用于在人ezh2基因中檢測(cè)突變的方法和組合物的制作方法
【專(zhuān)利說(shuō)明】用于在人EZH2基因中檢測(cè)突變的方法和組合物 發(fā)明領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明設(shè)及癌癥診斷學(xué)和癌癥治療的伴隨診斷學(xué)。具體而言，本發(fā)明設(shè)及突變檢 測(cè)，所述突變檢測(cè)對(duì)于診斷和預(yù)后W及預(yù)測(cè)癌癥治療效果是有用的。
[0002] 發(fā)明背景 EZH2是祀向組蛋白的染色質(zhì)修飾酶。具體而言，EZ肥蛋白為多梳抑制復(fù)合物2(PRC2)的 催化亞基，其為對(duì)組蛋白3(H3)的賴(lài)氨酸-27(Κ27)特異性的組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶。甲基化的 Η3-Κ27與基因抑制相關(guān)。異常升高的ΕΖΗ2水平已在多種癌組織中發(fā)現(xiàn)且與基因抑制相關(guān)， 綜述于Simon, J.,和Lange, C. (2008) Roles of EZH2 histone methyltransferase in cancer epigenetics, Mut.Res.647:21。還發(fā)現(xiàn)特定突變通過(guò)改變EZ肥蛋白的底物偏好而 改變其組蛋白修飾功能。在位置Y646處突變的EZH2(參見(jiàn)Wiggle, T.，等（2011) FEBS Lett. 585: 3011)在將二甲基化的H3化3K27me2)甲基化為Ξ甲基化形式化3K27me3)中有異 ?；钚浴Ｔ谖恢肁692處突變的EZH2(參見(jiàn)Majer, C.，等（2012) F邸S Lett, 586:3348)對(duì)二 甲基化是有異常活性的；且在位置4682處突變的62肥（參見(jiàn)1成曰66，1.，等（2012)，？麻8 109:2989)對(duì)所有Ξ個(gè)甲基化步驟是有異?；钚缘摹Ｔ谌税┌Y中，運(yùn)些突變已顯示促進(jìn)經(jīng)組 蛋白超甲基化的基因抑制。
[0003] 已發(fā)展了祀向EZH2的療法。EZH2的選擇性小分子抑制劑已顯示阻斷EZH2(和PRC2) 活性并促進(jìn)體外殺死癌細(xì)胞化nutson, S,等（2012)化1:ure Qiem.Bio.8:890)。該抑制劑 對(duì)于殺死具有異?；钚缘耐蛔凅wEZH2的細(xì)胞是獨(dú)特有效的且不影響具有野生型EZH2的細(xì) 胞（同上）。因此，伴隨診斷測(cè)試對(duì)于鑒定其腫瘤具有突變體EZH2且將可能從EZH2抑制劑中 受益的患者是必需的。EZH2突變的臨床檢測(cè)W足夠的靈敏度祀向盡可能多的突變是有必要 的。運(yùn)將保證具有稀有突變的患者不會(huì)接到"假陰性"的檢測(cè)結(jié)果從而錯(cuò)過(guò)了有可能會(huì)保全 性命的治療。同時(shí)，測(cè)試應(yīng)是高度特異性的W確?；颊卟粫?huì)接受"假陽(yáng)性"結(jié)果且接受昂貴 且無(wú)效的治療。
[0004] 靈敏并且適合多重處理的一種技術(shù)是等位基因特異性PCR (AS-PCR)。該技術(shù)在存 在序列的野生型變體的情況下檢測(cè)核酸序列中的突變或多態(tài)性。在成功的等位基因特異性 PCR中，擴(kuò)增目標(biāo)核酸的所需變體，而其它變體不被擴(kuò)增，至少不在可檢測(cè)到的水平上。在等 位基因特異性PC帥，至少一條引物是等位基因特異性的，從而使引物延伸僅在存在序列的 特異性變體時(shí)進(jìn)行。在相同的反應(yīng)混合物中可W存在祀向一個(gè)或多個(gè)多態(tài)位點(diǎn)的一條或多 條等位基因特異性引物。設(shè)計(jì)成功的等位基因特異性引物是不可預(yù)知的技術(shù)。盡管對(duì)于已 知序列設(shè)計(jì)引物是很平常的，卻不存在設(shè)計(jì)出可W區(qū)分非常相似的序列的引物的方案。
[000引在診斷測(cè)定的背景下，需要精確區(qū)分。例如，在EZH2突變檢測(cè)的背景下，等位基因 特異性引物的性能可W決定患者癌癥治療的過(guò)程。因此，仍然需要具有最大特異性和靈敏 度的能夠檢測(cè)最大數(shù)目的EZH2突變的全面檢測(cè)。
[0006] 發(fā)明概述 在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明為用于檢測(cè)人EZH2基因中的突變的分離的寡核巧酸，其由 選自對(duì)應(yīng)于W下的SEQ ID NO的寡核巧酸的序列組成：EZH2_Y646N_R (SEQ ID N0:1)、 Y646H-R (沈Q ID N0:12)、Y646F_R (沈Q ID N0:21)、Y646C_R (沈Q ID N0:41)、A682G_R (SEQ ID N0:59)和A692V_R (SEQ ID N0:73)，例外是包含與人EZH2基因的天然存在的序列 的至少一個(gè)錯(cuò)配。SEQ ID肋3:1、12、21、41、59和73的每一個(gè)包含至少一個(gè)1'1'二聯(lián)體 (duplet)和TTT或CTCS聯(lián)體。任何所述SEQ ID NO的長(zhǎng)度為20-30個(gè)核巧酸。在運(yùn)些實(shí)施方 案的變化中，錯(cuò)配位于各個(gè)寡核巧酸的3'端的最后5個(gè)核巧酸內(nèi)。在運(yùn)些實(shí)施方案的進(jìn)一步 變化中，所述寡核巧酸進(jìn)一步包含至少一個(gè)非天然核巧酸。
[0007] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明為檢測(cè)樣品中的人EZH2核酸中的突變的方法，其包 括：（a)將樣品中的核酸與上述選自對(duì)應(yīng)于沈Q ID NO: 1、12、21、41、59和73的沈〇10^的 至少一個(gè)寡核巧酸接觸；（b)將樣品在允許寡核巧酸與EZH2核酸內(nèi)的祀序列雜交的條件下 解育；（C)生成含有EZH2核酸內(nèi)的祀序列的擴(kuò)增產(chǎn)物;和(d)檢測(cè)經(jīng)擴(kuò)增的產(chǎn)物的存在，由此 檢測(cè)EZH2核酸中突變的存在。在該實(shí)施方案的變化中，樣品中的核酸與選自表2-4中列出的 等位基因特異性引物且包含與人EZH2基因的天然存在序列的至少一個(gè)錯(cuò)配的寡核巧酸接 觸。
[0008] 在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明為測(cè)定患有惡性腫瘤的患者是否可能對(duì)EZH2抑制劑響 應(yīng)的方法，包括：（a)將來(lái)自患者的樣品中的核酸與選自表2-4中列出的等位基因特異性引 物且包含與人EZH2基因的天然存在序列的至少一個(gè)錯(cuò)配的至少一個(gè)寡核巧酸接觸；（b)將 樣品在允許寡核巧酸與EZH2核酸內(nèi)的祀序列雜交的條件下解育;和生成含有EZH2核酸內(nèi)的 祀序列的擴(kuò)增產(chǎn)物；（C)檢測(cè)經(jīng)擴(kuò)增的產(chǎn)物的存在，由此檢測(cè)EZH2核酸中突變的存在，其中 存在突變表示患者可能對(duì)EZH2抑制劑響應(yīng)。在該實(shí)施方案的變化中，所述寡核巧酸對(duì)于選 自位置Y646、A682和A692處的突變的至少兩個(gè)是特異性的。在該實(shí)施方案的進(jìn)一步變化中， 所述寡核巧酸對(duì)于選自位置Y646N、Y646H、Y646S、Y646F、Y646C、A682G和A692V處的突變的 至少兩個(gè)是特異性的。
[0009] 在仍另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明是檢測(cè)人EZH2基因中的突變的試劑盒，所述試劑 盒包含選自表2-4中列出的等位基因特異性引物且包含與人EZH2基因的天然存在序列的至 少一個(gè)錯(cuò)配的至少一個(gè)寡核巧酸和任選地至少一種用于PCR的額外試劑。在該實(shí)施方案的 變化中，試劑盒包含SEQ ID N0:l-51、58-68和72-83中的兩個(gè)或更多個(gè)。在該實(shí)施方案的進(jìn) 一步變化中，所述試劑盒包含兩個(gè)或更多個(gè)寡核巧酸，所述寡核巧酸各自對(duì)于選自位置 Y646、A682和A692處的突變是特異性的。在該實(shí)施方案的進(jìn)一步變化中，所述試劑盒包含兩 個(gè)或更多個(gè)寡核巧酸，所述寡核巧酸各自對(duì)于選自位置Y646N、Y646H、Y646S、Y646F、Y646C、 A682G和A692V處的突變是特異性的。
[0010] 在仍另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明是治療患有癌癥的患者的方法，其包括向所述患 者施用合適劑量的EZH2抑制劑，其中所述患者的腫瘤攜帶有用選自表2-4中列出的等位基 因特異性引物且包含與人EZH2基因的天然存在序列的至少一個(gè)錯(cuò)配的寡核巧酸檢測(cè)到的 EZ肥基因中的體細(xì)胞突變。
[0011] 在仍另一實(shí)施方案中，本發(fā)明是治療患有癌癥的患者的方法，其包括使用選自表 2-4中列出的等位基因特異性引物且包含與人EZH2基因的天然存在序列的至少一個(gè)錯(cuò)配的 至少一個(gè)寡核巧酸探測(cè)患者樣品的EZH2基因中的突變，且如果發(fā)現(xiàn)突變，則向所述患者施 用一定劑量的EZH2抑制劑。在該實(shí)施方案的變化中，突變位于位置Y646、A682和A692。在該 實(shí)施方案的進(jìn)一步變化中，突變選自Y646N、Y646H、Y646S、Y646F、Y646C、A682G和A692V。在 該實(shí)施方案的進(jìn)一步變化中，所述寡核巧酸選自SEQ ID NO: 1-51、58-68和72-83。在該實(shí)施 方案的進(jìn)一步變化中，所述EZH2抑制劑選自EI1 EPZ6438化7438)、GSK343或GSK126。在該 實(shí)施方案的進(jìn)一步變化中，所述癌癥是淋己瘤。
[001引發(fā)明詳述 定義 為了便于理解本公開(kāi)內(nèi)容，提供了本文使用術(shù)語(yǔ)的W下定義。
[001引術(shù)語(yǔ)^[n]r指在氨基酸序列中[η]位置上氨基酸X替換為氨基酸Y的錯(cuò)義突變。例 如，術(shù)語(yǔ)叮646C'指646位酪氨酸替換為半脫氨酸的突變。
[0014]術(shù)語(yǔ)"等位基因特異性引物'或"AS引物'指運(yùn)樣的引物，所述引物與多于一個(gè)目標(biāo) 序列的變體雜交，但能夠在僅具有目標(biāo)序列的變體間區(qū)分開(kāi)，因?yàn)閮H對(duì)于一個(gè)變體，引物才 可W在合適條件下由核酸聚合酶有效延伸。對(duì)于目標(biāo)序列的其它變體，延伸效率更低或是 無(wú)效的。
[001引術(shù)語(yǔ)"通用引物'指包括等位基因特異性引物的引物對(duì)中的第二條引物。通用引物 不是等位基因特異性的，即無(wú)法在等位基因特異性引物可W區(qū)分的目標(biāo)序列的變體間進(jìn)行 區(qū)分。
[0016] 術(shù)語(yǔ)巧補(bǔ)的"或巧補(bǔ)性'參考Watson-