交叉引用

本申請根據(jù)35u.s.c.§119(e)要求2014年2月20日提交的美國臨時申請序列號61/768,374和2014年2月26日提交的美國臨時申請序列號61/944,943的優(yōu)先權(quán)，所述兩個臨時申請均以引用的方式并入本文。

發(fā)明技術(shù)領(lǐng)域

本公開涉及抗體及其組合物、編碼所述抗體的多核苷酸、用于產(chǎn)生所述抗體的表達(dá)載體和宿主細(xì)胞以及用于診斷和治療由補(bǔ)體介導(dǎo)的疾病的組合物和方法。

發(fā)明背景

補(bǔ)體系統(tǒng)由將近50種單個蛋白質(zhì)組成，所述蛋白質(zhì)作為先天免疫系統(tǒng)的一部分起作用，從而提供宿主防御的初始階段、對異物的調(diào)理作用以及組織動態(tài)平衡。(ricklind.,2010,complement:akeysystemforimmunesurveillanceandhomeostasis.nature:immunology,785-795)補(bǔ)體系統(tǒng)可見于所有多細(xì)胞生物體中并且系統(tǒng)發(fā)生地先于適應(yīng)性免疫系統(tǒng)的形成(zarkadisi.k.,2001phylogeneticaspectsofthecomplementsystem.developmentandcomparativeimmunology,745-762.)。補(bǔ)體系統(tǒng)的激活沿著三種主要途徑發(fā)生：經(jīng)典途徑、凝集素途徑和替代途徑。圖1示出了三種主要補(bǔ)體途徑的示意圖。還參見，donoso等，“theroleofinflammationinthepathogenesisofage-relatedmaculardegeneration”,surveyofophthalmology，第51卷，第2期，2006年3月-4月。

在激活過程中，連續(xù)的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用和蛋白水解活性引起c3和c5轉(zhuǎn)化酶的產(chǎn)生。這些轉(zhuǎn)化酶負(fù)責(zé)產(chǎn)生補(bǔ)體激活分裂產(chǎn)物，所述分裂產(chǎn)物表示對于調(diào)理作用、過敏毒素產(chǎn)生以及膜攻擊復(fù)合物(mac)形成重要的補(bǔ)體級聯(lián)的效應(yīng)分子。這些轉(zhuǎn)化酶中的后者為補(bǔ)體級聯(lián)的細(xì)胞裂解活性所必需的(ricklind.,2010)。在正常條件下，補(bǔ)體級聯(lián)的激活提供了針對致病性細(xì)菌、病毒的防御以及對患病和損傷組織的清除。在正常情況下，mac的形成由于存在細(xì)胞表面組分和可溶性調(diào)節(jié)組分而不影響外圍組織，所述組分包括cfh、cfh相關(guān)蛋白質(zhì)、c4bp、cd46、cd55、cd59以及補(bǔ)體因子i(cfi)。然而，當(dāng)發(fā)生過量激活時或者當(dāng)補(bǔ)體調(diào)節(jié)組分出現(xiàn)故障時，誘導(dǎo)了急性和慢性疾病狀態(tài)。其中不受控制的補(bǔ)體激活被識別為人體病理學(xué)的原因的實例包括：腎小球腎炎、系統(tǒng)性紅斑性狼瘡、陣發(fā)性睡眠性血紅蛋白尿癥、阿爾茲海默病、遺傳性血管性水腫、重癥肌無力以及年齡相關(guān)性黃斑變性(amd)(ricklin和lambris,2013,complementinimmuneandinflammatorydisorders:pthaologicalmechanisms.journalofimmunology,3831-3838)。

c5為包含通過二硫鍵連接在一起的兩條多肽鏈(α,115kda以及β,75kda)的190kda蛋白質(zhì)。c5轉(zhuǎn)化酶在c5α-鏈n末端下游的75個氨基酸的精氨酸殘基處切割，從而產(chǎn)生7.4kdc5a和180kdc5b補(bǔ)體分裂產(chǎn)物。c5b組分充當(dāng)用于通過依次添加c6、c7、c8以及c9而組裝膜攻擊復(fù)合物(mac)的初始組分。c6-c8亞基以1:1關(guān)系組裝到c5b，而多個c9亞基并入到所述復(fù)合物中，從而產(chǎn)生原核生物和真核生物質(zhì)膜中的非特異性孔，圖2。還參見，bubeckd.,2014,“themakingofamacromolecularmachine:assemblyofthemembraneattackcomplex”biochemistry,53(12):1908-15。細(xì)胞表面上的mac形成對細(xì)胞具有多種結(jié)果。在高水平下，未調(diào)節(jié)的溶質(zhì)的流入量和流出量導(dǎo)致細(xì)胞腫脹和最終細(xì)胞裂解。這引起細(xì)胞物質(zhì)不受控制的釋放，從而促成促炎環(huán)境和細(xì)胞損失。在細(xì)胞表面上mac以亞細(xì)胞裂解濃度形成可有助于促炎性細(xì)胞因子和促血管發(fā)生細(xì)胞因子以及生長因子的釋放、細(xì)胞應(yīng)激的提高以及最終壞死細(xì)胞死亡。

年齡相關(guān)性黃斑變性(amd)為發(fā)達(dá)國家老年人目盲的主導(dǎo)原因。僅在美國群體中，與視力喪失相關(guān)的amd晚期形式的患病率在將近2百萬個體中發(fā)生?；加兄卸萢md的另外7百萬個體處于發(fā)展amd晚期形式的高危險下。歐洲群體包括將近受影響個體數(shù)目的兩倍。amd的特征在于可歸因于引起視神經(jīng)視網(wǎng)膜進(jìn)行性變性的副炎性(para-inflammatory)過程的進(jìn)行性視力喪失，以及包括視網(wǎng)膜色素上皮(rpe)和脈絡(luò)膜血管層的支撐組織。大部分臨床上顯著的視力喪失發(fā)生在神經(jīng)變性的變化影響眼睛高度特化區(qū)域內(nèi)負(fù)責(zé)良好視敏度的視網(wǎng)膜中心(黃斑)時。所述疾病由于視力喪失和進(jìn)行每日工作對家庭成員增加的依賴性而對個體的生理健康和心理健康具有巨大影響。

補(bǔ)體系統(tǒng)的失調(diào)與amd的發(fā)展高度相關(guān)。首先，在超過20種基因中的遺傳突變已與個人發(fā)展amd的危險相關(guān)，這估計占了總危險的70％。(fritsche等，“agerelatedmaculardegeneration:geneticsandbiologycomingtogether”,annurevgenomicshumgenet.2014；15:151-71)。在這20種基因內(nèi)，五種為補(bǔ)體基因，它們單獨占了發(fā)展amd晚期形式的總危險的57％。另外，amd-相關(guān)性炎癥和補(bǔ)體活性的相關(guān)失調(diào)(如通過經(jīng)由組織學(xué)分析獲得的體循環(huán)中和amd組織中的補(bǔ)體激活產(chǎn)物提高所指示的)在補(bǔ)體蛋白中不存在已知遺傳多態(tài)性的情況下發(fā)生。新發(fā)現(xiàn)已突出顯示了膜攻擊復(fù)合物在患病組織中和amd晚期形式發(fā)生中的鑒定和存在對補(bǔ)體的潛在病理學(xué)影響(whitmores等，2014,“complementactivationandchoriocapillarislossinearlyamd:implicationsforpathophysiologyandtherapy.”progressinretinalandeyeresearch，2014年12月5日，電子版先于印刷版；nishigauchikm等，2012“c9-r95xpolymorphisminpatientswithneovascularage-relatedmaculardegeneration”，1月131；53(1)508-12)。這些結(jié)果表明了阻斷作為用于治療amd的治療靶標(biāo)的最終補(bǔ)體途徑組分的可行性。迄今為止，靶向mac形成的大部分治療劑通過阻斷c5b(開始mac形成所需要的關(guān)鍵性結(jié)構(gòu)單元)的形成來實現(xiàn)此治療。然而，這樣做時，它們也阻斷c5a的形成，從而導(dǎo)致已與組織動態(tài)平衡(調(diào)理作用粒子的去除)、神經(jīng)存活和抗血管形成反應(yīng)相關(guān)聯(lián)的c5a功能活性喪失。在人類中，選擇性阻斷mac形成的此過程通常通過阻斷mac組裝的細(xì)胞表面蛋白cd59并且通過可溶性因子玻連蛋白和簇蛋白來進(jìn)行。為了模擬天然機(jī)制并保留補(bǔ)體激活的有利上游活性，本申請揭示了一種新型治療性單克隆抗體的開發(fā)，所述抗體結(jié)合c5但獨特地允許c5分子加工成c5a和c5b，但抑制mac的形成，圖2，因此防止與amd相關(guān)聯(lián)的關(guān)鍵性致病組分的形成。通過阻斷mac的形成同時保留關(guān)鍵性支持性眼組織即脈絡(luò)膜血管層和rpe，將保持對于維持視力至關(guān)重要的神經(jīng)視網(wǎng)膜的功能和存活。

發(fā)明概述

本發(fā)明涵蓋了包含抗補(bǔ)體c5抗體或抗-c5抗體的藥物制劑的方法和組合物。在一方面，所述抗-c5抗體不結(jié)合于c5a并且抑制補(bǔ)體依賴性溶血。在另一方面，所述抗-c5抗體結(jié)合于c5b并且抑制患者中的膜攻擊復(fù)合物(mac)的形成。在一個實施方案中，所述抗-c5抗體阻斷c5結(jié)合于人補(bǔ)體組分6。在另一個實施方案中，所述抗-c5抗體阻斷c5結(jié)合于人補(bǔ)體組分7。在另一方面，所述抗-c5抗體的特征在于以下特性：一旦它并入到膜攻擊復(fù)合物中，它就不再結(jié)合于c5或者與c5(或其亞基)結(jié)合減少。

在另一方面，所述抗-補(bǔ)體c5抗體或抗-c5抗體結(jié)合于c5，其中kd小于約10pm。在另一方面，所述抗-c5抗體為單克隆抗體。在另一個實施方案中，所述抗-c5抗體選自由以下組成的組：單克隆抗體、多克隆抗體、重組抗體、人源化抗體、嵌合抗體、多特異性抗體以及抗體片段。在一個實施方案中，所述抗-c5抗體為抗體片段并且所述抗體片段為fab片段、fab'片段、f(ab')2片段、fv片段、雙抗體或單鏈抗體分子。在另一個實施方案中，所述抗-c5抗體為igg1、igg2、igg3或igg4。在另一個實施方案中，所述抗-c5抗體為igg1。

在另一方面，所述抗-c5抗體偶聯(lián)到標(biāo)記基團(tuán)。在另一個實施方案中，所述抗-c5抗體偶聯(lián)到標(biāo)記基團(tuán)并且該標(biāo)記基團(tuán)為光學(xué)標(biāo)記、放射性同位素、放射性核素、酶基團(tuán)以及生物素基團(tuán)。

在另一方面，本發(fā)明包括一種用于制備結(jié)合于補(bǔ)體c5的分離抗體的方法，所述方法包括從分泌所述抗體的宿主細(xì)胞中分離所述抗體。

在另一方面，本發(fā)明為包含選自由seqidno:13、18、23、28、33以及38組成的組的氨基酸序列的抗-補(bǔ)體c5抗體。在另一方面，所述抗-c5抗體包含選自由seqidno:14、19、24、29、34以及39組成的組的氨基酸序列。在另一方面，所述抗-c5抗體包含選自由gts、sgs、rts、yts以及was組成的組的氨基酸序列。在另一方面，所述抗-c5抗體包含選自由seqidno:15、20、25、30、35以及40組成的組的氨基酸序列。在另一方面，所述抗-c5抗體包含選自由seqidno:16、21、26、31、36以及41組成的組的氨基酸序列。在另一方面，所述抗-c5抗體包含選自由seqidno:17、22、27、32、37以及42組成的組的氨基酸序列。在另一方面，本發(fā)明為包含第一氨基酸序列和第二氨基酸序列的抗體，所述第一氨基酸序列包含選自由seqidno:13、18、23、28、33以及38組成的組的cdr1；選自由氨基酸序列g(shù)ts、sgs、yts以及was組成的組的cdr2；選自由seqidno:14、19、24、29、34以及39組成的組的cdr3；并且第二氨基酸序列包含選自由seqidno:15、20、25、30、35以及40組成的組的cdr1；選自由seqidno:16、21、26、31、36以及41組成的組的cdr2；以及選自由seqidno:17、22、27、32、37以及42組成的組的cdr3。在另一個實施方案中，本發(fā)明為一種包含seqidno:10和seqidno:2的氨基酸序列的抗體。

在另一方面，本發(fā)明包括一種編碼結(jié)合于補(bǔ)體c5的分離抗體的核酸分子。在一個實施方案中，編碼結(jié)合于補(bǔ)體c5的所述抗體的所述核酸分子可操作地連接至控制序列。

在另一方面，本發(fā)明包括一種抗-補(bǔ)體c5抗體和一種藥學(xué)上可接受的載體。在一個實施方案中，所述抗-補(bǔ)體c5抗體還包含另外的活性劑。在另一個實施方案中，所述抗-補(bǔ)體c5抗體和另外的活性劑還包括藥學(xué)上可接受的載體。

在另一方面，本發(fā)明包括一種用于在需要治療或預(yù)防的患者中治療或預(yù)防適應(yīng)癥的方法，所述方法包括向所述患者施用有效量的至少一種抗-補(bǔ)體c5抗體。在一個實施方案中，所述適應(yīng)癥為年齡相關(guān)性黃斑變性(amd)。在另一個實施方案中，在需要治療或預(yù)防的患者中的疾病或病癥為眼部病狀。

附圖簡述

圖1示出補(bǔ)體途徑的示意圖。

圖2示出mac形成的示意圖并且示出單克隆抗體治療劑阻斷mac而不阻斷c5a產(chǎn)生的機(jī)制。

圖3示出抗-c5抗體亞克隆對mac的抑制百分比。

圖4a和圖4b示出抗-c5抗體亞克隆對mac的抑制百分比。

圖5a、圖5b和圖5c示出抗-c5抗體亞克隆對mac的抑制百分比。

圖6a、圖6b和圖6c示出通過檢查單點測定或者通過滴定抗體來產(chǎn)生c5a抑制。

圖7示出單克隆抗體與直接涂覆到elisa板上的c5的劑量依賴性相互作用。

圖8示出抗-c5單克隆抗體與c5的結(jié)合親和力。

圖9示出使用生物層干涉測量法(bli)獲得的單克隆抗體與溶液中的c5蛋白質(zhì)的結(jié)合。

圖10示出當(dāng)在用igm進(jìn)行補(bǔ)體激活之后沉積到elisa板底部時識別c5b-9復(fù)合物內(nèi)的c5的能力。

圖11a和圖11b示出使用生物層干涉測量法(bli)技術(shù)獲得的單克隆抗體結(jié)合可溶性c5b-9的能力。

圖12a、圖12b和圖12c示出具有10c9的人源化重鏈和輕鏈的全長抗體對于mac的抑制。

圖13a、圖13b和圖13c示出具有10c9的人源化重鏈和輕鏈的fab片段的活性。

圖14a和圖14b示出h5l2(人源化10c9)抗體在非人靈長類輕損傷模型中相對于對照有效于阻斷視網(wǎng)膜(圖14a)和脈絡(luò)膜(圖14b)中的補(bǔ)體沉積。

發(fā)明詳述

本文所用的章節(jié)標(biāo)題僅出于組織目的，并且不應(yīng)解釋為限制所述主題。

標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)可用于重組dna、寡核苷酸合成、組織培養(yǎng)和轉(zhuǎn)化、蛋白質(zhì)純化等等。酶促反應(yīng)和純化技術(shù)可根據(jù)制造商說明書或者如本領(lǐng)域常見地完成或如本文所述地來執(zhí)行。以下程序和技術(shù)通?？筛鶕?jù)本領(lǐng)域中熟知以及如本說明書整篇引用和論述的各種一般性和更特定參考文獻(xiàn)中所述的常規(guī)方法來執(zhí)行。還參見，sambrook等，2001,molecularcloning:alaboratorymanual，第3版，coldspringharborlaboratorypress,coldspringharbor,n.y.，所述文獻(xiàn)以引用的方式整體并入。除非提供明確定義，否則關(guān)聯(lián)本文所述的分子生物學(xué)、生物化學(xué)、物理和生物物理化學(xué)、分析化學(xué)、有機(jī)化學(xué)以及醫(yī)學(xué)和藥物化學(xué)使用的命名法和這些學(xué)科的實驗室程序和技術(shù)是本領(lǐng)域中熟知并且通常使用的那些。標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)可用于化學(xué)合成、化學(xué)分析、藥物制劑、配制和輸送以及患者治療。

本文中使用以下定義：

“amd”是指所有形式的年齡相關(guān)性黃斑變性，包括但不限于疾病發(fā)作(即，早期和晚期)、疾病階段(即，早期、中期或晚期)、疾病類型(地圖狀委縮或新生血管性黃斑病變)、疾病分布(即，單側(cè)、雙側(cè)、中心或周邊)或者存在/不存在玻璃疣沉積物、存在/不存在網(wǎng)狀假性玻璃疣、視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞異常、光感受體異常、萎縮性年齡相關(guān)性黃斑變性、地圖狀委縮(ga)以及新生血管性黃斑病變。

如本文所用的“蛋白質(zhì)”意思是指至少兩個共價連接的氨基酸并且與多肽、寡肽和肽可互換使用。兩個或更多個共價連接的氨基酸通過肽鍵連接。

“c5”是指人補(bǔ)體組分5。如本文所用，因子c5、組分因子5與c5為同義詞。

“c5a”是指具有大約77-74氨基酸并且為約7kda的較小c5片段，所述片段在c5被補(bǔ)體級聯(lián)中激活的c5轉(zhuǎn)化酶切割時產(chǎn)生。“c5b”是指較大c5片段，所述片段在被補(bǔ)體級聯(lián)中激活的c5轉(zhuǎn)化酶切割時產(chǎn)生。c5b由通過單一的二硫鍵連接的α鏈(約104kda)和β鏈(約75kda)組成。

術(shù)語“抗體”和“免疫球蛋白”可互換地使用，它們在最廣義上是指一種包含一條或多條多肽鏈的蛋白質(zhì)，所述多肽鏈通過結(jié)合抗體上的多個cdr和抗原表位來與特異性抗原相互作用?？贵w可以是單克隆抗體(例如，全長或完整單克隆抗體)、多克隆抗體、多價抗體和/或多特異性抗體(例如，雙特異性抗體，只要它們展現(xiàn)出所需的生物活性)?？贵w還可以是或者包括抗體片段(如本文所述的)。

“表位”用于指示由抗體識別并結(jié)合的序列、結(jié)構(gòu)或部分。表位可以被稱為“抗原位點”。

“抗體片段”包含僅完整抗體的一部分，其中所述部分保留至少一種、大部分或所有當(dāng)存在于完整抗體中時通常與該部分相關(guān)聯(lián)的功能。抗體片段的實例包括fab、fab'、f(ab')2和fv片段；雙抗體；線性抗體；單鏈抗體分子；以及由抗體片段形成的多特異性抗體。在一個實施方案中，抗體片段包含完整抗體的抗原結(jié)合位點并且因此保留結(jié)合抗原的能力。在另一個實施方案中，抗體片段，例如包含fc區(qū)的抗體片段，保留了當(dāng)存在于完整抗體時通常與所述fc區(qū)相關(guān)聯(lián)的至少一種生物功能，諸如fcr結(jié)合、抗體半衰期調(diào)節(jié)、adcc功能以及補(bǔ)體結(jié)合。在一個實施方案中，抗體片段為具有基本上類似于完整抗體的體內(nèi)半衰期的單價抗體。例如，這種抗體片段可包含連接至能夠向所述片段賦予體內(nèi)穩(wěn)定性的fc序列的抗原結(jié)合臂。

如本文所用的“單克隆”是指從細(xì)胞群體中獲得的抗體，其中所述細(xì)胞群體為克隆地來源于單一親代細(xì)胞。單克隆抗體為同源抗體，即構(gòu)成所述群體的個別抗體的相同之處在于，它們都來源于相同基因并且具有相同氨基酸序列和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，除了可以少量存在的天然發(fā)生的突變和在一些情況下可能不同的翻譯后修飾之外。在一些實施方案中，單克隆抗體為可以是高度特異性的。在一些實施方案中，單克隆抗體可以是針對單一抗原位點。此外，與通常包括針對不同決定簇(表位)的不同抗體的其他抗體制劑不同，各單克隆抗體針對抗原上的同一表位。個別單克隆抗體可通過任何特定方法來產(chǎn)生。例如，根據(jù)本公開使用的單克隆抗體可通過首先由kohler等(1975)nature256:495描述的雜交瘤法來制成或者可通過重組dna方法(參見，例如，美國專利號4,816,567)來制成，或者由噬菌體抗體庫使用clackson等(1991)nature352:624-628和marks等(1991)j.mol.biol.222:581-597中所述的技術(shù)來制成。

“多克隆”用于描述一種來源于異源親代產(chǎn)抗體細(xì)胞群體的異源抗體群體。在大部分情況下，多克隆抗體對不同表位具有不同親和力并且由具有不同序列的基因產(chǎn)生。

“嵌合”抗體為包含來源于兩種或更多種不同物種的氨基酸序列的抗體。

“人源化”抗體為來源于非人親代抗體的嵌合抗體。在許多情況下，人源化抗體中的特定氨基酸位置已被改變?yōu)榕c人抗體中的相應(yīng)位置處的氨基酸的同一性相對應(yīng)。在許多情況下，在親代(非人)抗體的可變區(qū)中的位置被來自人類的可變區(qū)的氨基酸置換。這創(chuàng)建了具有所需特異性、親和力和能力的人源化小鼠、大鼠、兔或非人靈長類抗體。

“變體”是指與親代序列相比包含至少一個差異的序列。變體多肽為與親代序列具有至少約75％氨基酸序列同一性的蛋白質(zhì)。變體蛋白可與親代氨基酸序列具有至少約80％氨基酸序列同一性或至少約85％氨基酸序列同一性或至少約90％氨基酸序列同一性或至少約95％氨基酸序列同一性或至少約98％氨基酸序列同一性或至少約99％氨基酸序列同一性。在一些情況下，變體抗體為與親代抗體相比在氨基酸序列中具有一個或多個差異的抗體。人源化抗體和嵌合抗體為變體抗體。因此，變體抗體包含與親代抗體的小于100％序列同一性。變體核苷酸序列包含與親代核苷酸序列的小于約100％序列同一性。

“分離”或“純化”是指已與其天然環(huán)境中的至少一種組分分離和/或從中回收的分子，其中所述組分為可干擾分子的使用或活性的物質(zhì)。組分包括肽、糖、核酸、酶、激素以及其他蛋白質(zhì)性或非蛋白質(zhì)性溶質(zhì)。

“互補(bǔ)決定區(qū)”(cdr)是指抗體內(nèi)的一個或多個區(qū)域，其中一個或多個cdr的殘基有助于抗原結(jié)合。在許多情況下，cdr的個別氨基酸可非常接近于靶抗原的原子。在一些實施方案中，cdr可位于可包含三個cdr區(qū)的免疫球蛋白內(nèi)。在一些情況下，如在較大氨基酸序列中存在超過一個cdr序列的情況下，cdr可通過其他序列分離并且對cdr進(jìn)行編號。在一些情況下，多個cdr被鑒定為cdr1、cdr2和cdr3。每個cdr可包含來自如kabat所定義的互補(bǔ)決定區(qū)的氨基酸殘基。kabat等，sequencesofproteinsofimmunologicalinterest，第5版，publichealthservice,nationalinstitutesofhealth,bethesda,md.(1991))。cdr以及抗體內(nèi)的其他序列或抗體片段的氨基酸編號是根據(jù)kabat的編號。在許多情況下，cdr可通過它們在可變區(qū)序列中的位置來定義(如在kabat中的編號)，例如輕鏈cdr1可包含位置24與位置33之間；lccdr2的位置50與位置56之間；以及l(fā)ccdr3的位置89與位置97之間的氨基酸序列；并且重鏈cdr可位于cdr1的位置26與位置33之間；hccdr2的位置50與位置66之間；以及hccdr3的位置97與位置103之間。和/或高變環(huán)可位于輕鏈殘基26-32(lccdr1)、殘基50-52(lccdr2)以及殘基91-96(lccdr3)；與重鏈殘基26-32(hccdr1)、殘基53-55(hccdr2)和殘基97-101(hccdr3)之間。在一些情況下，互補(bǔ)決定區(qū)可包含來自根據(jù)kabat定義的cdr區(qū)和高變環(huán)二者的氨基酸。在一些實施方案中，如在抗體為單鏈免疫球蛋白的情況下，可存在超過一個cdr、超過兩個cdr、超過三個cdr、超過四個cdr或超過五個cdr。在一些實施方案中，抗體可包含六個cdr。

“框架區(qū)”fr為不同于cdr殘基的可變結(jié)構(gòu)域殘基。在大部分實施方案中，可變結(jié)構(gòu)域具有依次鑒定的兩個與四個之間的fr。例如，包含三個cdr的可變區(qū)具有四個fr：fr1、fr2、fr3和fr4。在cdr根據(jù)kabat定義的情況下，輕鏈fr殘基位于約殘基1-23(lcfr1)、34-49(lcfr2)、57-88(lcfr3)以及98-107(lcfr4)處并且重鏈fr殘基位于重鏈殘基中的約殘基1-25(hcfr1)、34-49(hcfr2)、67-96(hcfr3)以及104-113(hcfr4)處。如果cdr包含來自高變環(huán)的氨基酸殘基，則輕鏈fr殘基位于輕鏈中的約殘基1-23(lcfr1)、34-49(lcfr2)、57-88(lcfr3)以及98-107(lcfr4)處并且重鏈fr殘基位于重鏈殘基中的約殘基1-25(hcfr1)、34-49(hcfr2)、67-96(hcfr3)以及104-113(hcfr4)處。在一些情況下，當(dāng)cdr包含來自如kabat定義的cdr和高變環(huán)二者的氨基酸時，fr殘基將相應(yīng)地調(diào)整。例如，當(dāng)hccdr1包括氨基酸h26-h35時，重鏈fr1殘基處于位置1-25處并且fr2殘基處于位置36-49處。

“可變結(jié)構(gòu)域”是指傳統(tǒng)抗體分子的輕鏈和重鏈部分，它包含互補(bǔ)決定區(qū)(cdr)的氨基酸序列和框架區(qū)(fr)。vh是指重鏈可變結(jié)構(gòu)域。vl是指輕鏈可變結(jié)構(gòu)域。

“fv”或“fv片段”是指含有完整抗原識別和結(jié)合位點、包含fr和cdr序列的抗體片段。在許多實施方案中，所述fv由緊密締合的一個重鏈可變結(jié)構(gòu)域和一個輕鏈可變結(jié)構(gòu)域的二聚體組成，所述締合在自然界中可以是共價的，例如在單鏈fv分子(scfv)中。每個可變結(jié)構(gòu)域的三個cdr相互作用以限定vh-vl多肽表面上的抗原結(jié)合位點?？偟膩碚f，六個cdr或其亞型向抗體賦予抗原結(jié)合特異性。然而，在一些情況下，甚至單一可變結(jié)構(gòu)域(或僅包含對于抗原具有特異性的三個cdr的一半fv)具有識別并結(jié)合至抗原的能力，盡管通常親和力比整個結(jié)合位點低。

“fab”或“fab”片段含有輕鏈的可變結(jié)構(gòu)域和恒定結(jié)構(gòu)域(cl)和重鏈的可變結(jié)構(gòu)域和第一恒定結(jié)構(gòu)域(ch1)。f(ab')2抗體片段包含一對fab片段，所述片段通常通過它們之間的鉸合半胱氨酸來共價連接在其羧基端附近。抗體片段的其他化學(xué)偶合也是本領(lǐng)域已知的。

“氨基酸序列同一性百分比(％)”被定義為在比對序列并且必要時引入間隙以實現(xiàn)最大序列同一性百分比，并且不考慮任何保守性取代作為序列同一性的一部分之后，候選序列中與參照序列中的氨基酸殘基相同的氨基酸殘基的百分比。出于測定氨基酸序列同一性百分比的目的的比對可以屬于本領(lǐng)域中的技能的多種方式實現(xiàn)，所述方式例如使用可公開獲得的計算機(jī)軟件，如blast、blast-2、align或megalign(dnastar)軟件。本領(lǐng)域技術(shù)人員可確定測量比對的適當(dāng)參數(shù)，包括對所比較的序列的全長獲得最大比對所需的任何算法。然后相對于較長序列計算序列同一性，即，即使較短序列與較長序列的一部分顯示100％序列同一性，總體序列同一性將小于100％。

“氨基酸序列同源性百分比(％)”被定義為在比對序列并且必要時引入間隙以實現(xiàn)最大序列同源性百分比之后，候選序列中與參照序列中的氨基酸殘基同源的氨基酸殘基的百分比。此方法將保守性取代考慮在內(nèi)。保守性取代為允許氨基酸被類似氨基酸取代的那些取代。氨基酸在幾種特征方面可能類似，例如，尺寸、性狀、疏水性、親水性、電荷、等電點、極性、芳香性等等。出于測定氨基酸序列同源性百分比的目的的比對可以屬于本領(lǐng)域技術(shù)人員中的普通技能的多種方式實現(xiàn)。在一些情況下，氨基酸序列可使用可公開獲得的計算機(jī)軟件諸如blast、blast-2、align或megalign(dnastar)軟件來進(jìn)行比對。本領(lǐng)域技術(shù)人員可確定測量比對的適當(dāng)參數(shù)，包括對所比較的序列的全長獲得最大比對所需的任何算法。然后相對于較長序列計算序列同源性，即，即使較短序列與較長序列的一部分顯示100％序列同一性，總體序列同一性將小于100％。

“核酸序列同源性百分比(％)”被定義為在比對序列并且必要時引入間隙以實現(xiàn)最大序列同一性百分比之后，候選序列中與參照序列中的核苷酸相同的核苷酸百分比。出于測定核酸序列同一性百分比的目的的比對可以屬于本領(lǐng)域中的技能的多種方式實現(xiàn)，所述方式例如使用可公開獲得的計算機(jī)軟件，如blast、blast-2、align或megalign(dnastar)軟件。本領(lǐng)域技術(shù)人員可確定測量比對的適當(dāng)參數(shù)，包括對所比較的序列的全長獲得最大比對所需的任何算法。然后相對于較長序列計算序列同一性，即，即使較短序列與較長序列的一部分顯示100％序列同一性，總體序列同一性將小于100％。

分子的“活性”或“生物活性”可依賴于分子的類型和用于測定給定活性的測試有效性。例如，在c5抗體的情況下，活性是指其部分或完全抑制c5的生物活性的能力，所述生物活性例如結(jié)合于其他補(bǔ)體蛋白、通過如c5轉(zhuǎn)化酶或能夠切割c5的外源激活途徑的其他已知蛋白質(zhì)所列舉的蛋白酶進(jìn)行的切割(krisingerm.j.等，thrombingeneratespreviouslyunidentifiedc5productsthatsupporttheterminalcomplementactivationpathway.blood,2012120(8)1717-1725)或mac形成。要求保護(hù)的c5抗體的優(yōu)選生物活性為阻斷與c5分子激活相關(guān)聯(lián)的過程的能力。優(yōu)選地，抑制活性在例如c5相關(guān)疾病或病狀，例如像補(bǔ)體相關(guān)眼睛病狀的狀態(tài)下將實現(xiàn)可測量的提高。在一些情況下，通過公開的抗-c5抗體抑制的活性是通過阻斷c5蛋白酶或c5切割。在其他情況下，所述活性為結(jié)合復(fù)合物中的其他補(bǔ)體蛋白從而防止膜插入和細(xì)胞裂解的能力。在一些實施方案中，公開的抗-c5抗體的活性通過其抑制溶血、c5a產(chǎn)生、mac形成或其他補(bǔ)體蛋白與c5締合的能力來測量的。所述活性可通過使用體外或體內(nèi)測試，包括結(jié)合測定、mac形成測定、補(bǔ)體分裂產(chǎn)物的產(chǎn)生、細(xì)胞因子釋放的誘導(dǎo)，或通過使用相關(guān)動物模型或人臨床試驗來測定。

“補(bǔ)體相關(guān)眼睛病狀”在最廣義上使用并且包括其病理學(xué)涉及通過經(jīng)典途徑、凝集素途徑、替代途徑或外源途徑激活的補(bǔ)體的所有眼睛病狀。補(bǔ)體相關(guān)眼睛病狀包括而不限于，黃斑變性疾病(諸如所有階段的年齡相關(guān)性黃斑變性(amd)，包括干性和滲出性(非滲出性和滲出性)形式)、脈絡(luò)膜新生血管形成(cnv)、葡萄膜炎、糖尿病和其他缺血相關(guān)性視網(wǎng)膜病變(包括糖尿病性黃斑水腫)、視網(wǎng)膜中央靜脈阻塞(crvo)、視網(wǎng)膜分支靜脈阻塞(brvo)以及其他眼內(nèi)新生血管性疾病(諸如糖尿病性黃斑水腫)、病理性近視、vonhippel-lindau病、眼睛組織胞漿菌病、角膜血管新生以及視網(wǎng)膜新生血管形成。一組優(yōu)選的補(bǔ)體相關(guān)眼睛病狀包括年齡相關(guān)性黃斑變性(amd)(包括干性和濕性(非滲出性和滲出性)amd)、脈絡(luò)膜新生血管形成(cnv)、黃斑毛細(xì)血管擴(kuò)張癥、葡萄膜炎、糖尿病性和其他缺血相關(guān)新生血管相關(guān)視網(wǎng)膜病變或細(xì)胞變性糖尿病性黃斑水腫、病理性近視、vonhippel-lindau病、眼睛組織胞漿菌病、doyne蜂窩狀視網(wǎng)膜萎縮/蜂巢狀網(wǎng)膜變性、stargarts病、青光眼、視網(wǎng)膜中央靜脈阻塞(crvo)、brvo、角膜血管新生、視網(wǎng)膜新生血管形成。

“藥學(xué)上可接受的”是指由聯(lián)邦或州政府的管理機(jī)構(gòu)批準(zhǔn)或可獲批準(zhǔn)的或在美國藥典或其他一般公知的藥典中列出的用于動物并且更具體地說人的。

“藥學(xué)上可接受的鹽”是指化合物的鹽，其具有親代化合物的期望的藥理學(xué)活性。此類鹽包括與無機(jī)酸形成的酸加成鹽，所述無機(jī)酸例如鹽酸、氫溴酸、硫酸、硝酸、磷酸及類似無機(jī)酸；或與有機(jī)酸形成的酸加成鹽，所述有機(jī)酸例如乙酸、丙酸、己酸、環(huán)戊烷丙酸、乙醇酸、丙酮酸、乳酸、丙二酸、丁二酸、蘋果酸、馬來酸、富馬酸、酒石酸、檸檬酸、苯甲酸、3-(4-羥基苯甲?；?苯甲酸、肉桂酸、扁桃酸、甲磺酸、乙磺酸、1,2-乙烷-二磺酸、2-羥乙基磺酸、苯磺酸、4-氯苯磺酸、2-萘磺酸、4-甲苯磺酸、樟腦磺酸、4-甲基二環(huán)[2.2.2]-辛-2-烯-1-羧酸、葡庚糖酸、3-苯基丙酸、三甲基乙酸、叔丁基乙酸、十二烷基硫酸、葡萄糖酸、谷氨酸、羥基萘甲酸、水楊酸、硬脂酸、粘康酸及類似有機(jī)酸；以及親代化合物中存在的酸性質(zhì)子被金屬離子置換時形成的鹽，所述金屬離子例如堿金屬離子、堿土金屬離子或鋁離子；或與有機(jī)堿所成的配位體，所述有機(jī)堿例如乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺、n-甲基葡萄糖胺以及類似有機(jī)堿。在某些實施方案中，藥學(xué)上可接受的鹽為氯化物鹽。在某些實施方案中，藥學(xué)上可接受的鹽為鈉鹽。

“藥學(xué)上可接受的賦形劑”是指可與本公開提供的化合物一起施用給患者的藥學(xué)上可接受的稀釋劑、藥學(xué)上可接受的佐劑、藥學(xué)上可接受的媒介物、藥學(xué)上可接受的載體或任何以上各項的組合，當(dāng)以足以提供治療有效量的化合物或其藥理學(xué)活性代謝物的劑量施用時它不會破壞其藥理學(xué)活性并且為無毒的。

“治療”為施用用于預(yù)防病癥發(fā)展或改變病癥病理學(xué)的至少一種治療劑。因此，治療是指治療性治療與防治性或預(yù)防性措施兩者。需要治療者包括已患有病癥者以及待預(yù)防病癥者。如本文所公開的，用于施用的優(yōu)選藥劑包括至少一種公開的抗-c5抗體。在補(bǔ)體相關(guān)疾病的治療中，治療劑(包括至少一種目前公開的抗體或此抗體的編碼序列)可直接或間接改變補(bǔ)體途徑組分的反應(yīng)大小，或者致使所述疾病更易于被其他治療劑治療，所述治療劑例如抗生素、抗真菌劑、抗炎劑、化療藥物等等。

“治療有效量”是指當(dāng)藥劑當(dāng)施用給受試者以用于治療疾病或至少一種疾病臨床癥狀時足以實現(xiàn)疾病或其癥狀的此治療的量。特定治療有效量可根據(jù)例如藥劑、疾病和/或疾病癥狀、疾病和/或疾病癥狀的嚴(yán)重性、年齡、體重和/或待治療的患者健康以及處方醫(yī)生的判斷來改變。任何給定化合物的適當(dāng)量可通過本領(lǐng)域技術(shù)人員確定和/或能夠通過常規(guī)實驗確定。

“治療有效劑量”是指在患者中提供疾病的有效治療的劑量。治療有效劑量可因藥劑不同和/或患者不同而改變，并且可取決于諸如患者病狀和疾病嚴(yán)重性等因素。治療有效劑量可根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)藥理學(xué)程序來確定。

疾病諸如補(bǔ)體相關(guān)眼睛病狀的“病理學(xué)”包括危害患者健康的所有現(xiàn)象。這包括而不限于，異?；虿皇芸刂频募?xì)胞生長、蛋白質(zhì)產(chǎn)生、異?；虿皇芸刂频募?xì)胞死亡、自體抗體產(chǎn)生、補(bǔ)體產(chǎn)生、補(bǔ)體激活、mac形成、對相鄰細(xì)胞的正常功能的干擾、異常水平的細(xì)胞因子或其他分泌產(chǎn)物的釋放、任何炎性反應(yīng)或免疫反應(yīng)的抑制或加重、炎性細(xì)胞滲入到細(xì)胞間隙、水腫等等。

如本文所用的“哺乳動物”是指分類為哺乳動物的任何動物，包括而不限于，人類、高等靈長類、牲畜和家畜以及動物園動物、競技動物或?qū)櫸飫游镏T如馬、豬、牛、貓以及雪貂等等。在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，所述哺乳動物為人。

與一種或多種其他治療劑“組合”施藥包括同時(并行)施藥和以任何順序連續(xù)施藥。

本公開提供了結(jié)合補(bǔ)體組分5蛋白的抗體。確切的說，本文公開了結(jié)合c5和c5b而不結(jié)合c5a的抗體。目前公開的抗體并不抑制c5切割，但抑制mac形成和mac依賴性細(xì)胞裂解。

本文所述的抗體包含具有一個或多個互補(bǔ)決定區(qū)(cdr)的支架結(jié)構(gòu)。在某些實施方案中，cdr包含來自親代序列例如seqidno:13-48的重鏈cdr1、cdr2和cdr3以及輕鏈cdr1、cdr2和cdr3中的一種或多種的不超過兩個氨基酸添加、缺失或取代。

在其他實施方案中，cdr通過具有如本文所述的常見保守性氨基酸序列和可變氨基酸序列的共有序列來定義。

在某些實施方案中，本公開的c5抗體的支架結(jié)構(gòu)可基于抗體，包括但不限于單克隆抗體、雙特異性抗體、微型抗體、結(jié)構(gòu)域抗體、合成抗體(例如抗體模擬物)、嵌合抗體、人源化抗體、抗體融合物(例如抗體綴合物)及上述每種抗體各自的片段。下文進(jìn)一步描述并定義各種結(jié)構(gòu)。在一些實施方案中，所述支架結(jié)構(gòu)包含seqidno:1-12中的一種或多種。在某些實施方案中，支架序列包含與seqidno:1-12相比的一種或多種氨基酸添加、缺失或取代。

抗-c5抗體適用于治療與補(bǔ)體激活相關(guān)的結(jié)果、癥狀和/或病變。這些包括但不限于，動脈粥樣硬化、急性心肌梗死繼發(fā)的缺血再灌注、henoch-schonlein二氏紫癜性腎炎、免疫復(fù)合性血管炎、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、動脈炎、動脈瘤、中風(fēng)、心肌癥、出血性休克、擠壓傷、多器官功能衰竭、低血容量性休克和腸道缺血、移植排斥、心臟手術(shù)、ptca、自然流產(chǎn)、神經(jīng)元損傷、脊髓損傷、重癥肌無力、亨廷頓氏病、肌萎縮性側(cè)索硬化、多發(fā)性硬化、guillainbarre綜合征、帕金森病、阿耳茨海默病、急性呼吸窘迫綜合征、哮喘、慢性阻塞性肺病、輸血相關(guān)性急性肺損傷、急性肺損傷、goodpasture氏病、心肌梗死、心肺分流術(shù)后炎癥、心肺分流術(shù)、敗血性休克、移植排斥、異種移植、燒傷、系統(tǒng)性紅斑性狼瘡、膜腎炎、腦型瘧疾、berger氏病、牛皮癬、類天皰瘡、皮肌炎、抗磷脂綜合征、炎癥性腸病、血液透析、白細(xì)胞分離法、血漿除去法、肝素誘導(dǎo)型體外膜式氧合ldl沉淀、體外膜式氧合白細(xì)胞分離法、血漿除去法、肝素誘導(dǎo)型體外膜式氧合ldl沉淀、體外膜式氧合以及類似應(yīng)用。

所公開的抗體的其他用途包括例如診斷補(bǔ)體-和c5-相關(guān)疾病。

本公開的方面提供了抗-c5抗體，具體地是包含至少一個cdr的抗體，所述至少一個cdr包含如下文更充分描述的重鏈和/或輕鏈cdr或其組合。

在一方面，抗-c5抗體抑制c5和/或c5b的活性，并且抑制c5b形成蛋白質(zhì)復(fù)合物的能力。在不受限于特定機(jī)制或理論的情況下，在一些實施方案中，抗體中斷補(bǔ)體途徑，因此中斷補(bǔ)體級聯(lián)、mac的形成和細(xì)胞裂解。此破壞可以防止或改變在以下各項但不包括以下各項的疾病過程：地圖狀委縮和滲出性amd、葡萄膜炎、糖尿病性和其他新生血管或缺血相關(guān)視網(wǎng)膜病變、糖尿病性黃斑水腫、病理性近視、vonhippel-lindau病、眼睛組織胞漿菌病、視網(wǎng)膜血管瘤樣增生、視網(wǎng)膜中央靜脈阻塞(crvo)、視網(wǎng)膜分支靜脈阻塞(brvo)、角膜血管新生、視網(wǎng)膜血管新生以及類似疾病。在一些實施方案中，抗-c5抗體可抑制mac形成的c5b啟動。

本公開的抗體因此可用于鑒定與c5或補(bǔ)體系統(tǒng)相關(guān)的病狀或相關(guān)疾病或病狀。另外，抗體可用于調(diào)節(jié)和/或抑制由c5和/或其他下游補(bǔ)體蛋白介導(dǎo)的作用，這樣具有治療和預(yù)防與補(bǔ)體和/或c5相關(guān)的各種疾病和病狀的功效。

更確切地說，本公開提供了抗-c5抗體和編碼所述抗體的多核苷酸。在不同方面，抗-c5抗體抑制由c5、c5b和/或其他補(bǔ)體蛋白介導(dǎo)的至少一種生物反應(yīng)，并且這樣可適用于改善補(bǔ)體相關(guān)和c5相關(guān)疾病和病癥的影響。本公開還提供了用于產(chǎn)生抗-c5抗體的表達(dá)系統(tǒng)，包括哺乳動物細(xì)胞系和細(xì)菌細(xì)胞，以及治療與補(bǔ)體激活相關(guān)的疾病的方法。

本公開的抗體包含支架結(jié)構(gòu)和結(jié)合于c5的一個或多個互補(bǔ)決定區(qū)(cdr)。在不同實施方案中，抗體包含第一氨基酸序列和/或第二氨基酸序列。

在一個實施方案中，所述第一氨基酸序列和/或第二氨基酸序列包含選自由seqidno:1-48組成的組的序列。

在不同實施方案中，抗體包含第一氨基酸序列和第二氨基酸序列中的一者或二者。第一氨基酸序列和第二氨基酸序列可為單一線性氨基酸序列，可通過二硫橋鍵共價結(jié)合，或者可以是非共價結(jié)合的。

補(bǔ)體組分5、c5

膜攻擊復(fù)合物(mac)通常作為補(bǔ)體系統(tǒng)的三種主要途徑(例如替代途徑、凝集素途徑或經(jīng)典途徑)中的一種或多種的激活結(jié)果來形成，或者通過經(jīng)由較不常見的外源途徑進(jìn)行的c5確認(rèn)或激活中的改變來形成。mac為免疫系統(tǒng)的效應(yīng)蛋白之一并且形成跨膜通道。這些通道破壞了靶細(xì)胞的磷脂雙分子層，從而導(dǎo)致細(xì)胞裂解和死亡。mac組裝中的關(guān)鍵蛋白為c5。c5具有約190kda(約1600aa)的分子量并且由兩條多肽鏈α鏈(α，115kda)和β鏈(β，75kda)組成。α鏈和β鏈通過二硫鍵連接。c5轉(zhuǎn)化酶切割從α鏈的n末端下游的75個殘基的精氨酸處切割c5。此切割釋放小c5a片段(長度大約77-74aa并且約11kda)，其為有效炎性分子。c5轉(zhuǎn)化酶切割還引起c5b激活，然后可啟動膜攻擊復(fù)合物(mac)的形成。c5b蛋白由α鏈(現(xiàn)在為104kda)和β鏈(75kda)組成。

通過c5轉(zhuǎn)化酶切割c5導(dǎo)致形成c5a和c5b。最新形成的c5b片段募集c6，接著依次添加c7、c8和多個c9分子，以組裝mac?；钚詍ac具有c5b-c6-c7-c8-c9{n}的亞基組成。通過c9形成的環(huán)結(jié)構(gòu)為靶細(xì)胞膜中的孔。如果形成足夠的孔，則細(xì)胞由于分子自由擴(kuò)散進(jìn)出細(xì)胞而不再能夠存在。在亞細(xì)胞裂解濃度下，這些孔可促成促炎性細(xì)胞激活，而在細(xì)胞裂解濃度下，孔形成導(dǎo)致細(xì)胞死亡。mac的形成在圖2中示意性示出。c5a和c5b二者均為促炎性分子。c5a結(jié)合c5a受體(c5ar)并且刺激促炎性細(xì)胞因子諸如tnf-α、il-1β、il-6和il-8從人白細(xì)胞中合成和釋放。c5a還已顯示與組織動態(tài)平衡(調(diào)理作用粒子的去除)、神經(jīng)存活和對抗血管形成反應(yīng)的促進(jìn)相關(guān)聯(lián)。大部分抗-c5抗體抑制c5a和c5b的形成，這不僅通過阻斷c5b形成來干擾mac激活，而且有害地阻斷可有助于維持視網(wǎng)膜健康的c5a活性。需要一種選擇性阻斷c5b以便抑制mac形成同時保留c5a的作用的抗體。

減少c5b的形成可有助于治療許多補(bǔ)體系統(tǒng)的疾病以及炎性疾病。一種這樣的疾病為年齡相關(guān)性黃斑變性或amd。amd為由于視網(wǎng)膜退化而導(dǎo)致視力喪失的醫(yī)學(xué)病狀。補(bǔ)體系統(tǒng)通過補(bǔ)體系統(tǒng)中的幾種基因與發(fā)展amd的個人危險之間的強(qiáng)相關(guān)性來參與amd。因此，通過防止c5b蛋白結(jié)合在mac中來抑制補(bǔ)體系統(tǒng)對于amd的治療性治療可為重要的。

抗-c5抗體

在一方面，本公開提供了結(jié)合c5、不結(jié)合c5a并且不抑制c5a形成的抗體。在某些方面，本公開提供了結(jié)合c5的重組抗體，即抗-c5抗體。在此情形下，重組抗體可使用重組技術(shù)，即經(jīng)由表達(dá)如下文所述的重組核酸來產(chǎn)生。用于產(chǎn)生重組蛋白的方法和技術(shù)為本領(lǐng)域所熟知的。

在一些實施方案中，分離或純化本公開的抗體。分離或純化的抗體可未伴隨通常在天然狀態(tài)下與其締合的至少一些物質(zhì)(污染物質(zhì))。在一個實施方案中，污染物質(zhì)構(gòu)成給定樣品的總重量的小于約50重量％，可選地小于約20重量％并且可選地小于10重量％。在一些實施方案中，污染物可以是蛋白質(zhì)。

在許多實施方案中，純化的抗-c5抗體在或從除它所來源的生物體之外的生物體中產(chǎn)生。在一些實施方案中，抗-c5抗體可以與通常所見濃度相比顯著較高的濃度來制得，方法是經(jīng)由使用誘導(dǎo)型啟動子或高表達(dá)啟動子，以使得抗體以增加的濃度水平制得。

在一些實施方案中，分離或純化的抗體可從可干擾抗體的診斷和/或治療用途的組分中取出。在一些實施方案中，抗體將純化至按抗體重量計大于90％，其中總蛋白濃度例如通過lowry方法來測定并且抗體濃度百分比通過目視法諸如蛋白質(zhì)凝膠法來測定。在一個實施方案中，抗-c5抗體大于99重量％，例如純到足以通過使用常見氨基酸測序法來獲得n-末端或內(nèi)源性氨基酸序列的至少15個殘基(例如，edman降解和質(zhì)譜法)，或者足以通過sds-page在還原或非還原條件下使用coomassie藍(lán)或銀染色來同質(zhì)化。分離抗體包括重組細(xì)胞內(nèi)的原位抗體，因為抗體的天然環(huán)境的至少一種組分將不存在。然而，通常將通過至少一個純化步驟來制備分離抗體。

公開的抗體可特異性結(jié)合c5并且可用于抑制或調(diào)節(jié)c5和c5b的生物活性。在某些實施方案中，公開的抗體通過免疫動物來產(chǎn)生，在其他情況下，抗體可通過重組dna技術(shù)來產(chǎn)生。在另外的實施方案中，抗-c5抗體可通過酶切割或化學(xué)切割傳統(tǒng)抗體來產(chǎn)生(傳統(tǒng)抗體可與人類抗體同義)。在一些實施方案中，抗體可包含四聚體。在這些實施方案的一些實施方案中，每個四聚體通常由兩對相同的多肽鏈組成，每一對具有一條輕鏈(通常具有約25kda的分子量)和一條重鏈(通常具有約50-70kda的分子量)。每條鏈的氨基端部分包含具有約100至110個或更多個氨基酸的可變區(qū)并且可負(fù)責(zé)抗原識別。每條鏈的羧基-末端部分可定義主要負(fù)責(zé)效應(yīng)子功能的恒定區(qū)。人輕鏈分類為κ輕鏈和λ輕鏈。重鏈被分類為μ、δ、γ、α或ε，并且將抗體的同種型分別定義為igm、igd、igg、iga以及ige。igg具有若干亞類，包括但不限于igg1、igg2、igg3及igg4。

一些抗體，例如已見于駱駝和美洲駝中的抗體可以是由兩條重鏈組成的二聚體，并且不包含輕鏈。muldermans等，2001,j.biotechnol.74:277-302；desmyter等，2001,j.biol.chem.276:26285-26290。駱駝抗體的結(jié)晶學(xué)研究已揭示這些抗體的cdr3區(qū)形成與抗原相互作用的表面并且因此對于抗原結(jié)合，如在更典型的四聚體抗體中的抗原結(jié)合是關(guān)鍵的。本公開涵蓋了由兩條重鏈組成的二聚體抗體或其片段，它們可結(jié)合c5和/或c5b和/或抑制所述c5和/或c5b的生物活性。

本公開的抗體特異性結(jié)合于人c5。當(dāng)抗體對c5具有比對任何其他抗原或蛋白質(zhì)更高的結(jié)合親和力時，所述抗體可特異性結(jié)合c5。在不同實施方案中，結(jié)合親和力通過測定平衡結(jié)合常數(shù)例如kd(或kd)或者ka(或ka)來測量。在一些實施方案中，公開的抗體結(jié)合于靶抗原，其中kd為約10^-7m至約10^-13m或約10^-9m至約10^-12m或約10^-11m至約10^-12m。在不同實施方案中，kd小于約10^-8m、10^-9m、10^-10m、10^-11m或10^-12m以及大于約10^-13m、10^-12m、10^-11m、10^-10m、10^-9m。

在一些情況下，對其他抗原的kd大于靶抗原kd的1x、大于靶抗原kd的2x、大于靶抗原kd的3x、大于靶抗原kd的4x、大于靶抗原kd的5x、大于靶抗原kd的6x、大于靶抗原kd的7x、大于靶抗原kd的8x、大于靶抗原kd的9x、大于靶抗原kd的10x(例如當(dāng)抗體的kd對靶抗原為x^-09m時，抗體對另一種抗原的kd可以是10x大或者x^-08m)、大于100x(例如當(dāng)抗體的kd對靶抗原為x^-10m時，抗體對另一種抗原的kd可以是10x大或者x^-08m)。在一些情況下，平衡結(jié)合常數(shù)可被表示為平衡締合常數(shù)ka或ka。

平衡結(jié)合常數(shù)可使用各種方法測定。在一些情況下，公開的抗體的平衡結(jié)合常數(shù)通過在蛋白結(jié)合測定法中測量結(jié)合(k1)和解離(k-1)速率來測定。測定平衡結(jié)合常數(shù)的一種示例性方法為通過生物層干涉測量法(bli)。bli為能夠測定溶液中的結(jié)合動力學(xué)的無標(biāo)記技術(shù)。在一種示例性方法中，抗體可以是人igg，并且抗-c5抗體可根據(jù)制造商指導(dǎo)通過抗人iggfc捕獲(ahc)生物傳感器尖端(fortébio,menlopark,ca,usa)來捕獲。其他類型的蛋白結(jié)合測定法包括：共免疫沉淀法；雙分子熒光補(bǔ)充法；親和電泳；拖拉(pull-down)測定；標(biāo)記轉(zhuǎn)移法；酵母雙雜交篩選；噬菌體展示；使用光反應(yīng)性氨基酸類似物進(jìn)行蛋白質(zhì)復(fù)合物的體內(nèi)交聯(lián)；串聯(lián)親和純化；化學(xué)交聯(lián)；化學(xué)交聯(lián)，接著高質(zhì)量maldi質(zhì)譜法；spine(鏈霉蛋白(strepprotein)相互作用實驗)；與敲低組合的定量免疫沉淀法；親近連接測定生物層干涉測量法；雙偏振干涉測量法；靜態(tài)光散射；動態(tài)光散射；表面等離振子共振；熒光偏振/各向異性；熒光相關(guān)光譜法；熒光共振能量轉(zhuǎn)移；通過nmr多核弛豫測量或溶液中的2d-ftnmr光譜法與nmr弛豫或2d-ft光譜數(shù)據(jù)集的非線性回歸分析組合進(jìn)行的蛋白質(zhì)活性測定；蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)接合(docking)；等溫滴定量熱法；以及微觀熱遷移。

在其中抗-c5抗體用于治療性應(yīng)用的實施方案中，抗-c5抗體的一個特征在于它可調(diào)節(jié)和/或抑制c5的或由c5介導(dǎo)的一種或多種生物活性。在此情況下，抗體可特異性結(jié)合c5，可基本上調(diào)節(jié)c5和/或c5b的活性，和/或可抑制c5b與其他蛋白質(zhì)(例如c6、c7)的結(jié)合。

在許多實施方案中，c5活性和抗體抑制該活性的能力通過分析在10％人血清存在下紅血細(xì)胞的細(xì)胞裂解來測量。(ap)的替代途徑的激活需要比經(jīng)典途徑更高的血清濃度。通常，在其中egta優(yōu)先螯合ca⁺⁺的測定中在5mmegta存在下使用最終濃度5mmmg⁺⁺。大部分哺乳動物物種的ap通過兔紅細(xì)胞自發(fā)激活，因此它們是方便的靶標(biāo)。通過用gvb⁰(comptech產(chǎn)品)洗滌3次并且將其重新懸浮成5x10⁸/ml來制備兔紅細(xì)胞(complementtechnology,inc.)。用gvb⁰稀釋不同量的抗因子c5抗體。在冰上以連續(xù)稀釋的抗因子bb抗體、0.1mmgegta(comptech產(chǎn)品)、1/2nhs(用gvb⁰1/2稀釋的人血清)和兔紅細(xì)胞的順序混合100ul反應(yīng)物。然后，在振動器上在37℃下將反應(yīng)物孵育30分鐘。添加1.0ml冷gvbe。在約1000xg或更高速度下混合并離心3分鐘，以使細(xì)胞沉淀。將100ul上清液轉(zhuǎn)移到96孔板中并且在412nm下讀數(shù)(softmaxpro4.7.1)。使用graphpadprism4分析數(shù)據(jù)。

并非特異性結(jié)合于抗原的每種抗體都可阻斷抗原結(jié)合于其正常配體并且因此抑制或調(diào)節(jié)抗原的生物效應(yīng)。如本領(lǐng)域已知的，這種效應(yīng)可取決于抗體結(jié)合哪部分抗原并且取決于抗原和抗體(在此情況下為c5抗體)的絕對濃度和相對濃度。為了考慮到能夠抑制或調(diào)節(jié)c5和/或c5b的生物活性，如本文所意指的，抗體可以能夠例如將人血清介導(dǎo)的溶血抑制至少約20％、40％、60％、80％、85％、90％、95％、99％或更大。

抑制c5和/或c5b活性所需要的抗體濃度可廣泛改變并且可取決于抗體與c5和/或c5b結(jié)合的緊密程度。例如，每個c5分子一個或更少抗體分子可足以抑制生物活性。在一些實施方案中，抑制c5的生物活性可需要約1,000:1至約1:1,000的c5:抗-c5抗體比率，包括約2:1、1:1、1:2、1:4、1:6、1:8、1:10、1:20、1:40、1:60、1:100、1:500、1:1,000或更大比率。在許多情況下，抑制c5活性的能力可取決于c5的濃度和/或抗-c5抗體的濃度。

在一些實施方案中，本公開的抗體包括(a)支架和(b)一個或多個cdr，所述cdr為決定抗原結(jié)合特異性和親和力的區(qū)域。互補(bǔ)決定區(qū)或cdr為抗體中構(gòu)成用于抗原結(jié)合的主要表面接觸點的區(qū)域。一個或多個cdr包埋在抗體的支架結(jié)構(gòu)中。本公開的抗體的支架結(jié)構(gòu)可以是抗體或其片段或變體，或者可以是在自然界中完全合成的。下文進(jìn)一步描述了本公開的抗體的各種支架結(jié)構(gòu)。

在目前公開的抗體的一個實施方案中，所述抗體可以是其氨基酸序列與親代氨基酸序列的氨基酸序列具有至少75％氨基酸序列同一性、同源性或類似性(similarity)的變體抗體。例如，在一些實施方案中，變體抗體的重鏈或輕鏈可變結(jié)構(gòu)域序列與親代序列的重鏈或輕鏈可變結(jié)構(gòu)域序列是75％相同的，可選地至少80％、可選地至少85％、可選地至少90％以及可選地至少95％。在大部分情況下，變體抗體在cdr序列中將具有很少或不具有變化，并且因此在大部分情況下將以類似親和力結(jié)合靶抗原。關(guān)于此序列的同一性或類似性在本文中定義為在比對序列并且引入間隙(必要時)以實現(xiàn)最大序列同一性百分比之后，變體序列中與親代抗體氨基酸序列相同(即相同的殘基)或相似(即基于共同側(cè)鏈性質(zhì)來自相同組的氨基酸殘基，參見下文)的的氨基酸殘基百分比。

cdr

本公開的抗體包含支架區(qū)和一個或多個cdr。本公開的抗體可具有一個與六個之間的cdr(如通常天然存在的抗體)，例如一條重鏈cdr1(“hccdr1”或“cdrh1”)和/或一條重鏈cdr2(“hccdr2”或“cdrh2”)和/或一條重鏈cdr3(“hccdr3”或“cdrh3”)和/或一條輕鏈cdr1(“l(fā)ccdr1”或“cdrl1”)和/或一條輕鏈cdr2(“l(fā)ccdr2”或“cdrl2”)和/或一條輕鏈cdr3(“l(fā)ccdr3”或“cdrl3”)。如本說明書整篇與諸如多肽、核酸、宿主細(xì)胞以及類似物的生物物質(zhì)結(jié)合使用的術(shù)語“天然存在”是指可見于自然界中的物質(zhì)。在天然存在的抗體中，重鏈cdr1通常包含約五個(5)至約七個(7)氨基酸，重鏈cdr2通常包含約十六個(16)至約十九個(19)氨基酸，并且重鏈cdr3通常包含約三個(3)至約二十五個(25)氨基酸。輕鏈的cdr1通常包含約十個(10)至約十七個(17)氨基酸，輕鏈cdr2通常包含約七個(7)氨基酸，并且輕鏈cdr3通常包含約七個(7)至約十個(10)氨基酸。

本公開的氨基酸包含天然氨基酸和合成氨基酸(例如，高苯丙氨酸、瓜胺酸、鳥氨酸以及正亮氨酸)。此類合成的氨基酸可以并入，特別是當(dāng)抗體通過本領(lǐng)域已熟知的常規(guī)方法體外合成時。另外，可以使用肽模擬的、合成的和天然存在的殘基/結(jié)構(gòu)的任何組合。氨基酸包含亞氨基酸殘基，諸如脯氨酸和羥脯氨酸。氨基“r基團(tuán)”或“側(cè)鏈”可處于(l)-構(gòu)型或(s)-構(gòu)型中。在一個特定實施方案中，氨基酸為(l)-構(gòu)型或(s)-構(gòu)型中。在一些實施方案中，氨基酸可形成肽模擬結(jié)構(gòu)，即肽或蛋白質(zhì)類似物，諸如肽類似物(參見simon等，1992,proc.natl.acad.sci.u.s.a.89:9367，所述文獻(xiàn)以引用的方式并入本文)，所述結(jié)構(gòu)可以抵抗蛋白酶或其他生理學(xué)條件和/或貯存條件。

下文進(jìn)一步描述了天然存在的抗體內(nèi)的cdr的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)。簡言之，在傳統(tǒng)抗體支架中，cdr包埋在重鏈和輕鏈可變區(qū)中的框架內(nèi)，在框架中，它們構(gòu)成負(fù)責(zé)抗原結(jié)合和識別的區(qū)域?？勺儏^(qū)包含至少三個重鏈或輕鏈cdr，參見同上(kabat等，1991,sequencesofproteinsofimmunologicalinterest,publichealthservicen.i.h.,bethesda,md；還參見chothia和lesk,1987,j.mol.biol.196:901-917；chothia等，1989,nature342:877-883)，它們是在框架區(qū)內(nèi)(表示為框架區(qū)1-4，fr1、fr2、fr3和fr4，kabat等，1991，同上；還參見chothia和lesk，1987，同上)。參見下文。然而，本公開提供的cdr可不僅用于定義傳統(tǒng)抗體結(jié)構(gòu)的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域，而且可包埋在如本文所述的多種其他支架結(jié)構(gòu)中。

表1中呈現(xiàn)了用于公開的抗體的特定cdr。

在另一個實施方案中，本公開提供了結(jié)合c5的抗體，其中所述抗體包含具有seqidno:16-18、22-24、28-30、34-36、40-42以及46-48中任一項的不超過兩個(2)氨基酸添加、缺失或取代的至少一個hccdr區(qū)，和/或具有seqidno:13-15、19-21、25-27、31-33、37-39以及43-45中任一項的不超過兩個(2)氨基酸添加、缺失或取代的至少一個lccdr區(qū)。本公開的各種重鏈和輕鏈可變區(qū)的實施方案在表2和seqidno:1-12中描繪。在一些實施方案中，具有hccdr3區(qū)和/或lccdr3區(qū)的抗體具有特別的用途。另外，在一些實施方案中，抗體可具有包含選自seqidno:16-18、22-24、28-30、34-36、40-42以及46-48中任一項的hccdr的不超過兩個(2)序列氨基酸添加、缺失或取代的一個cdr，以及具有seqidno:13-15、19-21、25-27、31-33、37-39以及43-45中任一項的不超過兩個(2)氨基酸添加、缺失或取代的lccdr(例如，所述抗體具有兩個cdr區(qū)、一個hccdr和一個lccdr，特定實施方案為具有hccdr3和lccdr3二者的抗體，例如seqidno:45和48)。

表2

輕鏈序列

重鏈序列

變體cdr序列

在另一個實施方案中，本公開提供了結(jié)合c5蛋白的抗體，其中所述抗體包含具有seqidno:16-18、22-24、28-30、34-36、40-42以及46-48中任何hccdr1、hccdr2或hccdr3區(qū)(如上所討論的)的不超過兩個(2)氨基酸添加、缺失或取代的至少一個hccdr區(qū)，和/或具有seqidno:13-15、19-21、25-27、31-33、37-39以及43-45中任何lccdr1、lccdr2或lccdr3區(qū)(如上所討論的)的不超過兩個(2)氨基酸添加、缺失或取代的至少一個lccdr區(qū)。在此實施方案中，具有hccdr3區(qū)或lccdr3區(qū)的抗體具有特別的用途。另外的實施方案利用具有以下各項的抗體：具有選自seqidno:16-18、22-24、28-30、34-36、40-42以及46-48中任一項的hccdr區(qū)的不超過2個序列氨基酸添加、缺失或取代的一個cdr，以及具有seqidno:13-15、19-21、25-27、31-33、37-39以及43-45中任一項的不超過兩個(2)氨基酸添加、缺失或取代的lccdr區(qū)(例如，所述抗體具有兩個cdr區(qū)、一個hccdr和一個lccdr，特定實施方案為具有hccdr3區(qū)和lccdr3區(qū)二者的抗體，例如seqidno:45和48)。

如本領(lǐng)域技術(shù)人員將了解的，對于具有來自所描繪序列的超過一個cdr的任何抗體，獨立地選自所描述序列的任何cdr組合為有用的。因此，可產(chǎn)生具有一個、兩個、三個、四個、五個或六個獨立選自的cdr的抗體。然而，如本領(lǐng)域技術(shù)人員將了解的，特定實施方案通常利用非重復(fù)性cdr組合，例如抗體通常并未制成具有兩個hccdr2區(qū)，等等。

本公開的另一方面提供了一種結(jié)合c5的分離抗體，其中所述分離抗體包含具有seqidno:16-18、22-24、28-30、34-36、40-42以及46-48中任一項的不超過兩個(2)氨基酸添加、缺失或取代的重鏈氨基酸序列，以及具有seqidno:13-15、19-21、25-27、31-33、37-39以及43-45中任一項的不超過兩個(2)氨基酸添加、缺失或取代的輕鏈氨基酸序列。注意任何重鏈序列可與任何輕鏈序列混合并匹配。

通常，本文所述的個別變體cdr之間的氨基酸同源性、類似性或同一性當(dāng)與本文公開的序列相比時為至少80％。在許多情況下，aa同源性、類似性或同一性為至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％以及99％。

序列同一性/同源性

如本領(lǐng)域已知的，許多不同程序可用于鑒定蛋白質(zhì)或核酸與第二種序列的序列同一性或類似性程度。

對于氨基酸序列，序列同一性和/或同源性通過使用本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)來測定，所述標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)包括但不限于，smith和waterman，1981,adv.appl.math.2:482的局部序列同一性算法；needleman和wunsch,1970,j.mol.biol.48:443的序列同一性算法；pearson和lipman,1988,proc.nat.acad.sci.u.s.a.85:2444的類似性方法搜索；這些算法的計算機(jī)實施形式(在madison,wis.的575sciencedrive的遺傳學(xué)計算機(jī)組wisconsin遺傳學(xué)軟件包中的gap、bestfit、fasta和tfasta)；由devereux等，1984,nucl.acidres.12:387-395描述的bestfit序列程序，使用默認(rèn)設(shè)置或通過審查。同一性百分比可通過fastdb基于以下參數(shù)來計算：錯配罰分1；空位罰分1；缺口尺寸罰分0.33；以及連接罰分30，“currentmethodsinsequencecomparisonandanalysis,”macromoleculesequencingandsynthesis,selectedmethodsandapplications，第127-149頁(1988),alanr.liss,inc。

有用算法的實例為pileup。pileup使用漸進(jìn)性成對比對從一組相關(guān)序列來產(chǎn)生多重序列比對。它還可繪制顯示用于產(chǎn)生比對的聚類關(guān)系的樹形圖。pileup使用feng和doolittle,1987,j.mol.evol.35:351-360的漸進(jìn)性比對方法的簡化方法；所述方法類似于higgins和sharp,1989,cabios5:151-153所述的方法。有用的pileup參數(shù)包括默認(rèn)缺口權(quán)重3.00、默認(rèn)缺口長度權(quán)重0.10以及權(quán)重端缺口。

有用的算法的另一個實例為以下各項中描述的blast算法：altschul等，1990,j.mol.biol.215:403-410；altschul等，1997,nucleicacidsres.25:3389-3402；以及karin等，1993,proc.natl.acad.sci.u.s.a.90:5873-5787。特別有用的blast程序為從altschul等，1996,methodsinenzymology266:460-480獲得的wu-blast-2程序。wu-blast-2使用若干搜索參數(shù)，大部分參數(shù)被設(shè)置為默認(rèn)參數(shù)。對于蛋白質(zhì)，可調(diào)節(jié)參數(shù)被設(shè)置為以下數(shù)值：重疊跨接＝1、重疊分?jǐn)?shù)＝0.125、單詞閾值(wordthreshold)t＝11。hsps和hsps2參數(shù)為動態(tài)值并且通過程序自身基于特定序列組成和其中檢索感興趣的序列的特定數(shù)據(jù)庫的組成來建立；然而，所述值可被調(diào)節(jié)為增加靈敏度。

另一有用算法為缺口blast，如altschul等，1993,nucl.acidsres.25:3389-3402所報道的。缺口blast使用blosum-62取代評分；閾值t參數(shù)設(shè)置為9；引發(fā)無缺口延伸的雙擊法以10+k為代價承擔(dān)缺口長度k；xu設(shè)置為16并且對于數(shù)據(jù)庫搜索階段，xg設(shè)置為40，并且對于算法的輸出階段設(shè)置為67。缺口算法通過與約22位相對應(yīng)的評分來引發(fā)。

通常，個別變體cdr或可變區(qū)之間的氨基酸同源性、類似性或同一性為所述序列的至少80％，或者可選地使同源性或同一性增加至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％以及幾乎100％。

以一種類似的方式，相對于編碼公開抗體的核酸序列的核酸序列同一性百分比(％)為候選序列中與抗體編碼序列中的核苷酸殘基相同的核苷酸殘基百分比。特定方法利用設(shè)置為默認(rèn)參數(shù)的wu-blast-2的blastn模塊，其中重疊跨接和重疊分?jǐn)?shù)分別設(shè)置為1和0.125。

通常，編碼個別變體cdr與變體可變結(jié)構(gòu)域序列的核苷酸序列之間的核酸序列同源性、類似性或同一性為至少80％，或者可選地使同源性或同一性增加至少85％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％以及幾乎100％。在許多情況下，不相同的核酸序列由于遺傳密碼的簡并性而可編碼相同氨基酸序列。

核苷酸序列之間的同源性通常通過它們彼此雜交的能力來定義。在一些實施方案中，選擇性雜交可以是指以高特異性結(jié)合。根據(jù)本公開的多核苷酸、寡核苷酸及其片段在使與非特異性核酸的可檢測結(jié)合的可觀量最小化的雜交和洗滌條件下與核酸鏈選擇性雜交。高嚴(yán)格性條件可用于實現(xiàn)如本領(lǐng)域中已知及本文論述的選擇性雜交條件。

雜交反應(yīng)的嚴(yán)格性容易通過本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來確定，并且通常為依賴于探針長度、探針濃度/組成、靶濃度/組成、洗滌溫度以及鹽濃度的經(jīng)驗計算。通常，較長探針對于適當(dāng)退火需要較高溫度，而較短探針需要較低溫度。雜交通常取決于變性dna在互補(bǔ)鏈存在于低于其解鏈溫度的環(huán)境中時再退火的能力。探針與可雜交序列之間希望的同源性程度越高，可使用的相對溫度就越高。因此，由此得出較高的相對溫度傾向于使反應(yīng)條件更嚴(yán)格，而較低溫度則較不嚴(yán)格。對于另外的詳情和雜交反應(yīng)嚴(yán)格性的說明，參見ausubel等，currentprotocolsinmolecularbiology,wileyintersciencepublishers,(1995)。

高嚴(yán)格條件為本領(lǐng)域已知的；參見，例如sambrook等，2001，同上以及shortprotocolsinmolecularbiology，第二版，ausubel等編著，johnwiley&sons,1992，兩份文獻(xiàn)均以引用的方式并入。嚴(yán)格條件為序列依賴性的并且在不同情況下有所不同。較長的序列在較高溫度下特異性雜交。核酸雜交的詳盡指南參見tijssen,techniquesinbiochemistryandmolecularbiology--hybridizationwithnucleicacidprobes,“overviewofprinciplesofhybridizationandthestrategyofnucleicacidassays”(1993)。

在一些實施方案中，嚴(yán)格條件或高嚴(yán)格條件可通過以下各項來鑒定：(1)在50℃下采用低離子強(qiáng)度和高溫度用于洗滌，例如0.015m氯化鈉/0.0015m檸檬酸鈉/0.1％十二烷基硫酸鈉；(2)在雜交期間在42c下采用變性劑，諸如甲酰胺，例如具有0.1％牛血清白蛋白/0.1％ficoll/0.1％聚乙烯吡咯酮/50mmph6.5磷酸鹽緩沖液和750mm氯化鈉、75mm檸檬酸鈉的50％(v/v)甲酰胺；或者(3)在42℃下采用50％甲酰胺、5xssc(0.75mnacl,0.075m檸檬酸鈉)、50mm磷酸鈉(ph6.8)、0.1％焦磷酸鈉、5xdenhardt氏溶液、聲波處理的鮭精dna(50μg/ml)、0.1％sds以及10％硫酸葡聚糖，在42℃以0.2xssc(氯化鈉/檸檬酸鈉)洗滌并在55℃以50％甲酰胺洗滌，接著在55℃下進(jìn)行由含有edta的0.1xssc組成的高嚴(yán)格洗滌。

通常，對于在限定離子強(qiáng)度和ph下的特定序列，嚴(yán)格條件被選擇為低于熱熔點(tm)約5℃-10℃。tm為平衡時50％與靶序列互補(bǔ)的探針與靶序列雜交的溫度(在限定離子強(qiáng)度、ph和核酸濃度下)(因為靶序列過量存在，所以在tm下，平衡時50％探針被占據(jù))。嚴(yán)格度條件將是其中如下所述的那些：在ph7.0至8.3時鹽濃度低于約1.0m鈉離子、通常約0.01至1.0m鈉離子濃度(或其他鹽)，并且溫度對于短探針(例如10至50個核苷酸)而言為至少約30℃，而對于長探針(例如，大于50個核苷酸)而言為至少約60℃。還可通過加入去穩(wěn)定劑諸如甲酰胺來實現(xiàn)嚴(yán)格條件。

在另一個實施方案中，使用較不嚴(yán)格雜交條件；例如，可使用中度嚴(yán)格條件或低嚴(yán)格條件，如本領(lǐng)域已知的；參見，sambrook等，2001，同上；ausubel等，1992，同上；以及tijssen，1993，同上。

在一些情況下，中度嚴(yán)格條件可包括使用比以上所述嚴(yán)格條件更不嚴(yán)格的洗滌溶液和雜交條件(例如，溫度、離子強(qiáng)度和sds％)。中度嚴(yán)格條件的實例為在37℃下在包含以下各項的溶液中孵育過夜：20％甲酰胺、5xssc(150mmnacl、15mm檸檬酸三鈉)、50mm磷酸鈉(ph7.6)、5xdenhardt氏溶液、10％硫酸葡聚糖以及20mg/ml變性剪切鮭精dna，接著在約37℃-50℃下以1xssc洗滌過濾物。技術(shù)人員將知道如何根據(jù)需要來調(diào)整溫度、離子強(qiáng)度等等，以調(diào)節(jié)諸如探針長度等因素。

在一些實施方案中，公開的抗體及其變體可通過位點特異性誘變編碼所述抗體的dna序列內(nèi)的核苷酸來制備。這可使用序列盒或pcr誘變或本領(lǐng)域熟知的其他技術(shù)來實現(xiàn)，以便產(chǎn)生編碼變體的dna，并且此后在本文列出的細(xì)胞培養(yǎng)物中表達(dá)重組dna。在一些情況下，包含變體cdr的具有多達(dá)約100-150個殘基的抗體片段可通過使用確定技術(shù)進(jìn)行體外合成來制備。這些變體可展現(xiàn)出與天然存在的類似物相同的定性生物活性，例如結(jié)合于c5并抑制補(bǔ)體，但也可選擇具有改進(jìn)特征的變體，如將在本文中更充分概述。

當(dāng)預(yù)先確定用于引入氨基酸序列變化的位點或區(qū)域時，不需要預(yù)先確定突變本身。例如，為了優(yōu)化給定位點處的突變，可在靶密碼子或區(qū)域內(nèi)進(jìn)行隨機(jī)誘變并且對于最佳的希望的抗體活性篩選表達(dá)抗體cdr或可變區(qū)序列變體。用于在具有已知序列的dna的預(yù)先確定位點處形成取代突變的技術(shù)為已熟知的，例如m13引物誘變和pcr誘變。突變體的篩選使用抗體活性(諸如c5結(jié)合)測定來完成。

氨基酸取代通常具有單一殘基；插入通常將為約一個(1)至約二十個(20)氨基酸殘基，盡管可以忍受適當(dāng)較大的插入。缺失范圍為約1個(1)至約二十個(20)氨基酸殘基，盡管在一些情況下，缺失可能大許多。

取代、缺失、插入或其任何組合可以用于得到最終衍生物或變體。通常這些改變在幾個氨基酸上進(jìn)行，以使分子的改變最小化，特別是抗體的免疫原性和特異性。然而，在某些情形下可忍受更大的改變。保守性取代通常根據(jù)表3所描繪的以下突變來進(jìn)行。

功能和免疫同一性變化可通過選擇比表3所示取代更不保守的取代來形成。例如，取代可被形成為更顯著地影響以下各項：變化區(qū)域內(nèi)多肽主鏈的結(jié)構(gòu)，例如α螺旋結(jié)構(gòu)或β折疊結(jié)構(gòu)；靶位點處的分子電荷或親水性；或大體積側(cè)鏈。通常預(yù)期在多肽性質(zhì)中產(chǎn)生最大改變的取代為以下那些取代：其中(a)親水性殘基例如絲氨?；蛱K氨?；蝗〈?或被取代為)疏水性殘基例如亮氨?；?、異亮氨酰基、苯丙氨?；?、纈氨酰基或丙氨?；?b)半胱氨酸或脯氨酸被取代成(或被取代為)任何其他殘基；(c)具有正電側(cè)鏈的殘基例如賴氨酰基、精氨?；蚪M氨?；蝗〈?或被取代為)負(fù)電性殘基例如谷氨?；蛱扉T冬氨?；?；或者(d)具有大體積側(cè)鏈的殘基例如苯丙氨酸被取代成(或被取代為)不具有側(cè)鏈的殘基例如甘氨酸。

所述變體通常展現(xiàn)出相同的定性生物活性并且將引起與天然存在的類似物相同的免疫反應(yīng)，盡管變體也被選擇為按需要修飾公開的c5抗體的特征?？蛇x地，可選擇其中公開抗體的生物活性被改變的變體。例如，糖基化位點可如本文所討論地改變或去除。

本文公開了與seqidno:1-48同源的多肽序列。本文公開的多肽可包含與公開的氨基酸序列相同的氨基酸序列。在其他情況下，要求保護(hù)的多肽包含可含有與公開序列相比的保守性氨基酸取代的氨基酸序列。保守性氨基酸取代可包含與取代的氨基酸具有共同特征的氨基酸。在不同情況下，可進(jìn)行保守性取代而不對多肽的結(jié)構(gòu)或功能產(chǎn)生顯著改變。

保守性氨基酸取代可基于側(cè)鏈、尺寸、電荷、疏水性、親水性、等電點等等的相對類似性來進(jìn)行。在不同情況下，可通過常規(guī)測試測定取代對蛋白質(zhì)功能的影響。保守性氨基酸取代包括具有類似親水性值的氨基酸，如其中氨基酸具有可基于氨基酸疏水性和電荷的親水指數(shù)。在不同情況下，保守性氨基酸取代可在相同類別的氨基酸之間進(jìn)行，例如非極性氨基酸、酸性氨基酸、堿性氨基酸以及中性氨基酸。保守性取代也可基于尺寸或體積。氨基酸還可基于其形成或破壞給定結(jié)構(gòu)的能力來分類，所述結(jié)構(gòu)諸如α螺旋、β折疊或分子內(nèi)相互作用或分子間相互作用。在不同情況下，保守性氨基酸取代基于不超過一種特征。

目前公開的多肽可包含天然氨基酸和非天然氨基酸。在不同情況下，天然氨基酸側(cè)鏈可被非天然側(cè)鏈取代。在不同情況下，氨基酸可被衍生化。

公開的多肽包括與seqidno:1-48的序列同源的多肽。同源性可被表示為同一性％或類似性％或相似性(positive)％。在不同情況下，同一性％為兩種比對的多肽之間相同的氨基酸百分比，并且類似性％或相似性％為不相同但表示保守性取代的氨基酸百分比。保守性取代可以是帶相同電荷的氨基酸、相同尺寸的氨基酸、相同極性的氨基酸等等。例如，賴氨酸到精氨酸可被視為保守性取代，其中考慮到電荷。

在不同情況下，兩種多肽可通過算法例如blastp來比對。在不同情況下，blastp參數(shù)可設(shè)置成最大靶序列長度等于、大于或小于兩種多肽中較長多肽的長度，預(yù)期閾值可設(shè)置為10，單詞尺寸設(shè)置為3，并且評分矩陣可以是blosum62，其中缺口成本對于存在性為11并且對于擴(kuò)展為1。blastp可將比對的多肽的同源性報道為“同一性”和“相似性(positive)”。比對的序列可包含實現(xiàn)比對的缺口。

在不同情況下，氨基酸序列的同源性可反映當(dāng)如上文所述地最佳比對時的同一性百分比或者相似性百分比。在不同情況下，同源性％(相似性％)或同一性％可通過除以比較窗口內(nèi)比對的氨基酸數(shù)目來計算。如果兩種多肽具有不等的長度，則比較窗口可以是一種多肽或另一種多肽的完整長度。在其他情況下，比較窗口可以是所述多肽之一的一部分。在不同情況下，用于測量兩種多肽序列的同源性或同一性的比較窗口大于約40aa(氨基酸)、45aa、50aa、55aa、60aa、65aa、70aa、75aa、80aa、85aa、90aa、95aa、100aa、150aa或200aa和/或小于約200aa、150aa、100aa、95aa、90aa、85aa、80aa、75aa、70aa、65aa、60aa、55aa、50aa或45aa。在一些實施方案中，如在使用cdr序列的情況下，比較窗口可小于40aa，例如在小于約25aa、24aa,23aa,22aa,21aa,20aa,19aa,18aa、17aa、16aa、15aa、14aa、13aa、12aa、11aa、10aa、9aa,8aa、7aa、6aa、5aa或4aa，與大于約3aa、4aa、5aa、6aa、7aa、8aa、9aa、10aa、11aa、12aa、13aa、14aa、15aa、16aa、17aa、18aa、19aa、20aa、21aa、22aa、23aa或24aa之間。

在不同情況下，要求保護(hù)的氨基酸序列可在給定的比較窗口上具有以下同一性％或同源性％(相似性％)：大于約60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％和/或小于約100％、99％、98％、97％、96％、95％、94％、93％、92％、91％、90％、85％、80％、75％或70％。

在不同情況下，序列比對可使用不同算法來進(jìn)行，包括動態(tài)比對、局部比對和總體對比。例如，smith和waterman,1981,adv.appl.math2:482的算法；needleman和wunsch,1970,j.mol.biol.48:443的比對算法；pearson和lipman,1988,proc.natl.acad.sci.usa85:2444的類似性方法。在不同情況下，計算機(jī)程序可實施這些算法(諸如emboss、gap、bestfit、fasta、tfastablast、blosum等等)。

在替代情況下，可進(jìn)行保守性氨基酸取代，其中氨基酸殘基被取代為相同類別中的另一種氨基酸殘基，例如其中氨基酸被分成非極性、酸性、堿性和中性類別，如下：非極性：ala、val、leu、ile、phe、trp、pro、met；酸性：asp、glu；堿性：lys、arg、his；中性：gly、ser、thr、cys、asn、gln、tyr。

在一些情況下，可進(jìn)行保守性氨基酸取代，其中氨基酸殘基被取代為具有類似親水性值的另一種氨基酸殘基(例如，在加或減2.0的值內(nèi))，其中以下各項可以是具有分配給氨基酸殘基的約-1.6的親水指數(shù)的氨基酸，諸如tyr(-1.3)或pro(-1.6)：arg(+3；0)；lys(+3.0)；asp(+3.0)；glu(+3.0)；ser(+0.3)；asn(+0.2)；gin(+0.2)；gly(o)；pro(-0.5)；thr(-0.4)；ala(-0.5)；his(-0.5)；cys(-1.0)；met(-1.3)；val(-1.5)；leu(-1.8)；ile(-1.8)；tyr(-2.3)；phe(-2.5)；以及trp(-3.4)。

在替代情況下，可進(jìn)行保守性氨基酸取代，其中氨酸殘基被取代為具有類似親水指數(shù)的另一種氨基酸殘基(例如，在加或減2.0的值內(nèi))。在此類情況下，每種氨基酸殘基可基于其疏水性和電荷特征來分配親水指數(shù)，如下：lie(+4.5)；val(+4.2)；leu(+3.8)；phe(+2.8)；cys(+2.5)；met(+1.9)；ala(+1.8)；gly(-0.4)；thr(-0.7)；ser(-0.8)；trp(-0.9)；tyr(-1.3)；pro(-1.6)；his(-3.2)；glu(-3.5)；gln(-3.5)；asp(-3.5)；asn(-3.5)；lys(-3.9)；以及arg(-4.5)。

在替代情況下，保守性氨基酸改變包括基于親水性或疏水性、尺寸或體積或電荷的考慮因素的改變。氨基酸通常可表征為疏水性或親水性的，這主要取決于氨基酸側(cè)鏈的性質(zhì)。疏水性氨基酸展現(xiàn)出大于零的疏水性，并且親水性氨基酸展現(xiàn)出小于零的親水性，這是基于eisenberg等的歸一化共有疏水性標(biāo)度(j.mol.bio.179:125-142,184)。遺傳編碼的疏水性氨基酸包括gly、ala、phe、val、leu、lie、pro、met以及trp，并且遺傳編碼的親水性氨基酸包括thr、his、glu、gln、asp、arg、ser以及l(fā)ys。非遺傳編碼的疏水性氨基酸包括叔丁基丙氨酸，而非遺傳編碼的親水性氨基酸包括瓜氨酸和高半胱氨酸。

疏水性氨基酸或親水性氨基酸可基于其側(cè)鏈的特征來進(jìn)一步細(xì)分。例如，芳族氨基酸為具有含有至少一個芳香環(huán)或雜芳環(huán)的側(cè)鏈的疏水性氨基酸，所述氨基酸可含有一個或多個取代基，諸如--oh、--sh、--cn、--f、--cl、--br、--i、--no2、--no、--nh2、--nhr、--nrr、--c(o)r、--c(o)oh、--c(o)or、--c(o)nh2、--c(o)nhr、--c(o)nrr等等，其中r獨立地為(c1-c6)烷基、取代的(c1-c6)烷基、(c0-c6)烯基、取代的(c1-c6)烯基、(c1-c6)炔基、取代的(c0-c6)炔基、(c5-c20)芳基、取代的(c0-c20)芳基、(c6-c26)烷芳基、取代的(c6-c26)烷芳基、5-20元雜芳基、取代的5-20元雜芳基、6-26元烷基雜芳基或取代的6-26元烷基雜芳基。遺傳編碼的芳族氨基酸包括phe、tyr和trp。

非極性或無極性氨基酸為具有側(cè)鏈的疏水性氨基酸，所述側(cè)鏈在生理ph下不帶電荷并且具有其中由兩個原子共同享有的一對電子通常通過兩個原子各自等同地占有的鍵(即，側(cè)鏈為非極性的)。遺傳編碼的無極性氨基酸包括gly、leu、val、ile、ala以及met。無極性氨基酸可進(jìn)一步細(xì)分為包括脂肪族氨基酸，所述脂肪族氨基酸為具有脂肪烴側(cè)鏈的疏水性氨基酸。遺傳編碼的脂肪族氨基酸包括ala、leu、val以及ile。

極性氨基酸為具有側(cè)鏈的親水性氨基酸，所述側(cè)鏈在生理ph下不帶電荷，但是具有其中由兩個原子共同享有的一對電子通過兩個原子之一更緊密占有的鍵。遺傳編碼的極性氨基酸包括ser、thr、asn以及gln。

酸性氨基酸為具有小于7的側(cè)鏈pka值的親水性氨基酸。酸性氨基酸通常由于失去氫離子而在生理ph下具有帶負(fù)電荷的側(cè)鏈。遺傳編碼的酸性氨基酸包括asp和glu。堿性氨基酸為具有大于7的側(cè)鏈pka值的親水性氨基酸。堿性氨基酸通常由于與水合氫離子締合而在生理ph下具有帶正電荷的側(cè)鏈。遺傳編碼的堿性氨基酸包括arg、lys和his。

氨基酸序列同一性百分比值通過匹配的相同殘基數(shù)目除以比較窗口中“較長”序列殘基的總數(shù)目來確定?！拜^長”序列為具有比較窗口中的大部分實際殘基的序列(忽略通過wu-blast-2引入的使比對得到最大化的缺口)。

比對可包括比對序列中的缺口引入。另外，對于含有比由公開的多肽的序列編碼的蛋白質(zhì)更多或更少的氨基酸的序列，應(yīng)理解，在一種情況下，序列同一性百分比將基于相同氨基酸數(shù)目相對于氨基酸總數(shù)目來確定。在同一性百分比計算中，相對權(quán)重被分配給不同表現(xiàn)形式的序列變化，諸如插入、缺失、取代等等。

在一種情況下，僅同一性為正性評分(+1)并且所有形式的序列變化(包括缺口)被分配值“0”，這排除了如下所述用于序列類似性計算的權(quán)重標(biāo)度或參數(shù)的需要。序列同一性百分比可例如通過將匹配的相同殘基數(shù)目除以比對區(qū)內(nèi)“較短”序列殘基總數(shù)目并且乘以100來計算。“較長”序列為具有比對區(qū)內(nèi)大部分實際殘基的序列。

支架

如本文所述的，本公開的抗體可包含以上所述cdr可移植到的支架結(jié)構(gòu)。在一個實施方案中，支架結(jié)構(gòu)為傳統(tǒng)抗體結(jié)構(gòu)，即，包含兩個重鏈可變結(jié)構(gòu)域序列和兩個輕鏈可變結(jié)構(gòu)域序列的抗體。在一些情況下，本文所述的抗體組合可包含構(gòu)成重鏈和/或輕鏈的另外組分(框架、j區(qū)和d區(qū)、恒定區(qū)等等)。一些實施方案包括使用人支架組分。

因此，在不同實施方案中，本公開的抗體包含傳統(tǒng)抗體的支架。在一些實施方案中，公開的抗體可以是人抗體和單克隆抗體、雙特異性抗體、雙抗體、微型抗體、結(jié)構(gòu)域抗體、合成抗體、嵌合抗體、抗體融合物以及每種抗體各自的片段。以上所述cdr和cdr的組合可以移植到任何以下支架中。

本公開的嵌合抗體可包含與源自特定物種的對應(yīng)序列相同或同源的重鏈序列和/或輕鏈序列。例如，在一個實施方案中，抗-c5抗體為包含人fc結(jié)構(gòu)域的嵌合抗體，而所述抗體的其余部分可以是與對應(yīng)小鼠或嚙齒動物序列相同或同源的。嵌合抗體可以是此類抗體的片段，只要所述片段展現(xiàn)出希望的生物活性并且包含源自另一物種、抗體類別或抗體亞類的序列(美國專利號4,816,567；以及morrison等(1984)proc.natl.acad.sci.usa81:6851-6855)。

在一些實施方案中，目前公開的抗-c5抗體的可變區(qū)包含至少三個重鏈或輕鏈cdr，參見同上(kabat等，1991,sequencesofproteinsofimmunologicalinterest,publichealthservicen.i.h.,bethesda,md；還參見chothia和lesk,1987,j.mol.biol.196:901-917；chothia等，1989,nature342:877-883)，它們包埋在框架區(qū)內(nèi)(表示為框架區(qū)1-4，fr1、fr2、fr3和fr4，kabat等，1991，同上；還參見chothia和lesk，1987，同上)。

在一些情況下，所述抗體包含重鏈可變結(jié)構(gòu)域序列或輕鏈可變結(jié)構(gòu)域序列。在一些情況下，重鏈可變結(jié)構(gòu)域序列或輕鏈可變結(jié)構(gòu)域序列可包含選自表1序列的序列。

在大部分情況下，傳統(tǒng)抗體結(jié)構(gòu)單元包含四聚體。每個四聚體通常由兩對相同的多肽鏈組成，每一對具有一條輕鏈(通常具有約25kda的分子量)和一條重鏈(通常具有約50-70kda的分子量)。每條鏈的氨基端部分包含主要負(fù)責(zé)抗原識別的具有約100至110個或更多個氨基酸的可變區(qū)。每條鏈的羧基-末端部分定義一個恒定區(qū)，而重鏈可包含總計三個恒定區(qū)(ch1、ch2和ch3)，其中所述恒定區(qū)可有助于調(diào)節(jié)效應(yīng)子功能。人輕鏈分類為κ輕鏈和λ輕鏈。重鏈被分類為μ、δ、γ、α或ε，并且將抗體的同種型分別定義為igm、igd、igg、iga以及ige。igg具有若干亞類，包括但不限于igg1、igg2、igg3及igg4。igm具有的亞類包括但不限于igm1及igm2。

在輕鏈和重鏈內(nèi)，可變區(qū)與恒定區(qū)通過具有約十二個(12)或更多個氨基酸的“j”區(qū)加以接合，其中重鏈也包含具有約十個(10)或更多個氨基酸的“d”區(qū)。通常參見，paul,w.編著，1989,fundamentalimmunologych.7,第2版，ravenpress,n.y.各輕鏈和重鏈對的可變區(qū)形成抗體結(jié)合位點。

一些天然存在的抗體，例如已見于駱駝和美洲駝中的抗體是由兩條重鏈組成的二聚體，并且不包含輕鏈。muldermans等，2001,j.biotechnol.74:277-302；desmyter等，2001,j.biol.chem.276:26285-26290。駱駝抗體的結(jié)晶學(xué)研究已揭示cdr3區(qū)形成與抗原相互作用的表面并且因此對于抗原結(jié)合，如在更典型的四聚體抗體中的抗原結(jié)合是關(guān)鍵的。本公開涵蓋了由兩條重鏈組成的二聚體抗體或其片段，它們可結(jié)合于c5和/或抑制所述c5的生物活性。

重鏈和輕鏈的可變區(qū)通常展現(xiàn)相對保守的框架區(qū)(fr)由三個互補(bǔ)決定區(qū)或cdr接合的相同一般性結(jié)構(gòu)。所述cdr包含負(fù)責(zé)抗原識別和結(jié)合的抗體高變區(qū)。來自各對的兩個鏈的cdr通過框架區(qū)對準(zhǔn)并支撐，從而使得能夠結(jié)合于特定表位。自n末端至c末端，輕鏈與重鏈兩者均包含結(jié)構(gòu)域fr1、cdr1、fr2、cdr2、fr3、cdr3以及fr4。對各結(jié)構(gòu)域指定氨基酸是根據(jù)具有免疫意義的蛋白質(zhì)的kabat序列的定義。chothia等，1987,j.mol.biol.196:901-917；chothia等，1989,nature342:878-883。

cdr構(gòu)成用于抗原結(jié)合的主要表面接觸點。例如，參見，chothia和lesk,1987,j.mol.biol.196:901-917。另外，輕鏈的cdr3以及尤其是重鏈的cdr3可構(gòu)成輕鏈和重鏈可變區(qū)內(nèi)的抗原結(jié)合中的最重要的決定簇。例如，參見，chothia和lesk，1987，同上；desiderio等，2001,j.mol.biol.310:603-615；xu和davis，2000,immunity13:37-45；desmyter等，2001,j.biol.chem.276:26285-26290；以及muyldermans,2001,j.biotechnol.74:277-302。在一些抗體中，重鏈cdr3似乎構(gòu)成抗原與抗體之間的主要接觸區(qū)域。desmyter等，2001，同上。其中cdr3單獨改變的體外選擇方案可用于改變抗體的結(jié)合性質(zhì)。muyldermans,2001，同上；desiderio等，2001，同上。

天然存在的抗體通常包含信號序列，其引導(dǎo)抗體進(jìn)入蛋白質(zhì)分泌的細(xì)胞途徑并且不存在于成熟抗體中。編碼本公開的抗體的多核苷酸可編碼如下所述的天然存在的信號序列或異源信號序列。

在一個實施方案中，抗-c5抗體為具有一個(1)至六個(6)cdr的單克隆抗體，如本文所列出的。本公開的抗體可具有任何類型，包括igm、igg(包括igg1、igg2、igg3、igg4)、igd、iga或ige抗體。在一些實施方案中，所述抗體為igg型抗體。在一個實施方案中，所述抗體為igg2型抗體。

在一些實施方案中，抗體可包含完整重鏈和輕鏈，其中cdr全部來自相同物種，例如人類?？蛇x地，例如在其中抗體含有小于六個來自以上所列出序列的cdr的實施方案中，另外的cdr可來自其他物種(例如，鼠類cdr)，或者可以是與序列中所描繪的那些不同的人cdr。例如，可使用來自本文鑒定的適當(dāng)序列的人hccdr3區(qū)和lccdr3區(qū)，其中hccdr1、hccdr2、lccdr1和lccdr2任選地選自替代物種或不同人抗體序列或其組合。例如，本公開的cdr可置換商業(yè)相關(guān)嵌合抗體或人源化抗體的cdr區(qū)。

特定實施方案可包括含有人序列的抗體支架。

然而，在一些實施方案中，支架組分可以是來自不同物種的混合物。因此，所述抗體可以是嵌合抗體和/或人源化抗體。一般而言，嵌合抗體和人源化抗體二者可以是組合來自超過一種物種的多個區(qū)域或氨基酸的抗體。例如，在大部分實施方案中，嵌合抗體包含來自小鼠、大鼠、兔或其他適合的非人動物的可變區(qū)和來自人的恒定區(qū)。在其他實施方案中，嵌合抗體包含人fr序列和非人cdr。

人源化抗體為最初源自非人抗體例如小鼠抗體的抗體。在人源化抗-c5抗體的不同實施方案中，源自非人抗體的可變結(jié)構(gòu)域框架區(qū)或框架氨基酸可被改變?yōu)槿丝贵w對應(yīng)位置可見的氨基酸同一性。在人源化抗體的一些實施方案中，整個抗體除了cdr之外，可以由人來源的多核苷酸編碼或者除了其cdr內(nèi)之外可與此抗體相同。在其他實施方案中，人源化抗體可包含特定氨基酸位置，所述位置的同一性已被改變?yōu)閷?yīng)人抗體中的相同或類似位置的同一性。部分或全部可由來源于非人生物體的核酸編碼的cdr被移植到人抗體可變區(qū)的β折疊框架中以產(chǎn)生抗體，所述抗體的特異性由所移入的cdr決定。此類抗體的產(chǎn)生描述于例如wo92/11018,jones,1986,nature321:522-525,verhoeyen等,1988,science239:1534-1536中。人源化抗體也可使用具有遺傳工程化的免疫系統(tǒng)的小鼠產(chǎn)生。roque等，2004,biotechnol.prog.20:639-654。在一些實施方案中，cdr可以人的，并且因此在此背景下人源化抗體和嵌合抗體二者可包含一些非人cdr。在一些情況下，可產(chǎn)生人源化抗體，其包含hccdr3區(qū)和lccdr3區(qū)，其中一個或多個其他cdr區(qū)具有不同的特定來源。

在一個實施方案中，c5抗體可以是多特異性抗體，并且顯著地是雙特異性抗體(例如，雙抗體)。這些抗體為結(jié)合于兩種(或更多種)不同抗原例如c5和另一種抗原或者c5的兩個不同表位的抗體。雙抗體可以本領(lǐng)域已知的多種方式制造(holliger和winter,1993,currentopinionbiotechnol.4:446-449)，例如以化學(xué)方式制備或者由雜種雜交瘤制備。

在一個實施方案中，抗-c5抗體為微型抗體。微型抗體是最小化的抗體樣蛋白質(zhì)，其包含scfv連接至ch3域。hu等，1996,cancerres.56:3055-3061。

在一個實施方案中，抗-c5抗體為結(jié)構(gòu)域抗體；參見，例如美國專利號6,248,516。結(jié)構(gòu)域抗體(dab)為抗體的功能結(jié)合結(jié)構(gòu)域，與人抗體dab的重鏈(vh)或輕鏈(vl)的可變區(qū)相對應(yīng)，具有大約13kda的分子量或者小于完整抗體尺寸的十分之一。dab在多種宿主中良好表達(dá)，所述宿主包括細(xì)菌、酵母和哺乳動物細(xì)胞系統(tǒng)。另外，dab高度穩(wěn)定并且甚至在經(jīng)受苛刻條件諸如冷凍干燥或熱變性之后仍保留活性。參見，例如，美國專利6,291,158；6,582,915；6,593,081；6,172,197；美國序列號2004/0110941；歐洲專利0368684；美國專利6,696,245、wo04/058821、wo04/003019和wo03/002609，所有專利均以引用的方式整體并入。

在一個實施方案中，抗-c5抗體為抗體片段，其為本文所列出的保留與c5的特異性結(jié)合的任何抗體的片段。在不同實施方案中，所述抗體為f(ab)、f(ab')、f(ab')2、fv或單鏈fv片段。至少，如本文所意指的抗體包括可特異性結(jié)合抗原的多肽，其中所述多肽包含所有或一部分輕鏈和/或重鏈可變區(qū)。

特異性抗體片段包括但不限于，(i)由vl、vh、cl和ch1結(jié)構(gòu)域組成的fab片段；(ii)由vh和ch1結(jié)構(gòu)域組成的fd片段；(iii)由單一抗體的vl和vh結(jié)構(gòu)域組成的fv片段；(iv)由單一可變區(qū)組成的dab片段(ward等，1989,nature341:544-546)；(v)分離的cdr區(qū)、(vi)包含兩個連接的fab片段的二價片段f(ab')2片段；(vii)單鏈fv分子(scfv)，其中vh結(jié)構(gòu)域和vl結(jié)構(gòu)域通過允許兩個結(jié)構(gòu)域締合形成抗原結(jié)合位點的肽接頭連接(bird等，1988,science242:423-426，huston等，1988,proc.natl.acad.sci.u.s.a.85:5879-5883)；(viii)雙特異性單鏈fv二聚體(pct/us92/09965)；以及(ix)雙抗體或三抗體，它們?yōu)榛蛉诤衔飿?gòu)建的多價或多特異性片段(tomlinson等，2000,methodsenzymol.326:461-479；wo94/13804；holliger等，1993,proc.natl.acad.sci.u.s.a.90:6444-6448)?？尚揎椏贵w片段。例如，可通過并入連接vh結(jié)構(gòu)域和vl結(jié)構(gòu)域的二硫橋來穩(wěn)定分子(reiter等,1996,naturebiotech.14:1239-1245)。

在一個實施方案中，c5抗體為傳統(tǒng)抗體，例如人免疫球蛋白。在此實施方案中，如以上所列出的，特異性結(jié)構(gòu)包含所描繪的含有cdr區(qū)的完整重鏈和輕鏈。另外的實施方案利用一種或多種本公開的cdr，其中其他cdr、框架區(qū)、j區(qū)和d區(qū)、恒定區(qū)等等來自其他人抗體。例如，本公開的cdr可置換任何數(shù)目的人抗體，特別是商業(yè)上相關(guān)的抗體的cdr。

在一個實施方案中，c5抗體為抗體融合蛋白(例如，抗體綴合物)。在此實施方案中，所述抗體融合至綴合配伍物。所述綴合配伍物可以是蛋白質(zhì)的或非蛋白質(zhì)的；后者通常使用抗體上(參見，關(guān)于抗體共價修飾的討論)和綴合配伍物上的官能團(tuán)來產(chǎn)生。例如，接頭為本領(lǐng)域已知的；例如，同或異雙功能接頭為本領(lǐng)域已知的(參見，piercechemicalcompanycatalog,technicalsectiononcross-linkers,第155-200頁，所述文獻(xiàn)以引用的方式并入本文)。

在一個實施方案中，c5抗體為抗體類似物。在一些情況下，抗體類似物可被稱為合成抗體。例如，多種最近的工作利用了具有移植的cdr的替代性蛋白支架或人工支架。此類支架包括但不限于，被引入以便使抗體的三維結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的突變，以及由例如生物相容性聚合物組成的完全合成的支架。參見，例如korndorfer等，2003,proteins:structure,function,andbioinformatics，第53卷，第1期:121-129。roque等，2004,biotechnol.prog.20:639-654。另外，可使用肽抗體模擬物(pam)以及基于利用纖連蛋白組分作為支架的抗體模擬物的工作。

vh和vl變體

如以上所列出，在一些實施方案中，本公開提供了分別包含含有seqidno:2、4、6、8、10以及12的重鏈可變區(qū)和/或seqidno:1、3、5、7、9以及11的輕鏈可變區(qū)或由其組成的抗體或其如上所定義的片段。因此，在那些實施方案中，所述抗體不僅包含至少一個cdr或變體，而且包含至少一部分描繪的框架序列。另外，本公開涵蓋了此類重鏈可變序列或輕鏈可變序列的變體。

變體可變區(qū)通常與親代可變區(qū)(諸如本文所公開的那些)共享至少80％的氨基酸同源性、類似性或同一性。在一些實施方案中，變體和親代序列同源性或同一性為至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％以及幾乎100％。編碼個別變體vh和vl的核苷酸序列與本文所描繪的核酸序列之間的核酸序列同源性、類似性或同一性為本文所描繪的那些序列的至少70％，或者更可選地使同源性或同一性增加至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％以及幾乎100％。此外，在許多實施方案中，變體可變區(qū)可享有生物功能，包括但不限于，親代cdr的特異性和/或活性的至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％。在一些情況下，同源性和/或同一性僅在可能相同的cdr序列之外測量。在其他情況下，同源性和/或同一性在整個完整序列(包含cdr序列)中測量。在其他實施方案中，還可包括恒定區(qū)變體。

在不同情況下，氨基酸序列的同源性可反映當(dāng)如上文所述地最佳比對時的同一性百分比或者相似性百分比。在不同情況下，同源性％(相似性％)或同一性％可通過除以比較窗口內(nèi)比對的氨基酸數(shù)目來計算。如果兩種多肽具有不等的長度，則比較窗口可以是一種或另一種比較多肽的完整長度。在其他情況下，比較窗口可以是所述多肽之一的一部分。在不同情況下，用于測量兩種多肽序列的同源性或同一性的比較窗口大于約40aa(氨基酸)、45aa、50aa、55aa、60aa、65aa、70aa、75aa、80aa、85aa、90aa、95aa、100aa、150aa或200aa和/或小于約200aa、150aa、100aa、95aa、90aa、85aa、80aa、75aa、70aa、65aa、60aa、55aa、50aa或45aa。在一些實施方案中，如在使用本公開的不同cdr序列的情況下，比較窗口可小于40aa，例如在小于約25aa、24aa,23aa,22aa,21aa,20aa,19aa,18aa、17aa、16aa、15aa、14aa、13aa、12aa、11aa、10aa、9aa,8aa、7aa、6aa、5aa或4aa，與大于約3aa、4aa、5aa、6aa、7aa、8aa、9aa、10aa、11aa、12aa、13aa、14aa、15aa、16aa、17aa、18aa、19aa、20aa、21aa、22aa、23aa或24aa之間。

在不同情況下，要求保護(hù)的氨基酸序列可在給定的比較窗口上具有以下同一性％或同源性％(相似性％)：大于約70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％和/或小于約100％、99％、98％、97％、96％、95％、94％、93％、92％、91％、90％、85％、80％或75％。

抗-c5抗體的共價修飾

抗體的共價修飾包括在本公開的范圍以內(nèi)，并且通常，但不總是，在翻譯后進(jìn)行。舉例來說，通過使抗體的特定氨基酸殘基與能夠同選定側(cè)鏈或n末端或c末端殘基反應(yīng)的有機(jī)衍生劑反應(yīng)，來將幾種類型的抗體共價修飾引入分子中。

半胱胺酰殘基最常見地與α-鹵乙酸鹽(和對應(yīng)的胺)，如氯乙酸或氯乙酰胺反應(yīng)，得到羧基甲基或羧酰胺甲基(carboxyamidomethyl)衍生物。半胱氨酰殘基還通過與溴三氟丙酮、α-溴-β-(5-咪唑基)丙酸、氯乙酰基磷酸酯、n-烷基馬來酰亞胺、3-硝基-2-吡啶基二硫化物、甲基2-吡啶基二硫化物、對氯汞苯甲酸、2-氯汞-4-硝基酚或氯-7-硝基苯并-2-氧雜-1,3-二唑反應(yīng)來衍生化。

組氨酰殘基通過與焦碳酸二乙酯在ph5.5-7.0下反應(yīng)而衍生，因為所述試劑相對地對組氨酰基側(cè)鏈具特異性。對溴苯酰甲基溴(para-bromophenacylbromide)也為有用的；反應(yīng)可在0.1m二甲胂酸鈉中在ph6.0下執(zhí)行。

賴氨?；桶被藲埢c琥珀酸或其他羧酸酐反應(yīng)。利用所述試劑的衍生具有逆轉(zhuǎn)賴氨酰殘基的電荷的作用。用于衍生含α-氨基的殘基的其他適合試劑包括亞氨酸酯(imidoester)，如甲基吡啶亞胺甲酯(methylpicolinimidate)；磷酸吡哆醛(pyridoxalphosphate)；吡哆醛；硼氫化氯(chloroborohydride)；三硝基苯磺酸；o-甲基異脲；2,4-戊二酮；以及轉(zhuǎn)胺酶催化的與乙醛酸鹽的反應(yīng)。

精氨酰殘基通過與一種或幾種常規(guī)試劑反應(yīng)而修飾，所述常規(guī)試劑中有苯乙二醛(phenylglyoxal)、2,3-丁二酮、1,2-環(huán)己二酮以及茚三酮(ninhydrin)。精氨酸殘基的衍生要求反應(yīng)在堿性條件下進(jìn)行，這是因為胍官能團(tuán)具有高pka。此外，所述試劑可與賴氨酸的基團(tuán)以及精氨酸ε-氨基反應(yīng)。

酪氨酰殘基的特定修飾可通過與芳族重氮化合物或四硝基甲烷反應(yīng)來進(jìn)行，尤其關(guān)注將光譜標(biāo)記引入酪氨酰殘基中。最常見地，使用n-乙?；溥蚝退南趸淄榉謩e形成o-乙酰基酪氨?；镔|(zhì)和3-硝基衍生物。使用¹²⁵i或¹³¹i碘化酪氨酰殘基，以制備標(biāo)記的蛋白質(zhì)以供用于放射性免疫測定中，上文描述的氯胺t方法是適合的。

羧基側(cè)基(天冬氨酰基或谷氨?；?通過與碳化二亞胺(r'—n＝c＝n--r')反應(yīng)進(jìn)行選擇性修飾，其中r及r'任選地為不同烷基，如1-環(huán)己基-3-(2-嗎啉基-4-乙基)碳化二亞胺或1-乙基-3-(4-氮陽離子-4,4-二甲基戊基)碳化二亞胺。此外，天冬氨酰和谷氨酰殘基可通過與銨離子反應(yīng)而轉(zhuǎn)化為天冬酰胺酰和谷酰胺酰殘基。

利用雙官能試劑的衍生適用于將抗體交聯(lián)至水不可溶載體基質(zhì)或表面以供用于多種方法中。常用的交聯(lián)劑包括例如1,1-雙(重氮乙?；?-2-苯基乙烷；戊二醛；n-羥基琥珀酰亞胺酯，例如與4-疊氮基水楊酸的酯；同雙官能亞氨酸酯(homobifunctionalimidoester)，包括二琥珀酰亞氨基酯，諸如3,3'-二硫代雙(琥珀酰亞氨基丙酸酯)；以及雙官能順丁烯二酰亞胺，諸如雙-n-順丁烯二酰亞氨基-1,8-辛烷。諸如甲基-3-[(對-疊氮苯基)二硫代]丙亞氨酸酯(methyl-3-[(p-azidophenyl)dithio]propioimidate)的衍生劑產(chǎn)生能夠于光存在下形成交聯(lián)的光可活化中間物?？蛇x地，反應(yīng)性水不溶性基質(zhì)諸如溴化氰激活的碳水化物和反應(yīng)性底物描述于美國專利號3,969,287；3,691,016；4,195,128；4,247,642；4,229,537；以及4,330,440(所有這些專利均以引用的方式整體并入本文)，它們用于蛋白質(zhì)固定。

谷酰胺酰和天冬酰胺酰殘基常經(jīng)受去酰氨基作用，分別得到對應(yīng)谷氨酰和天冬氨酰殘基。或者，這些殘基在溫和酸性條件下脫去酰氨基。這些殘基的任一種形式屬于本公開的范圍內(nèi)。

其他修飾包括脯氨酸和賴氨酸的羥基化、絲氨酰基或蘇氨?；鶜埢牧u基的磷酸化、賴氨酸、精氨酸和組氨酸側(cè)鏈的α-氨基的甲基化(t.e.creighton,proteins:structureandmolecularproperties,w.h.freeman&co.,sanfrancisco,1983,第79-86頁)、n末端胺的乙?；约耙匀魏蝐-末端羧基的酰胺化。

糖化作用

本公開范圍內(nèi)包括的另一種類型的抗體共價修飾包括改變蛋白質(zhì)的糖基化模式。正如本領(lǐng)域所知，糖基化模式可以取決于蛋白質(zhì)的序列(例如，存在或不存在特定的糖基化氨基酸殘基，在下文中討論)或其中產(chǎn)生蛋白質(zhì)的宿主細(xì)胞或有機(jī)體兩者。以下討論特定的表達(dá)系統(tǒng)。

多肽的糖基化通常為n-連接或o-連接的。n-連接是指碳水化合物部分與天門冬酰胺殘基的側(cè)鏈連接。三肽序列天冬酰胺-x-絲氨酸和天冬酰胺-x-蘇氨酸為用于將碳水化合物部分酶促連接于天冬酰胺側(cè)鏈的識別序列，其中x為除脯氨酸之外的任何氨基酸。因此，在多肽中存在這些三肽序列的任何一個產(chǎn)生一個潛在的糖基化位點。o-連接糖基化是指糖n-乙酰半乳糖胺、半乳糖或木糖之一與羥氨基酸(最常見的是絲氨酸或蘇氨酸)連接，不過也可使用5-羥基脯氨酸或5-羥基賴氨酸。

糖化位點至公開的抗體的添加宜通過改變氨基酸序列以使得其含有上述三肽序列中的一個或多個來實現(xiàn)(對于n連接糖化位點)。所述改變也可通過向起始序列添加或取代一個或多個絲氨酸或蘇氨酸殘基來實現(xiàn)(對于o-連接糖基化位點)。為方便起見，抗體的氨基酸序列經(jīng)由dna水平的變化來改變，尤其通過使編碼靶多肽的dna在預(yù)選的堿基處突變以使得產(chǎn)生將翻譯成所需氨基酸的密碼子。

增加抗體上碳水化合物部分的數(shù)目的另一手段是糖苷至蛋白質(zhì)的化學(xué)或酶偶聯(lián)。這些程序之所以是有利的，是因為它們不需要在對n-連接和o-連接糖基化具有糖基化能力的宿主細(xì)胞中產(chǎn)生所述蛋白質(zhì)。根據(jù)所使用的偶聯(lián)方式，糖可連接至(a)精氨酸和組氨酸，(b)游離羧基，(c)游離巰基諸如半胱氨酸的那些游離巰基，(d)游離羥基諸如絲氨酸、蘇氨酸或羥基脯氨酸的那些游離羥基，(e)芳香殘基諸如苯丙氨酸、酪氨酸或色氨酸的那些芳香殘基，或(f)谷氨酰胺的酰胺基。這些方法在1987年9月11日公布的wo87/05330和aplin和wriston，1981,crccrit.rev.biochem.，第259-306頁中描述。

除去起始抗體上存在的碳水化合物部分可以化學(xué)或酶促方式實現(xiàn)。化學(xué)去糖基化需要蛋白質(zhì)暴露于化合物三氟甲磺酸或等效化合物。這種處理導(dǎo)致除連接糖(n-乙酰葡糖胺或n-乙酰半乳糖胺)外的大部分或所有糖裂解，而剩下多肽是完整的。化學(xué)去糖基化通過hakimuddin等，1987,arch.biochem.biophys.259:52并且通過edge等，1981,anal.biochem.118:131描述。多肽上的碳水化合物部分的酶裂解可通過使用如thotakura等，1987,meth.enzymol.138:350所述的各種內(nèi)切-和外切-糖苷酶實現(xiàn)。在潛在糖基化位點處的糖基化可通過使用如由duskin等,1982,j.biol.chem.257:3105所述的化合物衣霉素來預(yù)防。衣霉素阻斷蛋白質(zhì)-n-糖苷鍵的形成。

聚乙二醇化作用

另一種類型的抗體的共價修飾包括以美國專利號4,640,835；4,496,689；4,301,144；4,670,417；4,791,192或4,179,337中所示的方式將抗體與各種非蛋白質(zhì)聚合物連接，所述非蛋白質(zhì)聚合物包括但不限于，各種多元醇如聚乙二醇、聚丙二醇或聚氧化烯。此外，如本領(lǐng)域中所已知，氨基酸取代可在抗體內(nèi)的各種位置上進(jìn)行，以促進(jìn)聚合物諸如如peg的添加。

標(biāo)記

在一些實施方案中，本公開的抗體的共價修飾包括一種或多種標(biāo)記的添加。

術(shù)語“標(biāo)記基團(tuán)”是指任何可檢測標(biāo)記。適合的標(biāo)記基團(tuán)的實例包括但不限于以下：放射性同位素或放射性核素(例如，³h、¹⁴c、¹⁵n、³⁵s、⁹⁰y、⁹⁹tc、¹¹¹in、¹²⁵i、¹³¹i)、熒光基團(tuán)(例如，fitc、若丹明、鑭系元素磷光體)、酶基團(tuán)(例如，辣根過氧化物酶、β-半乳糖苷酶、熒光素酶、堿性磷酸酶)、化學(xué)發(fā)光基團(tuán)、生物素基團(tuán)或由二級報道體識別的預(yù)定多肽表位(例如，亮氨酸拉鏈對序列、二級抗體的結(jié)合位點、金屬結(jié)合結(jié)構(gòu)域、表位標(biāo)記)。在一些實施方案中，標(biāo)記基團(tuán)通過具有各種長度的間隔子臂使標(biāo)記基團(tuán)偶聯(lián)到抗體，以降低潛在空間位阻。用于標(biāo)記蛋白質(zhì)的各種方法為本領(lǐng)域中已知的并且可用于實施本公開。

一般而言，根據(jù)待檢測標(biāo)記所在的測定而定，標(biāo)記屬于多種類別：a)同位素標(biāo)記，其可以是放射性或重同位素；b)磁性標(biāo)記(例如，磁性顆粒)；c)氧化還原活性部分；d)光學(xué)染料；酶基團(tuán)(例如，辣根過氧化物酶、β-半乳糖苷酶、熒光素酶、堿性磷酸酶)；e)生物素化基團(tuán)；以及f)由二級報道體識別的預(yù)定多肽表位(例如，亮氨酸拉鏈對序列、二級抗體的結(jié)合位點、金屬結(jié)合結(jié)構(gòu)域、表位標(biāo)簽等)。在一些實施方案中，標(biāo)記基團(tuán)通過具有各種長度的間隔子臂使標(biāo)記基團(tuán)偶聯(lián)到抗體，以降低潛在空間位阻。用于標(biāo)記蛋白質(zhì)的各種方法為本領(lǐng)域中已知的并且可用于實施本公開。

特定標(biāo)記包括光學(xué)染料，包括但不限于發(fā)色團(tuán)、磷光體和熒光團(tuán)，其中后者在許多情況下具有特異性。熒光團(tuán)可為“小分子”熒光劑或蛋白質(zhì)性熒光劑。

熒光標(biāo)記可以是可通過其固有熒光性質(zhì)檢測的任何分子。適合的熒光標(biāo)記包括但不限于，熒光素、若丹明、四甲基若丹明、伊紅、藻紅、香豆素、甲基香豆素、芘、孔雀石綠(malacitegreen)、二苯乙烯、熒光黃(luciferyellow)、層疊藍(lán)j(cascadebluej)、德克薩斯紅(texasred)、iaedans、edans、bodipyfl、lc紅640,cy5、cy5.5、lc紅705、俄勒岡綠(oregongreen)、alexa-fluor染料(alexafluor350、alexafluor430、alexafluor488、alexafluor546、alexafluor568、alexafluor594、alexafluor633、alexafluor660、alexafluor680)、層疊藍(lán)、層疊黃(cascadeyellow)和r-藻紅素(phycoerythrin，pe)(molecularprobes,eugene,or)、fitc、若丹明和德克薩斯紅(pierce，rockford,il)、cy5、cy5.5、cy7(amershamlifescience,pittsburgh,pa)。包括熒光團(tuán)的適合光學(xué)染料描述于由richardp.haugland所著的molecularprobeshandbook中，所述手冊特此以引用的方式明確并入。

適合的蛋白質(zhì)熒光標(biāo)記也包括但不限于，綠熒光蛋白，包括gfp的renilla、ptilosarcus或aequorea物種(chalfie等，1994,science263:802-805)、egfp(clontechlaboratories,inc.,genbank登錄號u55762)、藍(lán)熒光蛋白(bfp，quantumbiotechnologies,inc.1801demaisonneuveblvd.west,8thfloor,montreal,quebec,canadah3h1j9；stauber,1998,biotechniques24:462-471；heim等，1996,curr.biol.6:178-182)、增強(qiáng)的黃熒光蛋白(eyfp，clontechlaboratories,inc.)、熒光素酶(ichiki等，1993,j.immunol.150:5408-5417)、β半乳糖苷酶(nolan等，1988,proc.natl.acad.sci.u.s.a.85:2603-2607)以及renilla(wo92/15673、wo95/07463、wo98/14605、wo98/26277、wo99/49019、美國專利號5292658、5418155、5683888、5741668、5777079、5804387、5874304、5876995、5925558)。所有以上引用的參考文獻(xiàn)均以引用的方式明確地并入本文。

編碼抗-c5抗體的多核苷酸

在某些方面，本公開提供了編碼本文所述的抗體的核酸分子。在一些情況下，公開的核酸編碼本文所述的抗體、可變區(qū)或cdr。核酸包括dna和rna分子。核酸可以是天然核酸、非天然核酸、核酸類似物或合成核酸。本公開的核酸通常為多核酸；即，通過磷酸二酯鍵共價連接的個別核苷酸的聚合物。在不同情況下，核苷酸序列可以是單鏈、雙鏈或其組合。核苷酸序列還可包括非核酸分子諸如氨基酸或其他單體。

在許多實施方案中，編碼序列可以是分離的核酸分子。分離的核酸分子被鑒定并且與至少一種組分(它在自然來源中通常與所述至少一種組分締合)分離。在一些情況下，組分可以是核苷酸序列、蛋白質(zhì)或非蛋白質(zhì)分子。分離的抗-c5多肽-編碼核酸分子不同于它在自然界中所存在的形式或配置。分離的抗-c5抗體編碼核酸分子因此不同于當(dāng)它存在于天然細(xì)胞中時的編碼核酸分子。然而，分離的抗-c5抗體編碼核酸分子包括通常表達(dá)抗-c5抗體的細(xì)胞中含有的抗-c5抗體編碼核酸分子，在所述細(xì)胞中，例如核酸分子處于不同于天然細(xì)胞的位置的染色體位置中。分離的核酸分子因此不同于當(dāng)它存在于生物體中時的核酸分子。然而，在一些情況下，分離的核酸分子可以是細(xì)胞內(nèi)含有的核酸，例如，其中分離的核酸分子被引入到細(xì)胞中并且駐留在染色體外位置或者不同于其天然位置的染色體位置。

根據(jù)其用途，核酸可以是單鏈、雙鏈，或者可含有雙鏈或單鏈序列二者的一部分。如本領(lǐng)域技術(shù)人員將了解的，單鏈(有時也稱為“watson”鏈)的描繪也定義了另一條鏈(有時也稱為“crick”鏈)的序列。重組核酸可以是一般通過內(nèi)切核酸酶對核酸進(jìn)行處理的最初于體外形成的核酸，通常為自然界中未發(fā)現(xiàn)的形式。因此，出于本公開的目的，可通過呈線性形式的核酸編碼的分離抗體，或通過連接通常不連接的dna分子在體外形成的表達(dá)載體兩者均被認(rèn)為是重組的。應(yīng)理解，一旦具有必需控制元件的重組核酸制成并且重新引入至宿主細(xì)胞或生物體中，它就可非重組地復(fù)制，即，使用宿主細(xì)胞的體內(nèi)細(xì)胞機(jī)制而非體外操縱；然而，出于本公開的目的，此類核酸，一旦重組產(chǎn)生，雖然隨后非重組地復(fù)制，但仍然被認(rèn)為是重組的。

在一些實施方案中，重組核酸可包含一種或多種控制元件或控制序列?？刂圃涂刂菩蛄惺侵冈诰唧w生物體中表達(dá)可操作地連接的編碼序列所需的核酸序列。適于原核生物的控制序列例如包括啟動子，任選地包括操縱子序列，和核糖體結(jié)合位點。已知真核細(xì)胞利用啟動子、多腺苷酸化信號和增強(qiáng)子。如本文所用，可操作地連接的序列為與另一核酸序列呈某一功能關(guān)系的核酸序列。例如，核酸編碼序列可以可操作地連接至核酸控制序列。例如，如果前序列或分泌前導(dǎo)序列的dna被表達(dá)為參與多肽分泌的前蛋白，那么其可以可操作地連接至多肽的dna；如果啟動子或增強(qiáng)子影響序列的轉(zhuǎn)錄，那么其可操作地連接至編碼序列；或者如果核糖體結(jié)合位點被定位為促進(jìn)翻譯，那么其可操作地連接至編碼序列。在大部分實施方案中，可操作地連接的序列為共價連接至例如分泌前導(dǎo)序列的dna序列。然而，如以上所述的，一些控制序列可以具有作為rna序列的活性。在許多實施方案中，增強(qiáng)子序列不需要與編碼序列相鄰，而兩種序列可通過一個或多個核酸分開。

在不同情況下，公開的核苷酸序列的核酸可包含以與天然存在的核苷酸類似的方式代謝的核苷酸。還包括具有合成主鏈類似物的核酸樣結(jié)構(gòu)，所述合成主鏈類似物包括而不限于，磷酸二酯、硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、甲基膦酸酯、氨基磷酸酯、烷基磷酸三酯、氨基磺酸酯、3'-硫代乙酸酯、亞甲基(甲基亞氨基)、3'-n-氨基甲酸酯、嗎啉代氨基甲酸酯以及肽核酸(pna)(例如，參見：“oligonucleotidesandanalogues,apracticalapproach,”editedbyf.eckstein,irlpressatoxforduniversitypress(1991)；“antisensestrategies,”annalsofthenewyorkacademyofsciences，第600卷，baserga和denhardt編著(nyas1992)；milligan(1993)j.med.chem.36:1923-1937；以及“antisenseresearchandapplications”(1993,crcpress))。pna含有非離子型主鏈，諸如n-(2-氨基乙基)甘氨酸單元。二硫代磷酸酯鍵描述于：wo97/03211；wo96/39154；以及mata(1997)toxicol.appl.pharmacol.144:189-197。由此術(shù)語涵蓋的其他合成主鏈包括甲基磷酸酯鍵或交替性甲基磷酸酯和磷酸二酯鍵(strauss-soukup(1997)biochemistry36:8692-8698)以及苯基磷酸酯鍵(samstag(1996)antisensenucleicaciddrugdev6:153-156)。

如本領(lǐng)域技術(shù)人員將了解，歸因于遺傳密碼的簡并性，可制備極大數(shù)目的全部都編碼本公開的cdr(和抗體的重鏈和輕鏈或其他組分)的核酸。因此，在已鑒定特定氨基酸序列的情況下，本領(lǐng)域技術(shù)人員可通過以不改變編碼蛋白質(zhì)的氨基酸序列的方式，僅修改一個或多個密碼子的序列來制備許多不同核酸。

在不同情況下，包括編碼多肽序列seqidno:1-48的核苷酸序列。這些核苷酸編碼序列可被翻譯成具有與公開的多肽序列相同的氨基酸序列的多肽。在許多情況下，編碼相同多肽的核苷酸可不具有相同的核苷酸序列。公開的編碼序列還可包含非翻譯序列，例如多腺苷酸化序列。本發(fā)明的編碼序列還可包含內(nèi)含子或在翻譯前剪切掉轉(zhuǎn)錄的mrna的插入的非翻譯序列。在不同情況下，轉(zhuǎn)錄的mrna可用末端7-甲基胍封端。在一些實施方案中，編碼序列將包含最終抗體中并不出現(xiàn)的氨基酸的編碼序列，例如輸出抗體所需要的序列。

核苷酸編碼序列可通過如上所述的blastn進(jìn)行比對。在不同情況下，這些比對的核苷酸序列的同源性(或者在blastn中的同一性)可大于約40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％和/或小于約100％、95％、90％、85％、80％、75％、70％、65％、60％、55％、50％或45％。在不同情況下，同源比對的序列可小于約700nt、600nt、500nt、400nt、300nt、200nt、100nt、90nt、80nt、70nt、60nt、50nt或40nt，和/或大于約50nt、60nt、70nt、80nt、90nt、100nt、200nt、300nt、400nt、500nt或600nt。

在不同情況下，編碼序列指導(dǎo)根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)遺傳密碼可翻譯成氨基酸序列的核糖核酸序列的轉(zhuǎn)錄。在不同情況下，密碼可包括規(guī)范密碼的變化。在不同變型中，編碼序列可包含內(nèi)含子或者并不編碼氨基酸但可被轉(zhuǎn)錄并且隨后在核糖核酸翻譯成多肽之前除去的插入序列。

產(chǎn)生抗體的方法

本公開還提供了呈質(zhì)粒、表達(dá)載體、轉(zhuǎn)錄或表達(dá)盒形式的包含至少一種如上多核苷酸的表達(dá)系統(tǒng)和構(gòu)建體。此外，本公開提供了包含此類表達(dá)系統(tǒng)或構(gòu)建體的宿主細(xì)胞。

通常，用于任何宿主細(xì)胞中的表達(dá)載體都將含有用于質(zhì)粒維持和用于外源性核苷酸序列的克隆和表達(dá)的序列。在某些實施方案中總稱為側(cè)接序列的此類序列通常將包括以下核苷酸序列中的一個或多個：啟動子、一種或多種增強(qiáng)子序列、復(fù)制起點、轉(zhuǎn)錄終止序列、含有供體和受體拼接位點的完全內(nèi)含子序列、編碼用于多肽分泌的前導(dǎo)序列的序列、核糖體結(jié)合位點、聚腺苷酸化序列、用于插入編碼待表達(dá)的多肽的核酸的多接頭區(qū)域以及可選擇標(biāo)記元件。以下論述這些序列中的每一個。

任選地，載體可含有“標(biāo)簽”編碼序列，即位于c5抗體編碼序列的5'端或3'端的寡核苷酸分子；寡核苷酸序列可編碼多his標(biāo)簽(諸如六his)或可商購抗體存在的另一“標(biāo)簽”，諸如flag、ha(血球凝集素流感病毒(hemaglutinininfluenzavirus))或myc。此標(biāo)簽通常在多肽表達(dá)后融合于多肽，并且可充當(dāng)一種從宿主細(xì)胞親和純化或檢測c5抗體的手段。親和純化可例如通過使用針對標(biāo)記的抗體作為親和基質(zhì)進(jìn)行柱色譜來達(dá)成。任選地，所述標(biāo)簽可隨后通過各種手段，諸如使用用于切割的某些肽酶從純化的抗-c5抗體中去除。

側(cè)接序列可以是同源的(即來自與宿主細(xì)胞相同的物種和/或品系)、異源的(即與除宿主細(xì)胞物種或品系不同的物種)、雜交的(即來自超過一種來源的側(cè)接序列的組合)、合成的或天然的。因此，側(cè)接序列的來源可以是任何原核或真核生物體、任何脊椎動物或無脊椎動物生物體或任何植物，前提是側(cè)接序列在宿主細(xì)胞機(jī)構(gòu)中具有功能性，并且可通過宿主細(xì)胞機(jī)構(gòu)激活。

適用于本公開的載體中的側(cè)接序列可通過本領(lǐng)域中熟知的若干方法中的任一種方法獲得。通常，適用于本文中的側(cè)接序列將已先前通過圖譜分析和/或通過限制核酸內(nèi)切酶消化鑒定，并且因此可使用適當(dāng)限制核酸內(nèi)切酶自適當(dāng)組織來源分離。在一些情況下，側(cè)接序列的完整核苷酸序列可以是已知的。在本文中，側(cè)接序列可使用本文對于核酸合成或克隆所述的方法合成。

無論已知全部側(cè)接序列還是僅一部分側(cè)接序列，它都可使用聚合酶鏈反應(yīng)(pcr)和/或通過用適合探針，諸如來自相同或另一物種的寡核苷酸和/或側(cè)接序列片段篩選基因組文庫來獲得。當(dāng)側(cè)接序列未知時，含有側(cè)接序列的dna片段可從一段可含有例如編碼序列或甚至另外一種或多種基因的較大dna分離。分離可通過以下方式達(dá)成：限制核酸內(nèi)切酶消化以產(chǎn)生適當(dāng)dna片段，隨后使用瓊脂糖凝膠純化柱色譜(chatsworth,ca)或熟練技術(shù)人員已知的其他方法進(jìn)行分離。對用以達(dá)成這個目的的適合酶的選擇將易于為本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所顯而易知。

復(fù)制起點通常是那些商購原核表達(dá)載體的一部分，并且起點有助于在宿主細(xì)胞中擴(kuò)增載體。如果所選載體不含有復(fù)制起點位點，那么可基于已知序列化學(xué)合成復(fù)制起點位點，并且將其連接至載體中。舉例來說，來自質(zhì)粒pbr322(newenglandbiolabs,beverly,ma)的復(fù)制起點適用于大多數(shù)革蘭氏陰性細(xì)菌，并且各種病毒起點(例如sv40、多瘤、腺病毒、水泡性口炎病毒(vsv)或乳頭狀瘤病毒諸如hpv或bpv)適用于哺乳動物細(xì)胞中的克隆載體。通常，復(fù)制起點組分不為哺乳動物表達(dá)載體所需(例如僅因為sv40起點也含有病毒早期啟動子而常使用它)。

轉(zhuǎn)錄終止序列通常位于多肽編碼區(qū)的末端的3'，并且用于終止轉(zhuǎn)錄。通常，原核細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄終止序列是g-c富集片段，繼之以多聚t序列。盡管序列易于自文庫克隆或甚至作為載體的一部分商購，但它也可易于使用用于核酸合成的方法(如本文所述的那些)合成。

可選擇標(biāo)記基因編碼為在選擇性培養(yǎng)基中生長的宿主細(xì)胞的存活和生長所必需的蛋白質(zhì)。典型選擇標(biāo)記基因編碼以下蛋白質(zhì)：(a)對原核宿主細(xì)胞賦予對抗生素或其他毒素，例如胺芐青霉素、四環(huán)素或卡那霉素的抗性；(b)彌補(bǔ)細(xì)胞的營養(yǎng)缺陷不足；或(c)供應(yīng)不可從復(fù)合或組分確定培養(yǎng)基獲得的關(guān)鍵養(yǎng)分。特定可選擇標(biāo)記是卡那霉素抗性基因、胺芐青霉素抗性基因和四環(huán)素抗性基因。有利的是，新霉素(neomycin)抗性基因也可用于在原核宿主細(xì)胞與真核宿主細(xì)胞兩者中進(jìn)行選擇。

可使用其他可選擇基因來擴(kuò)增將表達(dá)的基因。擴(kuò)增是產(chǎn)生對生長或細(xì)胞存活關(guān)鍵的蛋白質(zhì)所需的基因在連續(xù)多代重組細(xì)胞的染色體內(nèi)串聯(lián)重復(fù)的過程。用于哺乳動物細(xì)胞的適合可選擇標(biāo)記的實例包括二氫葉酸還原酶(dhfr)和無啟動子胸苷激酶基因。將哺乳動物細(xì)胞轉(zhuǎn)化體置于選擇壓力下，其中僅轉(zhuǎn)化體借助于載體中存在的可選擇基因而唯一適應(yīng)于存活。選擇壓力通過在以下條件下培養(yǎng)轉(zhuǎn)化的細(xì)胞來施加：連續(xù)增加培養(yǎng)基中的選擇劑的濃度，由此導(dǎo)致擴(kuò)增可選擇基因與編碼另一基因(諸如結(jié)合于c5多肽或c5表位的抗體)的dna兩者。因此，從擴(kuò)增的dna合成增加量的多肽，諸如抗-c5抗體。

核糖體結(jié)合位點通常為mrna的翻譯起始所必需且特征在于具有shine-dalgarno序列(原核生物)或kozak序列(真核生物)。所述元件通常位于啟動子的3'和待表達(dá)的多肽的編碼序列的5'。

在一些情況下，如當(dāng)在真核宿主細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)中需要糖基化時，可操作各種前序列或原序列以改進(jìn)糖基化或產(chǎn)率。舉例來說，可改變特定信號肽的肽酶裂解位點，或添加原序列，此也可影響糖基化。最終蛋白質(zhì)產(chǎn)物可在-1位置(相對于成熟蛋白質(zhì)的第一個氨基酸)具有一個或多個與表達(dá)相伴的可能尚未完全移除的額外氨基酸。舉例來說，最終蛋白質(zhì)產(chǎn)物可具有一個或兩個見于肽酶裂解位點中的連接于氨基末端的氨基酸殘基?；蛘?，如果酶在成熟多肽內(nèi)的所述區(qū)域處切割，那么使用一些酶裂解位點可產(chǎn)生所需多肽的略微截短形式。

本公開的表達(dá)和克隆載體將通常含有由宿主生物體識別，并且可操作地連接于編碼c5抗體的分子的啟動子。啟動子為位于結(jié)構(gòu)基因(通常在約100至1000bp內(nèi))的起始密碼子上游(即5')的未轉(zhuǎn)錄序列，其控制結(jié)構(gòu)基因的轉(zhuǎn)錄。啟動子依照慣例分組至以下兩個類別中的一個：誘導(dǎo)性啟動子和組成性啟動子。誘導(dǎo)性啟動子可反應(yīng)于培養(yǎng)條件的某一變化(如存在或不存在某一養(yǎng)分或溫度變化)來引發(fā)在它們控制下自dna的轉(zhuǎn)錄程度增加。另一方面，組成性啟動子均一轉(zhuǎn)錄它們所可操作地連接的基因，即少許控制或不控制基因表達(dá)。許多由多種潛在宿主細(xì)胞識別的啟動子是熟知的。通過限制酶消化從來源dna移除啟動子并且將所需啟動子序列插入導(dǎo)載體中，使適合的啟動子可操作地連接于編碼構(gòu)成本公開的c5抗體的重鏈或輕鏈的dna。

在一些實施方案中，酵母細(xì)胞可用于產(chǎn)生目前公開的抗-c5抗體。適合與酵母宿主一起使用的啟動子在本領(lǐng)域中也是熟知的。酵母增強(qiáng)子有利地與酵母啟動子一起使用。適合與哺乳動物宿主細(xì)胞一起使用的啟動子為已熟知的并且包括但不限于，自病毒的基因組獲得的那些啟動子，所述病毒諸如多形瘤病毒、禽痘病毒、腺病毒(如腺病毒2)、牛乳頭狀瘤病毒、禽肉瘤病毒、巨細(xì)胞病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒、乙型肝炎病毒和或猿猴病毒40(sv40)。其他適合哺乳動物啟動子包括異源哺乳動物啟動子，例如熱休克啟動子和肌動蛋白(actin)啟動子。

可能感興趣的其他啟動子包括但不限于：sv40早期啟動子(benoist和chambon,1981,nature290:304-310)；cmv啟動子(thornsen等，1984,proc.natl.acad.u.s.a.81:659-663)；勞斯肉瘤病毒的3'長末端重復(fù)序列中含有的啟動子(yamamoto等，1980,cell22:787-797)；皰疹胸苷激酶啟動子(wagner等，1981,proc.natl.acad.sci.u.s.a.78:1444-1445)；來自金屬硫蛋白基因的啟動子和調(diào)節(jié)序列(prinster等，1982,nature296:39-42)；以及原核生物啟動子諸如β-內(nèi)酰胺酶啟動子(villa-kamaroff等，1978,proc.natl.acad.sci.u.s.a.75:3727-3731)；或tac啟動子(deboer等，1983,proc.natl.acad.sci.u.s.a.80:21-25)。還感興趣的是以下動物轉(zhuǎn)錄控制區(qū)，它們展現(xiàn)出組織特異性并且已用于轉(zhuǎn)基因動物：在胰腺腺泡細(xì)胞中有活性的彈性蛋白酶i基因控制區(qū)(swift等，1984,cell38:639-646；ornitz等，1986,coldspringharborsymp.quant.biol.50:399-409；macdonald,1987,hepatology7:425-515)；在胰腺β細(xì)胞中有活性的胰島素基因控制區(qū)(hanahan,1985,nature315:115-122)；在淋巴樣細(xì)胞中有活性的免疫球蛋白基因控制區(qū)(grosschedl等，1984,cell38:647-658；adames等，1985,nature318:533-538；alexander等，1987,mol.cell.biol.7:1436-1444)；在睪丸細(xì)胞、乳腺細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和肥大細(xì)胞中有活性的小鼠乳腺瘤病毒控制區(qū)(leder等，1986,cell45:485-495)；在肝臟中有活性的白蛋白基因控制區(qū)(pinkert等，1987,genesanddevel.1:268-276)；在肝臟中有活性的α-胎蛋白基因控制區(qū)(krumlauf等，1985,mol.cell.biol.5:1639-1648；hammer等，1987,science253:53-58)；在肝臟中有活性的α1-抗胰蛋白酶基因控制區(qū)(kelsey等，1987,genesanddevel.1:161-171)；在髓樣細(xì)胞中有活性的β-球蛋白基因控制區(qū)(mogram等，1985,nature315:338-340；kollias等，1986,cell46:89-94)；在大腦的少突膠質(zhì)細(xì)胞中有活性的髓磷脂堿性蛋白基因控制區(qū)(readhead等，1987,cell48:703-712)；在骨骼肌中有活性的肌球蛋白輕鏈-2基因控制區(qū)(sani,1985,nature314:283-286)；以及在下丘腦中有活性的促性腺激素釋放激素基因控制區(qū)(mason等，1986,science234:1372-1378)。

增強(qiáng)子序列可插入載體中以增加高等真核生物對編碼構(gòu)成本公開的c5抗體的輕鏈或重鏈的dna的轉(zhuǎn)錄。增強(qiáng)子是dna的順式作用元件，長度通常約10-300bp，其作用于啟動子以增加轉(zhuǎn)錄。增強(qiáng)子具有相對定向和位置非依賴性，其已見于轉(zhuǎn)錄單元的5'位置與3'位置兩者處?？勺圆溉閯游锘颢@得的若干增強(qiáng)子序列為已知的(例如球蛋白、彈性蛋白酶、白蛋白、α-胎蛋白和胰島素)。然而，通常使用來自病毒的增強(qiáng)子。本領(lǐng)域中已知的sv40增強(qiáng)子、巨細(xì)胞病毒早期啟動子增強(qiáng)子、多瘤增強(qiáng)子和腺病毒增強(qiáng)子是用于活化真核啟動子的示例性增強(qiáng)元件。盡管增強(qiáng)子可在載體中位于編碼序列的5'或3'，但其通常位于啟動子的5'位點處。編碼適當(dāng)天然或異源信號序列(前導(dǎo)序列或信號肽)的序列可并入表達(dá)載體中以促進(jìn)抗體的細(xì)胞外分泌。對信號肽或前導(dǎo)物的選擇取決于待在其中產(chǎn)生抗體的宿主細(xì)胞的類型，并且異源信號序列可替換天然信號序列。在哺乳動物宿主細(xì)胞中具有功能的信號肽的實例包括以下：美國專利號4,965,195中所述的白介素-7(il-7)的信號序列；cosman等,1984,nature312:768中所述的白介素-2受體的信號序列；ep專利號0367566中所述的白介素-4受體信號肽；美國專利號4,968,607中所述的i型白介素-1受體信號肽；ep專利號0460846中所述的ii型白介素-1受體信號肽。

用于表達(dá)本公開目前要求保護(hù)的抗體的表達(dá)載體可由起始載體諸如可商購載體構(gòu)建。所述載體可或可不含有全部所需側(cè)接序列。當(dāng)本文所述的一種或多種側(cè)接序列未已存在于載體中時，它們可個別地加以獲得并且連接至載體中。用于獲得各側(cè)接序列的方法為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知。

在已構(gòu)建載體并且已將編碼構(gòu)成抗-c5抗體的輕鏈、重鏈或輕鏈和重鏈的核酸分子插入到載體的適當(dāng)位點之后，所完成的載體可插入到適合的宿主細(xì)胞中以進(jìn)行擴(kuò)增和/或多肽表達(dá)。將抗-c5抗體的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化至所選宿主細(xì)胞中可通過熟知方法來達(dá)成，所述方法包括轉(zhuǎn)染、感染、磷酸鈣共沉淀、電穿孔、顯微注射、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染、deae-葡聚糖介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染或其他已知技術(shù)。所選方法將部分地隨待使用的宿主細(xì)胞的類型而變。這些方法和其他適合方法為熟練技術(shù)人員所熟知的，并且例如闡述于sambrook等,2001，同上中。

當(dāng)在適當(dāng)條件下培養(yǎng)時，宿主細(xì)胞合成抗-c5抗體，其可隨后自培養(yǎng)基收集(如果宿主細(xì)胞將它分泌至培養(yǎng)基中)或直接自產(chǎn)生它的宿主細(xì)胞收集(如果它未被分泌)。對適當(dāng)宿主細(xì)胞的選擇將取決于各種因素，如所需表達(dá)水平、合乎活性需要或為活性所必需的多肽修飾(如糖基化或磷酸化)和折疊成生物活性分子的容易性。宿主細(xì)胞可以是真核細(xì)胞或原核細(xì)胞。

可用作表達(dá)宿主的哺乳動物細(xì)胞系為本領(lǐng)域已熟知的并且包括但不限于，可自美國典型培養(yǎng)物保藏中心(americantypeculturecollection，atcc)獲得的永生化細(xì)胞系，包括但不限于中國倉鼠卵巢(cho)細(xì)胞、hela細(xì)胞、幼小倉鼠腎(bhk)細(xì)胞、猴腎細(xì)胞(cos)、人肝細(xì)胞癌細(xì)胞(例如，hepg2)以及許多其他細(xì)胞系。在某些實施方案中，可通過確定哪些細(xì)胞系具有高表達(dá)水平并且組成性產(chǎn)生具有c5結(jié)合性質(zhì)的抗體來選擇細(xì)胞系。在另一實施方案中，可選擇來自b細(xì)胞譜系的不產(chǎn)生它的自身抗體，但能夠制備并且分泌異源抗體的細(xì)胞系。

出于診斷和治療目的使用抗-c5抗體

本公開的抗體適用于檢測生物樣品中的c5和/或c5b并且鑒定產(chǎn)生c5蛋白的細(xì)胞或組織。在一些實施方案中，本公開的抗-c5抗體可用于診斷測定，例如，檢測和/或量化組織或細(xì)胞中表達(dá)的c5或者血清或組織中或細(xì)胞上的c5b的結(jié)合測定。

在一些實施方案中，特異性結(jié)合c5的本公開的抗體可用于治療有需要的患者的補(bǔ)體或c5介導(dǎo)性疾病。另外，本公開的抗-c5抗體可用于通過與其他補(bǔ)體蛋白形成復(fù)合物來抑制c5，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞或組織內(nèi)c5的生物活性。結(jié)合c5的抗體因此可調(diào)節(jié)和/或阻斷與其他結(jié)合化合物的相互作用并且因此可具有緩解補(bǔ)體和c5介導(dǎo)性疾病的治療用途。

在一些實施方案中，通過抗-c5抗體結(jié)合c5可導(dǎo)致c5-介導(dǎo)性補(bǔ)體級聯(lián)的破壞。

診斷方法

本公開的抗體可用于診斷目的以檢測、診斷或監(jiān)測與補(bǔ)體或c5相關(guān)聯(lián)的疾病和/或病狀。本公開提供了使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的經(jīng)典免疫組織學(xué)方法檢測樣品中c5的存在(例如，tijssen,1993,practiceandtheoryofenzymeimmunoassays,第15卷(r.h.burdon和p.h.vanknippenberg編著，elsevier,amsterdam)；zola,1987,monoclonalantibodies:amanualoftechniques，第147-158頁(crcpress,inc.)；jalkanen等，1985,j.cell.biol.101:976-985；jalkanen等，1987,j.cellbiol.105:3087-3096)。可在體內(nèi)或在體外對c5進(jìn)行檢測。

本文提供的診斷應(yīng)用包括使用抗體檢測c5的表達(dá)。適用于檢測c5的存在的方法的實例包括免疫測定，諸如酶聯(lián)免疫吸附測定(elisa)和放射免疫測定(ria)。

對于診斷應(yīng)用，抗體通常可用可檢測標(biāo)記基團(tuán)標(biāo)記。適合的標(biāo)記基團(tuán)包括但不限于以下：放射性同位素或放射性核素(例如，³h、¹⁴c、¹⁵n、³⁵s、⁹⁰y、⁹⁹tc、¹¹¹in、¹²⁵i、¹³¹i)、熒光基團(tuán)(例如，fitc、若丹明、鑭系元素磷光體)、酶基團(tuán)(例如，辣根過氧化物酶、β-半乳糖苷酶、熒光素酶、堿性磷酸酶)、化學(xué)發(fā)光基團(tuán)、生物素基團(tuán)或由二級報道體識別的預(yù)定多肽表位(例如，亮氨酸拉鏈對序列、二級抗體的結(jié)合位點、金屬結(jié)合結(jié)構(gòu)域、表位標(biāo)記)。在一些實施方案中，標(biāo)記基團(tuán)通過具有各種長度的間隔子臂使標(biāo)記基團(tuán)偶聯(lián)到抗體，以降低潛在空間位阻。用于標(biāo)記蛋白質(zhì)的各種方法為本領(lǐng)域中已知的并且可用于實施本公開。

本公開的一方面提供對表達(dá)c5的一種或多種細(xì)胞的鑒定。在一個特定實施方案中，所述抗體用標(biāo)記基團(tuán)標(biāo)記并且檢測標(biāo)記的抗體與c5的結(jié)合。在另一個特定實施方案中，可在體內(nèi)檢測抗體與c5的結(jié)合。在另一個特定實施方案中，分離抗體/c5復(fù)合物并且使用本領(lǐng)域已知的技術(shù)進(jìn)行測量。參見，例如，harlow和lane,1988,antibodies:alaboratorymanual,newyork:coldspringharbor(1991和定期增補(bǔ)版中編著)；johne.coligan編著，1993,currentprotocolsinimmunologynewyork:johnwiley&sons。

本公開的另一方面提供對與本公開的抗-c5抗體競爭結(jié)合c5的測試分子的存在的檢測。這種測定的實例將涉及在存在或不存在測試分子的情況下檢測含有一定量的c5的溶液中的游離抗體的量。游離抗體(即，未結(jié)合于c5的抗體)的量的增加將指示測試分子能夠與抗-c5抗體競爭結(jié)合c5。在一個實施方案中，將抗體用標(biāo)記基團(tuán)標(biāo)記。或者，標(biāo)記測試分子且在存在和不存在抗體的情況下監(jiān)測游離測試分子的量。

適應(yīng)癥

補(bǔ)體系統(tǒng)涉及促成急性和慢性病狀，包括動脈粥樣硬化、急性心肌梗死繼發(fā)的缺血再灌注、henoch-schonlein紫癜性腎炎、免疫復(fù)合性血管炎、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、動脈炎、動脈瘤、中風(fēng)、心肌癥、出血性休克、擠壓傷、多器官功能衰竭、低血容量性休克和腸道缺血、移植排斥、心臟手術(shù)、ptca、自然流產(chǎn)、神經(jīng)元損傷、脊髓損傷、重癥肌無力、亨廷頓氏病、肌萎縮性側(cè)索硬化、多發(fā)性硬化、guillainbarre綜合征、帕金森病、阿耳茨海默病、急性呼吸窘迫綜合征、哮喘、慢性阻塞性肺病、輸血相關(guān)性急性肺損傷、急性肺損傷、goodpasture氏病、心肌梗死、心肺分流術(shù)后炎癥、心肺分流術(shù)、敗血性休克、移植排斥、異種移植、燒傷、系統(tǒng)性紅斑性狼瘡、膜腎炎、berger氏病、牛皮癬、類天皰瘡、皮肌炎、抗磷脂綜合征、炎癥性腸病、血液透析、白細(xì)胞分離法、血漿除去法、肝素誘導(dǎo)型體外膜式氧合ldl沉淀、體外膜式氧合以及黃斑變性。

黃斑變性疾病(諸如所有階段的年齡相關(guān)性黃斑變性(amd)，包括干性和濕性(非滲出性和滲出性)形式)、脈絡(luò)膜新生血管形成(cnv)、葡萄膜炎、糖尿病和其他缺血相關(guān)性視網(wǎng)膜病變以及其他眼內(nèi)新生血管性疾病(諸如糖尿病性黃斑水腫)、病理性近視、vonhippel-lindau病、眼睛組織胞漿菌病、視網(wǎng)膜中央靜脈阻塞(crvo)、角膜血管新生以及視網(wǎng)膜新生血管形成。一組補(bǔ)體相關(guān)眼睛病狀包括年齡相關(guān)性黃斑變性(amd)(包括非滲出性(濕性)和滲出性(干性或萎縮性)amd)、脈絡(luò)膜新生血管形成(cnv)、糖尿病性視網(wǎng)膜病(dr)以及內(nèi)眼炎。

目前公開的抗-c5抗體可與一種或多種細(xì)胞因子、淋巴因子、血細(xì)胞產(chǎn)生因子和/或抗炎劑組合使用。

本文所述的疾病和病癥的治療可包括使用首選藥物(治療前、治療后或同時治療)與使用本文提供的一種或多種抗-c5抗體的治療組合來控制疼痛和炎癥。在一些情況下，所述藥物被分類為非甾體抗炎藥(nsaid)。二級治療包括皮質(zhì)激素、長效抗風(fēng)濕藥(saard)或疾病改善(dm)藥。關(guān)于以下化合物的信息可見于themerckmanualofdiagnosisandtherapy，第十六版，merck,sharp&dohmeresearchlaboratories,merck&co.,rahway,n.j.(1992)和pharmaprojects,pjbpublicationsltd中。

在一個特定實施方案中，本公開涉及使用抗體和任何一種或多種nsaid來治療本文所述的疾病和病癥。nsaid的抗炎作用至少部分歸因于前列腺素合成的抑制(goodman和gilman，在“thepharmacologicalbasisoftherapeutics,”macmillan第7版(1985)中)。nsaid可被表征為至少九組：(1)水楊酸衍生物；(2)丙酸衍生物；(3)乙酸衍生物；(4)芬那酸衍生物；(5)羧酸衍生物；(6)丁酸衍生物；(7)昔康類；(8)吡唑類；以及(9)吡唑啉酮類。

在另一個特定實施方案中，本公開涉及使用抗體(治療前、治療后或同時治療)與一種或多種水楊酸衍生物、其前藥酯或藥學(xué)上可接受的鹽中任一種的組合。此類水楊酸衍生物、其前藥酯或藥學(xué)上可接受的鹽包括：醋氨沙洛、阿洛潑林(aloxiprin)、阿司匹靈、撲炎痛(benorylate)、溴水楊醇、乙酰水楊酸鈣、三水楊酸膽堿鎂、水楊酸鎂、水楊酸膽堿、二氟尼柳(diflusinal)、依特柳酯(etersalate)、芬多沙(fendosal)、龍膽酸、水楊酸乙二醇酯、水楊酸咪唑、賴氨酸乙酰水楊酸酯、美沙拉嗪(mesalamine)、水楊嗎啉、水楊酸1-萘酯、奧沙拉秦(olsalazine)、帕沙米特(parsalmide)、乙酰水楊酸苯酯、水楊酸苯酯、醋水楊胺、水楊酰胺o-乙酸、雙水楊酯、水楊酸鈉以及柳氮磺胺吡啶。此組還意圖涵蓋具有類似鎮(zhèn)痛和抗炎性質(zhì)的結(jié)構(gòu)相關(guān)水楊酸衍生物。

在另外的特定實施方案中，本公開涉及使用抗體(治療前、治療后或同時治療)與一種或多種丙酸衍生物、其前藥酯或藥學(xué)上可接受的鹽中任一種的組合。丙酸衍生物、其前藥酯和藥學(xué)上可接受的鹽包括：阿明洛芬、苯噁洛芬、布氯酸、卡洛芬(carprofen)、右吲哚洛芬、非諾洛芬、氟諾洛芬、氟洛芬(fluprofen)、氟比洛芬、呋洛芬、布洛芬、布洛芬鋁、異丁普生、吲哚洛芬、異洛芬、酮洛芬、洛索洛芬、咪洛芬、萘普生、萘普生鈉、噁丙嗪、吡酮洛芬、匹美洛芬(pimeprofen)、吡洛芬、普拉洛芬、丙替嗪酸、吡哆洛芬(pyridoxiprofen)、舒洛芬、噻洛芬酸以及硫噁洛芬。此組還意圖涵蓋具有類似鎮(zhèn)痛和抗炎性質(zhì)的結(jié)構(gòu)相關(guān)丙酸衍生物。

在又一個特定實施方案中，本公開涉及使用抗體(治療前、治療后或同時治療)與一種或多種乙酸衍生物、其前藥酯或藥學(xué)上可接受的鹽中任一種的組合。乙酸衍生物、其前藥酯和藥學(xué)上可接受的鹽包括：阿西美辛(acemetacin)、阿氯芬酸、氨芬酸、丁苯羥酸、桂美辛(cinmetacin)、氯吡酸、地美辛、雙氯芬酸鉀、雙氯芬酸鈉、依托度酸、聯(lián)苯乙酸、芬氯酸、苯克洛酸、芬克洛酸、芬替酸、呋羅芬酸、葡美辛、異丁芬酸、吲哚美辛、三苯唑酸、伊索克酸、氯那唑酸、甲嗪酸、奧沙美辛、奧昔平酸(oxpinac)、吡美辛、丙谷美辛、舒林酸、他美辛(talmetacin)、噻拉米特(tiaramide)、硫平酸(tiopinac)、托美丁、托美丁鈉、齊多美辛以及佐美酸。此組還意圖涵蓋具有類似鎮(zhèn)痛和抗炎性質(zhì)的結(jié)構(gòu)相關(guān)乙酸衍生物。

在另一個特定實施方案中，本公開涉及使用抗體(治療前、治療后或同時治療)與一種或多種芬那酸衍生物、其前藥酯或藥學(xué)上可接受的鹽中任一種的組合。芬那酸衍生物、其前藥酯和藥學(xué)上可接受的鹽包括：恩芬那酸、依托芬那酯、氟芬那酸、異尼辛、甲氯芬那酸、甲氯芬那酸鈉、美多滅酸(meclofenamicacid)、甲芬那酸、尼氟酸、他尼氟酯、特羅芬那酯、托芬那酸以及烏芬那酯。此組還意圖涵蓋具有類似鎮(zhèn)痛和抗炎性質(zhì)的結(jié)構(gòu)相關(guān)芬那酸衍生物。

在另外的特定實施方案中，本公開涉及使用抗體(治療前、治療后或同時治療)與一種或多種羧酸衍生物、其前藥酯或藥學(xué)上可接受的鹽中任一種的組合?？墒褂玫聂人嵫苌?、其前藥酯和藥學(xué)上可接受的鹽包括：環(huán)氯茚酸、二氟尼柳(diflunisal)、氟苯柳、伊諾立定(inoridine)、酮咯酸以及替諾立定。此組還意圖涵蓋具有類似鎮(zhèn)痛和抗炎性質(zhì)的結(jié)構(gòu)相關(guān)羧酸衍生物。

在又一個特定實施方案中，本公開涉及使用抗體(治療前、治療后或同時治療)與一種或多種丁酸衍生物、其前藥酯或藥學(xué)上可接受的鹽中任一種的組合。丁酸衍生物、其前藥酯和藥學(xué)上可接受的鹽包括：布馬地宗(bumadizon)、布替布芬、芬布芬以及聯(lián)苯丁酸。此組還意圖涵蓋具有類似鎮(zhèn)痛和抗炎性質(zhì)的結(jié)構(gòu)相關(guān)丁酸衍生物。

在另一個特定實施方案中，本公開涉及使用抗體(治療前、治療后或同時治療)與一種或多種昔康類、其前藥酯或藥學(xué)上可接受的鹽中任一種的組合。昔康類、其前藥酯和藥學(xué)上可接受的鹽包括：屈噁昔康、依諾利康、伊索昔康、吡羅昔康、舒多昔康、替諾昔康以及4-羥基-1,2-苯并噻嗪1,1-二氧化物4-(n-苯基)-甲酰胺。此組還意圖涵蓋具有類似鎮(zhèn)痛和抗炎性質(zhì)的結(jié)構(gòu)相關(guān)昔康類。

在又一個特定實施方案中，本公開涉及使用抗體(治療前、治療后或同時治療)與一種或多種吡唑類、其前藥酯或藥學(xué)上可接受的鹽中任一種的組合?？墒褂玫倪吝蝾?、其前藥酯和藥學(xué)上可接受的鹽包括：二苯米唑和依匹唑。此組還意圖涵蓋具有類似鎮(zhèn)痛和抗炎性質(zhì)的結(jié)構(gòu)相關(guān)吡唑類。

在另外的特定實施方案中，本公開涉及使用抗體(治療前、治療后或同時治療)與一種或多種吡唑啉酮類、其前藥酯或藥學(xué)上可接受的鹽中任一種的組合?？墒褂玫倪吝蜻?、其前藥酯和藥學(xué)上可接受的鹽包括：阿扎丙宗(apazone)、阿扎丙宗(azapropazone)、芐哌立隆、非普拉宗、莫非布宗、嗎拉宗、羥基保泰松、保泰松、哌布宗、丙基非那宗(propylphenazone)、雷米那酮、琥布宗以及噻唑丁炎酮。此組還意圖涵蓋具有類似鎮(zhèn)痛和抗炎性質(zhì)的結(jié)構(gòu)相關(guān)吡唑啉酮類。

在另一個特定實施方案中，本公開涉及使用抗體(治療前、治療后或同時治療)與一種或多種以下nsaid中任一種的組合：ε-乙酰氨基己酸、s-腺苷基-蛋氨酸、3-氨基-4-羥基丁酸、阿米西群(amixetrine)、阿尼扎芬、安曲非寧(antrafenine)、芐達(dá)酸、芐達(dá)賴氨酸酯、芐達(dá)明、雙苯硫胺(beprozin)、溴哌莫(broperamole)、布可隆(bucolome)、丁苯唑酸、環(huán)丙喹宗、氯克西酯(cloximate)、達(dá)齊胺(dazidamine)、地波沙美(deboxamet)、地托咪定(detomidine)、聯(lián)苯吡胺、difenpyramide、difisalamine、地他唑(ditazol)、依莫法宗(emorfazone)、甲磺酸法奈替唑(fanetizolemesylate)、芬氟咪唑、夫洛非寧、氟魯咪唑、氟尼辛、氟丙喹宗、伏哌托寧(fopirtoline)、磷柳酸(fosfosal)、呱美柳(guaimesal)、guaiazolene、isonixirn、利非他明hcl(lefetaminehcl)、來氟米特(leflunomide)、羅非咪唑(lofemizole)、諾替法唑(lotifazole)、溶素氯尼辛(lysinclonixinate)、美西拉宗、萘丁美酮、尼克吲哚(nictindole)、尼美舒利、肝蛋白(orgotein)、奧帕諾辛(orpanoxin)、奧沙西羅(oxaceprol)、奧沙帕多(oxapadol)、瑞尼托林(paranyline)、哌立索唑(perisoxal)、檸檬酸哌立索唑、哌福肟(pifoxime)、piproxen、吡拉唑酸(pirazolac)、吡非尼酮、普羅喹宗、普羅沙唑、thielavinb、替氟咪唑、替美加定(timegadine)、甲苯酰吡咯乙酸(tolectin)、托帕朵、tryptamid以及由諸如以下各項的公司代碼號指示的那些藥物：480156s、aa861、ad1590、afp802、afp860、ai77b、ap504、au8001、bppc、bw540c、chinoin127、cn100、eb382、el508、f1044、fk-506、gv3658、itf182、kcntei6090、kme4、la2851、mr714、mr897、my309、ono3144、pr823、pv102、pv108、r830、rs2131、scr152、sh440、sir133、spas510、sq27239、st281、sy6001、ta60、tai-901(4-苯甲?；?1-茚滿羧酸)、tvx2706、u60257、ur2301以及wy41770。此組還意圖涵蓋具有與nsaid類似的鎮(zhèn)痛和抗炎性質(zhì)的結(jié)構(gòu)相關(guān)nsaid。

在另一個特定實施方案中，本公開涉及使用抗體(治療前、治療后或同時治療)與一種或多種皮質(zhì)激素、其前藥酯或藥學(xué)上可接受的鹽中任一種的組合，以用于治療本文所述的疾病和病癥，包括急性和慢性炎癥，諸如風(fēng)濕性疾病、移植物抗宿主疾病和多發(fā)性硬化。皮質(zhì)激素、其前藥酯和藥學(xué)上可接受的鹽包括氫化可的松和源自氫化可的松的化合物，諸如21-乙酰氧孕烯醇酮、阿氯米松(alclomerasone)、阿爾孕酮、安西縮松、倍氯米松、倍他米松、戊酸倍他米松、布地縮松、氯潑尼松、氯倍他索、丙酸氯倍他索、氯倍他松、丁酸氯倍他松、氯可托龍、氯潑尼醇、皮質(zhì)脂酮、可的松、可的伐唑、醋噁唑龍(deflazacon)、地索奈德(desonide)、去羥米松(desoximerasone)、地塞米松、雙氟拉松、二氟可龍、二氟潑尼酯(difluprednate)、甘草次酸、氟扎可特、氟氯奈德、氟米松、氟米松特戊酸酯、醋酸氟輕松(flucinoloneacetonide)、氟尼縮松、氟輕松醋酸酯(fluocinonide)、氟輕松醋酸酯(fluorocinoloneacetonide)、氟可丁丁酯(fluocortinbutyl)、氟可龍、氟可龍己酸、戊酸二氟可龍、氟米龍、醋酸氟培龍、醋酸氟潑尼定、氟潑尼龍、氟羥可舒松(flurandenolide)、醛基縮松、哈西縮松、鹵米松、醋酸鹵潑尼松、氫可松氨酯、氫化可的松、醋酸氫化可的松、丁酸氫化可的松、磷酸氫化可的松、氫化可的松21-琥珀酸鈉、氫化可的松叔丁基乙酸酯、馬潑尼酮、甲羥松、甲潑尼松、甲潑尼龍、莫米松糠酸酯、帕拉米松、潑尼卡酯、潑尼松龍、潑尼松龍21-二乙氨基乙酸(diedryaminoacetate)、潑尼松龍磷酸鈉、潑尼松龍琥珀酸鈉、潑尼松龍21-m-磺苯甲酸鈉、潑尼松龍21-硬羥基乙酸鈉、潑尼松龍叔丁乙酯、潑尼松龍21-三甲基乙酸酯、強(qiáng)的松、潑尼松龍戊酸酯(prednival)、潑尼立定(prednylidene)、潑尼立定21-二乙基氨基乙酸酯、替可的松(tixocortol)、曲安西龍(triamcinolone)、縮丙酮曲安西龍、苯曲安縮松以及己曲安縮松。此組還意圖涵蓋具有類似鎮(zhèn)痛和抗炎性質(zhì)的結(jié)構(gòu)相關(guān)皮質(zhì)激素類。

在另一個特定實施方案中，本公開涉及使用抗體(治療前、治療后或同時治療)與一種或多種長效抗風(fēng)濕藥(saard)或疾病改善抗風(fēng)濕藥(dmard)、其前藥酯或藥學(xué)上可接受的鹽中任一種的組合，以用于治療本文所述的疾病和病癥，包括急性和慢性炎癥，諸如風(fēng)濕性疾病、移植物抗宿主疾病和多發(fā)性硬化。saard或dmard、其前藥酯和藥學(xué)上可接受的鹽包括：阿洛酮鈉、金諾芬、金硫葡糖、金硫醋苯胺、硫唑嘌呤、布喹那鈉、布西拉明、3-金硫基-2-丙醇-1-磺酸鈣、苯丁酸氮芥、氯醌醇、氯丁扎利(clobuzarit)、銅克索林(cuproxoline)、環(huán)磷酰胺、環(huán)孢霉素、氨苯砜(dapsone)、15-去氧精胍菌素、雙醋瑞因(diacerein)、葡萄糖胺、金鹽(例如，環(huán)喹金鹽、硫代蘋果酸金鈉、硫代硫酸金鈉)、羥氯喹、硫酸羥氯喹、羥基脲、酮保泰松、左咪唑、氯苯扎利、蜂毒素、6-巰基嘌呤、甲氨蝶呤、咪唑立賓、麥考酚酸酯、金硫乙酸(myoral)、氮芥、d-青霉胺、羥基吡啶咪唑類諸如sknf86002和sb203580、雷帕霉素、硫醇類、胸腺產(chǎn)生素以及長春新堿。此組還意圖涵蓋具有類似鎮(zhèn)痛和抗炎性質(zhì)的結(jié)構(gòu)相關(guān)saard或dmard。

在另一個特定實施方案中，本公開涉及使用抗體(治療前、治療后或同時治療)與一種或多種cox2抑制劑、其前藥酯或藥學(xué)上可接受的鹽中任一種的組合，以用于治療本文所述的疾病和病癥，包括急性和慢性炎癥。cox2抑制劑、其前藥酯或藥學(xué)上可接受的鹽的實例包括例如塞來昔布。此組還意圖涵蓋具有類似鎮(zhèn)痛和抗炎性質(zhì)的結(jié)構(gòu)相關(guān)cox2抑制劑。cox-2選擇性抑制劑的實例包括但不限于，依托昔布、伐地昔布、塞來昔布、利考非隆、盧米昔布、羅非昔布以及類似藥物。

在又一個特定實施方案中，本公開涉及使用抗體(治療前、治療后或同時治療)與一種或多種抗微生物劑、其前藥酯或藥學(xué)上可接受的鹽中任一種的組合，以用于治療本文所述的疾病和病癥，包括急性和慢性炎癥?？刮⑸飫┌ɡ绱箢悇e的青霉素類、頭孢菌素類和其他β-內(nèi)酰胺類、氨基糖苷類、唑類、喹諾酮類、大環(huán)內(nèi)酯類、利福霉素類、四環(huán)素類、磺胺類、林可酰胺類以及多粘菌素類。青霉素類包括但不限于，青霉素g、青霉素v、甲氧西林、萘夫西林、苯唑西林、氯唑西林、雙氯西林、氟氯西林、氨比西林/舒巴坦、阿莫西林、阿莫西林/克拉維酸鹽、海他西林、環(huán)青霉素、巴卡西林、羧芐西林、卡茚西林、替卡西林、替卡西林/克拉維酸鹽、阿洛西林、美洛西林、哌拉西林(peperacillin)以及美西林。頭孢菌素類和其他β-內(nèi)酰胺包括但不限于，頭孢噻吩、頭孢匹林、頭孢氨芐、頭孢拉啶(cephradine)、頭孢唑林、頭孢羥氨芐、頭孢克洛、頭孢孟多、頭孢替坦、頭孢西丁、頭孢呋辛(ceruroxime)、頭孢尼西、頭孢拉定(ceforadine)、頭孢克肟、頭孢噻肟、拉氧頭孢、頭孢唑肟、頭孢曲松(cetriaxone)、頭孢哌酮(cephoperazone)、頭孢他啶、亞胺培南以及氨曲南。氨基糖苷類包括但不限于，鏈霉素、慶大霉素、妥布霉素、阿米卡星、奈替米星、卡那霉素以及新霉素。唑類包括但不限于氟康唑。喹諾酮類包括但不限于，萘啶酸、諾氟沙星、依諾沙星、環(huán)丙沙星、氧氟沙星、司帕沙星以及替馬沙星。大環(huán)內(nèi)酯類包括但不限于紅霉素、螺旋霉素和阿奇霉素。利福霉素類包括但不限于利福平。四環(huán)素類包括但不限于，斯匹環(huán)素(spicycline)、金霉素、氯莫環(huán)素、地美環(huán)素、去氧土霉素、胍甲環(huán)素、賴甲環(huán)素、甲氯環(huán)素、美他環(huán)素(methacycline)、米諾環(huán)素、氧四環(huán)素、青哌環(huán)素、匹哌環(huán)素、羅利環(huán)素、山環(huán)素、琥珀酸氯霉素吡甲四環(huán)素(senociclin)以及四環(huán)素?；前奉惏ǖ幌抻?，磺胺、磺胺甲噁唑、乙?；前贰⒒前粪奏?、磺胺異噁唑以及磺胺甲基異惡唑(甲氧芐啶/磺胺甲噁唑)。林可酰胺類包括但不限于克林霉素和林可霉素。多粘菌素類(多肽)包括但不限于多粘菌素b和粘菌素。

治療方法：藥物制劑、施用路徑

公開了包含治療有效量的一種或多種本公開的抗體連同藥學(xué)上可接受的稀釋劑、載體、增溶劑、乳化劑、防腐劑和/或佐劑的組合物。此外，本公開提供了通過施用此類藥物組合物治療患者的方法?；颊呖梢允侨耸茉囌呋騽游锸茉囌摺?/p>

包含一種或多種抗-c5抗體的藥物組合物可用于減小c5活性。包含一種或多種抗體的藥物組合物可用于治療與c5相關(guān)聯(lián)的結(jié)果、癥狀和/或病理學(xué)。在不同實施方案中，包含一種或多種抗體的藥物組合物可用在抑制補(bǔ)體途徑的方法中。包含一種或多種抗體的藥物組合物可用在治療與c5相關(guān)聯(lián)的結(jié)果、癥狀和/或病理學(xué)的方法中。包含一種或多種抗體的藥物組合物可用在抑制mac產(chǎn)生的方法中。包含一種或多種抗體的藥物組合物可用在抑制黃斑變性的方法中。

各種可接受的配制物質(zhì)在所用劑量和濃度下對接受者無毒。在特定實施方案中，提供包含治療有效量的抗-c5抗體的藥物組合物。

在某些實施方案中，可接受的配制物質(zhì)在所用劑量和濃度下對接受者無毒。在某些實施方案中，藥物組合物可含有用于調(diào)節(jié)、維持或保持例如組合物的ph、摩爾滲透壓濃度、粘度、澄清度、顏色、等張性、氣味、無菌性、穩(wěn)定性、溶解或釋放速率、吸收或滲透的配制物質(zhì)。在此類實施方案中，適合配制物質(zhì)包括但不限于，氨基酸(諸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或賴氨酸)；抗微生物劑；抗氧化劑(諸如抗壞血酸、亞硫酸鈉或亞硫酸氫鈉)；緩沖劑(諸如硼酸鹽、碳酸氫鹽、tris-hcl、檸檬酸鹽、磷酸鹽或其他有機(jī)酸)；膨脹劑(諸如甘露糖醇或甘氨酸)；螯合劑(諸如乙二胺四乙酸(edta))；絡(luò)合劑(諸如咖啡堿、聚乙烯吡咯烷酮、β-環(huán)糊精或羥丙基-β-環(huán)糊精)；填充劑；單糖；雙糖；以及其他碳水化合物(如葡萄糖、甘露糖或糊精)；蛋白質(zhì)(諸如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白)；著色劑、調(diào)味劑和稀釋劑；乳化劑；親水性聚合物(諸如聚乙烯吡咯烷酮)；低分子量多肽；成鹽相對離子(諸如鈉)；防腐劑(諸如氯化苯甲烴銨、苯甲酸、水楊酸、硫柳汞、苯乙醇、對羥基苯甲酸甲酯、對羥基苯甲酸丙酯、氯己定、山梨酸或過氧化氫)；溶劑(諸如甘油、丙二醇或聚乙二醇)；糖醇(諸如甘露糖醇或山梨糖醇)；混懸劑；表面活性劑或濕潤劑(諸如普洛尼克(pluronic)、peg、脫水山梨醇酯、聚山梨醇酯(如聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯)、氚核(triton)、氨丁三醇、卵磷脂、膽固醇、泰洛沙泊(tyloxapal))；穩(wěn)定性增強(qiáng)劑(如蔗糖或山梨糖醇)；張力增強(qiáng)劑(如堿金屬鹵化物(優(yōu)選氯化鈉或氯化鉀)、甘露糖醇山梨糖醇)；遞送媒介物；稀釋劑；賦形劑和/或藥物佐劑。參見remington'spharmaceuticalsciences,第18版,(a.r.genrmo編著),1990,mackpublishingcompany。

在某些實施方案中，最佳藥物組合物將由本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)例如預(yù)定施用路徑、遞送形式和所需劑量來確定。參見例如remington'spharmaceuticalsciences，同上。在某些實施方案中，此類組合物可影響本公開的抗體的物理狀態(tài)、穩(wěn)定性、體內(nèi)釋放速率以及體內(nèi)清除速率。在某些實施方案中，藥物組合物中的主要媒介物或載體在性質(zhì)方面可以是水性或非水性。舉例來說，適合媒介物或載體可以是注射用水、生理鹽水溶液或人工腦脊液，可能補(bǔ)充有用于胃腸外施用的組合物中常見的其他物質(zhì)。中性緩沖鹽水或與血清白蛋白混合的鹽水是其他示例性媒介物。在特定實施方案中，藥物組合物包含約ph7.0-8.5的tris緩沖液或約ph4.0-5.5的乙酸鹽緩沖液，并且可還包括山梨糖醇或其適合替代物。在本公開的某些實施方案中，可通過混合具有所需純度的所選組合物與任選的配制劑(remington'spharmaceuticalsciences，同上)來以凍干餅或水溶液形式制備c5抗體組合物以供儲存。此外，在某些實施方案中，可使用適當(dāng)賦形劑諸如蔗糖將c5抗體產(chǎn)物配制成凍干物。

可選擇本公開的藥物組合物以用于胃腸外遞送?；蛘?，組合物可選擇用來吸入或通過消化道遞送，諸如口服。制備此類藥學(xué)上可接受的組合物屬于本領(lǐng)域的技能。

制劑組分可以對于施用部位可接受的濃度存在。在某些實施方案中，緩沖劑用于將組合物維持在生理ph或略微較低ph下，通常在約5至約8的ph范圍內(nèi)。

當(dāng)預(yù)期胃腸外施用時，用于本公開中的治療組合物可以于藥學(xué)上可接受的媒介物中包含所需c5抗體的無熱原、胃腸外可接受的水溶液形式提供。特別適于胃腸外注射的媒介物為c5抗體于其中被配制成適當(dāng)防腐的無菌等張溶液的無菌蒸餾水。在某些實施方案中，制備可涉及用可提供可經(jīng)由積存注射遞送的產(chǎn)品的控制或持續(xù)釋放的試劑，諸如可注射微球、生物蝕解性顆粒、聚合化合物(諸如聚乳酸或聚乙醇酸)、珠粒或脂質(zhì)體配制所需分子。在某些實施方案中，也可使用具有提升在循環(huán)中的持續(xù)時間的作用的透明質(zhì)酸。在某些實施方案中，可植入的藥物遞送裝置可用于引入所需抗體。

可配制用于吸入的本公開的藥物組合物。在這些實施方案中，c5抗體被有利地配制成干燥可吸入粉末。在特定實施方案中，c5抗體吸入溶液也可與推進(jìn)劑一起配制以用于氣霧劑遞送。在某些實施方案中，溶液可被霧化吸入。經(jīng)肺施藥和因此配制方法進(jìn)一步描述于國際專利申請?zhí)杙ct/us94/001875中，所述申請以引用的方式并入本文，并且描述化學(xué)修飾蛋白質(zhì)的經(jīng)肺遞送。也預(yù)期制劑可經(jīng)口施用。以這個方式施用的c5抗體可與或不與慣常用于混配固體劑型諸如片劑和膠囊的載體一起配制。在某些實施方案中，膠囊可被設(shè)計為在于胃腸道中時釋放制劑的活性部分，此時生物可用度最大，并且預(yù)先全身降解最小?？砂ㄆ渌噭┮源龠M(jìn)c5抗體吸收。也可采用稀釋劑、調(diào)味劑、低熔點蠟、植物油、潤滑劑、混懸劑、片劑崩解劑以及粘合劑。

提供了本公開的藥物組合物以包含有效量的一種或多種c5抗體與適于制造片劑的無毒賦形劑的混合物。通過將片劑溶解于無菌水或另一適當(dāng)?shù)拿浇槲镏校芍苽涑蕟挝粍┝啃问降娜芤?。適合賦形劑包括但不限于，惰性稀釋劑，諸如碳酸鈣、碳酸鈉或碳酸氫鹽、乳糖或磷酸鈣；或粘合劑，如淀粉、明膠或阿拉伯膠(acacia)；或潤滑劑，如硬脂酸鎂、硬脂酸或滑石。

其他藥物組合物將為本領(lǐng)域技術(shù)人員所顯而易知，包括涉及呈持續(xù)或控制遞送制劑形式的c5抗體的制劑。用于配制多種其他持續(xù)或控制遞送裝置，如脂質(zhì)體載體、生物可腐蝕微?；蚨嗫字榱：蛢Σ圩⑸湟旱募夹g(shù)也為本領(lǐng)域技術(shù)人員所知。參見例如國際專利申請?zhí)杙ct/us93/00829，其以引用的方式并入本文，并且描述用于遞送藥物組合物的多孔聚合微粒的控制釋放。持續(xù)釋放制劑可包括呈定形物品，例如薄膜或微膠囊形式的半透性聚合物基質(zhì)。持續(xù)釋放基質(zhì)可包括聚酯、水凝膠、聚交酯(如美國專利號3,773,919和歐洲專利申請公布號ep058481所公開的，所述專利各自以引用的方式并入本文)、l-谷氨酸與γ乙基-l-谷氨酸酯的共聚物(sidman等，1983,biopolymers2:547-556)、聚(2-羥乙基-甲基丙烯酸酯(inethacrylate))(langer等，1981,j.biomed.mater.res.15:167-277和langer,1982,chem.tech.12:98-105)、乙烯乙酸乙烯酯(langer等，1981，同上)或聚-d(-)-3-羥基丁酸(歐洲專利申請公布號ep133,988)。持續(xù)釋放組合物也可包括可通過本領(lǐng)域中已知的若干方法中的任一種方法制備的脂質(zhì)體。參見例如eppstein等，1985,proc.natl.acad.sci.u.s.a.82:3688-3692；歐洲專利申請公布號ep036,676；ep088,046和ep143,949，所述文獻(xiàn)均以引用的方式并入。

通常以無菌制劑形式提供用于體內(nèi)施用的藥物組合物。滅菌可通過無菌過濾膜進(jìn)行過濾來實現(xiàn)。當(dāng)凍干組合物時，使用這個方法進(jìn)行的滅菌可在凍干和重構(gòu)之前或之后進(jìn)行。用于胃腸外施藥的組合物可以凍干形式或以溶液形式儲存。胃腸外組合物通常放置入具有無菌入口的容器，例如具有可由皮下注射針刺穿的塞的靜脈內(nèi)溶液袋或小瓶中。

一旦藥物組合物已被配制，它可作為溶液、混懸液、凝膠劑、乳液、固體、晶體或作為脫水或凍干粉末儲存在無菌小瓶中。此類制劑可以備用形式或以在施用之前重構(gòu)的形式(例如凍干形式)儲存。本公開還提供用于產(chǎn)生單劑量施藥單位的試劑盒。本公開的試劑盒可各自含有具有干燥蛋白質(zhì)的第一容器和具有水性制劑的第二容器兩者。在本公開的某些實施方案中，提供含有單室和多室預(yù)填充注射器(例如液體注射器和冷凍注射器)的試劑盒。

待采用的含有c5抗體的藥物組合物的治療有效量將例如取決于治療情形和目標(biāo)。本領(lǐng)域技術(shù)人員將了解，適用于治療的劑量水平將部分地視遞送的分子、使用c5抗體所針對的適應(yīng)癥、施藥途徑和患者的尺寸(體重、身體表面或器官尺寸)和/或狀況(年齡和總體健康狀況)而變化。在某些實施方案中，臨床醫(yī)師可滴定劑量并且改變施用途徑以獲得最佳治療效應(yīng)。根據(jù)上述因素，常用劑量的范圍可為約0.1μg/kg至達(dá)到約30mg/kg或更高。在特定實施方案中，劑量的范圍可為0.1μg/kg直至約30mg/kg，任選地1μg/kg直至約30mg/kg或10μg/kg直至約5mg/kg。

給藥頻率將取決于所用制劑中的特定c5抗體的藥物動力學(xué)參數(shù)。通常，臨床醫(yī)師施用組合物直至達(dá)到實現(xiàn)所需效應(yīng)的劑量。因此，組合物可以單次劑量形式，或隨時間以兩次或更多次劑量(其可含有或可不含有相同量的所需分子)形式，或以通過植入裝置或?qū)Ч艿倪B續(xù)輸注形式施用。適當(dāng)劑量的進(jìn)一步細(xì)化由本領(lǐng)域普通技術(shù)人員按常規(guī)方式進(jìn)行并且處于由其常規(guī)執(zhí)行的任務(wù)范圍內(nèi)。適當(dāng)?shù)膭┝靠赏ㄟ^使用適當(dāng)?shù)膭┝?反應(yīng)數(shù)據(jù)來確定。在某些實施方案中，本公開的抗體可在整個延長時期期間向患者施用。本公開的抗體的長期施用最小化通常與非完全人類抗體相關(guān)聯(lián)的不良免疫反應(yīng)或變態(tài)反應(yīng)，所述抗體例如針對非人動物中的人抗原產(chǎn)生的抗體，例如在非人物種中產(chǎn)生的非完全人抗體或非人抗體。

藥物組合物的施用途徑是依照已知方法，例如經(jīng)口；通過由靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、腦內(nèi)(實質(zhì)內(nèi))、腦室內(nèi)、肌肉內(nèi)、眼內(nèi)、玻璃體內(nèi)、視網(wǎng)膜下、動脈內(nèi)、門靜脈內(nèi)或病變內(nèi)途徑達(dá)成的注射；通過持續(xù)釋放系統(tǒng)或通過植入裝置。在某些實施方案中，組合物可通過快速濃注施用，或通過輸注連續(xù)施用，或通過植入裝置施用。

所述藥物組合物也可經(jīng)由植入其上已吸收或囊封期望分子的膜、海綿或另一合適材料來局部施用。在某些實施方案中，當(dāng)使用植入裝置時，所述裝置可植入到任何適合的組織或器官中，并且所要分子的遞送可經(jīng)由擴(kuò)散、定時釋放推注或連續(xù)施用來達(dá)成。對于眼部植入物，所述植入物可經(jīng)由眼部注射、玻璃體內(nèi)注射、視網(wǎng)膜下注射、脈絡(luò)膜上腔注射、球后注射或注射到眼球囊下間隙來植入。

也可合乎需要的是離體使用根據(jù)本公開的c5抗體藥物組合物。在此類情況下，將已從患者中取出的細(xì)胞、組織或器官暴露于c5抗體藥物組合物，然后再將所述細(xì)胞、組織和/或器官植入回患者中。

特別地，可使用諸如本文所述的那些方法等方法通過植入某些已遺傳工程改造為表達(dá)并分泌c5抗體的細(xì)胞來遞送c5抗體。在某些實施方案中，此類細(xì)胞可以是動物細(xì)胞或人類細(xì)胞，并且可以是自體的、異體的或異種的。在某些實施方案中，細(xì)胞可以是永生化的。在其他實施方案中，為降低免疫反應(yīng)的機(jī)會，可將所述細(xì)胞囊封以避免周圍組織的浸潤。在另外的實施方案中，囊封材料通常為允許蛋白產(chǎn)物釋放但防止患者的免疫系統(tǒng)或來自周圍組織的其他有害因素破壞細(xì)胞的生物兼容性、半透性聚合外套或膜。

本說明書的主體內(nèi)引用的所有參考文獻(xiàn)均以引用的方式明確整體并入本文。

實施例

僅出于說明的目的提供以下實施例(包括進(jìn)行的實驗和達(dá)成的結(jié)果)并且不欲解釋為限制本公開。

實施例1–免疫和雜交瘤形成

對于雜交瘤和單克隆抗體的產(chǎn)生，基本上如下所述地進(jìn)行免疫和篩選：antibodies,alaboratorymannual,coldspringharborlaboratory。對如本申請所述的抗-c5單克隆抗體的產(chǎn)生特異的程序簡要描述如下：通過足墊注射使用75μg在完全弗氏佐劑中的人c5(目錄號a403)，接著在第28天通過使用具有不完全弗氏佐劑的75μgc5蛋白質(zhì)進(jìn)行腹膜內(nèi)(i.p.)施用來依次進(jìn)行第二次強(qiáng)化，從而免疫補(bǔ)體c5(jacksonbarharbormaine)缺陷型b10.d2-hc^oh2^dh2-t18c/02snj小鼠。在二次強(qiáng)化后9-10天進(jìn)行用于針對c5蛋白的反應(yīng)性的血清滴度的elisa篩選。對于初始組的融合物，在第82天、第83天和第84天用融合強(qiáng)化物(在pbs中的75μgc5，i.p.)免疫顯示有利滴度的小鼠，其中在第85天脾臟使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)融合到sp2/0小鼠骨髓瘤中。在第68天和第175天進(jìn)一步免疫第二組小鼠，接著在第195天、第196天和第197天進(jìn)行融合強(qiáng)化，其中在第198天進(jìn)行融合。在融合后18天通過elisa篩選所有融合物孔針對c5蛋白的反應(yīng)性并且使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)亞克隆陽性雜交瘤，以允許衍生單克隆抗體。

實施例2–雜交瘤培養(yǎng)

在含有15％fetalcloneii、opi、hat、非必需氨基酸和重組小鼠il-6的dmem中維持雜交瘤。通過酶聯(lián)免疫測定(elisa)篩選雜交瘤上清液，以檢測抗人c5抗體。在含有15％fetalcloneii、opi和非必需氨基酸的dmem中擴(kuò)增c5的陽性培養(yǎng)物，并且通過有效稀釋亞克隆兩次。根據(jù)制造商方案亞克隆雜交瘤與sbaclonotypingsystem/hrp(southernbiotech)為同種型。

實施例3–單克隆可變重鏈和輕鏈結(jié)構(gòu)域的克隆和序列測定

在重新進(jìn)行rt-pcr擴(kuò)增之后，克隆可變輕鏈(vl)和重鏈(vh)結(jié)構(gòu)域。簡言之，使用總rna分離試劑盒從選定的亞克隆雜交瘤細(xì)胞系分離總rna。使用第一鏈cdna合成試劑盒進(jìn)行cdna合成。正向引物對于vl區(qū)和vh區(qū)的n末端氨基酸序列特異，并且lc和hc反向引物被設(shè)計為使恒定輕鏈結(jié)構(gòu)域(cl)和恒定重鏈結(jié)構(gòu)域1(ch1)中的區(qū)域退火。用于重新克隆的引物列出如下。分離擴(kuò)增的vl或vh片段并且將其亞克隆到載體(life)并且使用標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行測序。

如下進(jìn)行pcr：

cdna5μl

10xpcr緩沖液5μl

dntp1μl

引物混合物2.5μl

聚合酶1μl

dh2o35.5μl

總體積，50μl

實施例4–抗-c5抑制活性篩選(ch50溶血測定)

通過在37℃下將抗rbc基質(zhì)抗體孵育1小時(sigmaaldrich，目錄號s8014)接著洗滌來激發(fā)羊紅血細(xì)胞(rbc)(innovativeresearchic100-0210)并且以5x10⁸/ml的濃度使其重懸于gvb++緩沖液中，并存儲在4℃下直到使用為止。對于溶血活性的分析，在人血清存在下在gvb++緩沖液中將rbc稀釋至4.1x10⁷/ml最終濃度，接著在37℃下孵育1小時。通過在4℃下以10,000xg沉淀未裂解rbc和細(xì)胞碎片并且經(jīng)由監(jiān)控541nm處的吸光度以測量上清液中釋放的血紅蛋白水平來確定溶血活性水平。在檢查抗體功能活性的研究中，在4℃下將血清和抗體孵育20分鐘，之后添加到紅血細(xì)胞中。對于測試雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的活性，在4℃下用1:1比率的gvb緩沖液中的3％nhs孵育上清液60分鐘，之后添加到激發(fā)的rbc中。對照包含單獨的血清(陽性對照)、dh2o(100％裂解物)和血清+edta10mm(陰性對照)。對于替代途徑的分析，使用gvb+10mmegta(bostonbioproductsibb-310)和c1q缺陷性人血清(quidel,a509)。在一些測定中，用羊紅血細(xì)胞取代未激發(fā)的兔紅血細(xì)胞(1x10⁷)并且在含有0.5mmegta的gvb緩沖液(bostonbioproductsibb-310)存在下進(jìn)行測定。

圖3為用于選定的許多篩選的克隆的溶血測定結(jié)果的圖示。克隆5b201與5d7-5之間的黑線表示來自商購的小鼠單克隆抗體a239(quidela239)的結(jié)果。從此線左側(cè)的克隆表示顯示更高/更好補(bǔ)體激活抑制(其導(dǎo)致細(xì)胞裂解)的抗體。特別感興趣的一個亞克隆為10c9(以及后代，它具有名稱10c9-x，其中x表示來自親代的不同亞克隆數(shù)目)。

實施例5–抗-c5抑制活性篩選(igmelisa測定)

在4℃下用涂覆緩沖液ph9.5中的2μg/ml人igm(bd-biosciences51-2713kc)涂覆96-孔eia板(costar#3590)過夜。用洗滌緩沖液(bd-biosciences51-9003739)洗滌板。將血清在gvb(bd-biosciences51-2713kc)中稀釋至2％并且與不同濃度的雜交瘤上清液或純化的igg組合并在4℃下孵育20分鐘。在孵育時段之后，將100ul血清/抗體混合物添加到洗滌的igm涂覆板中并且在37℃下孵育1小時。在孵育時段之后，將板用洗滌緩沖液洗滌三次并且然后在室溫下用測定稀釋液(bd-biosciences51-2641kc)中以1:10.000稀釋的抗-c5b-9小鼠單克隆抗體(quidela239)孵育30分鐘。在孵育后，將板洗滌三次并且然后用在測定稀釋液中1:3000稀釋的山羊抗小鼠hrp綴合物探測。將板孵育30分鐘并且以洗滌緩沖液洗滌三次，并通過添加底物(bd-biosciences51-2606kz和bd-biosciences51-2607kz)接著在室溫下孵育10分鐘之后添加終止溶液(bd-biosciences51-2608kz)來檢測信號。然后通過讀取在450nm處的吸收度來測定補(bǔ)體激活水平。

圖5a、圖5b和圖5c示出使用全血清進(jìn)行的igmelisa的結(jié)果，其中所有補(bǔ)體途徑均具有活性；使用c2缺陷型血清進(jìn)行的igmelisa的結(jié)果，其中僅替代途徑具有活性；以及使用因子b缺陷型血清進(jìn)行的igmelisa的結(jié)果，其中經(jīng)典途徑和凝集素途徑具有活性。針對c5(圖5a-圖5c中標(biāo)記的抗-c5)的a239抗體(quidela239)充當(dāng)陰性對照。抗因子d抗體(圖5a-圖5c中標(biāo)記的抗-fd)充當(dāng)替代途徑中的陽性對照比較物(圖5b)?？傊?，10c9-19抗體在所有三種條件血清條件下同樣良好地進(jìn)行。

實施例6–抗-c5elisa

在4℃下用涂覆緩沖液ph9.5.(bd-biosciences51-2713kc)中的1μg/ml人c5涂覆96-孔eia板(costar#3590)過夜。在幾天后，洗滌板。用洗滌緩沖液(bd-biosciences51-9003739)洗滌板，并且然后用測定稀釋液封閉30分鐘(bd-biosciences51-2641kc)。然后在測定稀釋液中稀釋純化的單克隆抗體或雜交瘤上清液并且將其添加到先前涂覆有c5的孔中，并且在室溫下孵育60分鐘。將板洗滌3次并且使用小鼠hpr綴合二級抗體和底物檢測結(jié)合的單克隆抗體水平。通過測量在450nm處的吸光度來測定結(jié)合抗體的水平。圖7為使用選定的單克隆抗體/雜交瘤上清液的c5結(jié)合的圖示。

實施例7–不溶性c5b-9測定的檢測

在4℃下用涂覆緩沖液ph9.5.中的2μg/ml人igmigm(v)(bd-biosciences51-2713kc)涂覆96-孔eia板(costar#3590)過夜。用洗滌緩沖液(bd-biosciences51-9003739)洗滌板。將正常人血清在gvb(bd-biosciences51-2713kc)中稀釋至2％并且將100μl血清/gvb混合物添加到洗滌的igm涂覆的板中并在37℃下孵育1小時。在孵育時段之后，將板用洗滌緩沖液洗滌三次并且然后用在測定緩沖液中稀釋至如附圖所指示的濃度的抗-c5單克隆抗體孵育。在孵育后，將板洗滌三次并且然后用在測定稀釋液中1:3000稀釋的抗小鼠hrp綴合物二級抗體探測30分鐘，接著用洗滌緩沖液洗滌三次。然后通過添加底物(bd-biosciences51-2606kz和bd-biosciences51-2607kz)接著在室溫下孵育10分鐘之后添加終止溶液(bd-biosciences51-2608kz)來檢測結(jié)合抗體。然后通過讀取在450nm處的吸收度來測定補(bǔ)體激活水平。

圖10示出所述結(jié)果的圖示。在篩選的單克隆抗體中，10c9-19r(r用于指示所使用的抗體為10c9-19克隆的重組版本)不結(jié)合于不溶性c5b9。這與以下假設(shè)一致：此抗體在并入mac之后并不識別或結(jié)合c5。

實施例8–可溶性c5b-9的檢測

將胺反應(yīng)尖端(ar2g)(18-5092)用于固定octetred96中的抗體。在裝料盤中，首先將ar2g尖端在ddh20中再水合10分鐘。在開始o(jì)ctet方案后，然后將尖端轉(zhuǎn)移到ddh20的次級水合溶液中60秒，以確定不存在異常讀數(shù)。在再水合之后，在新鮮混合的20mm1-乙基-3-[3-二甲基氨基丙基]碳二亞胺鹽酸鹽(edc)、10mm磺基-n-羥基硫代琥珀酰亞胺(s-nhs)中將所述尖端激活300秒。將結(jié)合至ar2g尖端的抗體以ph5.0的10mm乙酸鈉中稀釋至20μg/ml。在ar2g尖端激活后，將它們置于抗體溶液中600秒。然后將所述尖端在ph8.5的1m乙醇胺中淬火300秒。在淬火后，將所述尖端移入到kinetics緩沖液中120秒，以獲得基線讀數(shù)。將可溶性c5b-9(comptech,a127)以kinetics緩沖液(kb)稀釋至30μg/ml。在基線后，將抗體結(jié)合尖端置于可溶性c5b-9溶液中300秒，以測量締合。最后將所述尖端返回到kb溶液中，在所述溶液中基線已得到測量并且斷開締合步驟已測量600秒。將締合300秒時與基線偏離水平用作結(jié)合親和力的指示。在96孔平底黑板中，所有使用的溶液均為每孔200μl體積(greinerbio-one,655209)。在1000rpm和30℃下進(jìn)行octet方案。

結(jié)果示出在圖11a和圖11b中。quidela239抗體(圖11a和圖11b中標(biāo)記的a239)當(dāng)它結(jié)合于c5b-9(mac的一部分)時充當(dāng)陽性對照。根據(jù)結(jié)果，正如預(yù)期，使用10c9-19r抗體觀察到?jīng)]有結(jié)合/極少的結(jié)合。這與以下假設(shè)一致：10c9(及其后代/亞克隆)不結(jié)合于可溶性c5b-9。

實施例9–c5a產(chǎn)生測定

在4℃下用涂覆緩沖液ph9.5.中的2μg/ml人igm(bd-biosciences51-2713kc)涂覆96-孔eia板(costar#3590)過夜。用洗滌緩沖液(bd-biosciences51-9003739)洗滌板。在純化的igg(抗-c5抗體)存在或不存在下將血清在gvb(bd-biosciences51-2713kc)中稀釋至10％并且在4℃下孵育20分鐘。在孵育時段之后，將100μl血清/抗體混合物添加到洗滌的igm涂覆板中并在37℃下孵育1小時。在孵育之后，收集上清液。然后使用microvuec5aeiakit(quidel，目錄號a021)測定上清液中的c5a水平。

圖6a、圖6b和圖6c示出測定的結(jié)果。圖6a示出對于篩選的選定抗-c5抗體的上清液中的c5a水平。黑色水平線描繪了背景水平。如由圖表中看出，一些抗體比阻斷c5a形成中的其他抗體更好。圖6b比較c5a形成中的10c9-19抗體。如由圖表中看出，msigg條件充當(dāng)陽性對照并且“無cvf”(無眼鏡蛇毒因子)對照充當(dāng)無蛋白酶陰性對照。在5μg/ml濃度下，另一種抗-c5抗體8c7-26抑制c5a形成，但在0.05ug/ml濃度下并不抑制c5a形成。然而，10c9-19在5μg/ml濃度或在0.05ug/ml濃度下均不抑制c5a形成。

實施例10–統(tǒng)計分析

以下描述抑制百分比和其他統(tǒng)計分析如何在此實施例部分中包括的實驗中進(jìn)行。

溶血測定：抑制％＝1-((t-n)/(p-n))*100

t為測試od(在測定期間釋放的血紅蛋白的水平)

n＝陰性對照od(在其中補(bǔ)體激活已通過將edta增加至10mm來阻斷的條件下在測定內(nèi)的血紅蛋白釋放)

p＝陽性對照od(當(dāng)紅細(xì)胞在血清存在下在抑制劑不存在下孵育時的血紅蛋白釋放，這表示100％活性)。

z-因子：z-因子＝1-((3*(dp-dn))/(abs(mp-mn)))，其中dp為陽性對照的標(biāo)準(zhǔn)偏差，dn為陰性對照的標(biāo)準(zhǔn)偏差，mp為陽性對照的平均值，并且mn為陰性對照的平均值。

曲線擬合(graphpadprism)ic90：y＝y(tǒng)最小+(y最大-y最小)/(1+10^(ecx-x)*m))，其中ecx為logic90-(1/m)*log(90/(100-90))。

實施例11–c5缺陷型小鼠的免疫

c5缺陷型小鼠的免疫允許產(chǎn)生能夠抑制補(bǔ)體介導(dǎo)的紅血細(xì)胞裂解的雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清液，如通過ch50溶血測定確定的。通過選定雜交瘤的反應(yīng)比使用常規(guī)商業(yè)上可獲得的抗體時所見的反應(yīng)大得多，如通過圖3的黑線指示的。

具有依次純化的igg的初代雜交瘤的擴(kuò)增和克隆允許通過滴定igg的濃度來分析阻斷補(bǔ)體介導(dǎo)型細(xì)胞裂解中的功能和功效。獲得對給定單克隆抗體抑制補(bǔ)體介導(dǎo)型細(xì)胞裂解的相對功效的更充分理解，如圖4a和圖4b中所示的。

抗c5單克隆抗體的功能活性可基于用于抑制選定補(bǔ)體途徑的功效來表征。抑制性抗體基于它們所抑制的特定抗體來選擇，如圖5a、圖5b和圖5c中所示的。

阻斷細(xì)胞裂解可通過防止膜攻擊復(fù)合物組裝或通過經(jīng)由c5轉(zhuǎn)化酶阻斷c5轉(zhuǎn)化成c5b來發(fā)生。進(jìn)一步表征允許檢查抑制機(jī)制，即在抑制試劑破壞c5的蛋白水解切割從而導(dǎo)致c5b產(chǎn)生并且破壞c5b-9復(fù)合物的組裝或者僅阻斷c5b-9復(fù)合物的組裝而不阻斷c5a的產(chǎn)生的情況下。在后一種情況下，阻斷轉(zhuǎn)化酶活性的抑制劑的鑒定通過檢查必須為c5b產(chǎn)生中的產(chǎn)物的c5a的產(chǎn)生來鑒定。這通過檢查單點測定或者通過滴定抗體來實現(xiàn)，如圖6a、圖6b和圖6b中所示。

c5的單克隆抗體的特異性通過檢查它與直接涂覆在elisa板上的c5的相互作用劑量依賴性相互作用，如圖7所示。

進(jìn)一步表征可通過使用生物層干涉測量法(bli)研究單克隆抗體的親和力以鑒定單克隆抗體的kd值和相對親和力來發(fā)生，如圖8所示。另外的表征通過研究單克隆抗體與溶液中c5蛋白的結(jié)合性來獲得，如圖9所示。

實施例12–c5抗體的選擇

一個優(yōu)選的實施方案為對于一旦并入膜攻擊復(fù)合物就不識別c5的抗體的選擇。根據(jù)當(dāng)在用igm進(jìn)行補(bǔ)體激活之后沉積到elisa板底部時識別c5b-9復(fù)合物內(nèi)的c5的能力檢查單克隆抗體，如圖10所示。

與c5b-9內(nèi)的c5的其他交叉反應(yīng)性通過使用生物層干涉測量法(bli)檢查單克隆抗體結(jié)合可溶性c5b-9的能力并且測定偏離水平來鑒定，如圖11所示。

實施例13–人源化抗體的產(chǎn)生

選擇前導(dǎo)抗體并對其進(jìn)行人源化。將嚴(yán)格內(nèi)容優(yōu)化(stringcontentoptimization)的人源化方法(lazar等，us7657380b2，2010年2月2日授權(quán)；us7930107b2，2011年4月19日授權(quán)；us20060008883a1，2004年12月3日提交；us20080167449a1，2007年10月31日提交；us20110236969a1，2011年3月21日提交；us20100190247a1，2012年3月12日提交，所有專利均以引用的方式整體并入)應(yīng)用于小鼠10c9抗體。選定的人源化序列列出在seqidno:1-12和表2中。

使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，產(chǎn)生igg。在圖12a、圖12b和圖12c中示出使用以上實施例6所述的elisa測定獲得的全長抗體的抑制百分比。另外，使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)產(chǎn)生fab片段并且使用實施例6所述的elisa測定知道，它們的活性類似于親代分子的活性。在圖13a、圖13b和圖13c中示出所述結(jié)果的圖示。

實施例14–使用c5抗體預(yù)防c5b-9在視網(wǎng)膜和脈絡(luò)膜組織中的沉積

另外，化合物通過玻璃體內(nèi)遞送產(chǎn)生的阻斷視網(wǎng)膜和脈絡(luò)膜組織中的c5b-9形成的治療可能性可通過使用導(dǎo)致感興趣的組織中的補(bǔ)體激活的標(biāo)準(zhǔn)模型來評定，如al-78898ainhibitscomplementdepositioninaprimatelightdamagemodel,arvoaba3872012中所提供的。由小鼠單克隆抗體亞克隆10c9人源化產(chǎn)生人源化h5l2(分別為seqidno:10和seqidno:2)抗體。在非人靈長類輕度損傷模型中測試h5l2。h5l2抗體的玻璃體內(nèi)給藥提供阻斷視網(wǎng)膜內(nèi)補(bǔ)體沉積的功效，這比得上陰性對照(pbs，無輕度損傷，標(biāo)記為“pbsnobl”)。還使用具有輕度損傷的pbs的陽性對照(標(biāo)記為“pbs”)。在圖14a(視網(wǎng)膜)和圖14b(脈絡(luò)膜)中示出所述結(jié)果的圖示。這些數(shù)據(jù)表明h5l2抗體的局部遞送在與黃斑變性和其他眼部適應(yīng)癥的治療的體內(nèi)模型中是有效的。