，將濾液濃縮后，用1–3倍體積的乙酸乙酯萃取2–5次；萃取液濃縮后分別進(jìn)行正相硅膠柱層析（固定相為本領(lǐng)域常規(guī)正相硅膠，流動相為5%–95%的乙酸乙酯-石油醚混合溶劑，體積比）、Sephadex LH-20 凝膠柱層析（流動相為石油醚:氯仿:甲醇=2:1:1的混合溶劑，體積比）后，再經(jīng)HPLC高效液相制備色譜（色譜柱為本領(lǐng)域常規(guī)ODS C18柱，流速為1.0–5.0 mL/min，流動相為5%–95%的甲醇-水混合溶劑，體積比），將所得洗脫液濃縮，得無色結(jié)晶，即為式I化合物。其中式Ⅰ化合物的結(jié)構(gòu)確證數(shù)據(jù)與實(shí)施例1中相應(yīng)數(shù)據(jù)一致。

實(shí)施例1–2中未具體指明的其他菌種培養(yǎng)、發(fā)酵條件，以及正相硅膠柱色譜分離、Sephadex LH-20 凝膠柱層析分離、高效液相色譜分離等其他實(shí)驗(yàn)操作條件均為本領(lǐng)域常規(guī)的實(shí)驗(yàn)操作條件，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以根據(jù)實(shí)際需要，進(jìn)行合理的選擇。

實(shí)施例3

在菌種培養(yǎng)基中對海洋真菌Scopulariopsis sp.(TA01-33)進(jìn)行菌種培養(yǎng)，再在發(fā)酵培養(yǎng)基中對該真菌進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，將所得發(fā)酵液過濾，除去菌體，將濾液濃縮后，用乙酸乙酯萃??；萃取液濃縮后分別進(jìn)行正相硅膠柱層析、Sephadex LH-20 凝膠柱層析后，再經(jīng)HPLC高效液相制備色譜，將所得洗脫液濃縮，得無色晶體，即為式I化合物，其結(jié)構(gòu)確證數(shù)據(jù)與實(shí)施例1中相應(yīng)數(shù)據(jù)一致。其中所述菌種培養(yǎng)基中含有葡萄糖、酵母膏、蛋白胨、瓊脂、粗海鹽、水，所述發(fā)酵培養(yǎng)基中含有大米、粗海鹽、蛋白胨、水；所述的色譜分離為正相硅膠柱色譜分離、Sephadex LH-20 凝膠柱層析和高效液相色譜分離。

為了探索更廣泛的適用于制備本發(fā)明式Ⅰ化合物的方法，本實(shí)施例中菌種培養(yǎng)基、發(fā)酵培養(yǎng)基中各成分的添加，均按本領(lǐng)域中常規(guī)比例添加或按任意比例添加，色譜分離時所用硅膠的規(guī)格、Sephadex LH-20 凝膠的規(guī)格、色譜柱的型號及洗脫溶劑的選擇，均為本領(lǐng)域的常規(guī)選擇。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，上述常規(guī)選擇的制備方法，均能得到發(fā)明的無色晶體，即式Ⅰ化合物，其結(jié)構(gòu)確證數(shù)據(jù)與實(shí)施例1中相應(yīng)數(shù)據(jù)一致，僅僅存在個別化合物在純度及收率方面的微小差異。

實(shí)施例1–3的結(jié)果表明，按照本領(lǐng)域常規(guī)的菌種培養(yǎng)、發(fā)酵條件，常規(guī)的正相硅膠柱色譜分離、Sephadex LH-20 凝膠柱色譜分離、高效液相色譜分離的條件對海洋真菌Scopulariopsis sp.(TA01-33)進(jìn)行菌種培養(yǎng)、發(fā)酵、分離純化，均能得到本發(fā)明式Ⅰ結(jié)構(gòu)的化合物。本發(fā)明式Ⅰ化合物的制備方法，優(yōu)選實(shí)施例1–2中記載的方法。

實(shí)施例4

本發(fā)明的式I化合物對藤壺Balanus amphitrite幼蟲附著活性試驗(yàn)按照如下文獻(xiàn)方法測試：Thiyagarajan, V.; Harder, T.; Qiu, J. W.; Qian, P. Y. Mar. Biol. (Berlin) 2003, 143, 543–554.

本發(fā)明的式I化合物及其晶體藤壺B. amphitrite幼蟲附著具有極強(qiáng)的抑制活性，其EC₅₀ 值為0.045 μg/mL，而具有很高的安全性，其毒性功效比值LC₅₀/EC₅₀值222。上述活性遠(yuǎn)遠(yuǎn)強(qiáng)于美國海軍規(guī)定的潛在的天然防污損化合物EC₅₀值25 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)。更重要的是，它的毒性功效比值 (LC₅₀/EC₅₀) 遠(yuǎn)大于15，而LC₅₀/EC₅₀ 大于15就被認(rèn)為具有開發(fā)成安全防污劑的潛力。這表明式I化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽可用于制備高效低毒的海洋防污劑，并且柳珊瑚內(nèi)生真菌Scopulariopsis sp.(TA01-33)可進(jìn)行大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)，保證了式I化合物的天然來源，具有廣闊的應(yīng)用前景。