本發(fā)明屬于酶制劑領(lǐng)域，特別涉及一種固定化β-葡萄糖苷酶的制備方法。

背景技術(shù)：

纖維素是地球上儲量最大的高分子碳水化合物，為可再生能源和材料領(lǐng)域提供了豐富的原料。纖維素的生物轉(zhuǎn)化是纖維素原料的一項重要轉(zhuǎn)化技術(shù)，纖維素酶的分離純化制備是其中的關(guān)鍵技術(shù)環(huán)節(jié)。纖維素酶是糖苷水解酶的多組分復(fù)合酶系，按照催化功能被分為3類組分：內(nèi)切葡聚糖酶；外切葡聚糖酶，即纖維二糖水解酶和β-葡萄糖苷酶[12,19～21]。

β-葡萄糖苷酶是主要作用于β-(1，4)糖苷鍵，還作用于β-(1，1)、(1，2)、(1，3)、(1，6)糖苷鍵。它能夠水解結(jié)合于末端非還原性的β-D-葡萄糖苷鍵，同時釋放出β-D-葡萄糖和相應(yīng)的配基。纖維素酶在催化水解纖維素時首先由葡聚糖內(nèi)切酶作用于微纖維的非結(jié)晶區(qū)，使其露出許多末端供外切酶作用，外切葡聚糖酶(纖維二糖水解酶)從非還原末端依次分解，產(chǎn)生纖維二糖，部分降解的纖維素進一步由葡聚內(nèi)切酶和外切酶協(xié)同作用，分解生成纖維二糖、三糖等低聚糖，最后由β-葡萄糖苷酶作用分解成葡萄糖。在這個過程，β-葡萄糖苷酶起到關(guān)鍵作用，而在纖維素酶組分中β-葡萄糖苷酶含量少、活力低，制約了酶系中內(nèi)切葡聚糖酶和外切葡聚糖酶發(fā)揮最大的作用，從而導(dǎo)致水解糖液中纖維二糖積累，降低了后續(xù)發(fā)酵可利用的糖量，成為纖維素酶解的瓶頸，往往在纖維素酶解過程中需要額外添加β-葡萄糖苷酶。

固定化酶技術(shù)是提高酶穩(wěn)定性、使用率及降低成本的一個重要技術(shù)，主要包括包埋法；吸附法；共價法，交聯(lián)法四種。這四種方法各有利弊，主要體現(xiàn)在固定化酶的負載量和酶活上。由于酶是生物活性物質(zhì)，其對溫度，pH值等條件參數(shù)非常敏感，所以酶固定化方法對于不同的酶具有特定性。本發(fā)明針對特定的單組份β-葡萄糖苷酶，采用果糖做模板(致孔劑)，通過正硅酸乙酯(TEOS)水解反應(yīng)溶膠-凝膠法來制備固定化β-葡萄糖苷酶。通過加入不同 濃度的果糖水溶液和不同劑量的β-葡萄糖苷酶來制備不同的固定化β-葡萄糖苷酶樣品。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于針對β-葡萄糖苷酶生產(chǎn)及使用成本高，易于被木質(zhì)纖維素底物中的木質(zhì)素?zé)o效吸附發(fā)生失活的問題，以溶膠-凝膠包埋法制備固定化β-葡萄糖苷酶。將第一次壓榨得到的高濃度糖汁直接蒸發(fā)、濃縮、結(jié)晶得到蔗糖，結(jié)晶母液(糖蜜)與蔗渣混合后固體發(fā)酵生產(chǎn)乙醇。本發(fā)明的甘蔗利用方法，高效利用了其中的蔗糖，降低了蔗糖生產(chǎn)的成本，緩解了蔗糖和乙醇生產(chǎn)過程中的污染問題。

本發(fā)明提供一種固定化β-葡萄糖苷酶的制備方法，包括如下步驟：

采用果糖做致孔劑，通過正硅酸乙酯水解反應(yīng)溶膠-凝膠法來制備固定化β-葡萄糖苷酶。

本發(fā)明所述的固定化β-葡萄糖苷酶的制備方法，優(yōu)選的是，包括如下步驟：

(1)一定量的正硅酸乙酯與水混合，加入鹽酸，在鹽酸催化下，惰性氣體中攪拌，然后將溫度升至55-65℃時回流1-2h，之后冷卻至室溫，得反應(yīng)混合液；

(2)將所述反應(yīng)混合液抽真空，直至失重50％以上；

(3)向步驟(2)抽真空后的反應(yīng)液中加入定量的果糖水溶液，攪拌均勻，加入欲固定化的β-葡萄糖苷酶，攪拌，低溫靜置下凝膠化，得凝膠化的固定化β-葡萄糖苷酶；

(4)將所述凝膠化的固定化β-葡萄糖苷酶樣品真空干燥至恒重，機械粉碎成20目的顆粒。

本發(fā)明所述的固定化β-葡萄糖苷酶的制備方法，其中，所述欲固定化的β-葡萄糖苷酶優(yōu)選為單組份的β-葡萄糖苷酶，且加入時用緩沖液進行稀釋加入。

本發(fā)明所述的固定化β-葡萄糖苷酶的制備方法，其中，所述緩沖液為醋酸緩沖液，pH值優(yōu)選為4.0-5.0。

本發(fā)明所述的固定化β-葡萄糖苷酶的制備方法，其中，步驟(3)中，所述果糖水溶液中果糖的質(zhì)量分數(shù)優(yōu)選在0-70％。

本發(fā)明所述的固定化β-葡萄糖苷酶的制備方法，其中，步驟(1)所述反應(yīng)混合液中，正硅酸乙酯與水的摩爾比優(yōu)選為1:2。

本發(fā)明所述的固定化β-葡萄糖苷酶的制備方法，其中，步驟(3)所述凝膠化的固定化β-葡萄糖苷酶中，β-葡萄糖苷酶的用量優(yōu)選在500-2000IU/g凝膠。

本發(fā)明所述的固定化β-葡萄糖苷酶的制備方法，其中，步驟(3)中，所述凝膠化時間優(yōu)選為1-4天。

本發(fā)明的β-葡萄糖苷酶固定化方法，其優(yōu)點在于：

(1)β-葡萄糖苷酶酶負載量高，達到90％以上；

(2)酶活穩(wěn)定，連續(xù)使用30天，酶活僅下降5％以內(nèi)；

(3)模板分子價格低廉，水洗法就可以去除，去除方法簡單無污染。

本發(fā)明通過固定化β-葡萄糖苷酶，可顯著提高β-葡萄糖苷酶的酶活穩(wěn)定性，增加重復(fù)利用次數(shù)，對于降低木質(zhì)纖維素酶解轉(zhuǎn)化成本，提高酶解轉(zhuǎn)化效率具有顯著價值。

附圖說明

圖1是用掃描電子顯微鏡觀察到的50％果糖以及1.155mL酶的固定化β-葡萄糖甘酶的表面的掃描電鏡圖；

圖2是用掃描電子顯微鏡觀察到的50％果糖以及2.31mL酶的固定化β-葡萄糖甘酶的表面的掃描電鏡圖；

圖3是用掃描電子顯微鏡觀察到的60％果糖以及1.155mL酶的固定化β-葡萄糖甘酶的表面的掃描電鏡圖；

圖4是用掃描電子顯微鏡觀察到的60％果糖以及2.31mL酶的固定化β-葡萄糖甘酶的表面的掃描電鏡圖；

圖5是用掃描電子顯微鏡觀察到的70％果糖以及0.5mL酶的固定化β-葡萄糖甘酶的表面的掃描電鏡圖；

圖6是用掃描電子顯微鏡觀察到的70％果糖以及4.61mL酶的固定化β-葡萄糖甘酶的表面的掃描電鏡圖。

具體實施方式

以下對本發(fā)明的實施例作詳細說明：本實施例在以本發(fā)明技術(shù)方案為前提下進行實施，給出了詳細的實施方式和過程，但本發(fā)明的保護范圍不限于下述的實施例，下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件。

緩沖液：

在本發(fā)明中，對緩沖液并無特別限定，通常所述緩沖液為醋酸緩沖液，pH值為4.0-5.0；

如果pH值小于4.0，由于pH值過小，造成水凝膠迅速固化，無法實現(xiàn)均勻混合，而pH值大于5.0，由于pH值過大，造成酶酶失活，并無其他有益效果。

步驟(3)中，所述果糖水溶液中果糖的質(zhì)量分數(shù)：

在本發(fā)明中，對步驟(3)中，所述果糖水溶液中果糖的質(zhì)量分數(shù)并無特別限定，通常步驟(3)中，所述果糖水溶液中果糖的質(zhì)量分數(shù)在40-70％；

如果步驟(3)中，所述果糖水溶液中果糖的質(zhì)量分數(shù)小于40％，由于果糖的質(zhì)量分數(shù)過小，造成材料有效孔道體積降低，而步驟(3)中，所述果糖水溶液中果糖的質(zhì)量分數(shù)大于70％，由于果糖的質(zhì)量分數(shù)過高，造成果糖浪費，并無其他有益效果。

正硅酸乙酯與水的摩爾比：

在本發(fā)明中，對正硅酸乙酯與水的摩爾比并無特別限定，通常步驟(1)所述反應(yīng)混合液中，正硅酸乙酯與水的摩爾比為1:2；

如果正硅酸乙酯與水的摩爾比小于1:2，由于正硅酸乙酯的用量過小，造成后續(xù)抽真空步驟無法預(yù)知減重質(zhì)量，導(dǎo)致無法形成水凝膠，而正硅酸乙酯與水的摩爾比大于1:2，由于正硅酸乙酯用量過多，造成浪費，且正硅酸乙酯的反應(yīng)不充分，并無其他有益效果。

β-葡萄糖苷酶的用量：

在本發(fā)明中，對β-葡萄糖苷酶的用量并無特別限定，通常步驟(3)所述凝膠化的固定化β-葡萄糖苷酶中，β-葡萄糖苷酶的用量在500-2000IU/g凝膠；

如果β-葡萄糖苷酶的用量小于500IU/g，由于β-葡萄糖苷酶的用量過小，造成單位有效酶活過低，而凝膠β-葡萄糖苷酶的用量大于2000IU/g，由于凝膠β-葡萄糖苷酶的用量過多，造成浪費，且容易發(fā)生包埋不完全，并無其他有益效果。

凝膠化時間：

在本發(fā)明中，對凝膠化時間并無特別限定，通常步驟(3)中，所述凝膠化時間為1-4天；

如果凝膠化時間小于1天，由于時間過短，造成凝膠化不徹底，材料強度差；而凝膠化時間為超過4天，由于時間過長，造成時間浪費，并無其他有 益效果。

實施例1

在500mL的三口圓底燒瓶中加入32g正硅酸乙酯，7.5mL 0.034mol的鹽酸，在氮氣氣氛下，磁力攪拌(1500rpm)15min，然后將水浴的溫度升高，升到60℃時回流1h,然后冷卻至室溫，去氮氣。

在磁力攪拌下抽真空，直至失重50％左右。加入50％果糖水溶液，攪拌均勻，然后超聲5min，以除掉氣泡。將得到的液體平均分到3個100mL的小燒杯中，加入酶液(β-葡萄糖苷酶和50mM，pH5.0的醋酸緩沖液的混合液)1.155mL，攪拌2min,用保鮮膜密封，并在膜上扎30～40個孔，放入4℃的冰箱中48h，使其凝膠化。

48h后，將凝膠化的固定化β-葡萄糖苷酶樣品放入真空干燥箱中真空干燥，至重量不在變化，然后研磨樣品，并將研磨的樣品過20目篩，得到小于等于20目的粉末。

用掃描電子顯微鏡(SEM)觀察固定化β-葡萄糖苷酶的表面，詳見圖1、圖2、圖3、圖4、圖5、圖6。

實施例2

在500mL的三口圓底燒瓶中加入32g正硅酸乙酯，7.5mL 0.034mol的鹽酸，在氮氣氣氛下，磁力攪拌(1500rpm)15min，然后將水浴的溫度升高，升到55℃時回流2h,然后冷卻至室溫，去氮氣。

在磁力攪拌下抽真空，直至失重50％左右。加入50％果糖水溶液，攪拌均勻，然后超聲5min，以除掉氣泡。將得到的液體平均分到3個100mL的小燒杯中，加入酶液(β-葡萄糖苷酶和50mM，pH5.0的醋酸緩沖液的混合液)2.31mL，攪拌2min,用保鮮膜密封，并在膜上扎30～40個孔，放入4℃的冰箱中96h，使其凝膠化。

96h后，將凝膠化的固定化β-葡萄糖苷酶樣品放入真空干燥箱中真空干燥，至重量不在變化，然后研磨樣品，并將研磨的樣品過20目篩，得到小于等于20目的粉末。

實施例3

在500mL的三口圓底燒瓶中加入32g正硅酸乙酯，7.5mL 0.034mol的鹽酸，在氮氣氣氛下，磁力攪拌(1500rpm)15min，然后將水浴的溫度升高，升到65℃時回流1h,然后冷卻至室溫，去氮氣。

在磁力攪拌下抽真空，直至失重50％左右。加入60％果糖水溶液，攪拌均勻，然后超聲5min，以除掉氣泡。將得到的液體平均分到3個100mL的小燒杯中，加入酶液(β-葡萄糖苷酶和50mM，pH5.0的醋酸緩沖液的混合液)1.155mL，攪拌2min,用保鮮膜密封，并在膜上扎30～40個孔，放入4℃的冰箱中48h，使其凝膠化。

48h后，將凝膠化的固定化β-葡萄糖苷酶樣品放入真空干燥箱中真空干燥，至重量不在變化，然后研磨樣品，并將研磨的樣品過20目篩，得到小于等于20目的粉末。

實施例4

在500mL的三口圓底燒瓶中加入32g正硅酸乙酯，7.5mL 0.034mol的鹽酸，在氮氣氣氛下，磁力攪拌(1500rpm)15min，然后將水浴的溫度升高，升到60℃時回流1.5h,然后冷卻至室溫，去氮氣。

在磁力攪拌下抽真空，直至失重50％左右。加入60％果糖水溶液，攪拌均勻，然后超聲5min，以除掉氣泡。將得到的液體平均分到3個100mL的小燒杯中，加入酶液(β-葡萄糖苷酶和50mM，pH5.5的醋酸緩沖液的混合液)2.31mL，攪拌4min,用保鮮膜密封，并在膜上扎30～40個孔，放入4℃的冰箱中96h，使其凝膠化。

96h后，將凝膠化的固定化β-葡萄糖苷酶樣品放入真空干燥箱中真空干燥，至重量不在變化，然后研磨樣品，并將研磨的樣品過20目篩，得到小于等于20目的粉末。

實施例5

在500mL的三口圓底燒瓶中加入32g正硅酸乙酯，7.5mL 0.034mol的鹽酸，在氮氣氣氛下，磁力攪拌(1500rpm)15min，然后將水浴的溫度升高，升到60℃時回流1h,然后冷卻至室溫，去氮氣。

在磁力攪拌下抽真空，直至失重50％左右。加入70％果糖水溶液，攪拌均勻，然后超聲5min，以除掉氣泡。將得到的液體平均分到3個100mL的小燒杯中，加入酶液(β-葡萄糖苷酶和50mM，pH5.0的醋酸緩沖液的混合液)0.5mL，攪拌2min,用保鮮膜密封，并在膜上扎30～40個孔，放入4℃的冰箱中48h，使其凝膠化。

48h后，將凝膠化的固定化β-葡萄糖苷酶樣品放入真空干燥箱中真空干燥，至重量不在變化，然后研磨樣品，并將研磨的樣品過20目篩，得到小于等于20目的粉末。

實施例6

在500mL的三口圓底燒瓶中加入32g正硅酸乙酯，7.5mL 0.034mol的鹽酸，在氮氣氣氛下，磁力攪拌(1500rpm)15min，然后將水浴的溫度升高，升到60℃時回流1h,然后冷卻至室溫，去氮氣。

在磁力攪拌下抽真空，直至失重50％左右。加入50％果糖水溶液，攪拌均勻，然后超聲5min，以除掉氣泡。將得到的液體平均分到3個100mL的小燒杯中，加入酶液(β-葡萄糖苷酶和50mM，pH4.0的醋酸緩沖液的混合液)2.31mL，攪拌2min,用保鮮膜密封，并在膜上扎30～40個孔，放入4℃的冰箱中48h，使其凝膠化。

48h后，將凝膠化的固定化β-葡萄糖苷酶樣品放入真空干燥箱中真空干燥，至重量不在變化，然后研磨樣品，并將研磨的樣品過20目篩，得到小于等于20目的粉末。

實施例7

在500mL的三口圓底燒瓶中加入32g正硅酸乙酯，7.5mL 0.034mol的鹽酸，在氮氣氣氛下，磁力攪拌(1500rpm)15min，然后將水浴的溫度升高，升到60℃時回流1h,然后冷卻至室溫，去氮氣。

在磁力攪拌下抽真空，直至失重50％左右。加入70％果糖水溶液，攪拌均勻，然后超聲5min，以除掉氣泡。將得到的液體平均分到3個100mL的小燒杯中，加入酶液(β-葡萄糖苷酶和50mM，pH5.0的醋酸緩沖液的混合液)4.61mL，攪拌2min,用保鮮膜密封，并在膜上扎30～40個孔，放入4℃的冰 箱中96h，使其凝膠化。

96h后，將凝膠化的固定化β-葡萄糖苷酶樣品放入真空干燥箱中真空干燥，至重量不在變化，然后研磨樣品，并將研磨的樣品過20目篩，得到小于等于20目的粉末。