發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及抗體，所述抗體包含經(jīng)修飾的恒定區(qū)以允許抗體與有效負載如放射性核素，聚合物，細胞毒性劑或藥物部分綴合。優(yōu)選地，綴合的抗體產(chǎn)生期望的有效負載與抗體的比率。本發(fā)明的各方面涉及有效負載-抗體綴合物。發(fā)明背景抗體-藥物綴合物(antibody-drugconjugates,adc)是一類靶向治療，其將抗體的特異性與細胞毒性治療劑的細胞毒性相結(jié)合。adc主要被認為是治療各種癌癥的候選物。adc包含與治療藥物連接的抗體。開發(fā)adc的一個問題是使用的綴合技術(shù)；如果藥物與抗體中的半胱氨酸或賴氨酸殘基非選擇性綴合，則可能導(dǎo)致adc的異質(zhì)混合物。這種方法導(dǎo)致次優(yōu)的安全性和有效性，并使得優(yōu)化adc的生物學(xué)，物理和藥理學(xué)特性成為挑戰(zhàn)。特別地，異質(zhì)性對于細胞毒素的分布(即附著位點)以及細胞毒素的加載(即，每抗體的藥物分子數(shù))可成為一個問題。異質(zhì)性提出了安全性擔(dān)憂，因為高藥物/抗體比(drug/antibodyratio,dar)種類與其靶標的結(jié)合能力差，并增加脫靶毒性的風(fēng)險。低藥物負載種類活性較低(dar1)或無活性(dar0)。隨著每mab的藥物數(shù)量的減少，adc的藥代動力學(xué)特性提高(hamblett,clin.cancerres.2004,10,7063-7070)。此外，adc的異質(zhì)性導(dǎo)致與一致的制造和分析測試相關(guān)的挑戰(zhàn)。位點選擇性綴合(site-selectiveconjugation,ssc)可能會提高adc的安全性和有效性，從而導(dǎo)致更高的adc質(zhì)量。junutula等人naturebiotech2008報道，與對照相比，通過ssc-adc中的半adc劑量達到相同的活性。因此，adc均質(zhì)性將提高治療指數(shù)(ti是最大耐受劑量和有效劑量之間的比率)(ti＝td50/ed50))。此外，更高的dar均質(zhì)性將導(dǎo)致：-關(guān)于管理存檔的更簡單的產(chǎn)品鑒定，更明確的產(chǎn)品規(guī)格和-減少脫靶或旁觀者的毒性-潛在的更受控制的藥理學(xué)(要估計的種類較少)-可能降低達到類似的藥理作用的劑量要求(每克)-降低潛在的副作用(如免疫原性，毒性等)的發(fā)生率-由于更高的綴合產(chǎn)率和減少的劑量(所需施用的adc量)，降低成本。然而，簡單地制備具有修飾殘基的抗體可能導(dǎo)致不可預(yù)見的作用，例如抗體聚集傾向，溶解度或功效的變化。因此，本申請人開發(fā)了合理的篩選方法以確定哪些殘基可以被修飾。在選擇的實施方案中，修飾實現(xiàn)了適于與有效負載(例如藥物)綴合的抗體以產(chǎn)生約2的dar。發(fā)明概述根據(jù)本發(fā)明的第一方面，提供了具有可變區(qū)和恒定區(qū)的抗體或其片段或衍生物，所述可變區(qū)結(jié)合靶標分子，其中恒定區(qū)包含一個或多個突變，所述突變引入所選擇的位點特異性的綴合位點，以允許所述抗體、片段或衍生物與有效負載綴合，其中所述一個或多個突變包括輕鏈位置180(位置編號)處的突變?？贵w可以包含兩個引入的位點特異性綴合位點。在優(yōu)選的實施方案中，位置180處的野生型殘基是t。在位置180處的突變殘基優(yōu)選選自半胱氨酸，賴氨酸，谷氨酰胺或非天然氨基酸，并且最優(yōu)選半胱氨酸。在某些實施方案中，抗體還可包含選自根據(jù)位置編號約定的輕鏈(lc)s208，lcs171，lcs182，lca184，lcv191，lcs202，lcs203，lct206，重鏈(hc)s160，hct190，hcs443，hcs447，hcs139，hcs168，hcv170，hcv176，hct200，hcs445的一個或多個突變。優(yōu)選的突變位于選自殘基206(輕鏈)，160，190，443和447(重鏈)(位置編號)的一個或多個位置。突變的殘基優(yōu)選獨立地選自半胱氨酸，賴氨酸，谷氨酰胺或非天然氨基酸，并且最優(yōu)選半胱氨酸。例如，在wo2013/185115中描述了用非天然氨基酸修飾抗體。根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供了具有可變區(qū)和恒定區(qū)的抗體或其片段或衍生物，所述可變區(qū)結(jié)合靶標分子，其中恒定區(qū)包含一個或多個突變，所述突變引入所選擇的位點特異性的綴合位點，以允許所述抗體、片段或衍生物與有效負載綴合，其中所述抗體包含seqidno33的氨基酸序列；其中x選自c，k，q或非天然氨基酸?？贵w可以進一步包含一個或多個選自seqidno22-32和seqidno34-40的氨基酸序列；其中每個x獨立地選自c，k，q或非天然氨基酸，并且最優(yōu)選半胱氨酸。根據(jù)本發(fā)明的第二方面，提供了具有可變區(qū)和恒定區(qū)的抗體或其片段或衍生物，所述可變區(qū)結(jié)合靶標分子，其中恒定區(qū)包含一個或多個突變，所述突變引入所選擇的位點特異性的綴合位點，以允許所述抗體、片段或衍生物與有效負載綴合，其中所述一個或多個突變包括輕鏈位置208(位置編號)處的突變?？贵w可以包含兩個引入的位點特異性綴合位點。在優(yōu)選的實施方案中，位置208處的野生型殘基是s。在位置208的突變殘基優(yōu)選選自半胱氨酸，賴氨酸，谷氨酰胺或非天然氨基酸，并且最優(yōu)選半胱氨酸。在某些實施方案中，抗體還可包含選自根據(jù)位置編號約定(convention)的輕鏈(lc)t208,lcs171,lcs182,lca184,lcv191,lcs202,lcs203,lct206,重鏈(hc)s160,hct190,hcs443,hcs447,hcs139,hcs168,hcv170,hcv176,hct200,hcs445的一個或多個突變。優(yōu)選的突變位于選自殘基180，206(輕鏈)，160，190，443和447(重鏈)(位置編號)的一個或多個位置。突變的殘基優(yōu)選獨立地選自半胱氨酸，賴氨酸，谷氨酰胺或非天然氨基酸，并且最優(yōu)選半胱氨酸。例如，在wo2013/185115中描述了用非天然氨基酸修飾抗體。根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供了具有可變區(qū)和恒定區(qū)的抗體或其片段或衍生物，所述可變區(qū)結(jié)合靶標分子，其中恒定區(qū)包含一個或多個突變，所述突變引入所選擇的位點特異性的綴合位點，以允許所述抗體、片段或衍生物與有效負載綴合，其中所述抗體包含seqidno40的氨基酸序列；其中x選自c，k，q或非天然氨基酸。抗體可以進一步包含一個或多個選自seqidno22-39的氨基酸序列；其中每個x獨立地選自c，k，q或非天然氨基酸，并且最優(yōu)選半胱氨酸。本發(fā)明還提供了分離的或工程改造的具有可變區(qū)和恒定區(qū)的抗體或其片段或衍生物，所述可變區(qū)結(jié)合靶標分子，其中恒定區(qū)包含一個或多個突變，通過下述方式引入位點特異性的綴合位點：a)將選自由根據(jù)位置編號約定的輕鏈(lc)t180，lcs208，lcs171，lcs182，lca184，lcv191，lcs202，lcs203，lct206，重鏈(hc)s160，hct190，hcs443，hcs447，hcs139，hcs168，hcv170，hcv176，hct200，hcs445組成的組的殘基用半胱氨酸殘基，賴氨酸殘基，谷氨酰胺殘基或非天然氨基酸置換；或者b)在選自由根據(jù)位置編號約定的lct180c，lcs208c，lcs171c，lcs182c，lca184c，lcv191c，lcs202c，lcs203c，lct206c，hcs160c，hct190c，hcs443c，hcs447c，hcs139c，hcs168c，hcv170c，hcv176c，hct200c，hcs445c組成的組的殘基處引入半胱氨酸置換；或者c)包含至少一個選自由seqidno22至40組成的組的氨基酸序列，其中x是半胱氨酸殘基，賴氨酸殘基，谷氨酰胺殘基或非天然氨基酸；或者d)包含至少一個選自由seqidno22至40組成的組的氨基酸序列，其中x是半胱氨酸殘基。本發(fā)明還提供了具有可變區(qū)和恒定區(qū)的抗體或其片段或衍生物，所述可變區(qū)結(jié)合靶標分子，其中恒定區(qū)包含一個或多個突變，所述突變引入所選擇的位點特異性的綴合位點，以允許所述抗體、片段或衍生物與有效負載綴合，其中所述抗體包括包含seqidno14的殘基109-214的氨基酸序列的輕鏈恒定區(qū)。本發(fā)明還提供了具有可變區(qū)和恒定區(qū)的抗體或其片段或衍生物，所述可變區(qū)結(jié)合靶標分子，其中恒定區(qū)包含一個或多個突變，所述突變引入所選擇的位點特異性的綴合位點，以允許所述抗體、片段或衍生物與有效負載綴合，其中所述抗體包括包含seqidno21的殘基109-214的氨基酸序列的輕鏈恒定區(qū)。以下特征可以應(yīng)用于本發(fā)明的所有方面?？贵w優(yōu)選選自包括igg1，igg2，igg3和igg4的組。輕鏈可以是κ或λ輕鏈，輕鏈恒定區(qū)可以是ckappa(ck)或clambda(cλ)。恒定區(qū)可以包含1gg1恒定區(qū)的至少一部分，優(yōu)選1gg1恒定區(qū)的ck，ch1和ch3結(jié)構(gòu)域中的一個或多個，優(yōu)選全部。抗體可以選自由fab，雙特異性抗體片段(串聯(lián)scfv-fc，scfv-fc凸起-進入-孔洞(knobs-into-holes)，scfv-fc-scfv,f(ab’)2,fab-scfv,(fab’scfv)2,sc雙抗體-fc或sc雙抗體-ch3)，基于igg的雙特異性抗體(雜交體雜交瘤，具有普通輕鏈的凸起-進入-孔洞，二合一igg，雙v結(jié)構(gòu)域igg，igg-scfv，scfv-igg，igg-v，v-igg)，小抗體(minibody)，tribi-小抗體，納米抗體和二-雙抗體(di-diabody)?？贵w可以是人的，人源化的或嵌合的。優(yōu)選的抗體選自阿昔單抗(abciximab)；利妥昔單抗(rituximab)；巴利昔單抗(basiliximab)；達克珠單抗(daclizumab)；帕利珠單抗(palivizumab)；英利昔單抗(infliximab)；曲妥珠單抗(trastuzumab)；阿侖珠單抗(alemtuzumab)；阿達木單抗(adalimumab)；依法珠單抗(efalizumab)；西妥昔單抗(cetuximab)；替伊莫單抗(ibritumomab)；奧馬珠單抗(omalizumab)；貝伐珠單抗(bevacizumab)；雷珠單抗(ranibizumab)；戈利木單抗(golimumab)；canakinumab；ustekinumab；托珠單抗(tocilizumab)；奧法木單抗(ofatumumab)；貝利木單抗(belimumab)；伊匹木單抗(ipilimumab)；brentuximab；帕妥珠單抗(pertuzumab)；raxibacumab；vedolizumab；ramucirumab；obinutuzumab；siltuximab；secukinumab；dinutuximab。抗體可以缺乏一種或多種fc效應(yīng)子功能；可以缺乏adcc活性；或可以具有增加adcc活性。本發(fā)明的另一方面提供了具有可變區(qū)和恒定區(qū)的抗體或其片段或衍生物，所述可變區(qū)結(jié)合靶標分子，其中恒定區(qū)包含一個或多個突變，所述突變引入所選擇的位點特異性的綴合位點，以允許所述抗體、片段或衍生物與有效負載綴合，其中所述抗體包括包含seqidno14的氨基酸序列的輕鏈?？贵w可以包括重鏈，其包含選自seqidno2至seqidno12的氨基酸序列。在本發(fā)明的另一方面，提供了具有可變區(qū)和恒定區(qū)的抗體或其片段或衍生物，所述可變區(qū)結(jié)合靶標分子，其中恒定區(qū)包含一個或多個突變，所述突變引入所選擇的位點特異性的綴合位點，以允許所述抗體、片段或衍生物與有效負載綴合，其中所述抗體包括包含seqidno21的氨基酸序列的輕鏈?？贵w可以包括重鏈，其包含選自seqidno2至seqidno12的氨基酸序列。本發(fā)明還提供了免疫綴合物，其包含根據(jù)本發(fā)明前述方面任一項的抗體，有效負載和將有效負載連接到抗體的接頭。接頭可以選自6-馬來酰亞氨基己?；?mc)，馬來酰亞胺丙?；?mp)，纈氨酸-瓜氨酸(val-cit)，丙氨酸-苯丙氨酸(ala-phe)，p-氨基芐氧基羰基(pab)，4-(2-吡啶基硫代)戊酸n-琥珀酰亞胺酯(spp)，4-(n-馬來酰亞胺基甲基)環(huán)己烷-1-羧酸n-琥珀酰亞胺酯(smcc)，(4-碘-乙酰基)氨基苯甲酸n-琥珀酰亞胺酯(siab)和6-馬來酰亞氨基己?；?纈氨酸-瓜氨酸-p-氨基苯甲酸氧基羰基(mc-vc-pab)；或者是分支接頭，其包括肽鏈，并來源于o-羥基p-氨基芐醇，其中所述肽鏈通過p-氨基連接到苯環(huán)，有效負載通過芐醇部分連接到苯環(huán)，并且抗體通過o-羥基與苯環(huán)連接。有效負載可以選自由以下組成的組：放射性核素，化學(xué)治療劑，細胞毒性劑，微生物毒素，植物毒素，聚合物，碳水化合物，細胞因子，熒光標記，發(fā)光標記，酶底物標記，酶，肽，肽模擬物，核苷酸，sirna，微小rna，rna模擬物和適體。優(yōu)選的聚合物是peg分子。其他優(yōu)選的有效負載包括90y，131i，67cu，177lu，213bi，211at，多拉司他汀，vedotin，單甲基auristatinf，美坦生類化合物，包括dm1和dm4，duocarmycin類似物，刺孢霉素，吡咯并苯并二氮centanamycin，伊立替康和多柔比星，假單胞菌外毒素a，白喉毒素，蓖麻毒蛋白，聚乙二醇，羥乙基淀粉和甘露糖基殘基。有效負載可以是微管破壞劑或dna修飾劑。本發(fā)明進一步提供了包含根據(jù)上述方面任一項的抗體或免疫綴合物和藥學(xué)上可接受的稀釋劑、載體或賦形劑的藥物組合物。還提供了產(chǎn)生免疫綴合物的方法，所述方法包括將根據(jù)上述任一方面的抗體與有效負載綴合。制備抗體的方法可以包括：(i)通過用突變殘基替換一個或多個氨基酸殘基來誘變親本抗體的核酸序列以編碼抗體；(ii)表達突變抗體；和(iii)分離突變抗體?？乖梢栽谠?例如大腸桿菌(e.coli)或芽孢桿菌(bacillus))或真核細胞(例如酵母(畢赤酵母屬(pichia)，酵母屬(saccharomyces)，漢森酵母屬(hansenula)，耶氏酵母屬(yarrowia))或哺乳動物細胞(cho細胞，nso細胞，sp2/0細胞，293細胞)或昆蟲細胞(sf9細胞)。該方法還可以包括：(i)使突變抗體與硫醇反應(yīng)性(thiol-reactive)親和試劑反應(yīng)以產(chǎn)生親和標記的抗體；和(ii)測量親和標記的抗體與捕獲介質(zhì)的結(jié)合。本發(fā)明的其它方面提供了具有可變區(qū)和恒定區(qū)的抗體或其片段或衍生物，所述可變區(qū)結(jié)合靶標分子，其中恒定區(qū)包含一個或多個突變，所述突變引入所選擇的位點特異性的綴合位點，以允許所述抗體、片段或衍生物與有效負載綴合，使得每個抗體的85％至110％的位點特異性綴合位點與有效負載綴合。在優(yōu)選的實施方案中，每個抗體的至少90％，至少95％或至少100％的位點特異性綴合位點綴合有效負載。在優(yōu)選的實施方案中，抗體包含兩個位點特異性綴合位點(即重鏈或輕鏈上的一個，每抗體兩個這樣的鏈)。對于這樣的抗體，85-110％綴合產(chǎn)生1.7-2.2的藥物-抗體比(dar)。在某些實施方案中，dar優(yōu)選為1.8-2.1，更優(yōu)選為1.9-2.1，并且最優(yōu)選為約2.0。在另一個優(yōu)選的實施方案中，抗體包含四個位點特異性綴合位點(即重鏈上一個和輕鏈上一個，或重鏈上兩個和輕鏈上沒有，或重鏈上沒有且輕鏈上兩個，并且每個抗體兩個這樣的鏈)。對于這樣的抗體，85-110％的綴合產(chǎn)生2x(1.7-2.2)即3.4-4.4的藥物-抗體比(dar)。在某些實施方案中，dar優(yōu)選為2x1.8-2.1，即3.6-4.2，更優(yōu)選2x1.9-2.1，即3.8-4.2，并且最優(yōu)選約2x2.0，即4。抗體，片段或衍生物可以直接或間接綴合到有效負載上；間接綴合可以通過連接體進行?？贵w還可以包含接頭。合適的接頭包括馬來酰亞胺接頭，其允許通過琥珀酰亞胺綴合與有效負載綴合。接頭可以是可切割的或不可切割的。國際專利申請wo2012/113847中公開了其它合適的接頭，其描述了包含肽鏈并且來源于o-羥基p-氨基芐醇的分支接頭，其中肽鏈經(jīng)由p-氨基連接到苯環(huán)，藥物通過芐醇部分與苯環(huán)連接，并且抗體經(jīng)由o-羥基與苯環(huán)連接。恒定區(qū)優(yōu)選包含iggiga，igd，ige或igm恒定區(qū)，更優(yōu)選人igg恒定區(qū)的至少一部分。在優(yōu)選的實施方案中，恒定區(qū)是全長igg恒定區(qū)，盡管在其它實施方案中，可以使用截短的恒定區(qū)或僅使用輕鏈或重鏈的恒定區(qū)。例如，恒定區(qū)可以包含igg恒定區(qū)的ck，ch1和ch3結(jié)構(gòu)域的一個或多個，優(yōu)選全部。優(yōu)選的igg是igg1，其他igg包括igg2，igg3和igg4?！翱贵w”是指任何抗原結(jié)合免疫球蛋白分子?？贵w優(yōu)選為完整的哺乳動物抗體(包含兩條重鏈和兩條輕鏈，每條都包含恒定區(qū)和可變區(qū))，但也可使用其他形式的抗體和衍生物。例如，fabs，雙特異性抗體片段(串聯(lián)scfv-fc，scfv-fc凸起-進入-孔洞，scfv-fc-scfv，f(ab')2，fab-scfv，(fab'scfv)2，sc雙抗體-fc或sc雙抗體-ch3)，基于igg的雙特異性抗體(雜交體雜交瘤，具有普通輕鏈的凸起-進入-孔洞，二合一igg，雙v結(jié)構(gòu)域igg，igg-scfv，scfv-igg，igg-v，v-igg)，小抗體，tribi-小抗體，納米抗體，二-雙抗體?？贵w可以是人的，或人源化的或嵌合的。一個或多個突變優(yōu)選包含從非半胱氨酸氨基酸到半胱氨酸氨基酸的突變。優(yōu)選地，非半胱氨酸氨基酸選自絲氨酸，纈氨酸，蘇氨酸或丙氨酸；更優(yōu)選絲氨酸或蘇氨酸。備選地，突變可以是賴氨酸，谷氨酰胺或非天然氨基酸。在優(yōu)選的實施方案中，一個或多個突變選自s160c，t190c，s443c，s447c(重鏈)，t180c或t206c(輕鏈)。本文所述的編號是基于全長曲妥珠單抗序列的位置編號。其他編號約定如下表所示：優(yōu)選的抗體包括輕鏈t180突變。這可能是唯一的突變，或者可以與本文公開的任何其它突變組合。優(yōu)選的抗體包括選自下組的2個突變的組合：lct180聯(lián)合lcs208,lct180聯(lián)合lcs171,lct180聯(lián)合lcs182,lct180聯(lián)合lca184,lct180聯(lián)合lcv191,lct180聯(lián)合lcs202,lct180聯(lián)合lcs203,lct180聯(lián)合lct206,lct180聯(lián)合hcs160,lct180聯(lián)合hct190lct180聯(lián)合hcs443,lct180聯(lián)合hcs447,lct180聯(lián)合hcs139,lct180聯(lián)合hcs168,lct180聯(lián)合hcv170,lct180聯(lián)合hcv176,lct180聯(lián)合hct200,lct180聯(lián)合hcs445。所述突變優(yōu)選是變?yōu)榘腚装彼幔嚢彼?，谷氨酰胺或非天然氨基酸。進一步優(yōu)選的抗體包括選自下組的2個突變的組合：lct180c聯(lián)合lcs208c,lct180c聯(lián)合lcs171c,lct180c聯(lián)合lcs182c,lct180c聯(lián)合lca184c,lct180c聯(lián)合lcv191c,lct180c聯(lián)合lcs202c,lct180c聯(lián)合lcs203c,lct180c聯(lián)合lct206c,lct180c聯(lián)合hcs160c,lct180c聯(lián)合hct190c,lct180c聯(lián)合hcs443c,lct180c聯(lián)合hcs447c,lct180c聯(lián)合hcs139c,lct180c聯(lián)合hcs168c,lct180c聯(lián)合hcv170c,lct180c聯(lián)合hcv176c,lct180c聯(lián)合hct200c,lct180c聯(lián)合hcs445c。最優(yōu)選的抗體包含lct180c聯(lián)合hcs160c。其它優(yōu)選的抗體包括選自下組的2條氨基酸序列的組合：seqidno.33和seqidno.22,seqidno.33和seqidno.23,seqidno.33和seqidno.24,seqidno.33和seqidno.25,seqidno.33和seqidno.26,seqidno.33和seqidno.27,seqidno.33和seqidno.28,seqidno.33和seqidno.29,seqidno.33和seqidno.30,seqidno.33和seqidno.31,seqidno.33和seqidno.32,seqidno.33和seqidno.34,seqidno.33和seqidno.35,seqidno.33和seqidno.36,seqidno.33和seqidno.37,seqidno.33和seqidno.38,seqidno.33和seqidno.39,seqidno.33和seqidno.40。在優(yōu)選抗體中，x是半胱氨酸。備選地，x可以獨立地選自賴氨酸，谷氨酰胺，半胱氨酸或非天然氨基酸，并且最優(yōu)選是半胱氨酸。最優(yōu)選的抗體包含seqidno.33和seqidno.23?？梢耘c本文描述的任一方面組合的另外的突變包括：在上表中，突變殘基表示為x。x優(yōu)選為半胱氨酸，但是也可以使用其它突變殘基，尤其是賴氨酸，谷氨酰胺或非天然氨基酸。注意在一些親本抗體中，v191可以是l191，尤其在kappa同種異型km1和km2中；這種情況下，在本文中述及v191突變，除非上下文有其它要求，其也理解為同樣述及l(fā)191突變。其它優(yōu)選抗體包括輕鏈t206突變聯(lián)合一個或多個其它突變。在優(yōu)選實施方案中，輕鏈t206突變與本文描述的另一個突變組合。下述是兩個突變的優(yōu)選組合；根據(jù)本發(fā)明的抗體可以包括這些突變，連同一個或多個另外的突變。lct206聯(lián)合lcs208,lct206聯(lián)合lcs171,lct206聯(lián)合lcs182,lct206聯(lián)合lca184,lct206聯(lián)合lcv191,lct206聯(lián)合lcs202,lct206聯(lián)合lcs203,lct206聯(lián)合lct180,lct206聯(lián)合hcs160,lct206聯(lián)合hct190lct206聯(lián)合hcs443,lct206聯(lián)合hcs447,lct206聯(lián)合hcs139,lct206聯(lián)合hcs168,lct206聯(lián)合hcv170,lct206聯(lián)合hcv176,lct206聯(lián)合hct200,lct206聯(lián)合hcs445。其中優(yōu)選的是：lct206聯(lián)合lct180,lct206聯(lián)合hcs160,lct206聯(lián)合hct190lct206聯(lián)合hcs443,lct206聯(lián)合hcs447,其中最優(yōu)選的是：lct206c聯(lián)合lct180c,lct206c聯(lián)合hcs160c,lct206c聯(lián)合hct190clct206c聯(lián)合hcs443c,lct206c聯(lián)合hcs447c。因此，優(yōu)選抗體可以包括seqidno39的氨基酸序列連同選自seqidno22至38或40的氨基酸序列的組合。在優(yōu)選抗體中，x是半胱氨酸。備選地，x可以獨立地選自賴氨酸，谷氨酰胺，半胱氨酸或非天然氨基酸，并且最優(yōu)選是半胱氨酸。其它優(yōu)選抗體包括重鏈s160突變聯(lián)合一個或多個其它突變。在優(yōu)選實施方案中，重鏈s160突變與本文描述的另一個突變組合。下述是兩個突變的優(yōu)選組合；根據(jù)本發(fā)明的抗體可以包括這些突變，連同一個或多個另外的突變。hcs160聯(lián)合lcs208,hcs160聯(lián)合lcs171,hcs160聯(lián)合lcs182,hcs160聯(lián)合lca184,hcs160聯(lián)合lcv191,hcs160聯(lián)合lcs202,hcs160聯(lián)合lcs203,hcs160聯(lián)合lct180,hcs160聯(lián)合lct206,hcs160聯(lián)合hct190,hcs160聯(lián)合hcs443,hcs160聯(lián)合hcs447,hcs160聯(lián)合hcs139,hcs160聯(lián)合hcs168,hcs160聯(lián)合hcv170,hcs160聯(lián)合hcv176,hcs160聯(lián)合hct200,hcs160聯(lián)合hcs445。其中優(yōu)選的是：hcs160聯(lián)合lct180,hcs160聯(lián)合lct206,hcs160聯(lián)合hct190,hcs160聯(lián)合hcs443,hcs160聯(lián)合hcs447,其中最優(yōu)選的是：hcs160c聯(lián)合lct180c,hcs160c聯(lián)合lct206c,hcs160c聯(lián)合hct190c,hcs160c聯(lián)合hcs443c,hcs160c聯(lián)合hcs447c,因此，優(yōu)選抗體可以包括seqidno23的氨基酸序列連同選自seqidno22或24至40的氨基酸序列的組合。在優(yōu)選抗體中，x是半胱氨酸。備選地，x可以獨立地選自賴氨酸，谷氨酰胺，半胱氨酸或非天然氨基酸，并且最優(yōu)選是半胱氨酸。其它優(yōu)選抗體包括重鏈t190突變聯(lián)合一個或多個其它突變。在優(yōu)選實施方案中，重鏈t190突變與本文描述的另一個突變組合。下述是兩個突變的優(yōu)選組合；根據(jù)本發(fā)明的抗體可以包括這些突變，連同一個或多個另外的突變。hct190聯(lián)合lcs208,hct190聯(lián)合lcs171,hct190聯(lián)合lcs182,hct190聯(lián)合lca184,hct190聯(lián)合lcv191,hct190聯(lián)合lcs202,hct190聯(lián)合lcs203,hct190聯(lián)合lct180,hct190聯(lián)合lct206,hct190聯(lián)合hcs160,hct190聯(lián)合hcs443,hct190聯(lián)合hcs447,hct190聯(lián)合hcs139,hct190聯(lián)合hcs168,hct190聯(lián)合hcv170,hct190聯(lián)合hcv176,hct190聯(lián)合hct200,hct190聯(lián)合hcs445。其中優(yōu)選的是：hct190聯(lián)合lct180,hct190聯(lián)合lct206,hct190聯(lián)合hcs160,hct190聯(lián)合hcs443,hct190聯(lián)合hcs447,其中最優(yōu)選的是：hct190c聯(lián)合lct180c,hct190c聯(lián)合lct206c,hct190c聯(lián)合hcs160c,hct190c聯(lián)合hcs443c,hct190c聯(lián)合hcs447c。因此，優(yōu)選抗體可以包括seqidno27的氨基酸序列連同選自seqidno22至26或28至40的氨基酸序列的組合。在優(yōu)選抗體中，x是半胱氨酸。備選地，x可以獨立地選自賴氨酸，谷氨酰胺，半胱氨酸或非天然氨基酸，并且最優(yōu)選是半胱氨酸。其它優(yōu)選抗體包括重鏈s443突變聯(lián)合一個或多個其它突變。在優(yōu)選實施方案中，重鏈s443突變與本文描述的另一個突變組合。下述是兩個突變的優(yōu)選組合；根據(jù)本發(fā)明的抗體可以包括這些突變，連同一個或多個另外的突變。hcs443聯(lián)合lcs208,hcs443聯(lián)合lcs171,hcs443聯(lián)合lcs182,hcs443聯(lián)合lca184,hcs443聯(lián)合lcv191,hcs443聯(lián)合lcs202,hcs443聯(lián)合lcs203,hcs443聯(lián)合lct180,hcs443聯(lián)合lct206,hcs443聯(lián)合hcs160,hcs443聯(lián)合hct190,hcs443聯(lián)合hcs447,hcs443聯(lián)合hcs139,hcs443聯(lián)合hcs168,hcs443聯(lián)合hcv170,hcs443聯(lián)合hcv176,hcs443聯(lián)合hct200,hcs443聯(lián)合hcs445。其中優(yōu)選的是：hcs443聯(lián)合lct180,hcs443聯(lián)合lct206,hcs443聯(lián)合hcs160,hcs443聯(lián)合hct190,hcs443聯(lián)合hcs447,其中最優(yōu)選的是：hcs443c聯(lián)合lct180c,hcs443c聯(lián)合lct206c,hcs443c聯(lián)合hcs160c,hcs443c聯(lián)合hct190c,hcs443c聯(lián)合hcs447c。因此，優(yōu)選抗體可以包括seqidno29的氨基酸序列連同選自seqidno22至28或30至40的氨基酸序列的組合。在優(yōu)選抗體中，x是半胱氨酸。備選地，x可以獨立地選自賴氨酸，谷氨酰胺，半胱氨酸或非天然氨基酸，并且最優(yōu)選是半胱氨酸。其它優(yōu)選抗體包括重鏈s447突變聯(lián)合一個或多個其它突變。在優(yōu)選實施方案中，重鏈s447突變與本文描述的另一個突變組合。下述是兩個突變的優(yōu)選組合；根據(jù)本發(fā)明的抗體可以包括這些突變，連同一個或多個另外的突變。hcs447聯(lián)合lcs208,hcs447聯(lián)合lcs171,hcs447聯(lián)合lcs182,hcs447聯(lián)合lca184,hcs447聯(lián)合lcv191,hcs447聯(lián)合lcs202,hcs447聯(lián)合lcs203,hcs447聯(lián)合lct180,hcs447聯(lián)合lct206,hcs447聯(lián)合hcs160,hcs447聯(lián)合hct190,hcs447聯(lián)合hcs443,hcs447聯(lián)合hcs139,hcs447聯(lián)合hcs168,hcs447聯(lián)合hcv170,hcs447聯(lián)合hcv176,hcs447聯(lián)合hct200,hcs447聯(lián)合hcs445。其中優(yōu)選的是：hcs447聯(lián)合lct180,hcs447聯(lián)合lct206,hcs447聯(lián)合hcs160,hcs447聯(lián)合hct190,hcs447聯(lián)合hcs443,其中最優(yōu)選的是：hcs447c聯(lián)合lct180c,hcs447c聯(lián)合lct206c,hcs447c聯(lián)合hcs160c,hcs447c聯(lián)合hct190c,hcs447c聯(lián)合hcs443c。因此，優(yōu)選抗體可以包括seqidno31的氨基酸序列連同選自seqidno22至30或32至40的氨基酸序列的組合。在優(yōu)選抗體中，x是半胱氨酸。備選地，x可以獨立地選自賴氨酸，谷氨酰胺，半胱氨酸或非天然氨基酸，并且最優(yōu)選是半胱氨酸。其它優(yōu)選抗體包括輕鏈s208突變聯(lián)合一個或多個其它突變。在優(yōu)選實施方案中，輕鏈s208突變與本文描述的另一個突變組合。下述是兩個突變的優(yōu)選組合；根據(jù)本發(fā)明的抗體可以包括這些突變，連同一個或多個另外的突變。lcs208聯(lián)合lcs171,lcs208聯(lián)合lcs182,lcs208聯(lián)合lca184,lcs208聯(lián)合lcv191,lcs208聯(lián)合lcs202,lcs208聯(lián)合lcs203,lcs208聯(lián)合lct180,lcs208聯(lián)合lct206,lcs208聯(lián)合hcs160,lcs208聯(lián)合hct190,lcs208聯(lián)合hcs443,lcs208聯(lián)合hcs447,lcs208聯(lián)合hcs139,lcs208聯(lián)合hcs168,lcs208聯(lián)合hcv170,lcs208聯(lián)合hcv176,lcs208聯(lián)合hct200,lcs208聯(lián)合hcs445。其中優(yōu)選的是：lcs208聯(lián)合lct180,lcs208聯(lián)合lct206,lcs208聯(lián)合hcs160,lcs208聯(lián)合hct190,lcs208聯(lián)合hcs443,lcs208聯(lián)合hcs447,其中最優(yōu)選的是：lcs208c聯(lián)合lct180c,lcs208c聯(lián)合lct206c,lcs208c聯(lián)合hcs160c,lcs208c聯(lián)合hct190c,lcs208c聯(lián)合hcs443c,lcs208c聯(lián)合hcs447c。因此，優(yōu)選抗體可以包括seqidno40的氨基酸序列連同選自seqidno22至39的氨基酸序列。在優(yōu)選抗體中，x是半胱氨酸。備選地，x可以獨立地選自賴氨酸，谷氨酰胺，半胱氨酸或非天然氨基酸，并且最優(yōu)選是半胱氨酸。因此，優(yōu)選的抗體包括選自下組的2個氨基酸序列的組合：seqidno.40和seqidno.22,seqidno.40和seqidno.23,seqidno.40和seqidno.24,seqidno.40和seqidno.25,seqidno.40和seqidno.26,seqidno.40和seqidno.27,seqidno.40和seqidno.28,seqidno.40和seqidno.29,seqidno.40和seqidno.30,seqidno.40和seqidno.31,seqidno.40和seqidno.32,seqidno.40和seqidno.33,seqidno.40和seqidno.34,seqidno.40和seqidno.35,seqidno.40和seqidno.36,seqidno.40和seqidno.37,seqidno.40和seqidno.38,seqidno.40和seqidno.39。在優(yōu)選抗體中，x是半胱氨酸。備選地，x可以獨立地選自賴氨酸，谷氨酰胺，半胱氨酸或非天然氨基酸，并且最優(yōu)選是半胱氨酸。其它優(yōu)選抗體包括輕鏈s171突變聯(lián)合一個或多個其它突變。在優(yōu)選實施方案中，輕鏈s171突變與本文描述的另一個突變組合。下述是兩個突變的優(yōu)選組合；根據(jù)本發(fā)明的抗體可以包括這些突變，連同一個或多個另外的突變。lcs171聯(lián)合lcs208,lcs171聯(lián)合lcs182,lcs171聯(lián)合lca184,lcs171聯(lián)合lcv191,lcs171聯(lián)合lcs202,lcs171聯(lián)合lcs203,lcs171聯(lián)合lct180,lcs171聯(lián)合lct206,lcs171聯(lián)合hcs160,lcs171聯(lián)合hct190,lcs171聯(lián)合hcs443,lcs171聯(lián)合hcs447,lcs171聯(lián)合hcs139,lcs171聯(lián)合hcs168,lcs171聯(lián)合hcv170,lcs171聯(lián)合hcv176,lcs171聯(lián)合hct200,lcs171聯(lián)合hcs445。其中優(yōu)選的是：lcs171聯(lián)合lct180,lcs171聯(lián)合lct206,lcs171聯(lián)合hcs160,lcs171聯(lián)合hct190,lcs171聯(lián)合hcs443,lcs171聯(lián)合hcs447,其中最優(yōu)選的是：lcs171c聯(lián)合lct180c,lcs171c聯(lián)合lct206c,lcs171c聯(lián)合hcs160c,lcs171c聯(lián)合hct190c,lcs171c聯(lián)合hcs443c,lcs171c聯(lián)合hcs447c。因此，優(yōu)選抗體可以包括seqidno32的氨基酸序列連同選自seqidno22至31或33至40的氨基酸序列的組合。在優(yōu)選抗體中，x是半胱氨酸。備選地，x可以獨立地選自賴氨酸，谷氨酰胺，半胱氨酸或非天然氨基酸，并且最優(yōu)選是半胱氨酸。其它優(yōu)選抗體包括輕鏈s182突變聯(lián)合一個或多個其它突變。在優(yōu)選實施方案中，輕鏈s182突變與本文描述的另一個突變組合。下述是兩個突變的優(yōu)選組合；根據(jù)本發(fā)明的抗體可以包括這些突變，連同一個或多個另外的突變。lcs182聯(lián)合lcs208,lcs182聯(lián)合lcs171,lcs182聯(lián)合lca184,lcs182聯(lián)合lcv191,lcs182聯(lián)合lcs202,lcs182聯(lián)合lcs203,lcs182聯(lián)合lct180,lcs182聯(lián)合lct206,lcs182聯(lián)合hcs160,lcs182聯(lián)合hct190,lcs182聯(lián)合hcs443,lcs182聯(lián)合hcs447,lcs182聯(lián)合hcs139,lcs182聯(lián)合hcs168,lcs182聯(lián)合hcv170,lcs182聯(lián)合hcv176,lcs182聯(lián)合hct200,lcs182聯(lián)合hcs445。其中優(yōu)選的是：lcs182聯(lián)合lct180,lcs182聯(lián)合lct206,lcs182聯(lián)合hcs160,lcs182聯(lián)合hct190,lcs182聯(lián)合hcs443,lcs182聯(lián)合hcs447,其中最優(yōu)選的是：lcs182c聯(lián)合lct180c,lcs182c聯(lián)合lct206c,lcs182c聯(lián)合hcs160c,lcs182c聯(lián)合hct190c,lcs182c聯(lián)合hcs443c,lcs182c聯(lián)合hcs447c。因此，優(yōu)選抗體可以包括seqidno34的氨基酸序列連同選自seqidno22至33或35至40的氨基酸序列的組合。在優(yōu)選抗體中，x是半胱氨酸。備選地，x可以獨立地選自賴氨酸，谷氨酰胺，半胱氨酸或非天然氨基酸，并且最優(yōu)選是半胱氨酸。其它優(yōu)選抗體包括輕鏈a184突變聯(lián)合一個或多個其它突變。在優(yōu)選實施方案中，輕鏈a184突變與本文描述的另一個突變組合。下述是兩個突變的優(yōu)選組合；根據(jù)本發(fā)明的抗體可以包括這些突變，連同一個或多個另外的突變。lca184聯(lián)合lcs208,lca184聯(lián)合lcs171,lca184聯(lián)合lcs182,lca184聯(lián)合lcv191,lca184聯(lián)合lcs202,lca184聯(lián)合lcs203,lca184聯(lián)合lct180,lca184聯(lián)合lct206,lca184聯(lián)合hcs160,lca184聯(lián)合hct190,lca184聯(lián)合hcs443,lca184聯(lián)合hcs447,lca184聯(lián)合hcs139,lca184聯(lián)合hcs168,lca184聯(lián)合hcv170,lca184聯(lián)合hcv176,lca184聯(lián)合hct200,lca184聯(lián)合hcs445。其中優(yōu)選的是：lca184聯(lián)合lct180,lca184聯(lián)合lct206,lca184聯(lián)合hcs160,lca184聯(lián)合hct190,lca184聯(lián)合hcs443,lca184聯(lián)合hcs447,其中最優(yōu)選的是：lca184c聯(lián)合lct180c,lca184c聯(lián)合lct206c,lca184c聯(lián)合hcs160c,lca184c聯(lián)合hct190c,lca184c聯(lián)合hcs443c,lca184c聯(lián)合hcs447c。因此，優(yōu)選抗體可以包括seqidno35的氨基酸序列連同選自seqidno22至34或36至40的氨基酸序列的組合。在優(yōu)選抗體中，x是半胱氨酸。備選地，x可以獨立地選自賴氨酸，谷氨酰胺，半胱氨酸或非天然氨基酸，并且最優(yōu)選是半胱氨酸。其它優(yōu)選抗體包括輕鏈v191突變聯(lián)合一個或多個其它突變。在優(yōu)選實施方案中，輕鏈v191突變與本文描述的另一個突變組合。下述是兩個突變的優(yōu)選組合；根據(jù)本發(fā)明的抗體可以包括這些突變，連同一個或多個另外的突變。lcv191聯(lián)合lcs208,lcv191聯(lián)合lcs171,lcv191聯(lián)合lcs182,lcv191聯(lián)合lca184,lcv191聯(lián)合lcs202,lcv191聯(lián)合lcs203,lcv191聯(lián)合lct180,lcv191聯(lián)合lct206,lcv191聯(lián)合hcs160,lcv191聯(lián)合hct190,lcv191聯(lián)合hcs443,lcv191聯(lián)合hcs447,lcv191聯(lián)合hcs139,lcv191聯(lián)合hcs168,lcv191聯(lián)合hcv170,lcv191聯(lián)合hcv176,lcv191聯(lián)合hct200,lcv191聯(lián)合hcs445。其中優(yōu)選的是：lcv191聯(lián)合lct180,lcv191聯(lián)合lct206,lcv191聯(lián)合hcs160,lcv191聯(lián)合hct190,lcv191聯(lián)合hcs443,lcv191聯(lián)合hcs447,其中最優(yōu)選的是：lcv191c聯(lián)合lct180c,lcv191c聯(lián)合lct206c,lcv191c聯(lián)合hcs160c,lcv191c聯(lián)合hct190c,lcv191c聯(lián)合hcs443c,lcv191c聯(lián)合hcs447c。因此，優(yōu)選抗體可以包括seqidno36的氨基酸序列連同選自seqidno22至35或37至40的氨基酸序列的組合。在優(yōu)選抗體中，x是半胱氨酸。備選地，x可以獨立地選自賴氨酸，谷氨酰胺，半胱氨酸或非天然氨基酸，并且最優(yōu)選是半胱氨酸。其它優(yōu)選抗體包括輕鏈s202突變聯(lián)合一個或多個其它突變。在優(yōu)選實施方案中，輕鏈s202突變與本文描述的另一個突變組合。下述是兩個突變的優(yōu)選組合；根據(jù)本發(fā)明的抗體可以包括這些突變，連同一個或多個另外的突變。lcs202聯(lián)合lcs208,lcs202聯(lián)合lcs171,lcs202聯(lián)合lcs182,lcs202聯(lián)合lca184,lcs202聯(lián)合lcv191,lcs202聯(lián)合lcs203,lcs202聯(lián)合lct180,lcs202聯(lián)合lct206,lcs202聯(lián)合hcs160,lcs202聯(lián)合hct190,lcs202聯(lián)合hcs443,lcs202聯(lián)合hcs447,lcs202聯(lián)合hcs139,lcs202聯(lián)合hcs168,lcs202聯(lián)合hcv170,lcs202聯(lián)合hcv176,lcs202聯(lián)合hct200,lcs202聯(lián)合hcs445。其中優(yōu)選的是：lcs202聯(lián)合lct180,lcs202聯(lián)合lct206,lcs202聯(lián)合hcs160,lcs202聯(lián)合hct190,lcs202聯(lián)合hcs443,lcs202聯(lián)合hcs447,其中最優(yōu)選的是：lcs202c聯(lián)合lct180c,lcs202c聯(lián)合lct206c,lcs202c聯(lián)合hcs160c,lcs202c聯(lián)合hct190c,lcs202c聯(lián)合hcs443c,lcs202c聯(lián)合hcs447c。因此，優(yōu)選抗體可以包括seqidno37的氨基酸序列連同選自seqidno22至36或38至40的氨基酸序列的組合。在優(yōu)選抗體中，x是半胱氨酸。備選地，x可以獨立地選自賴氨酸，谷氨酰胺，半胱氨酸或非天然氨基酸，并且最優(yōu)選是半胱氨酸。其它優(yōu)選抗體包括輕鏈s203突變聯(lián)合一個或多個其它突變。在優(yōu)選實施方案中，輕鏈s203突變與本文描述的另一個突變組合。下述是兩個突變的優(yōu)選組合；根據(jù)本發(fā)明的抗體可以包括這些突變，連同一個或多個另外的突變。lcs203聯(lián)合lcs208,lcs203聯(lián)合lcs171,lcs203聯(lián)合lcs182,lcs203聯(lián)合lca184,lcs203聯(lián)合lcv191,lcs203聯(lián)合lcs202,lcs203聯(lián)合lct180,lcs203聯(lián)合lct206,lcs203聯(lián)合hcs160,lcs203聯(lián)合hct190,lcs203聯(lián)合hcs443,lcs203聯(lián)合hcs447,lcs203聯(lián)合hcs139,lcs203聯(lián)合hcs168,lcs203聯(lián)合hcv170,lcs203聯(lián)合hcv176,lcs203聯(lián)合hct200,lcs203聯(lián)合hcs445。其中優(yōu)選的是：lcs203聯(lián)合lct180,lcs203聯(lián)合lct206,lcs203聯(lián)合hcs160,lcs203聯(lián)合hct190,lcs203聯(lián)合hcs443,lcs203聯(lián)合hcs447,其中最優(yōu)選的是：lcs203c聯(lián)合lct180c,lcs203c聯(lián)合lct206c,lcs203c聯(lián)合hcs160c,lcs203c聯(lián)合hct190c,lcs203c聯(lián)合hcs443c,lcs203c聯(lián)合hcs447c。因此，優(yōu)選抗體可以包括seqidno38的氨基酸序列連同選自seqidno22至37或39至40的氨基酸序列的組合。在優(yōu)選抗體中，x是半胱氨酸。備選地，x可以獨立地選自賴氨酸，谷氨酰胺，半胱氨酸或非天然氨基酸，并且最優(yōu)選是半胱氨酸。其它優(yōu)選抗體包括重鏈s139突變聯(lián)合一個或多個其它突變。在優(yōu)選實施方案中，重鏈s139突變與本文描述的另一個突變組合。下述是兩個突變的優(yōu)選組合；根據(jù)本發(fā)明的抗體可以包括這些突變，連同一個或多個另外的突變。hcs139聯(lián)合lcs208,hcs139聯(lián)合lcs171,hcs139聯(lián)合lcs182,hcs139聯(lián)合lca184,hcs139聯(lián)合lcv191,hcs139聯(lián)合lcs202,hcs139聯(lián)合lcs203,hcs139聯(lián)合lct180,hcs139聯(lián)合lct206,hcs139聯(lián)合hcs160,hcs139聯(lián)合hct190,hcs139聯(lián)合hcs443,hcs139聯(lián)合hcs447,hcs139聯(lián)合hcs168,hcs139聯(lián)合hcv170,hcs139聯(lián)合hcv176,hcs139聯(lián)合hct200,hcs139聯(lián)合hcs445。其中優(yōu)選的是：hcs139聯(lián)合lct180,hcs139聯(lián)合lct206,hcs139聯(lián)合hcs160,hcs139聯(lián)合hct190,hcs139聯(lián)合hcs443,hcs139聯(lián)合hcs447,其中最優(yōu)選的是：hcs139c聯(lián)合lct180c,hcs139c聯(lián)合lct206c,hcs139c聯(lián)合hcs160c,hcs139c聯(lián)合hct190c,hcs139c聯(lián)合hcs443c,hcs139c聯(lián)合hcs447c。因此，優(yōu)選抗體可以包括seqidno22的氨基酸序列連同選自seqidno23至40的氨基酸序列的組合。在優(yōu)選抗體中，x是半胱氨酸。備選地，x可以獨立地選自賴氨酸，谷氨酰胺，半胱氨酸或非天然氨基酸，并且最優(yōu)選是半胱氨酸。其它優(yōu)選抗體包括重鏈s168突變聯(lián)合一個或多個其它突變。在優(yōu)選實施方案中，重鏈s168突變與本文描述的另一個突變組合。下述是兩個突變的優(yōu)選組合；根據(jù)本發(fā)明的抗體可以包括這些突變，連同一個或多個另外的突變。hcs168聯(lián)合lcs208,hcs168聯(lián)合lcs171,hcs168聯(lián)合lcs182,hcs168聯(lián)合lca184,hcs168聯(lián)合lcv191,hcs168聯(lián)合lcs202,hcs168聯(lián)合lcs203,hcs168聯(lián)合lct180,hcs168聯(lián)合lct206,hcs168聯(lián)合hcs160,hcs168聯(lián)合hct190,hcs168聯(lián)合hcs443,hcs168聯(lián)合hcs447,hcs168聯(lián)合hcs139,hcs168聯(lián)合hcv170,hcs168聯(lián)合hcv176,hcs168聯(lián)合hct200,hcs168聯(lián)合hcs445。其中優(yōu)選的是：hcs168聯(lián)合lct180,hcs168聯(lián)合lct206,hcs168聯(lián)合hcs160,hcs168聯(lián)合hct190,hcs168聯(lián)合hcs443,hcs168聯(lián)合hcs447,其中最優(yōu)選的是：hcs168c聯(lián)合lct180c,hcs168c聯(lián)合lct206c,hcs168c聯(lián)合hcs160c,hcs168c聯(lián)合hct190c,hcs168c聯(lián)合hcs443c,hcs168c聯(lián)合hcs447c。因此，優(yōu)選抗體可以包括seqidno24的氨基酸序列連同選自seqidno22,23,或25至40的氨基酸序列的組合。在優(yōu)選抗體中，x是半胱氨酸。備選地，x可以獨立地選自賴氨酸，谷氨酰胺，半胱氨酸或非天然氨基酸，并且最優(yōu)選是半胱氨酸。其它優(yōu)選抗體包括重鏈v170突變聯(lián)合一個或多個其它突變。在優(yōu)選實施方案中，重鏈v170突變與本文描述的另一個突變組合。下述是兩個突變的優(yōu)選組合；根據(jù)本發(fā)明的抗體可以包括這些突變，連同一個或多個另外的突變。hcv170聯(lián)合lcs208,hcv170聯(lián)合lcs171,hcv170聯(lián)合lcs182,hcv170聯(lián)合lca184,hcv170聯(lián)合lcv191,hcv170聯(lián)合lcs202,hcv170聯(lián)合lcs203,hcv170聯(lián)合lct180,hcv170聯(lián)合lct206,hcv170聯(lián)合hcs160,hcv170聯(lián)合hct190,hcv170聯(lián)合hcs443,hcv170聯(lián)合hcs447,hcv170聯(lián)合hcs139,hcv170聯(lián)合hcs168,hcv170聯(lián)合hcv176,hcv170聯(lián)合hct200,hcv170聯(lián)合hcs445。其中優(yōu)選的是：hcv170聯(lián)合lct180,hcv170聯(lián)合lct206,hcv170聯(lián)合hcs160,hcv170聯(lián)合hct190,hcv170聯(lián)合hcs443,hcv170聯(lián)合hcs447,其中最優(yōu)選的是：hcv170c聯(lián)合lct180c,hcv170c聯(lián)合lct206c,hcv170c聯(lián)合hcs160c,hcv170c聯(lián)合hct190c,hcv170c聯(lián)合hcs443c,hcv170c聯(lián)合hcs447c。因此，優(yōu)選抗體可以包括seqidno25的氨基酸序列連同選自seqidno22至24或26至40的氨基酸序列的組合。在優(yōu)選抗體中，x是半胱氨酸。備選地，x可以獨立地選自賴氨酸，谷氨酰胺，半胱氨酸或非天然氨基酸，并且最優(yōu)選是半胱氨酸。其它優(yōu)選抗體包括重鏈v176突變聯(lián)合一個或多個其它突變。在優(yōu)選實施方案中，重鏈v176突變與本文描述的另一個突變組合。下述是兩個突變的優(yōu)選組合；根據(jù)本發(fā)明的抗體可以包括這些突變，連同一個或多個另外的突變。hcv176聯(lián)合lcs208,hcv176聯(lián)合lcs171,hcv176聯(lián)合lcs182,hcv176聯(lián)合lca184,hcv176聯(lián)合lcv191,hcv176聯(lián)合lcs202,hcv176聯(lián)合lcs203,hcv176聯(lián)合lct180,hcv176聯(lián)合lct206,hcv176聯(lián)合hcs160,hcv176聯(lián)合hct190,hcv176聯(lián)合hcs443,hcv176聯(lián)合hcs447,hcv176聯(lián)合hcs139,hcv176聯(lián)合hcs168,hcv176聯(lián)合hcv170,hcv176聯(lián)合hct200,hcv176聯(lián)合hcs445。其中優(yōu)選的是：hcv176聯(lián)合lct180,hcv176聯(lián)合lct206,hcv176聯(lián)合hcs160,hcv176聯(lián)合hct190,hcv176聯(lián)合hcs443,hcv176聯(lián)合hcs447,其中最優(yōu)選的是：hcv176c聯(lián)合lct180c,hcv176c聯(lián)合lct206c,hcv176c聯(lián)合hcs160c,hcv176c聯(lián)合hct190c,hcv176c聯(lián)合hcs443c,hcv176c聯(lián)合hcs447c。因此，優(yōu)選抗體可以包括seqidno26的氨基酸序列連同選自seqidno22至25或27至40的氨基酸序列的組合。在優(yōu)選抗體中，x是半胱氨酸。備選地，x可以獨立地選自賴氨酸，谷氨酰胺，半胱氨酸或非天然氨基酸，并且最優(yōu)選是半胱氨酸。其它優(yōu)選抗體包括重鏈t200突變聯(lián)合一個或多個其它突變。在優(yōu)選實施方案中，重鏈t200突變與本文描述的另一個突變組合。下述是兩個突變的優(yōu)選組合；根據(jù)本發(fā)明的抗體可以包括這些突變，連同一個或多個另外的突變。hct200聯(lián)合lcs208,hct200聯(lián)合lcs171,hct200聯(lián)合lcs182,hct200聯(lián)合lca184,hct200聯(lián)合lcv191,hct200聯(lián)合lcs202,hct200聯(lián)合lcs203,hct200聯(lián)合lct180,hct200聯(lián)合lct206,hct200聯(lián)合hcs160,hct200聯(lián)合hct190,hct200聯(lián)合hcs443,hct200聯(lián)合hcs447,hct200聯(lián)合hcs139,hct200聯(lián)合hcs168,hct200聯(lián)合hcv170,hct200聯(lián)合hcv176,hct200聯(lián)合hcs445。其中優(yōu)選的是：hct200聯(lián)合lct180,hct200聯(lián)合lct206,hct200聯(lián)合hcs160,hct200聯(lián)合hct190,hct200聯(lián)合hcs443,hct200聯(lián)合hcs447,其中最優(yōu)選的是：hct200c聯(lián)合lct180c,hct200c聯(lián)合lct206c,hct200c聯(lián)合hcs160c,hct200c聯(lián)合hct190c,hct200c聯(lián)合hcs443c,hct200c聯(lián)合hcs447c。因此，優(yōu)選抗體可以包括seqidno28的氨基酸序列連同選自seqidno22至27或29至40的氨基酸序列的組合。在優(yōu)選抗體中，x是半胱氨酸。備選地，x可以獨立地選自賴氨酸，谷氨酰胺，半胱氨酸或非天然氨基酸，并且最優(yōu)選是半胱氨酸。其它優(yōu)選抗體包括重鏈s445突變聯(lián)合一個或多個其它突變。在優(yōu)選實施方案中，重鏈s445突變與本文描述的另一個突變組合。下述是兩個突變的優(yōu)選組合；根據(jù)本發(fā)明的抗體可以包括這些突變，連同一個或多個另外的突變。hcs445聯(lián)合lcs208,hcs445聯(lián)合lcs171,hcs445聯(lián)合lcs182,hcs445聯(lián)合lca184,hcs445聯(lián)合lcv191,hcs445聯(lián)合lcs202,hcs445聯(lián)合lcs203,hcs445聯(lián)合lct180,hcs445聯(lián)合lct206,hcs445聯(lián)合hcs160,hcs445聯(lián)合hct190,hcs445聯(lián)合hcs443,hcs445聯(lián)合hcs447,hcs445聯(lián)合hcs139,hcs445聯(lián)合hcs168,hcs445聯(lián)合hcv170,hcs445聯(lián)合hcv176,hcs445聯(lián)合hct200.其中優(yōu)選的是：hcs445聯(lián)合lct180,hcs445聯(lián)合lct206,hcs445聯(lián)合hcs160,hcs445聯(lián)合hct190,hcs445聯(lián)合hcs443,hcs445聯(lián)合hcs447,其中最優(yōu)選的是：hcs445c聯(lián)合lct180c,hcs445c聯(lián)合lct206c,hcs445c聯(lián)合hcs160c,hcs445c聯(lián)合hct190c,hcs445c聯(lián)合hcs443c,hcs445c聯(lián)合hcs447c。因此，優(yōu)選的抗體可以包含seqidno30的氨基酸序列與選自seqidno22-29或31-40的氨基酸序列的組合。在優(yōu)選的抗體中，x是半胱氨酸?；蛘?，x可以獨立地選自賴氨酸，谷氨酰胺，半胱氨酸或非天然氨基酸，并且最優(yōu)選半胱氨酸?？贵w可以選自阿昔單抗(abciximab)；利妥昔單抗(rituximab)；巴利昔單抗(basiliximab)；達克珠單抗(daclizumab)；帕利珠單抗(palivizumab)；英利昔單抗(infliximab)；曲妥珠單抗(trastuzumab)；阿侖珠單抗(alemtuzumab)；阿達木單抗(adalimumab)；依法珠單抗(efalizumab)；西妥昔單抗(cetuximab)；替伊莫單抗(ibritumomab)；奧馬珠單抗(omalizumab)；貝伐珠單抗(bevacizumab)；雷珠單抗(ranibizumab)；戈利木單抗(golimumab)；canakinumab；ustekinumab；托珠單抗(tocilizumab)；奧法木單抗(ofatumumab)；貝利木單抗(belimumab)；伊匹木單抗(ipilimumab)；brentuximab；帕妥珠單抗(pertuzumab)；raxibacumab；vedolizumab；ramucirumab；obinutuzumab；siltuximab；secukinumab；dinutuximab。本發(fā)明還提供了這樣的抗體，其具有：包含seqidno1的氨基酸序列或由seqidno1的氨基酸序列組成的輕鏈，以及包含選自seqidno3至12中任一個的氨基酸序列或由選自seqidno3至12中任一個的氨基酸序列組成的重鏈。備選地，抗體具有選自seqidno13至21的氨基酸序列或由選自seqidno13至21的氨基酸序列組成的輕鏈，以及包含seqidno2的氨基酸序列或由seqidno2的氨基酸序列組成的重鏈?？贵w優(yōu)選具有兩條輕鏈和兩條重鏈。還提供了具有可變區(qū)和恒定區(qū)的抗體，所述可變區(qū)提供對靶標的結(jié)合特異性，其中恒定區(qū)包含具有seqidno1的殘基109至214的氨基酸序列的輕鏈恒定區(qū)，和具有選自seqidno3至12的序列的殘基121至450的氨基酸序列的重的鏈恒定區(qū)。備選地，恒定區(qū)包含具有seqidno13至21的殘基109至214的氨基酸序列的輕鏈恒定區(qū)，以及具有seqidno2的殘基121至450的氨基酸序列的重鏈恒定區(qū)。優(yōu)選地，抗體包含具有seqidno14的殘基109至214的氨基酸序列的輕鏈恒定區(qū)和具有seqidno2的殘基121至450的氨基酸序列的重鏈恒定區(qū)；或者抗體包含具有seqidno14的殘基109-214的氨基酸序列的輕鏈恒定區(qū)和具有seqidno4的殘基121至450的氨基酸序列的重鏈恒定區(qū)；或者抗體包含具有seqidno21的殘基109至214的氨基酸序列的輕鏈恒定區(qū)和具有seqidno2的殘基121至450的氨基酸序列的重鏈恒定區(qū)。還提供了抗體-藥物綴合物(adc)，其包含根據(jù)本發(fā)明第一方面的抗體，其綴合到有效負載，優(yōu)選藥物有效負載(payload)，使得在重鏈或輕鏈上一個突變的情況下，dar為1.7-2.2；和在輕鏈或重鏈中有2個突變，或1個在輕鏈中和1個重鏈中的情況下，dar為3.4-4.4。藥物有效負載可以是微管破壞劑或dna修飾劑。合適的藥物有效負載的實例包括多拉司他汀，vedotin，單甲基auristatinf，美坦生類化合物，包括dm1和dm4，duocarmycin類似物，刺孢霉素，吡咯并苯并二氮duocarmycin，centanamycin，伊立替康和多柔比星?？梢允褂闷渌幬镉行ж撦d。本發(fā)明的另一方面提供了用作治療劑的本文所述的抗體或adc。本發(fā)明還提供包含如本文所述的抗體或adc的藥物組合物。本發(fā)明的另一方面提供了一種用于產(chǎn)生adc的方法，所述方法包括將如本文所述的抗體與藥物有效負載綴合。本發(fā)明的另一方面提供了一種用于在將抗體與有效負載綴合之后改善親本抗體的選定特征的方法，其中所述改進選自降低單體損失，減少抗體片段化和/或減少綴合后的抗體聚集，其中所述方法包括制備具有親本抗體的氨基酸序列的修飾抗體，其在選自hct200，hcv170，hcv176，hct190，hcs139，hcs160，hcs168，hcs443hcs445，hcs447，lcs171c，lct180，lct206，lcv191，lcs202，lcs203或lcs208的殘基中具有一個或多個置換。該置換優(yōu)選是半胱氨酸，但是可以使用其它突變體殘基，特別是賴氨酸，谷氨酰胺或非天然氨基酸。定義本文中使用的以下術(shù)語具有以下定義：“片段”是指保留抗體的特異性結(jié)合特性的全長抗體的一部分?！把苌铩笔侵妇哂须男蛄幸粋€或多個變化，和/或帶有一個或多個官能團或與其結(jié)合的一個或多個部分的修飾的抗體或抗體片段，其保留了抗體的特異性結(jié)合特性?！把苌铩笨梢园ǚg后修飾的抗體?！拔恢镁幪枴?，“順序編號”和類似術(shù)語是指將n末端的第一個殘基指定為殘基號1和后續(xù)的殘基依次編號為殘基2，3，4等等的肽的氨基酸序列的編號。這與用于抗體的kabat或eu編號系統(tǒng)形成對照。“位點特異性綴合位點”是指抗體內(nèi)的氨基酸殘基，其被特異性修飾以允許綴合有效負載?！耙吧汀笔侵肝葱揎椀奶烊淮嬖诘碾幕蚝怂嵝蛄??！坝H本抗體”是指用作制備修飾抗體的基礎(chǔ)的抗體?！胺翘烊话被帷笔侵覆皇钱a(chǎn)生蛋白質(zhì)的氨基酸的氨基酸，或其翻譯后修飾的變體。特別地，該術(shù)語是指不是20種常見氨基酸之一的氨基酸。附圖簡述圖1顯示候選抗體在25mlchok1sv培養(yǎng)物中的表達水平。圖2顯示了綴合和非綴合變體抗體的％單體以及綴合變體的％聚集和片段化的sec-hplc分析的結(jié)果。圖3顯示生物素-馬來酰亞胺與抗體變體輕鏈的綴合程度?？瞻讞l表示未綴合的產(chǎn)物，條形條表示具有單個綴合有效負載的產(chǎn)物，實心條表示具有兩個綴合有效負載的產(chǎn)物。圖4顯示生物素-馬來酰亞胺與抗體變體重鏈綴合的程度?？瞻讞l表示未綴合的產(chǎn)物，條形條表示具有單個綴合有效負載的產(chǎn)物，實心條表示具有兩個綴合有效負載的產(chǎn)物。圖5顯示了圖3和圖4的抗體變體的計算的藥物抗體比。圖6顯示抗體變體子集的生物素隨時間的減少百分比。圖7顯示了與mmae綴合的一些選定變體的計算的藥物與抗體的比率。圖8顯示了在72小時期間暴露于不同濃度的所選adc的不同細胞系的細胞存活力的降低。pbs＝磷酸緩沖鹽水；vc-mmae＝纈氨酸-瓜氨酸-mmae。發(fā)明詳述本發(fā)明人已經(jīng)開發(fā)了合理設(shè)計修飾的抗體的方法，以允許選擇具有所需性質(zhì)的抗體，用于產(chǎn)生與有效負載(例如adc)綴合的抗體(adc變體)。設(shè)計過程融入了計算機和體外篩選步驟。因此，如將會看到的，本發(fā)明的抗體共享許多性質(zhì)。為了摻入用于位點特異性綴合的殘基，決定用另一個殘基(如抗體結(jié)構(gòu)的選定位置處的半胱氨酸殘基)替代天然殘基。(計算機和體外)分析候選變體的所需性質(zhì)，包括滴度和聚集以及任選的免疫原性(僅在計算機中)。作為構(gòu)思的初步證明，選擇赫賽汀(曲妥珠單抗)作為模型抗體，并用生物素馬來酰亞胺進行綴合優(yōu)化和分析。選擇突變位點的標準包括：·要突變?yōu)榘腚装彼?cys)的殘基必須具有相似的物理化學(xué)性質(zhì)，或者是小的非疏水性非帶電殘基(ser，val，thr，ala)·易于突變?yōu)榘腚装彼岬臍埢仨氃诳贵w或其片段的輕鏈(cκ，cλ)或重鏈(ch1，ch2或ch3)的恒定區(qū)?！ぴ谑褂眯揎椀目贵w或支架的情況下，引入的cys應(yīng)與任何靶結(jié)合界面或結(jié)構(gòu)域距離>以使干擾分子生物學(xué)活性的風(fēng)險最小化?！ys突變不應(yīng)產(chǎn)生鏈內(nèi)氫鍵，導(dǎo)致局部環(huán)境的改變和蛋白質(zhì)的性質(zhì)的改變·cys突變不能放置在抗體(或支架)的鏈或結(jié)構(gòu)域之間的界面中。作為一般規(guī)則，修飾應(yīng)該與鏈鏈或域-域界面中涉及的殘基的距離>·cys突變距離任何抗體天然cys距離>并且不應(yīng)干擾fc糖基化位點(即應(yīng)放置在發(fā)生糖基化的殘基asn295的距離>處)·cys突變不應(yīng)增加化學(xué)降解風(fēng)險/不應(yīng)引入不需要的翻譯后修飾然后進行曲妥珠單抗序列的篩選以鑒定用于突變?yōu)榱硪粴埢?如例如，半胱氨酸)的合適位點。未修飾的輕鏈序列是：diqmtqspsslsasvgdrvtitcrasqdvntavawyqqkpgkapklliysasflysgvpsrfsgsrsgtdftltisslqpedfatyycqqhyttpptfgqgtkveikrtvaapsvfifppsdeqlksgtasvvcllnnfypreakvqwkvdnalqsgnsqesvteqdskdstyslsstltlskadyekhkvyacevthqglsspvtksfnrgec(seqidno：1)未修飾的重鏈序列是：evqlvesggglvqpggslrlscaasgfnikdtyihwvrqapgkglewvariyptngytryadsvkgrftisadtskntaylqmnslraedtavyycsrwggdgfyamdywgqgtlvtvssastkgpsvfplapsskstsggtaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtqtyicnvnhkpsntkvdkkvepkscdkthtcppcpapellggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsrdeltknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk(seqidno：2)探索了在ch1，ch3和cl中ser，thr，val和ala殘基。這給出了一些候選物：輕鏈：ser171，val191，ser208，ser182，thr180，thr206，ala184，ser203，ser202重鏈：val170，val176，thr190，ser445，ser443，ser139，ser160，ser447，thr200，ser168。然后分析這些突變所需的性質(zhì)。在計算機上進行溶劑可及性表面建模。discoverystudio(accelryssoftwareinc.，discoverystudiomodelingenvironment，release4.0，sandiego：accelryssoftwareinc.，2013.)用于計算所選殘基的側(cè)鏈溶劑可及性表面(sidechainsolventaccessibilitysurface)。溶劑可及性應(yīng)大于15％(＞15％)或大于17％(＞17％)以促進分子的“綴合性”。側(cè)鏈溶劑可及性表面的百分比計算為使用延長的ala-x-ala三肽計算的側(cè)鏈溶劑可及性除以完全暴露的氨基酸殘基的側(cè)鏈溶劑可及性，然后乘以100，其中x是感興趣的殘基。具有等于或小于15％(＜＝15％)或等于或小于17％(＜＝17％)的溶劑可及性側(cè)鏈被認為是埋藏的，不被考慮。sas建模的結(jié)果如下：聚合傾向建模也是以計算機進行的。聚集傾向不應(yīng)通過預(yù)期的工程設(shè)計的任何這些(潛在)adc變體的cys的引入而顯著增加。該傾向基于將參考分子和任何上述(潛在的)adc變體的z得分與抗體或蛋白質(zhì)(其中引入cys突變)的最小功能結(jié)構(gòu)域的參考組的值的分布的比較來計算。確定參考組的平均值和標準偏差。然后通過從靶標蛋白質(zhì)得分中減去參考平均值，并除以標準偏差，計算z-得分。結(jié)果是以零(0)為中心的分數(shù)，其中正值表明靶標比平均值更易于聚集(在這種情況下)。具有(-1，1)內(nèi)的z分數(shù)的靶標在參考組內(nèi)的分數(shù)的標準偏差內(nèi)。計算機平臺中aggresolvetm(lonza，巴塞爾，瑞士)包含一系列算法，其基于序列和結(jié)構(gòu)參數(shù)，可以計算出反映給定多肽的聚集傾向的預(yù)測因子。這些預(yù)測因子反映了全局和局部(殘基特異性)聚合傾向以及局部靈活性和穩(wěn)定性。已經(jīng)計算了全長曲妥珠單抗重鏈和輕鏈以及adc置換所在的ch1，ch3和cl結(jié)構(gòu)域(最小功能結(jié)構(gòu)域)的aggresolvez-得分。ch1，ch3和cl結(jié)構(gòu)域的邊界符合m.p.lefranc,c.pommie,q.kaas,e.duprat,n.bosc,d.guiraudou,c.jean,m.ruiz,i.dapiedade,m.rouard,e.foulquier,v.thouvenin和g.lefranc(imgtuniquenumberingforimmunoglobulinandtcellreceptorconstantdomainsandigsuperfamilyc-likedomains(免疫球蛋白和t細胞受體恒定區(qū)和ig超家族c樣結(jié)構(gòu)域的imgt獨特編號).developmentalandcomparativeimmunology(發(fā)育與比較免疫學(xué))29(3),2005.)的imgt定義。在計算機選擇步驟之后，對變體進行體外測試以確定蛋白質(zhì)產(chǎn)率(體外)，聚集/片段化和結(jié)合動力學(xué)?！さ鞍踪|(zhì)產(chǎn)率，通過上清液中產(chǎn)物滴度和蛋白質(zhì)a純化后估計，必須至少為親本分子的70％或更高·通過尺寸排阻層析法hplc測量的綴合后失去的單體百分比優(yōu)選≤35％，更優(yōu)選≤5％,≤10％,≤15％,≤20％,≤25％或≤30％?！ぞY合分子的聚合百分比優(yōu)選為<5％，<10％，<15％，或<20％?！ぞY合抗體的片段化百分比優(yōu)選為<5％，<10％，<15％，<20％，<25％，<30％，<32％，<35％或<40％。·綴合變體的解離常數(shù)(kd)必須等于或小于未突變或親本抗體的參考標準kd的2(≤2)個數(shù)量級。對于本文所述的抗體，參考標準是赫賽汀(曲妥珠單抗)，盡管應(yīng)當(dāng)理解，在使用不同親代抗體的情況下，該親本可用作參考標準。用于在多種不同宿主細胞中克隆和表達抗體的系統(tǒng)是眾所周知的。合適的宿主細胞包括細菌，哺乳動物細胞，酵母和桿狀病毒系統(tǒng)。本領(lǐng)域可用于表達異源多肽的哺乳動物細胞系包括中國倉鼠卵巢細胞，hela細胞，幼倉鼠腎細胞，nso小鼠黑素瘤細胞和許多其它細胞。常見優(yōu)選的小免疫球蛋白分子的細菌宿主是大腸桿菌。原核細胞如大腸桿菌中的免疫球蛋白(如抗體和抗體片段)的表達在本領(lǐng)域已經(jīng)成熟。培養(yǎng)物中的真核細胞中的表達也可用于本領(lǐng)域技術(shù)人員作為免疫球蛋白生產(chǎn)的選擇。免疫球蛋白，例如抗體和抗體片段，也可以在無細胞系統(tǒng)中表達?？梢赃x擇或構(gòu)建用于表達免疫球蛋白的合適的載體，其含有調(diào)節(jié)序列，包括啟動子序列，終止子序列，多聚腺苷酸化序列，增強子序列，標記基因和其他序列，如果適當(dāng)?shù)脑?。載體可以是質(zhì)粒，病毒例如'噬菌體，或噬菌粒，如果適當(dāng)?shù)脑?。有關(guān)更多細節(jié)，請參見例如molecularcloning:alaboratorymanual:第2版,sambrook等,1989,coldspringharborlaboratorypress。用于操作核酸的許多已知技術(shù)和方案，例如在制備核酸構(gòu)建體，誘變，測序，將dna引入細胞和基因表達以及蛋白質(zhì)分析中的詳細描述在currentprotocolsinmolecularbiology,第2版,ausubel等eds.,johnwiley&sons,1992。編碼變體免疫球蛋白或其ch1，vh和/或vl結(jié)構(gòu)域的核酸可以包含在宿主細胞中。如wo2011021009a1中所述產(chǎn)生變體抗體。詳細地：編碼本文所述的抗體變體的dna被化學(xué)合成并克隆到合適的哺乳動物表達載體中。對于瞬時表達實驗，重鏈和輕鏈被克隆到單獨的表達載體中。為了穩(wěn)定表達變體抗體的細胞系的產(chǎn)生，將重鏈和輕鏈克隆到單個表達載體中。每個表達載體包含編碼重鏈上游信號序列的dna和輕鏈編碼區(qū)，以便能夠從哺乳動物細胞分泌重鏈和輕鏈。對于瞬時表達，使用例如lipofectamine與編碼本文所述變體的表達載體轉(zhuǎn)染chok1sv細胞。例如，在輕鏈中包含至少一個突變的變體的情況下，將包含所述突變的表達載體與編碼未修飾重鏈的載體共轉(zhuǎn)染；在重鏈中包含至少一個突變的變體的情況下，將包含所述突變的表達載體與編碼未修飾輕鏈的載體共轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染后72小時，從轉(zhuǎn)染細胞收獲上清液，離心并在4℃下儲存，然后純化。為了大規(guī)模生產(chǎn)，如上所述，用含有修飾或未修飾的輕鏈和重鏈的單個載體轉(zhuǎn)染chok1sv細胞。將穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的任一細胞庫用于進一步實驗或進行克隆選擇。收獲表達本發(fā)明變體的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞的上清液，并在純化前在4℃下儲存。細胞培養(yǎng)上清液是使用hitrap柱(ge)蛋白a純化，并在濃縮和緩沖液交換之前在4℃下儲存。通過2000g15-20min離心濃縮樣品。使用制劑緩沖液(50mm磷酸鹽，100mmnacl，ph7.4)交換4-5次將物質(zhì)緩沖。一旦緩沖液交換，將樣品在制劑緩沖液中稀釋至適當(dāng)?shù)墓ぷ鳚舛?。蛋白質(zhì)產(chǎn)率評估(體外)抗體或抗體變體產(chǎn)率通過在上清液中的產(chǎn)物滴度和蛋白a純化(例如通過夾心elisa，280nm處的吸光度，或通過hplc蛋白a定量)估計。圖1顯示了每個候選抗體在25mlchok1sv培養(yǎng)物中的表達水平。所有變體顯示相似的表達水平。綴合用生物素-馬來酰亞胺綴合，通過標準技術(shù)junutulajretal,naturebiotechnology2008,8,925-932；jeffreyscetal,bioconjugatechem.2013,24,1256-1263綴合至游離硫醇基團。例如，對于綴合至毒素，在35℃和ph7.7下，用tris(2-羧乙基)膦(12.5當(dāng)量)還原工程化抗體2小時。將混合物用緩沖液交換成50mmtris，5mmedta，ph7.7。加入脫氫抗壞血酸(15當(dāng)量)，氧化反應(yīng)在24℃下進行3小時。加入n,n-二甲基乙酰胺以達到通常在1至5％之間的濃度。加入馬來酰亞氨基己酰基-纈氨酸-瓜氨酸-p-氨基苯甲酸氧基羰基-單甲基auristatin(5當(dāng)量)，綴合反應(yīng)在22℃下進行1小時。通過加入n-乙?；腚装彼?5當(dāng)量)來猝滅反應(yīng)。在22℃孵育0.5小時后，將混合物緩沖交換成1×pbs。聚集傾向/片段化評估(體外)在綴合之前和之后，定量使用大小排阻層析hplc(sec-hplc)并定性使用sdspage測量由于抗體聚集和/或片段化而損失的單體百分比。對于后者，每個變體抗體用β巰基乙醇處理，或不給予處理，并在sdspage上大小分級。沒有可見的變體的明顯聚集或片段化。綴合和非綴合樣品的sec-hplc分析結(jié)果顯示在圖2中，其中使用zorbax-250gf柱上1mg/ml的樣品。令人驚奇的是，與親本/未突變抗體相比，本發(fā)明的一些抗體例如hcs139c，hcv170c，hcs160c，hct200c，lcv191c，lct206c和lct180c顯示較少的單體損失，和/或減少量的抗體聚集或片段化。結(jié)合動力學(xué)評估(體外)還使用石英晶體微量天平分析變體的結(jié)合動力學(xué)。將erb2/her2fc嵌合體固定在羧基芯片上，并測試了三種不同濃度的各變體(綴合和非綴合)。下表總結(jié)了每個變體的kd：藥物抗體比(dar)評估(體外)最后，通過液相層析-電噴霧離子化-串聯(lián)質(zhì)譜法(lc-esi-ms/ms或lc-esi-ms)測定每種變體的dar。不同變體的dar值必須>1.7和<2.2，因為每個抗體存在兩個位點特異性綴合位點。為了測定，1mg/ml的dar樣品用pngasef處理。通過rp層析，電噴霧和質(zhì)譜分析還原和未還原的樣品。生物素-馬來酰亞胺與變體輕鏈和重鏈綴合的程度分別如圖3和圖4所示，每個變體的計算dar如圖5所示。結(jié)合和去綴合評估(體外)當(dāng)體外分析adc的穩(wěn)定性時，8天期間綴合分子的平均損失百分比應(yīng)低于39％。選擇六種優(yōu)選的變體，然后進一步分析優(yōu)選六種變體的每一種。在37℃下8天將人血清中四種不同濃度(150ng/ml；300ng/ml；1000ng/ml和2000ng/ml)的每種最終變體測定綴合穩(wěn)定性(去綴合水平)。在第0,2,4和8天取樣，并通過elisa進行分析。8天內(nèi)生物素的降低百分比如圖6所示。然后將最終六種變體中的每一種根據(jù)期望的特征(純度，dar，去綴合和陽性環(huán)境)評級，并且從6(＝最佳)到1(＝最差)打分。然后總計得分，給出從4到24的總分。這表明每種抗體進一步開發(fā)的可取性。分數(shù)如下表所示。盡管以這種方式可以對抗體變體進行排序，但是由于最終六個中的每一個已經(jīng)通過初始選擇過程，所以它們都可以被認為具有作為adc開發(fā)的理想特性。特別地，并不是每個抗體都將通過后續(xù)的藥物開發(fā)過程和體內(nèi)測試來實現(xiàn)，所以能夠產(chǎn)生候選者的選擇是有益的。此外，未被選擇用于最終六個的其他變體，例如本文公開的其余變體也可以具有有益的性質(zhì)，因此被認為可用于進一步的研究。六個最終變體是：四個重鏈(s160c，t190c，s443c，s447c)和兩條輕鏈(t180c或t206c)變體。作為選擇的順序方法的結(jié)果，所有最終變體可以預(yù)期共享許多特定性質(zhì)(或設(shè)計標準)：穩(wěn)定性；低聚集；低化學(xué)降解風(fēng)險；低不希望的翻譯后修飾；保持結(jié)構(gòu)穩(wěn)定；生產(chǎn)率；綴合適用性；和生物活性。每個測試變體的值如下表所示；突出顯示了六個最終選定的變體。隨后，通過標準技術(shù)將最終的六種變體與單甲基auristatine(mmae)綴合。綴合方法廣泛地遵循上述方法。如上所述測定所選變體的dar。結(jié)果的一個例子如圖7所示。cond1-3表示綴合過程中的較小變體，其參數(shù)變化以嘗試優(yōu)化dar；在綴合之前的抗體的還原時間和溫度在條件1至3中的每種中變化：條件1：在35℃下還原2小時(如上所述)條件2：在25℃下還原2小時條件3：在35℃下還原1小時。還使用與上述相同的技術(shù)測試了組合lct180c和hcs160c的雙突變體(dm)以確定聚集傾向和dar數(shù)據(jù)。結(jié)果如下表所示：來自瞬時轉(zhuǎn)染的dm聚集數(shù)據(jù)使用大小排阻層析法來自瞬時轉(zhuǎn)染的dmdar數(shù)據(jù)使用plrphplc或esi-ms方法變體plrp完好物質(zhì)dm3.773.97體外毒性試驗在mmae綴合后，測試adc變體的體外細胞毒性。通過標準技術(shù)進行分析(andreotti,p.e.等cancerres1995.55,5276–82；gerhardt,r.t.等am.j.obstet.gynecol1991165,245–55)。選擇用于測定的細胞是基于never.m.等cancercell200610,515-527。測定圖解：第1天：用以下每一種接種三個96-孔板：在培養(yǎng)基(mccoy5a+10％fbs+1xpen/strep)中skbr3細胞(5k/孔)，在培養(yǎng)基(dmem/f12+10％fbs+1xpen/strep)中bt474細胞(8k/孔),和在培養(yǎng)基(rpmi+10％fbs+1xpen/strep)中mcf7細胞(4k/孔)。在37℃加濕的co2培養(yǎng)箱中孵育18小時。第2天：準備adc變體樣品稀釋液。將這些樣品的初始667nm工作庫存制備在含10％fbs的rpmi培養(yǎng)基中。然后在培養(yǎng)基中制備從667nm至11pm的1/3系列稀釋。將5ul稀釋液加入到～100ul細胞的每個孔中。最終樣品濃度范圍為33.3nm至0.56pm(以1/3系列稀釋度計)。在37℃下在加濕的co2培養(yǎng)箱中孵育72小時。第4天：在顯微鏡下評估板第5天：使用cell-titerglo試劑測定細胞生存力：-從96孔板中吸出培養(yǎng)基。-在每個孔中加入100μlcell-titerglo試劑(promegainc.)。在室溫下孵育10分鐘。-使用tecanultra讀板器測定發(fā)光。-以生存力百分比相對于濃度(nm)分析和繪制數(shù)據(jù)，或者作為隨機發(fā)光。結(jié)果示例如圖8所示。從圖8可以看出，adc變體hcs443c和lct180c在非常低的濃度下將skbr3細胞和bt474細胞的生存力降低50％，而這些adc變體在較低反應(yīng)性細胞(如mcf7)中在72小時內(nèi)不顯示作用。本文所述每種變體的變體鏈的完整序列如下所示。這些僅顯示變體鏈；另一條鏈將與未修飾的曲妥珠單抗序列(即seqidno1(lc)或2(hc))相同。重鏈：＞hchers139c(seqidno3)evqlvesggglvqpggslrlscaasgfnikdtyihwvrqapgkglewvariyptngytryadsvkgrftisadtskntaylqmnslraedtavyycsrwggdgfyamdywgqgtlvtvssastkgpsvfplapsskstcggtaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtqtyicnvnhkpsntkvdkrvepkscdkthtcppcpapellggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsreemtknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk＞hchers160c(seqidno4)evqlvesggglvqpggslrlscaasgfnikdtyihwvrqapgkglewvariyptngytryadsvkgrftisadtskntaylqmnslraedtavyycsrwggdgfyamdywgqgtlvtvssastkgpsvfplapsskstsggtaalgclvkdyfpepvtvcwnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtqtyicnvnhkpsntkvdkrvepkscdkthtcppcpapellggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsreemtknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk＞hchers168c(seqidno5)evqlvesggglvqpggslrlscaasgfnikdtyihwvrqapgkglewvariyptngytryadsvkgrftisadtskntaylqmnslraedtavyycsrwggdgfyamdywgqgtlvtvssastkgpsvfplapsskstsggtaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltcgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtqtyicnvnhkpsntkvdkrvepkscdkthtcppcpapellggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsreemtknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk＞hcherv170c(seqidno6)evqlvesggglvqpggslrlscaasgfnikdtyihwvrqapgkglewvariyptngytryadsvkgrftisadtskntaylqmnslraedtavyycsrwggdgfyamdywgqgtlvtvssastkgpsvfplapsskstsggtaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgchtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtqtyicnvnhkpsntkvdkrvepkscdkthtcppcpapellggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngk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tasvvcllnnfypreakvqwkvdnalqsgnsqesvteqdskdstyslsstltlskadyekhkvyacevthqglsspvtkcfnrgec應(yīng)當(dāng)理解，可以使用類似的選擇和篩選過程來開發(fā)其他變體抗體，不僅是基于曲妥珠單抗的那些，而且還可以預(yù)期，具有如本文所鑒定的相同恒定區(qū)突變的這些其它抗體的變體也預(yù)期具有類似的期望性質(zhì)。序列表<110>lonzaltd<120>抗體<130>pc927465wo<150>gb1502591.9<151>2015-02-16<150>gb1504858.0<151>2015-03-23<160>40<170>bissap1.3<210>1<211>214<212>prt<213>人工序列<220><223>曲妥珠單抗未修飾的輕鏈<400>1aspileglnmetthrglnserproserserleuseralaservalgly151015aspargvalthrilethrcysargalaserglnaspvalasnthrala202530valalatrptyrglnglnlysproglylysalaprolysleuleuile354045tyrseralaserpheleutyrserglyvalproserargphesergly505560serargserglythraspphethrleuthrileserserleuglnpro65707580gluaspphealathrtyrtyrcysglnglnhistyrthrthrpropro859095thrpheglyglnglythrlysvalgluilelysargthrvalalaala100105110proservalpheilepheproproseraspgluglnleulyssergly115120125thralaservalvalcysleuleuasnasnphetyrproarggluala130135140lysvalglntrplysvalaspasnalaleuglnserglyasnsergln145150155160gluservalthrgluglnaspserlysaspserthrtyrserleuser165170175serthrleuthrleuserlysalaasptyrglulyshislysvaltyr180185190alacysgluvalthrhisglnglyleuserserprovalthrlysser195200205pheasnargglyglucys210<210>2<211>448<212>prt<213>人工序列<220><223>曲妥珠單抗未修飾的重鏈<400>2gluvalglnleuvalgluserglyglyglyleuvalglnproglygly151015serleuargleusercysalaalaserglypheasnilelysaspthr202530tyrilehistrpvalargglnalaproglylysglyleuglutrpval354045alaargiletyrprothrasnglytyrthrargtyralaaspserval505560lysglyargphethrileseralaaspthrserlysasnthralatyr65707580leuglnmetasnserleuargalagluaspthralavaltyrtyrcys859095serargtrpglyglyaspglyphetyralametasptyrtrpglygln100105110glythrleuvalthrvalserseralaserthrlysglyproserval115120125pheproleualaproserserlysserthrserglyglythralaala130135140leuglycysleuvallysasptyrpheprogluprovalthrvalser145150155160trpasnserglyalaleuthrserglyvalhisthrpheproalaval165170175leuglnserserglyleutyrserleuserservalvalthrvalpro180185190serserserleuglythrglnthrtyrilecysasnvalasnhislys195200205proserasnthrlysvalasplyslysvalgluprolyssercysasp210215220lysthrhisthrcysproprocysproalaprogluleuleuglygly225230235240proservalpheleupheproprolysprolysaspthrleumetile245250255serargthrprogluvalthrcysvalvalvalaspvalserhisglu260265270aspprogluvallyspheasntrptyrvalaspglyvalgluvalhis275280285asnalalysthrlysproargglugluglntyrasnserthrtyrarg290295300valvalservalleuthrvalleuhisglnasptrpleuasnglylys305310315320glutyrlyscyslysvalserasnlysalaleuproalaproileglu325330335lysthrileserlysalalysglyglnproarggluproglnvaltyr340345350thrleuproproserargaspgluleuthrlysasnglnvalserleu355360365thrcysleuvallysglyphetyrproseraspilealavalglutrp370375380gluserasnglyglnprogluasnasntyrlysthrthrproproval385390395400leuaspseraspglyserphepheleutyrserlysleuthrvalasp405410415lysserargtrpglnglnglyasnvalphesercysservalmethis420425430glualaleuhisasnhistyrthrglnlysserleuserleuserpro435440445<210>3<211>450<212>prt<213>人工序列<220><223>修飾的重鏈<400>3gluvalglnleuvalgluserglyglyglyleuvalglnproglygly151015serleuargleusercysalaalaserglypheasnilelysaspthr202530tyrilehistrpvalargglnalaproglylysglyleuglutrpval354045alaargiletyrprothrasnglytyrthrargtyralaaspserval505560lysglyargphethrileseralaaspthrserlysasnthralatyr65707580leuglnmetasnserleuargalagluaspthralavaltyrtyrcys859095serargtrpglyglyaspglyphetyralametasptyrtrpglygln100105110glythrleuvalthrvalserseralaserthrlysglyproserval115120125pheproleualaproserserlysserthrcysglyglythralaala130135140leuglycysleuvallysasptyrpheprogluprovalthrvalser145150155160trpasnserglyalaleuthrserglyvalhisthrpheproalaval165170175leuglnserserglyleutyrserleuserservalvalthrvalpro180185190serserserleuglythrglnthrtyrilecysasnvalasnhislys195200205proserasnthrlysvalasplysargvalgluprolyssercysasp210215220lysthrhisthrcysproprocysproalaprogluleuleuglygly225230235240proservalpheleupheproprolysprolysaspthrleumetile245250255serargthrprogluvalthrcysvalvalvalaspvalserhisglu260265270aspprogluvallyspheasntrptyrvalaspglyvalgluvalhis275280285asnalalysthrlysproargglugluglntyrasnserthrtyrarg290295300valvalservalleuthrvalleuhisglnasptrpleuasnglylys305310315320glutyrlyscyslysvalserasnlysalaleuproalaproileglu325330335lysthrileserlysalalysglyglnproarggluproglnvaltyr340345350thrleuproproserarggluglumetthrlysasnglnvalserleu355360365thrcysleuvallysglyphetyrproseraspilealavalglutrp370375380gluserasnglyglnprogluasnasntyrlysthrthrproproval385390395400leuaspseraspglyserphepheleutyrserlysleuthrvalasp405410415lysserargtrpglnglnglyasnvalphesercysservalmethis420425430glualaleuhisasnhistyrthrglnlysserleuserleuserpro435440445glylys450<210>4<211>450<212>prt<213>人工序列<220><223>修飾的重鏈<400>4gluvalglnleuvalgluserglyglyglyleuvalglnproglygly151015serleuargleusercysalaalaserglypheasnilelysaspthr202530tyrilehistrpvalargglnalaproglylysglyleuglutrpval354045alaargiletyrprothrasnglytyrthrargtyralaaspserval505560lysglyargphethrileseralaaspthrserlysasnthralatyr65707580leuglnmetasnserleuargalagluaspthralavaltyrtyrcys859095serargtrpglyglyaspglyphetyralametasptyrtrpglygln100105110glythrleuvalthrvalserseralaserthrlysglyproserval115120125pheproleualaproserserlysserthrserglyglythralaala130135140leuglycysle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