交叉引用的申請本申請要求2014年11月5日提交的專利合作條約(pct)申請?zhí)杙ct/us2014/064165、2015年5月6日提交的美國臨時申請?zhí)?2/157,928和2015年10月27日提交的美國臨時申請?zhí)?2/247,108的權(quán)益，它們中的每一篇通過引用整體并入本文。序列表本申請含有序列表，其已經(jīng)通過efs-web以ascii格式遞交，并特此通過引用整體并入。所述ascii拷貝（創(chuàng)建于2015年11月3日）被命名為sc2703pct_s69697_1270wo_seql_110315.txt，且具有247,510字節(jié)的大小。本發(fā)明一般地涉及過繼免疫療法，其包含摻入封閉蛋白（claudin）(cldn)結(jié)合結(jié)構(gòu)域的新嵌合抗原受體的應(yīng)用。在優(yōu)選的實施方案中，公開的嵌合抗原受體可用于治療或預(yù)防增殖性病癥及其任何復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移。
背景技術(shù)：
：干細胞和祖細胞的分化和增殖是正常的持續(xù)過程，其一致地起作用以支持器官發(fā)生、細胞修復(fù)和細胞替代過程中的組織生長。緊密地調(diào)節(jié)系統(tǒng)以確?；谏锏男枰鴥H產(chǎn)生適當?shù)男盘?。細胞增殖和分化通常僅在對于替換受損傷的或正在死亡的細胞而言或?qū)τ谏L而言必要時發(fā)生。但是，這些過程的破壞可以由許多因素觸發(fā)，所述因素包括各種信號傳導(dǎo)化學(xué)物質(zhì)的不足或過多、改變的微環(huán)境的存在、基因突變或它們的組合。正常細胞增殖和/或分化的破壞可以導(dǎo)致各種病癥，包括增殖性疾病諸如癌癥。用于癌癥的常規(guī)治療性治療包括化學(xué)療法、放射療法和免疫療法。這些治療經(jīng)常是無效的，且外科手術(shù)切除術(shù)不可提供可行的臨床替代?，F(xiàn)有護理標準的限制在患者經(jīng)歷第一線治療且隨后復(fù)發(fā)的那些情況下尤其明顯。在此類情況下，難治性腫瘤頻繁出現(xiàn)，其經(jīng)常為侵襲性的和不可治愈的。對于許多實體瘤而言，總生存率在多年中維持基本上不變，這至少部分地歸因于防止復(fù)發(fā)、腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的現(xiàn)有療法的失敗。因此，仍然非常需求開發(fā)針對增殖性病癥的更靶向和有效的療法。本發(fā)明解決了該需求。發(fā)明概況在一個寬的方面，本發(fā)明提供了包含cldn結(jié)合結(jié)構(gòu)域的新嵌合抗原受體(car)(cldncar)，所述cldn結(jié)合結(jié)構(gòu)域特異性地結(jié)合cldn家族的至少一種蛋白。在選擇的實施方案中，本發(fā)明的cldncar特異性地結(jié)合cldn6或特異性地結(jié)合cldn6和cldn9。在其它的實施方案中，本發(fā)明的抗體以基本上相同的表觀結(jié)合親和力結(jié)合cldn6和cldn9。在其它實施方案中，公開的car可以與cldn4交叉反應(yīng)。在其它優(yōu)選的實施方案中，在腫瘤起始細胞上表達cldn靶蛋白。通過遺傳修飾(例如，轉(zhuǎn)導(dǎo))，在細胞毒性的淋巴細胞(優(yōu)選自體的)上表達cldncar以提供cldn敏感的淋巴細胞，其用于靶向和殺傷cldn陽性的腫瘤細胞。如在本文中將廣泛地討論的，本發(fā)明的car通常包含含有cldn結(jié)合結(jié)構(gòu)域的細胞外結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)域和細胞內(nèi)信號傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域，所述細胞內(nèi)信號傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域活化某些淋巴細胞并產(chǎn)生針對cldn陽性的腫瘤細胞(即，是cldn6+和/或cldn9+和/或cldn4+的那些)的免疫應(yīng)答。本發(fā)明的選擇的實施方案包含表達公開的car的免疫活性的宿主細胞以及編碼本發(fā)明的cldncar的各種多核苷酸序列和載體。其它方面包括增強個體中的t淋巴細胞或天然殺傷(nk)細胞活性的方法，以及通過向個體中引入表達cldncar分子的宿主細胞來治療遭受癌癥的個體的方法。這樣的方面具體地包括肺癌(例如，小細胞肺癌)、黑素瘤、乳腺癌、前列腺癌、結(jié)腸癌、腎細胞癌、卵巢癌、神經(jīng)母細胞瘤、橫紋肌肉瘤、白血病和淋巴瘤的治療。如在下面更詳細地討論的，本文中使用的術(shù)語“抗體”應(yīng)當認為是指完整抗體(例如，igg或igm)以及它們的任何免疫反應(yīng)片段(例如，fab片段)或免疫反應(yīng)構(gòu)建體或衍生物(例如，scfv)。在某些實施方案中，本發(fā)明的cldn結(jié)合結(jié)構(gòu)域(和cldncar)將包含scfv構(gòu)建體，且在優(yōu)選的實施方案中，將包含與含有本文中公開的重鏈和輕鏈可變區(qū)的抗體競爭結(jié)合的scfv構(gòu)建體。在其它優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的cldn結(jié)合結(jié)構(gòu)域(和cldncar)將包含這樣的scfv構(gòu)建體：其包含本文中公開的重鏈和輕鏈可變區(qū)或其片段。這樣，為了本發(fā)明的目的，術(shù)語“抗體”應(yīng)當一般地使用，且將明確地意在包括其免疫反應(yīng)片段、構(gòu)建體或衍生物，除非另外根據(jù)上下文指出。在本發(fā)明的特定方面，所述car結(jié)合結(jié)構(gòu)域結(jié)合cldn家族的至少一個成員(例如，cldn4、cldn6和/或cldn9)，且將源自、包含抗體或抗體片段或者與抗體或抗體片段競爭結(jié)合，所述抗體或抗體片段包含：seqidno:21的輕鏈可變區(qū)(vl)和seqidno:23的重鏈可變區(qū)(vh)；或seqidno:25的vl和seqidno:27的vh；或seqidno:29的vl和seqidno:31的vh；或seqidno:33的vl和seqidno:35的vh；或seqidno:37的vl和seqidno:39的vh；或seqidno:41的vl和seqidno:43的vh；或seqidno:45的vl和seqidno:47的vh；或seqidno:49的vl和seqidno:51的vh；或seqidno:53的vl和seqidno:55的vh；或seqidno:57的vl和seqidno:59的vh。在特別優(yōu)選的實施方案中，所述cldn結(jié)合結(jié)構(gòu)域?qū)星笆鰒l和vh序列或其片段的scfv構(gòu)建體。在本發(fā)明的某些方面，所述car結(jié)合結(jié)構(gòu)域包含嵌合的、cdr移植的、人源化的或人的抗體或其免疫反應(yīng)片段。在本發(fā)明的其它方面，包含前述序列的car結(jié)合結(jié)構(gòu)域是內(nèi)化抗體。在其它的實施方案中，所述car結(jié)合結(jié)構(gòu)域特異性地結(jié)合clnd6；或特異性地結(jié)合cldn6和cldn9，并與抗體競爭結(jié)合，所述抗體包含：seqidno:21的輕鏈可變區(qū)(vl)和seqidno:23的重鏈可變區(qū)(vh)；或seqidno:25的vl和seqidno:27的vh；或seqidno:29的vl和seqidno:31的vh；或seqidno:33的vl和seqidno:35的vh；或seqidno:37的vl和seqidno:39的vh；或seqidno:41的vl和seqidno:43的vh；或seqidno:45的vl和seqidno:47的vh；或seqidno:49的vl和seqidno:51的vh；或seqidno:53的vl和seqidno:55的vh；或seqidno:57的vl和seqidno:59的vh。本發(fā)明的其它優(yōu)選的car將包含cdr移植的或人源化的car結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其包含一個或多個如在圖3a或3b中所示的重(cdrh1、cdrh2、cdrh3)或輕(cdrl1、cdrl2、cdrl3)鏈cdr，其中所述cdr按照kabat等人衍生出。在一個特定實施方案中，本發(fā)明包含結(jié)合結(jié)構(gòu)域，所述結(jié)合結(jié)構(gòu)域結(jié)合cldn家族的至少一種蛋白并與抗體競爭結(jié)合，所述抗體包含如在seqidno:61中所示的三個可變輕鏈cdr(cdrl)；和如在seqidno:63中所示的三個可變重鏈cdr(cdrh)；或如在seqidno:65中所示的三個cdrl和如在seqidno:67中所示的三個cdrh；或如在seqidno:69中所示的三個cdrl和如在seqidno:71中所示的三個cdrh；如在seqidno:73中所示的三個cdrl和如在seqidno:87中所示的三個cdrh。在另一個實施方案中，本發(fā)明包含人源化的或cdr移植的結(jié)合結(jié)構(gòu)域，所述結(jié)合結(jié)構(gòu)域結(jié)合cldn家族的至少一種蛋白并與抗體競爭結(jié)合，所述抗體包含vh和vl，其中所述vl具有三個cdrl，所述cdrl包含seqidno:151的cdrl1、seqidno:152的cdrl2和seqidno:153的cdrl3；或vl具有三個cdrl，所述cdrl包含seqidno:157的cdrl1、seqidno:158的cdrl2和seqidno:159的cdrl3；或vl具有三個cdrl，所述cdrl包含seqidno:163的cdrl1、seqidno:164的cdrl2和seqidno:165的cdrl3；或vl具有三個cdrl，所述cdrl包含seqidno:169的cdrl1、seqidno:170的cdrl2和seqidno:171的cdrl3。在另一個實施方案中，本發(fā)明包含人源化的或cdr移植的結(jié)合結(jié)構(gòu)域，所述結(jié)合結(jié)構(gòu)域結(jié)合cldn家族的至少一種蛋白并與抗體競爭結(jié)合，所述抗體包含vl和vh，其中所述vh具有三個cdr(cdrh)，所述cdrh包含seqidno:154的cdrh1、seqidno:155的cdrh2和seqidno:156的cdrh3；或所述vh具有三個cdrh，所述cdrh包含seqidno:160的cdrh1、seqidno:161的cdrh2和seqidno:162的cdrh3；或所述vh具有三個cdrh，所述cdrh包含seqidno:166的cdrh1、seqidno:167的cdrh2和seqidno:168的cdrh3；或所述vh具有三個cdrh，所述cdrh包含seqidno:172的cdrh1、seqidno:173的cdrh2和seqidno:174的cdrh3；或所述vh具有三個cdrh，所述cdrh包含seqidno:172的cdrh1、seqidno:176的cdrh2和seqidno:174的cdrh3。在另一個實施方案中，本發(fā)明包含人源化的或cdr移植的結(jié)合結(jié)構(gòu)域，所述結(jié)合結(jié)構(gòu)域結(jié)合cldn家族的至少一種蛋白并與抗體競爭結(jié)合，所述抗體包含vl和vh，其中所述vl具有三個cdrl，所述cdrl包含seqidno:151的cdrl1、seqidno:152的cdrl2和seqidno:153的cdrl3，且所述vh具有三個cdrh，所述cdrh包含seqidno:154的cdrh1、seqidno:155的cdrh2和seqidno:156的cdrh3；或包含vl和vh的抗體，其中所述vl具有三個cdrl，所述cdrl包含seqidno:157的cdrl1、seqidno:158的cdrl2和seqidno:159的cdrl3，且所述vh具有三個cdrh，所述cdrh包含seqidno:160的cdrh1、seqidno:161的cdrh2和seqidno:162的cdrh3；或包含vl和vh的抗體，其中所述vl具有三個cdrl，所述cdrl包含seqidno:163的cdrl1、seqidno:164的cdrl2和seqidno:165的cdrl3，且所述vh具有三個cdrh，所述cdrh包含seqidno:166的cdrh1、seqidno:167的cdrh2和seqidno:168的cdrh3；或包含vl和vh的抗體，其中所述vl具有三個cdrl，所述cdrl包含seqidno:169的cdrl1、seqidno:170的cdrl2和seqidno:171的cdrl3，且所述vh具有三個cdrh，所述cdrh包含seqidno:172的cdrh1、seqidno:173的cdrh2和seqidno:174的cdrh3；或包含vl和vh的抗體，其中所述vl具有三個cdrl，所述cdrl包含seqidno:169的cdrl1、seqidno:170的cdrl2和seqidno:171的cdrl3，且所述vh具有三個cdrh，所述cdrh包含seqidno:172的cdrh1、seqidno:176的cdrh2和seqidno:174的cdrh3。在特別優(yōu)選的實施方案中，所述car結(jié)合結(jié)構(gòu)域?qū)⑴c包含seqidno:69的vl和seqidno:71的vh的抗體競爭。在其它實施方案中，所述car構(gòu)建體將包含含有seqidno:69的vl和seqidno:71的vh的結(jié)合結(jié)構(gòu)域。優(yōu)選地所述結(jié)合結(jié)構(gòu)域?qū)瑂cfv。在其它特別優(yōu)選的實施方案中，所述car結(jié)合結(jié)構(gòu)域?qū)⑴c包含seqidno:73的vl和seqidno:87的vh的抗體競爭。在其它實施方案中，所述car構(gòu)建體將包含含有seqidno:73的vl和seqidno:87的vh的結(jié)合結(jié)構(gòu)域。優(yōu)選地所述結(jié)合結(jié)構(gòu)域?qū)瑂cfv。在某些優(yōu)選的實施方案中，前述嵌合抗原受體中的每一種包含人源化的或cdr移植的結(jié)合結(jié)構(gòu)域。當在公開的結(jié)合結(jié)構(gòu)域的上下文中使用時，術(shù)語“競爭”或“競爭抗體”是指抗體之間的結(jié)合競爭，如通過測定所確定的，在所述測定中，參比抗體或免疫學(xué)功能片段基本上(例如，大于30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%或90%)阻止或抑制測試抗體與共同抗原的特異性結(jié)合。用于確定這樣的競爭的適合方法包括本領(lǐng)域已知的技術(shù)，例如，生物層干擾量度法、表面等離子體共振、流式細胞計量術(shù)、競爭性elisa等。在某些實施方案中，本發(fā)明涉及一種編碼car的核酸，所述car包含本文中公開的任一種抗-cldn結(jié)合結(jié)構(gòu)域的重鏈或輕鏈氨基酸序列。在這點上，編碼這樣的示例性的人源化的或cdr移植的重鏈和輕鏈可變區(qū)的核酸序列闡述在附帶的圖3c和序列表中。在優(yōu)選的實施方案中，將所述編碼結(jié)合結(jié)構(gòu)域或car的核酸摻入在質(zhì)?；蜉d體中。在其它的實施方案中，所述載體將包含病毒載體。在其它實施方案中，本發(fā)明提供了治療癌癥諸如胰腺癌、卵巢癌、結(jié)直腸癌、小細胞肺癌和非小細胞肺癌和胃癌的方法，所述方法包括施用藥物組合物，所述藥物組合物包含表達本文中公開的抗-cldncar的宿主細胞。在某些實施方案中，本發(fā)明提供了治療癌癥的方法，所述方法包括施用藥物組合物，所述藥物組合物包含表達本文中公開的抗-cldncar的宿主細胞且還包括給所述受試者施用至少一種另外的治療部分。在優(yōu)選的實施方案中，所述宿主細胞將包含敏化的淋巴細胞。本發(fā)明也提供了一種減少腫瘤細胞群體中的腫瘤起始細胞的方法，其中所述方法包括，使包含腫瘤起始細胞和除了腫瘤起始細胞以外的腫瘤細胞的腫瘤細胞群體與表達抗-cldncar的宿主細胞接觸，由此降低腫瘤起始細胞的頻率。在其它優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明也提供了可用于治療cldn相關(guān)病癥諸如癌癥的試劑盒或裝置和有關(guān)的方法。為此目的，本發(fā)明優(yōu)選地提供了一種制成品，其可用于產(chǎn)生用于治療cldn相關(guān)病癥的cldn敏化的淋巴細胞，所述制成品包括例如，含有編碼公開的car的載體(例如，病毒載體)的容器，和關(guān)于產(chǎn)生cldn敏化的淋巴細胞的指導(dǎo)材料。在選擇的實施方案中，所述試劑盒將包含另外的試劑和容器以有效地轉(zhuǎn)導(dǎo)所述淋巴細胞。在某些選擇的實施方案中，所述試劑盒將用于轉(zhuǎn)導(dǎo)得自要治療的患者的自體淋巴細胞。在其它選擇的實施方案中，這樣的試劑盒包含同種異體的cldn敏化的淋巴細胞，其可以直接施用給所述患者以產(chǎn)生期望的免疫應(yīng)答。前述是概述，且因而必然地含有細節(jié)的簡化、泛化和省略；因此，本領(lǐng)域技術(shù)人員會明白，所述概述僅僅是示例性的，且無意以任何方式限制。將從本文闡述的教導(dǎo)中明白本文描述的方法、組合物和/或裝置和/或其它主題的其它方面、特征和優(yōu)點。提供所述概述來以簡化形式介導(dǎo)概念的選擇，所述概念在下面在詳細描述中進一步描述。該概述無意鑒別要求保護的主題的關(guān)鍵特征或基本特征，也無意用作確定要求保護的主題的范圍的輔助。附圖簡述圖1顯示了通過選擇的患者衍生的異種移植物(pdx)腫瘤中的全轉(zhuǎn)錄組(solid)測序確定的cdln4、cldn6和cldn9的相對mrna表達水平，其中根據(jù)在下面表3中列出的縮寫表示腫瘤類型；圖2a-2c顯示了cldn家族成員之間的關(guān)聯(lián)，其中圖2a是顯示由23種人cldn基因編碼的30種cldn蛋白之間的相似性的相對程度的樹形圖；圖2b是cldn4、cldn6和cldn9中的細胞外結(jié)構(gòu)域(ecd)1或ecd2的氨基酸殘基的同一性百分比的表格表示；且圖2c是包含cldn4、cldn6和cldn9的人、大鼠、小鼠和食蟹猴直系同源物的集合的16種蛋白之間的ecd1環(huán)和ecd2環(huán)中的氨基酸殘基的同一性百分比的表格表示；圖3a-3c以表格形式提供了示例性的小鼠和人源化抗-cldn抗體(seqidno:21-75，奇數(shù))和hsc27.22、hsc27.108和hsc27.204的變體的輕鏈(圖3a)和重鏈(圖3b)連續(xù)可變區(qū)氨基酸序列，而圖3c顯示了這樣的示例性的小鼠和人源化的抗-cldn抗體(seqidno:20-74，偶數(shù))以及抗體hsc27.22、hsc27.108和hsc27.204的變體的相同輕鏈和重鏈可變區(qū)的核酸序列；圖4a-4c證實了本發(fā)明的某些結(jié)合結(jié)構(gòu)域的交叉反應(yīng)性，其中圖4a顯示了抗-cldn結(jié)合結(jié)構(gòu)域sc27.1和sc27.22的結(jié)合過表達人cldn4、cldn6和cldn9的hek-293t細胞的能力，圖4b顯示了抗-cldn抗體的結(jié)合過表達cldn4、cldn6和cldn9的hek-293t細胞的能力，且圖4c用圖解釋了一種示例性的抗-cldn抗體對cldn6和cldn9的表觀結(jié)合親和力，如通過相對于固定數(shù)目的表達目標抗原的細胞滴定抗體的量所確定的；圖5提供了與本文中的教導(dǎo)一致的示例性cldncar構(gòu)建體的示意圖；圖6a-6d描繪了本發(fā)明的兩種新嵌合抗原受體sct1-sc27.108和sct1-sc27.204v2的核酸(圖6a和6c)和氨基酸(圖6b和6d)序列；圖7提供的示意圖解釋了用于生產(chǎn)cldn敏化的淋巴細胞的方法和它們隨后用于制備針對cldn陽性腫瘤細胞的免疫應(yīng)答的用途；圖8a和8b證實了示例性cldncar在轉(zhuǎn)導(dǎo)的jurkat細胞上的表達(圖8a)和hcldn在經(jīng)工程改造的hek-293t對照細胞上的表達(圖8b)，各自使用流式細胞計量術(shù)來測量；圖9a和9b描繪了cldncarjurkat細胞與表達cldn的對照細胞的比率，其用于計量示例性的cldncar細胞的活性(圖9a)以及通過il-2產(chǎn)生來測量的sct1-h27.108或sct1-h27.204v2轉(zhuǎn)導(dǎo)的jurkat細胞中的免疫應(yīng)答的誘導(dǎo)(圖9b)；圖10證實，可以將來自兩個個體的人淋巴細胞工程改造以有效地表達根據(jù)本文中的教導(dǎo)的抗-cldncar(sct1-h27.108或sct1-h27.204v2)；圖11a和11b提供了經(jīng)工程改造成表達cldn6的293t細胞系(圖11a)和卵巢癌患者衍生出的異種移植物(“pdx”)細胞系(圖11b)的cldn表面表達概況，如通過流式細胞計量術(shù)所證實的；圖12a和12b證實了當暴露于經(jīng)工程改造的293t細胞(圖12a)或pdx腫瘤細胞(圖12b)時，包含來自兩個個體的宿主細胞的cldn敏化的淋巴細胞的引起免疫應(yīng)答(如通過infγ的誘導(dǎo)所測量的)的能力；圖13a和13b證實了當暴露于經(jīng)工程改造的293t細胞(圖13a)或pdx腫瘤細胞(圖13b)時，包含來自兩個個體的宿主細胞的cldn敏化的淋巴細胞的引起免疫應(yīng)答(如通過tnfα的誘導(dǎo)所測量的)的能力；和圖14a和14b顯示了包含來自兩個個體的宿主細胞的cldn敏化的淋巴細胞消除暴露后的經(jīng)工程改造的293t細胞(圖14a)或pdx腫瘤細胞(圖14b)的能力。發(fā)明詳述本發(fā)明可以以許多不同的形式具體化。本文中公開了本發(fā)明的非限制性的示例性實施方案，它們例證了本發(fā)明的原理。本文中使用的任何段落標題僅僅用于組織目的，不應(yīng)解釋為限制描述的主題。為了本發(fā)明的目的，所有標識序列登錄號都可以在ncbi參照序列(refseq)數(shù)據(jù)庫和/或ncbigenbank?檔案序列數(shù)據(jù)庫中找到，除非另外指出。在過繼轉(zhuǎn)移免疫療法中的新近進展已經(jīng)提供了用于治療多種瘤形成的有前途的方案和改善患者體驗的機會，特別是就實體瘤而言。在這點上，本發(fā)明涉及包含細胞外結(jié)合或靶向結(jié)構(gòu)域的新嵌合抗原受體(“car”)的用途，所述結(jié)構(gòu)域與至少一個封閉蛋白家族成員(“cldn”)結(jié)合或反應(yīng)。優(yōu)選地，所述car將與cldn6、cldn4和/或cldn9中的至少一種免疫特異性地結(jié)合。如在本文中將廣泛地討論的，cldn(例如，cldn6)是在許多不同癌癥上表達的特別有效的腫瘤標志物，且顯著地已經(jīng)發(fā)現(xiàn)與癌癥干細胞有關(guān)。因而，當將本發(fā)明的抗-cldn結(jié)合結(jié)構(gòu)域摻入在淋巴細胞上表達的嵌合抗原受體中時，得到的“cldn敏化的淋巴細胞”(例如，免疫特異性地識別cldn的天然殺傷細胞或t細胞)能夠有效地引起針對異常cldn陽性細胞（包括癌癥干細胞）的免疫應(yīng)答。這種有效地消除致瘤“種子”細胞的能力經(jīng)常在減小腫瘤復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移的可能性中是關(guān)鍵性的。為此目的，應(yīng)當理解，本發(fā)明的抗-cldncart細胞可以與其它治療劑(包括抗-cldn抗體藥物綴合物)聯(lián)合使用，或用作護理治療標準以后的維持方案的組成部分。更具體地，嵌合抗原受體是人工構(gòu)建的雜合蛋白或多肽，其含有或包含與信號傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域(例如，t-細胞信號傳導(dǎo)或t-細胞活化結(jié)構(gòu)域)連接的抗體的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域。利用單克隆抗體的抗原結(jié)合性質(zhì)，car具有將這樣的敏化的淋巴細胞(例如，t-細胞)特異性和反應(yīng)性以非-mhc限制的方式重新導(dǎo)向cldn陽性的靶細胞的能力。非-mhc限制的抗原識別會給表達car的t-細胞提供獨立于抗原加工而識別cldn的能力，因而繞過腫瘤逃逸的主要機制。此外，當在t-細胞中表達時，car有利地不會與內(nèi)源性t細胞受體(tcr)α和β鏈二聚化，所述二聚化可能在應(yīng)用tcr工程改造技術(shù)時發(fā)生。因此，本發(fā)明一般地涉及包含cldn結(jié)合結(jié)構(gòu)域的嵌合抗原受體，所述cldn結(jié)合結(jié)構(gòu)域與靶細胞上的cldn免疫特異性地結(jié)合并刺激免疫應(yīng)答。在優(yōu)選的實施方案中，所述car的cldn結(jié)合結(jié)構(gòu)域可以包含從本文中公開的重鏈和輕鏈抗體可變區(qū)衍生出的scfv。更具體地，本發(fā)明的“抗-cldncar”或簡稱“cldncar”應(yīng)當包含摻入細胞外cldn結(jié)合結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)域和細胞內(nèi)信號傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域的嵌合蛋白(參見圖5)。通常，將合成或工程改造編碼期望的cldncar的核苷酸序列并插入表達載體或系統(tǒng)(例如慢病毒表達載體或系統(tǒng)、逆轉(zhuǎn)錄病毒表達載體或系統(tǒng)等)中。在優(yōu)選的實施方案中，然后將得自患者或供體的淋巴細胞（包括t-淋巴細胞和天然殺傷細胞(“nk細胞”)）暴露于(例如，轉(zhuǎn)導(dǎo))選擇的cldncar載體以提供經(jīng)工程改造的、表達具有細胞外cldn結(jié)合結(jié)構(gòu)域的car蛋白的淋巴細胞(即，“cldn敏化的淋巴細胞”)。在其它實施方案中，可以將同種異體細胞工程改造成表達公開的car以提供cldn敏化的淋巴細胞。在任選的繁殖以后，可以將這些cldn敏化的淋巴細胞輸入患者中以引起對cldn陽性的腫瘤細胞的免疫特異性應(yīng)答(通常參見圖7)。在這點上，cldn敏化的淋巴細胞在與表達cldn決定簇的靶細胞接觸后將被活化?；罨艋牧馨图毎?例如，t細胞和nk細胞)是指誘導(dǎo)它們的生物學(xué)狀態(tài)的變化，由此使所述細胞表達活化標志物、生產(chǎn)細胞因子、增殖和/或變得對靶細胞具有細胞毒性。所有這些變化可以由主要刺激信號產(chǎn)生，優(yōu)選地與擴大主要信號的量級的共刺激性信號一起，并在初步刺激以后抑制細胞死亡，從而導(dǎo)致更持久的活化狀態(tài)并因而導(dǎo)致更高的細胞毒性能力。進一步理解，除了cldn結(jié)合結(jié)構(gòu)域以外，本發(fā)明的car將包含細胞內(nèi)的或細胞質(zhì)的結(jié)構(gòu)域，其起始主要細胞質(zhì)信號傳導(dǎo)序列(例如，用于通過t-細胞受體復(fù)合物起始抗原依賴性的主要活化的序列)。適合的細胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域可以例如源自cd3ζ、fcrγ、fcrβ、cd3γ、cd3δ、cd3ε、cd5、cd22、cd79a、cd79b和cd66d。在其它優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的car將包含細胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域，其起始次要或共刺激信號。適合的共刺激性結(jié)構(gòu)域可以包含，例如，從cd2、cd4、cd5、cd8α、cd8β、cd28、cd134、cd137、icos、cd154、4-1bb和糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的腫瘤壞死因子受體衍生出的細胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域(參見u.s.p.n.us/2014/0242701)。另外，在優(yōu)選的實施方案中，公開的car將包含插入在所述細胞外cldn結(jié)合結(jié)構(gòu)域和所述細胞內(nèi)信號傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域之間的跨膜(和任選地間隔物)結(jié)構(gòu)域。如在下面更詳細地討論的，所述跨膜結(jié)構(gòu)域可以包含，例如，抗體恒定(fc)區(qū)的組成部分、人cd8a或本領(lǐng)域已知的人工生產(chǎn)的間隔物。基本上，將car錨定在細胞膜中并允許cldn結(jié)合結(jié)構(gòu)域的有效結(jié)合和從細胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域傳播適當信號傳導(dǎo)的任何氨基酸序列適合本發(fā)明。關(guān)于本發(fā)明的新穎的cldncar，應(yīng)當理解，cldn作為腫瘤靶標的選擇在產(chǎn)生有效的免疫應(yīng)答中是組成性的。更具體地已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，cldn表型決定簇在臨床上與多種增殖性病癥（包括幾類癌癥）有關(guān)，并且cldn蛋白及其變體或同種型會提供可以用于治療相關(guān)疾病的有用腫瘤標志物。在這點上，本發(fā)明提供了多種嵌合抗原受體，其除了包含任何信號傳導(dǎo)組分以外還包含抗-cldn結(jié)合結(jié)構(gòu)域。如在下面更詳細地討論的，公開的cldncar會特別有效地消除致瘤性細胞，且因此可用于治療和預(yù)防某些增殖性病癥或其進展或復(fù)發(fā)。此外，如在本申請中所述，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，cldn標志物或決定簇諸如細胞表面cldn蛋白在治療上與癌癥干細胞(也被稱作腫瘤永存細胞)有關(guān)，且可以有效地影響以消除或沉默它們。通過使用如本文中公開的cldncar來選擇性地減少或消除癌癥干細胞的能力是驚人的，因為已知這樣的細胞通常耐受許多常規(guī)治療。也就是說，傳統(tǒng)的、以及更近的靶向治療方法的有效性經(jīng)常受限于抗性癌癥干細胞的存在和/或出現(xiàn)，所述抗性癌癥干細胞能夠甚至在面臨不同治療方法的情況下保全腫瘤生長。此外，由于低或不一致的表達、不能保持與致瘤性細胞有關(guān)或不能存在于細胞表面上，與癌癥干細胞相關(guān)的決定簇經(jīng)常造成差治療靶標。與現(xiàn)有技術(shù)的教導(dǎo)形成尖銳對比的是，本發(fā)明公開的cldncar和相關(guān)的方法會有效地克服該固有抗性，以特異性地消除、耗盡、沉默或促進這樣的癌癥干細胞的分化，由此消除它們的持續(xù)或顯著地重新誘導(dǎo)潛在腫瘤生長的能力。因而，特別驚人的是，cldncar諸如本文中公開的那些可以有利地用于治療和/或預(yù)防選擇的增殖性(例如，腫瘤)病癥或其進展或復(fù)發(fā)。應(yīng)當理解，盡管將在下面廣泛地討論本發(fā)明的優(yōu)選實施方案，特別是以示例性信號傳導(dǎo)或共刺激性結(jié)構(gòu)域或區(qū)域的方式或在包含選定特征的癌癥干細胞或腫瘤和它們與公開的cldncar的相互作用的上下文中，本領(lǐng)域技術(shù)人員會明白，本發(fā)明的范圍不受限于這樣的示例性實施方案。相反，本發(fā)明的最可擴大的實施方案和所附權(quán)利要求廣泛地和明確地指向包含免疫特異性地締合或結(jié)合至少一種封閉蛋白家族成員的結(jié)合結(jié)構(gòu)域的任何嵌合抗原受體和它們在多種cldn相關(guān)的或介導(dǎo)的病癥（包括腫瘤或細胞增殖性病癥）的治療和/或預(yù)防中的用途，不論任何特定作用機理、car構(gòu)建體或特異性地靶向的腫瘤、細胞的或分子組分。在特別優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的car將免疫特異性地結(jié)合或締合cldn6。為此目的，和如在本申請中證實的，已經(jīng)意外地發(fā)現(xiàn)，公開的cldncar可以有效地用于靶向和消除或以其它方式廢除增殖性或致瘤性細胞并治療cldn相關(guān)病癥(例如，瘤形成)。本文中使用的“cldn相關(guān)病癥”應(yīng)當認為是指在疾病或病癥的進程或病原學(xué)中通過cldn遺傳組分或表達(“cldn決定簇”)的表型畸變標記、診斷、檢測或鑒別的任何病癥或疾病(包括增殖性病癥)。在這點上，cldn表型畸變或決定簇可以例如包含升高的或降低的cldn蛋白表達水平(例如，cldn6)、在某些可定義的細胞群體上異常的cldn蛋白表達、或在細胞生命周期的不適當時期或階段的異常的cldn蛋白表達。當然，應(yīng)當理解，cldn的基因型決定簇(例如，mrna轉(zhuǎn)錄水平)的類似表達概況也可以用于分類、檢測或治療cldn病癥。i.封閉蛋白(cldn)生理學(xué)已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，cldn表型決定簇在臨床上與多種增殖性病癥（包括瘤形成）有關(guān)，并且cldn家族蛋白(包括cldn6)及其變體或同種型會提供可用于治療相關(guān)疾病的有用腫瘤標志物。在這點上，本發(fā)明提供了多種包含經(jīng)工程改造的抗-cldn結(jié)合或靶向試劑的cldncar構(gòu)建體，所述抗-cldn結(jié)合或靶向試劑可操作地與一個或多個能夠在淋巴細胞中誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的信號傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域結(jié)合。如在下面更詳細地討論的和在附加的實施例中所述的，公開的抗-cldncar會特別有效地消除致瘤性細胞且因此可用于治療和預(yù)防某些增殖性病癥或其進展或復(fù)發(fā)。此外，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，cldn標志物或決定簇諸如細胞表面cldn蛋白(例如，cldn6)在治療上與癌癥干細胞(也被稱作腫瘤永存細胞)有關(guān)，且可以有效地用于消除或沉默它們。通過使用本文中公開的cldncar選擇性地減少或消除癌癥干細胞的能力是驚人的，因為已知這樣的細胞通常耐受許多常規(guī)治療。也就是說，傳統(tǒng)的、以及更近的靶向治療方法的有效性經(jīng)常受限于抗性癌癥干細胞的存在和/或出現(xiàn)，所述抗性癌癥干細胞能夠甚至在面臨這些不同治療方法的情況下保全腫瘤生長。此外，由于低或不一致的表達、不能保持與致瘤性細胞有關(guān)或不能存在于細胞表面上，與癌癥干細胞有關(guān)的決定簇經(jīng)常造成差治療靶標。與現(xiàn)有技術(shù)的教導(dǎo)形成尖銳對比的是，本發(fā)明公開的car和方法會有效地克服該固有抗性，并特異性地消除、排除、沉默或促進這樣的癌癥干細胞的分化，由此消除它們的持續(xù)或重新誘導(dǎo)潛在腫瘤生長的能力。封閉蛋白是包含緊密連接部(極化細胞類型中的最頂端細胞-細胞粘附連接部，諸如在上皮或內(nèi)皮細胞片層中發(fā)現(xiàn)的那些)的主要結(jié)構(gòu)蛋白的膜內(nèi)在蛋白。緊密連接部由成網(wǎng)絡(luò)的蛋白鏈組成，所述成網(wǎng)絡(luò)的蛋白鏈形成在細胞周圍的連續(xù)密封，以給細胞旁空間中的溶質(zhì)和水的運輸提供物理的、但是可調(diào)節(jié)的屏障。人類中的蛋白的封閉蛋白家族由大小范圍為22-34kda的至少23個成員構(gòu)成。所有封閉蛋白都具有跨膜四蛋白拓撲學(xué)，其中兩個蛋白末端位于膜的細胞內(nèi)表面上，從而導(dǎo)致兩個細胞外(ec)環(huán)ec1和ec2的形成。ec環(huán)介導(dǎo)頭對頭同嗜性的相互作用和對于封閉蛋白的某些組合而言的異嗜性相互作用，其導(dǎo)致緊密連接部的形成。具體的封閉蛋白-封閉蛋白相互作用和封閉蛋白ec序列是離子選擇性和緊密連接部強度的一個關(guān)鍵決定因素(例如，參見nakano等人,2009,pmid:19696885)。通常，ec1是約50-60個氨基酸的大小，含有在較大w-x(17-22)-w-x(2)-c-x(8-10)-c基序內(nèi)的保守二硫鍵和參與離子通道形成的許多帶電荷殘基(turksen和troy,2004,pmid:15159449)。ec2小于ec1，為約25個氨基酸。由于它的螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋構(gòu)象，已經(jīng)提出，ec2有助于在相對細胞膜上形成封閉蛋白的二聚體或多聚體，盡管在兩個環(huán)中的突變可能擾亂復(fù)合物形成。體外封閉蛋白-封閉蛋白復(fù)合物可以在二聚體至六聚體的大小范圍內(nèi)，取決于所涉及的具體封閉蛋白(krause等人,2008,pmid:18036336)。個別封閉蛋白顯示一定范圍的組織特異性的表達模式，以及在發(fā)育上受調(diào)節(jié)的表達，如通過pcr分析所確定的(krause等人,2008,pmid:18036336;turksen,2011,pmid:21526417)。序列分析可以用于構(gòu)建封閉蛋白家族成員的系統(tǒng)樹，從而指示蛋白序列的關(guān)系和相關(guān)性的程度(圖2a)。例如，可以看出，cldn6和cldn9蛋白密切相關(guān)，鑒于它們的基因在染色體位置16p3.3處的相鄰頭對頭位置，這提示祖先基因復(fù)制。這些相似性可以轉(zhuǎn)化為這些家族成員異型地相互作用的能力。類似地，cldn3和cldn4蛋白通過序列分析密切相關(guān)，并且它們的基因可以在染色體位置7r11.23處串聯(lián)地發(fā)現(xiàn)。某些家族成員之間的ec1或ec2環(huán)的高同源性(例如圖2b)為開發(fā)與各種封閉蛋白家族成員多反應(yīng)的抗體提供機會，而不同物種的ecd環(huán)1和ecd環(huán)2之間的實質(zhì)同源性(圖2c)允許開發(fā)結(jié)合選擇的直系同源物的交叉反應(yīng)性抗體。cldn6，也被稱作skullin，是一種在發(fā)育上受調(diào)節(jié)的封閉蛋白。代表性的cldn6蛋白直系同源物包括、但不限于人(np_067018)、黑猩猩(xp_523276)、恒河猴(np_001180762)、小鼠(np_061247)和大鼠(np_001095834)。在人類中，cldn6基因由在染色體位置16p13.3處跨越約3.5kbp的2個外顯子組成。cldn6基因座的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生成熟的1.4kbmrna轉(zhuǎn)錄物(nm_021195)，其編碼219氨基酸蛋白(np_061247)。cldn6在獻身于上皮命運的es細胞衍生物中(turksen和troy,2001,pmid:11668606)、在周皮中(morita等人,2002,pmid:12060405)和在表皮的上基部水平中(turkson和troy,2002,pmid:11923212)表達。它也在正在發(fā)育的小鼠腎臟中表達(abuazza等人,2006,pmid:16774906)，盡管在成體腎臟中未檢測到表達(reyes等人,2002,pmid:12110008)。cldn6也與cldn1和cldn9一起是丙型肝炎病毒的共受體(zheng等人,2007,pmid:17804490)。cldn9是與cldn6最密切相關(guān)的家族成員。代表性的cldn9蛋白直系同源物包括、但不限于人(np_066192)、黑猩猩(xp_003314989)、恒河猴(np_001180758)、小鼠(np_064689)和大鼠(np_001011889)。在人類中，cldn9基因由在染色體基因座16p13.3處跨越約2.1kbp的單一外顯子組成。無內(nèi)含子的cldn9基因座的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生2.1kbmrna轉(zhuǎn)錄物(nm_020982)，其編碼217氨基酸蛋白(np_0066192)。cldn9在內(nèi)耳(kitarjiri等人,2004,pmid:14698084;nankano等人,2009,pmid:19696885)、角膜(ban等人,2003,pmid:12742348)、肝臟(zheng等人,2007,pmid:17804490)和正在發(fā)育的腎臟(abuazza等人,2006,pmid:16774906)的不同結(jié)構(gòu)中表達。與其在耳蝸中的表達一致，表達具有錯義突變的cldn9蛋白的動物表現(xiàn)出聽覺缺陷，可能是由于改變的細胞旁k+滲透性，隨之擾動對于參與聲音檢測的毛細胞的去極化而言關(guān)鍵的離子電流。cldn9在內(nèi)耳的細胞中的表達特別定位于由其它封閉蛋白形成的更頂端緊密連接束下方的子結(jié)構(gòu)域，從而指示并非正常組織中的所有封閉蛋白都存在于最頂端和可接近的緊密連接部中(nankano等人,2009,pmid:19696885)。與耳蝸中的結(jié)果相比，表達錯義cldn9的小鼠沒有表現(xiàn)出肝或腎缺陷的體征(nankano等人,2009,pmid:19696885)。cldn4也被稱作產(chǎn)氣莢膜梭菌（clostridiumperfringens）腸毒素受體，這是由于它與該毒素的高親和力結(jié)合，所述毒素引起食物中毒和其它胃腸疾病。代表性的cldn4蛋白直系同源物包括、但不限于人(np_001296)、黑猩猩(xp_519142)、恒河猴(np_001181493)、小鼠(np_034033)和大鼠(np_001012022)。在人類中，無內(nèi)含子的cldn4基因在染色體位置17q11.23處跨越約1.82kbp。cldn4基因座的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生1.82kbmrna轉(zhuǎn)錄物(nm_001305)，其編碼209氨基酸蛋白(np_001296)。與cldn4的結(jié)合由胃腸病原體產(chǎn)生的毒素的能力一致，可以在整個胃腸道中以及在前列腺、膀胱、乳房和肺中檢測到cdln4表達(rahner等人,2001,pmid:11159882;tamagawa等人,2003,pmid:12861044;wang等人,2003,pmid:12600828;nichols等人,2004,pmid:14983936)。盡管封閉蛋白在正常組織的功能和體內(nèi)穩(wěn)態(tài)中是重要的，腫瘤細胞頻繁表現(xiàn)出異常的緊密連接功能。這可能與封閉蛋白的失調(diào)表達和/或定位相關(guān)，所述封閉蛋白的失調(diào)表達和/或定位是腫瘤細胞的去分化或要求迅速生長的癌組織在具有異常血管形成的腫瘤塊內(nèi)有效地吸收營養(yǎng)物的結(jié)果(morin,2005,pmid:16266975)。各個封閉蛋白家族成員可以在某些癌癥類型中上調(diào)，但是在其它癌癥類型中下調(diào)。例如，cldn3和cldn4表達在某些胰腺癌、乳腺癌和卵巢癌中升高，但是可以在其它乳腺(例如，“封閉蛋白-低”)癌中更低。封閉蛋白可以是car的特別好的靶標，因為已知封閉蛋白經(jīng)歷胞吞作用，一些封閉蛋白的周轉(zhuǎn)時間相對于其它膜蛋白是短的(vanitallie等人,2004,pmid:15366421)，封閉蛋白表達在癌細胞中失調(diào)，且腫瘤細胞之間的緊密連接結(jié)構(gòu)在癌細胞中被破壞。這些特性可以為活化的淋巴細胞結(jié)合腫瘤組織中（但是不在正常組織中）的封閉蛋白提供更多機會。盡管對各種封閉蛋白特異性的結(jié)合結(jié)構(gòu)域可以是有用的，但是也可能多反應(yīng)性的封閉蛋白car將更可能促進凈荷向更廣患者群體的遞送。具體地，多反應(yīng)性的封閉蛋白car可以允許由于較高聚集抗原密度而更有效地靶向表達多種封閉蛋白的細胞，降低具有低水平的任何單一封閉蛋白的抗原表達的腫瘤細胞的逃逸的可能性，并且如下面表達實施例中所見，擴展單一cldncar的治療適應(yīng)癥的數(shù)目。ii.癌癥干細胞如上面提及的，已經(jīng)令人驚訝地發(fā)現(xiàn)，異常的cldn表達(遺傳型和/或表型)與多種致瘤性細胞亞群有關(guān)。在這方面，本發(fā)明提供了cldncar介導(dǎo)的治療方案，其對于靶向這類細胞(例如，癌癥干細胞)而言可能是特別有用的，由此促進腫瘤病癥的治療、控制或預(yù)防。因而，在優(yōu)選的實施方案中，公開的cldncar可以有利地用于根據(jù)本教導(dǎo)降低腫瘤起始細胞頻率并由此促進增殖性病癥的治療或控制。根據(jù)當前模型，腫瘤包含非致瘤性細胞和致瘤性細胞。非致瘤性細胞不具有自我更新的能力，并且不能可再現(xiàn)地形成腫瘤（即使當以過量細胞數(shù)目移植進免疫受損的小鼠中時）。占腫瘤的細胞群體的0.1-40％(更通常0.1-10%)的致瘤性細胞，在本文中也被稱作”腫瘤起始細胞”(tic)，具有形成腫瘤的能力。致瘤性細胞包括腫瘤永存細胞(tpc)（可互換地稱為癌癥干細胞(csc)）和腫瘤祖細胞(tprog)。csc，如支持在正常組織中的細胞層次的正常干細胞一樣，能夠無限地自我復(fù)制，同時維持多譜系分化的能力。csc能夠生成致瘤性后代和非致瘤性后代，并且能夠完全重演親本腫瘤的異質(zhì)細胞組成（如通過將少量分離的csc連續(xù)分離和移植入免疫受損的小鼠中所證實的）。tprog，如csc一樣，具有刺激原代移植物中的腫瘤生長的能力。但是，不同于csc，它們不能重演親代腫瘤的細胞異質(zhì)性，并且在隨后的移植物中重新起始腫瘤發(fā)生的效率較低，因為tprog通常僅能夠有限數(shù)目的細胞分裂（如通過將少量高度純化的tprog連續(xù)移植進免疫受損的小鼠中所證實的）。tprog可以進一步被分為早期tprog和晚期tprog，其可以通過表型(例如，細胞表面標志物)和它們的重演腫瘤細胞體系結(jié)構(gòu)的不同能力來區(qū)分。盡管都不能重演腫瘤至與csc相同的程度，早期tprog具有比晚期tprog更大的重演親代腫瘤的特征的能力。盡管存在上述區(qū)別，已經(jīng)證實，一些tprog群體，在稀有情況下，可以獲得通常歸因于csc的自我更新能力，并且可以自身變?yōu)閏sc。csc表現(xiàn)出比以下更高的致腫瘤性且相對更靜止：(i)tprog(早期和晚期tprog)；和(ii)非致瘤性細胞，諸如腫瘤浸潤細胞，例如，成纖維細胞/間質(zhì)、內(nèi)皮細胞和造血細胞，它們可以衍生自csc且通常構(gòu)成腫瘤塊。鑒于常規(guī)療法和方案在很大程度上已經(jīng)被設(shè)計成減小腫瘤且攻擊快速增殖的細胞，csc比更快速增殖的tprog和其它大量腫瘤細胞群體諸如非致瘤性細胞更耐受常規(guī)療法和方案?？梢允沟胏sc相對更化學(xué)耐受常規(guī)療法的其它特征是增加的多藥抗性轉(zhuǎn)運蛋白的表達、增強的dna修復(fù)機制和抗細胞凋亡的基因表達。csc中的這些特性構(gòu)成確保具有晚期瘤形成的大部分患者的長期利益的標準腫瘤學(xué)治療方案的失敗的關(guān)鍵原因，因為標準化學(xué)療法不靶向?qū)嶋H刺激繼續(xù)腫瘤生長和復(fù)發(fā)的csc。已經(jīng)令人驚訝地發(fā)現(xiàn)，cldn表達(包括cldn6表達)與多種致瘤性細胞群體相關(guān)。本發(fā)明提供了cldncar，其可以特別用于靶向致瘤性細胞，并且可以用于沉默、敏化、中和、降低其頻率、阻斷、廢除、干擾、降低、阻礙、制止、控制、排除、減輕、介導(dǎo)、減少、重編、消除或以其它方式抑制(統(tǒng)稱為“抑制”)致瘤性細胞，由此促進增殖性病癥(例如癌癥)的治療、控制和/或預(yù)防。有利地，可以選擇本發(fā)明的新穎的cldncar，使得它們優(yōu)選地在施用給受試者后降低致瘤性細胞的頻率或致腫瘤性，無論cldn決定簇的形式(例如，同種型a或b)。致瘤性細胞頻率的降低可以作為以下的結(jié)果而發(fā)生：(i)致瘤性細胞的抑制或消除；(ii)控制致瘤性細胞的生長、擴增或復(fù)發(fā)；(iii)中斷致瘤性細胞的起始、繁殖、維持或增殖；或(iv)通過以其它方式阻礙致瘤性細胞的存活、再生和/或轉(zhuǎn)移。在某些實施方案中，致瘤性細胞的抑制可以作為一種或多種生理學(xué)途徑的變化的結(jié)果而發(fā)生。無論是通過抑制致瘤性細胞、改變它們的潛能(例如，通過誘導(dǎo)的分化或小生境破壞)還是以其它方式干擾致瘤性細胞的影響腫瘤環(huán)境或其它細胞的能力，途徑中的變化允許通過抑制腫瘤發(fā)生、腫瘤維持和/或轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)而更有效地治療cldn相關(guān)病癥?？捎糜谠u估致瘤性細胞的頻率的降低的方法包括、但不限于細胞計數(shù)或免疫組織化學(xué)分析，優(yōu)選地通過體外或體內(nèi)有限稀釋分析(dylla等人.2008,pmid:pmc2413402和hoey等人.2009,pmid:19664991)。流式細胞計量術(shù)和免疫組織化學(xué)也可以用于確定致瘤性細胞頻率。兩種技術(shù)均采用一種或多種抗體或試劑，它們結(jié)合本領(lǐng)域公認的已知致瘤性細胞富集的細胞表面蛋白或標志物(參見wo2012/031280)。如本領(lǐng)域已知的，流式細胞計量術(shù)(例如，熒光激活的細胞分選(facs))也可以用于表征、分離、純化、富集或分選多種細胞群體，包括致瘤性細胞。流式細胞計量術(shù)通過使在其中懸浮了混合細胞群體的流體流傳遞穿過電子檢測設(shè)備來測量致瘤性細胞水平，所述電子檢測設(shè)備能夠測量高達每秒數(shù)千個顆粒的物理和/或化學(xué)特征。免疫組織化學(xué)會提供額外信息，因為它能夠通過用結(jié)合致瘤性細胞標志物的經(jīng)標記的抗體或試劑將組織樣品染色而在原位(例如，在組織切片中)顯現(xiàn)致瘤性細胞。下面列出了已經(jīng)與csc群體相關(guān)、并在某些情況下已經(jīng)用于分離或表征csc的標志物：abca1、abca3、abcg2、adcy9、adora2a、afp、axin1、b7h3、bcl9、bmi-1、bmp-4、c20orf52、c4.4a、羧肽酶m、cav1、cav2、cd105、cd133、cd14、cd16、cd166、cd16a、cd16b、cd2、cd20、cd24、cd29、cd3、cd31、cd324、cd325、cd34、cd38、cd44、cd45、cd46、cd49b、cd49f、cd56、cd64、cd74、cd9、cd90、ceacam6、celsr1、cpd、crim1、cx3cl1、cxcr4、daf、飾膠蛋白聚糖、easyh1、easyh2、edg3、eed、egfr、enpp1、epcam、epha1、epha2、flj10052、flvcr、fzd1、fzd10、fzd2、fzd3、fzd4、fzd6、fzd7、fzd8、fzd9、gd2、gja1、gli1、gli2、gpnmb、gpr54、gprc5b、il1r1、il1rap、jam3、lgr5、lgr6、lrp3、ly6e、mcp、mf2、mllt3、mpzl1、muc1、muc16、myc、n33、nanog、nb84、巢蛋白、nid2、nma、npc1、制癌蛋白m、oct4、opn3、pcdh7、pcdha10、pcdhb2、ppap2c、ptpn3、pts、rarres1、sema4b、slc19a2、slc1a1、slc39a1、slc4a11、slc6a14、slc7a8、smarca3、smarcd3、smarce1、smarca5、sox1、stat3、steap、tcf4、tem8、tgfbr3、tmepai、tmprss4、轉(zhuǎn)鐵蛋白受體、trka、wnt10b、wnt16、wnt2、wnt2b、wnt3、wnt5a、yy1和β-聯(lián)蛋白。參見，例如，schulenburg等人,2010,pmid:20185329、u.s.p.n.7,632,678和u.s.p.n.2007/0292414、2008/0175870、2010/0275280、2010/0162416和2011/0020221。類似地，與某些腫瘤類型的csc相關(guān)的細胞表面表型的非限制性例子包括cd44高cd24低、aldh+、cd133+、cd123+、cd34+cd38?、cd44+cd24?、cd46高cd324+cd66c?、cd46高cd324+cd66c+、cd133+cd34+cd10?cd19?、cd138?cd34?cd19+、cd133+rc2+、cd44+α2β1高cd133+、cd44+cd24+esa+、cd271+、abcb5+以及本領(lǐng)域中已知的其它csc表面表型。參見，例如，schulenburg等人,2010,出處同上，visvader等人,2008,pmid:18784658和u.s.p.n.2008/0138313。就本發(fā)明而言特別重要的是包含cd46高cd324+表型的csc制備物。“陽性”、“低”和“陰性”表達水平當它們適用于標志物或標志物表型時如下定義。具有陰性表達(即“-”)的細胞在本文中定義為這樣的細胞:其表達小于或等于在熒光發(fā)射的額外通道中在針對其它目標蛋白標記的完全抗體染色混合液存在下在熒光通道中用同種型對照抗體觀察到的表達的95%。本領(lǐng)域技術(shù)人員會明白，用于定義陰性事件的該程序被稱為“熒光減一”或“fmo”染色。具有大于使用上述fmo染色程序用同種型對照抗體觀察到的表達的95%的表達的細胞在本文中被定義為“陽性”(即”+”)。如本文所定義，存在被廣泛定義為“陽性”的多種細胞群體。如果抗原的平均觀察表達高于使用如上所述用同種型對照抗體的fmo染色確定的95%，則細胞被定義為陽性的。如果平均觀察表達高于通過fmo染色確定的95%并且是在95%的一個標準差內(nèi)，則陽性細胞可以被稱為具有低表達(即“低”)的細胞?？蛇x地，如果平均觀察表達高于通過fmo染色確定的95%并且大于95%以上的一個標準差，則陽性細胞可以被稱為具有高表達(即“高”)的細胞。在其它實施方案中，99%可以優(yōu)選地用作陰性和陽性fmo染色之間的分界點，并且在特別優(yōu)選的實施方案中，所述百分位數(shù)可以大于99％。cd46高cd324+標志物表型和上面剛剛例舉的那些可以與標準流式細胞計數(shù)分析和細胞分選技術(shù)結(jié)合使用，以表征、分離、純化或富集tic和/或tpc細胞或細胞群體用于進一步分析。因此使用上述的技術(shù)和標志物可以確定本發(fā)明的抗體降低致瘤性細胞的頻率的能力。在某些情況下，cldncar可以使致瘤性細胞的頻率降低10%、15%、20%、25%、30%或甚至35%。在其它實施方案中，致瘤性細胞的頻率的降低可以是40%、45%、50%、55%、60%或65%的等級。在某些實施方案中，公開的過繼免疫療法可以使致瘤性細胞的頻率降低70%、75%、80%、85%、90%或甚至95%。應(yīng)當理解，致瘤性細胞的頻率的任何降低可能導(dǎo)致瘤形成的致腫瘤性、持續(xù)性、復(fù)發(fā)和侵襲性的相應(yīng)降低。iii.嵌合抗原受體療法癌癥免疫療法目標在于利用人免疫系統(tǒng)通過細胞毒性的淋巴細胞(包含t-淋巴細胞和nk細胞)的活性根除腫瘤的能力。從研究推斷出細胞毒性的淋巴細胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答可以導(dǎo)致殘余腫瘤細胞的根除，所述研究對比了已經(jīng)經(jīng)歷不同類型移植的白血病患者中的復(fù)發(fā)率：相對于接受同系移植物的那些患者，對于接受除去非-t-細胞的骨髓（在來自hla相同同胞的同種異體移植物中）的患者觀察到復(fù)發(fā)率的顯著下降，并且該效應(yīng)可以歸因于除了移植物抗宿主病應(yīng)答以外的其它t-細胞介導(dǎo)的作用。但是，抗腫瘤t-細胞的臨床上有效的過繼轉(zhuǎn)移已經(jīng)受到以下事實阻礙：大多數(shù)腫瘤抗原是自體抗原，且因此是差免疫原性的。帶有識別自體抗原的高親和力t-細胞受體(tcr)的t-細胞的負選擇在發(fā)育過程中發(fā)生在胸腺中，從而導(dǎo)致具有腫瘤/自體抗原的低親合力識別的t-細胞的中心耐受性和選擇。這些較低親合力t-細胞然后具有抗腫瘤t-細胞功能的隨后弱活化和有限持久性。遺傳工程改造的細胞毒性的淋巴細胞正在被用在兩個主要方案中以防止通向強抗腫瘤t-細胞活化的該耐受性/低親合力阻斷。在第一個方案中，使用分子基因工程技術(shù)將親和力增強的識別腫瘤抗原的tcr人工引入t-細胞中。該方案受限于幾個因素，包括在接近野生型tcr表達的水平表達親和力增強的tcr中的困難，當將tcr基因的另外集合引入天然t-細胞中時產(chǎn)生tcr鏈錯配的潛力，和腫瘤細胞通過下調(diào)mhc分子避免mhc限制的tcr識別的能力。通向細胞毒性的淋巴細胞的基因工程的第二個方案是，將人工的非-mhc限制的嵌合抗原受體(car)引入各種淋巴細胞群體中。這最典型地如下實現(xiàn)：收獲大量淋巴細胞群體，其在用編碼car分子的逆轉(zhuǎn)錄病毒或慢病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)之前離體培養(yǎng)、刺激和擴增。象天然tcr一樣，car必須具有特異性地和選擇性地識別靶抗原的能力，然后在結(jié)合該抗原后，將適當信號轉(zhuǎn)導(dǎo)至淋巴細胞以刺激持久的抗腫瘤免疫學(xué)應(yīng)答所需的效應(yīng)子功能和/或細胞因子產(chǎn)生。car修飾的t-細胞的概念源自這樣的研究，其中觀察到，當獨立于tcr:cd3蛋白復(fù)合物表達時，特別當cd3ζitam結(jié)構(gòu)域與異源細胞外結(jié)構(gòu)域和跨膜結(jié)構(gòu)域融合時，cd3ζ鏈的細胞質(zhì)itam結(jié)構(gòu)域可以活化t-細胞。將第一代cd4-cd3ζcar轉(zhuǎn)導(dǎo)進t-細胞中并在hiv患者中測試。隨訪研究表明這些經(jīng)工程改造的car-t細胞在輸注以后持續(xù)多達十年，從而指示經(jīng)工程改造的細胞的某種增殖和持久性。隨后，通過在單個重組分子中將scfv結(jié)構(gòu)域和跨膜結(jié)構(gòu)域與cd3ζ鏈的細胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域組合來構(gòu)建抗腫瘤car，并且可以證實這些經(jīng)工程改造的car-t細胞的抗原識別被重新導(dǎo)向以反映scfv的特異性(u.s.p.n.7,446,179)。這些第一代scfv-指導(dǎo)的car-t細胞能夠充當非-mhc限制的細胞毒性的淋巴細胞，從而識別天然腫瘤抗原而不是經(jīng)過加工的肽，并促進表達天然抗原的腫瘤細胞的裂解。盡管許多第一代scfv-指導(dǎo)的car-t細胞表現(xiàn)出預(yù)期的體外效應(yīng)，在癌癥患者中的體內(nèi)研究由于它們?nèi)狈鼓[瘤作用和缺乏car-t持久性是令人失望的。隨著t-細胞生物學(xué)已經(jīng)變得更好理解，已經(jīng)變清楚的是，t-細胞群體包含存活短的效應(yīng)細胞、存活較長的中心和周圍記憶t-細胞、以及與其它t-細胞亞群相互作用的調(diào)節(jié)性t-細胞(treg)。這些群體的功能的中心是，共刺激信號在通過細胞因子產(chǎn)生而誘導(dǎo)靜止原初或記憶t-細胞的持久活化中的作用，以及共刺激在阻止無反應(yīng)性（一種t-細胞無應(yīng)答性的狀態(tài)，其可能潛在地源自在沒有共刺激性信號存在下的排它tcr:cd3ζ信號傳導(dǎo)）中提供的作用。具體地，來自蛋白的各種共刺激性信號諸如cd28、ox40、cd27、cd137/4-1bb、cd2、cd3、cd11a/cd18、cd54和cd58可能對于細胞因子產(chǎn)生、增殖和克隆繁殖的最佳水平以及細胞裂解活性的誘導(dǎo)而言是有益的。在這些中，cd28可能是最佳地理解的共刺激性信號，且cd28共刺激已經(jīng)被證實會增加抗原活化的car-t細胞的細胞因子釋放。類似地，通過cd137/4-1bb進行的共刺激性信號傳導(dǎo)已經(jīng)被證實會增強天然t-細胞增殖，且可以促進car-t體內(nèi)更長持久性。因此，已經(jīng)設(shè)計了所謂的第二代car構(gòu)建體，其中已經(jīng)將來自這些分子的各種另外信號傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域串聯(lián)地添加至cd3ζ結(jié)構(gòu)域(u.s.p.n.5,686,281和8,399,645)。據(jù)報道還正在開發(fā)所謂的第三代car分子，其包括三個或更多個信號傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域(例如，cd3ζ和兩個共刺激性信號傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域)。已經(jīng)證實幾種針對cd19抗原的第二代car-t細胞在具有血液惡性腫瘤的患者中具有強烈的抗腫瘤作用以及實質(zhì)的持久性。car-t療法的一個重要邊界是在實體瘤治療中的應(yīng)用。就本發(fā)明而言，已經(jīng)令人驚訝地發(fā)現(xiàn)，抗-cldn結(jié)合結(jié)構(gòu)域可以有利地與前述嵌合抗原受體和過繼免疫療法中的每一種結(jié)合以提供克服一些前述限制的有效抗腫瘤治療。iv.嵌合抗原受體如上面提及的，本發(fā)明的car通常包含含有cldn結(jié)合結(jié)構(gòu)域的細胞外結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)域和細胞內(nèi)信號傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域，所述細胞內(nèi)信號傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域活化某些淋巴細胞并產(chǎn)生針對cldn陽性的腫瘤細胞的免疫應(yīng)答。更一般而言，公開的嵌合抗原受體包含各自如宿主細胞壁所定義的外結(jié)構(gòu)域和內(nèi)結(jié)構(gòu)域，。在這點上，術(shù)語“外結(jié)構(gòu)域”或“細胞外結(jié)構(gòu)域”將表示car多肽在細胞外部或膜脂質(zhì)雙層外面的部分，其可以包含抗原識別(例如，cldn)結(jié)合結(jié)構(gòu)域、任選的鉸鏈區(qū)和在物理上跨膜的氨基酸殘基之外的任意間隔結(jié)構(gòu)域。相反，術(shù)語“內(nèi)結(jié)構(gòu)域”或“細胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域”將表示car多肽在細胞內(nèi)部或膜脂質(zhì)雙層里面的部分，其可以包含在物理上跨膜的氨基酸殘基之內(nèi)的任意間隔結(jié)構(gòu)域以及細胞內(nèi)信號傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域。a.cldn結(jié)合結(jié)構(gòu)域1.結(jié)合結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)如在本發(fā)明中廣泛地討論的，包含抗-cldn結(jié)合結(jié)構(gòu)域的嵌合抗原受體可以有利地用于提供多種增殖性病癥的靶向療法。應(yīng)當理解，適合的抗-cldn結(jié)合結(jié)構(gòu)域可以包含抗-cldn抗體或其免疫反應(yīng)片段。在某些實施方案中，完整抗體或包含fc或恒定結(jié)構(gòu)域的至少一些部分的抗體包含cldn結(jié)合結(jié)構(gòu)域(參見，例如，u.s.p.n.2015/0139943)。在特別優(yōu)選的實施方案中，和如在隨其附帶的實施例中證實的，抗-cldn結(jié)合結(jié)構(gòu)域可以包含從結(jié)合cldn的單克隆抗體(包括人源化的或cdr移植的單克隆抗體)衍生出的scfv。在下面立即更詳細地討論可以用于提供符合本發(fā)明的cldn結(jié)合結(jié)構(gòu)域的適合抗體。為了本申請的目的，術(shù)語“結(jié)合結(jié)構(gòu)域”和“抗體”或“抗體片段”可以互換使用，除非另外根據(jù)上下文指出。抗體及其變體和衍生物(包括公認的命名法和編號系統(tǒng))已經(jīng)廣泛地描述在例如abbas等人(2010),cellularandmolecularimmunology(第6版),w.b.saunderscompany；或murphey等人(2011),janeway’simmunobiology(第8版),garlandscience中?！巴暾贵w”通常包含y-形四聚體蛋白，其包含通過共價二硫鍵和非共價相互作用保持在一起的兩個重(h)和兩個輕(l)多肽鏈。每個輕鏈由一個可變結(jié)構(gòu)域(vl)和一個恒定結(jié)構(gòu)域(cl)組成。每個重鏈包含一個可變結(jié)構(gòu)域(vh)和一個恒定區(qū)，其在igg、iga和igd抗體的情況下，包含三個被稱作ch1、ch2和ch3的結(jié)構(gòu)域(igm和ige具有第四個結(jié)構(gòu)域，ch4)。在igg、iga和igd類別中，ch1和ch2結(jié)構(gòu)域被柔性鉸鏈區(qū)隔開，所述柔性鉸鏈區(qū)是可變長度(在不同的igg亞類中，約10個至約60個氨基酸)的富含脯氨酸和半胱氨酸的區(qū)段。在輕鏈和重鏈中的可變結(jié)構(gòu)域通過約12個或更多個氨基酸的“j”區(qū)域連接至恒定結(jié)構(gòu)域，且重鏈也具有約10個另外氨基酸的“d”區(qū)域。每類抗體還包含由成對的半胱氨酸殘基形成的鏈間和鏈內(nèi)二硫鍵。如上面提及的，術(shù)語“抗體”應(yīng)當一般地解釋，且包括多克隆抗體、單克隆抗體、嵌合抗體、人源化抗體和靈長類源化抗體、cdr移植抗體、人抗體、重組地生產(chǎn)的抗體、細胞內(nèi)抗體、多特異性抗體、雙特異性抗體、單價抗體、多價抗體、抗-獨特型抗體、合成抗體(包括其突變蛋白和變體)、免疫特異性抗體片段(諸如fd、fab、f(ab')2、f(ab')片段)、單鏈片段(例如scfv和scfvfc)；及其衍生物，包括fc融合體和其它修飾，和任何其它免疫反應(yīng)性的免疫球蛋白分子，只要它表現(xiàn)出與cldn決定簇的優(yōu)先締合或結(jié)合。此外，除非由上下文約束另外指出，否則該術(shù)語還包含所有抗體類別(即iga、igd、ige、igg和igm)和所有亞類(即，igg1、igg2、igg3、igg4、iga1和iga2)及其所有免疫反應(yīng)片段。對應(yīng)于不同抗體類別的重鏈恒定結(jié)構(gòu)域通常分別由相應(yīng)小寫希臘字母α、δ、ε、γ和表示。來自任何脊椎動物物種的抗體的輕鏈可以基于其恒定結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列而指定為兩種明顯不同的類型(稱為κ和λ)之一。簡言之，任何這樣的結(jié)合或締合人cldn的抗體適合本文中的教導(dǎo)，且可以用作公開的嵌合抗原受體的結(jié)合結(jié)構(gòu)域組分?？贵w的可變結(jié)構(gòu)域顯示一種抗體與另一種抗體的氨基酸組成的顯著變化，且主要負責抗原識別和結(jié)合。每個輕鏈/重鏈對的可變區(qū)形成抗體結(jié)合位點，使得完整igg抗體具有兩個結(jié)合位點(即其為二價的)。vh和vl結(jié)構(gòu)域包含三個具有極端變異性的區(qū)域，它們被稱為高變區(qū)，或更通常被稱為互補性決定區(qū)(cdr)，其由四個較低可變性的區(qū)域(被稱為框架區(qū)(fr))構(gòu)架和分離。vh和vl區(qū)域之間的非共價締合形成fv片段(對于“可變片段”)，其含有抗體的兩個抗原結(jié)合位點之一。特別重要的是，scfv構(gòu)建體(對于單鏈可變片段)，其可以通過下面更廣泛地討論的基因工程得到，通過肽接頭連接vh和vl區(qū)域(優(yōu)選地來自相同抗體)。取決于期望的構(gòu)象，應(yīng)當理解，所述肽接頭可以具有不同長度。如本文中使用的，除非另外指出，否則氨基酸向每個結(jié)構(gòu)域、框架區(qū)和cdr的分配可以根據(jù)以下文獻提供的編號方案之一來進行：kabat等人(1991)sequencesofproteinsofimmunologicalinterest(第5版),usdept.ofhealthandhumanservices,phs,nih,nih公開號91-3242;chothia等人,1987,pmid:3681981;chothia等人,1989,pmid:2687698;maccallum等人,1996,pmid:8876650；或dubel,編(2007)handbookoftherapeuticantibodies,第3版,wily-vchverlaggmbhandcoorabm(oxfordmolecular/msipharmacopia)。在下面闡述了包含由kabat、chothia、maccallum(也被稱作contact)和abm方案定義的cdr的氨基酸殘基(如得自abysis網(wǎng)站數(shù)據(jù)庫(參見下文))。表1kabatchothiamaccallumabmvhcdr131-3526-3230-3526-35vhcdr250-6552-5647-5850-58vhcdr395-10295-10293-10195-102vlcdr124-3424-3430-3624-34vlcdr250-5650-5646-5550-56vlcdr389-9789-9789-9689-97根據(jù)在本領(lǐng)域中已開發(fā)的一般規(guī)則(如上所述，例如，kabat編號系統(tǒng))，或通過將序列與已知可變區(qū)的數(shù)據(jù)庫比對，可以鑒別抗體序列中的可變區(qū)和cdr。用于鑒別這些區(qū)域的方法描述于kontermann和dubel,編,antibodyengineering,springer,newyork,ny,2001和dinarello等人,currentprotocolsinimmunology,johnwileyandsonsinc.,hoboken,nj,2000?？贵w序列的示例性數(shù)據(jù)庫描述于“abysis”網(wǎng)站www.bioinf.org.uk/abs(由a.c.martininthedepartmentofbiochemistry&molecularbiologyuniversitycollegelondon,london,england維護)和vbase2網(wǎng)站www.vbase2.org(如描述于retter等人,nucl.acidsres.,33(數(shù)據(jù)庫發(fā)行):d671-d674(2005))中，且可通過前述網(wǎng)站獲得。優(yōu)選地，使用abysis數(shù)據(jù)庫分析抗體序列，所述abysis數(shù)據(jù)庫將來自kabat、imgt和proteindatabank(pdb)的序列數(shù)據(jù)與來自pdb的結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)整合。參見dr.andrewc.r.martin的書章節(jié)proteinsequenceandstructureanalysisofantibody可變domains.見:antibodyengineeringlabmanual(編著:duebel,s.和kontermann,r.,springer-verlag,heidelberg,isbn-13:978-3540413547，也可在網(wǎng)站bioinforg.uk/abs上得到)。abysis數(shù)據(jù)庫網(wǎng)站還包括已開發(fā)用于鑒別可根據(jù)本文中的教導(dǎo)使用的cdr的一般規(guī)則。除非另有說明，否則本文中闡述的所有cdr都根據(jù)abysis數(shù)據(jù)庫網(wǎng)站按照kabat等人衍生出。對于在本發(fā)明中討論的重鏈恒定區(qū)氨基酸位置，編號是根據(jù)在edelman等人,1969,proc.natl.acad.sci.usa63(1):78-85中首次描述的eu索引，其描述據(jù)報道為第一個測序的人igg1的骨髓瘤蛋白eu的氨基酸序列。edelman的eu索引也描述于kabat等人,1991(出處同上)中。因此，術(shù)語“如kabat中所述的eu索引”或“kabat的eu索引”或“eu索引”在重鏈的上下文中表示基于如kabat等人,1991(出處同上)中描述的edelman等人的人igg1eu抗體的殘基編號系統(tǒng)。用于輕鏈恒定區(qū)氨基酸序列的編號系統(tǒng)類似地描述于kabat等人,(出處同上)中。在下面立即描述適合本發(fā)明的一個示例性的κ輕鏈恒定區(qū)氨基酸序列：。類似地，在下面立即描述的是適合本發(fā)明的一個示例性的igg1重鏈恒定區(qū)氨基酸序列：。使用標準分子生物學(xué)技術(shù)，可以將公開的恒定區(qū)序列或其變型或衍生物與公開的重鏈和輕鏈可變區(qū)可操作地結(jié)合以提供抗體(全長抗體或包含部分fc區(qū)域的免疫反應(yīng)片段)，其可以原樣使用或并入本發(fā)明的cldncar中(優(yōu)選地作為跨膜結(jié)構(gòu)域的部分)。更一般而言，可以從特異性地識別或結(jié)合至少一個cldn決定簇(例如，cldn4、cldn6、cldn9)或它們的某種組合的任何抗體制備適合car的抗-cldn結(jié)合結(jié)構(gòu)域組分。本文中使用的“決定簇”或“靶標”意指任何可檢測的特性、性質(zhì)、標志物或因子，其可與特定細胞、細胞群體或組織可鑒別地關(guān)聯(lián)或特異性地見于特定細胞、細胞群體或組織內(nèi)部或表面。決定簇或靶標在性質(zhì)上可以是形態(tài)的、功能的或生物化學(xué)的，且優(yōu)選為表型的。在某些優(yōu)選實施方案中，決定簇是由特定細胞類型或在某些條件下(例如在特定生境中在細胞周期或細胞的特定點中)由細胞差異地表達(過表達或低表達)的蛋白。為了本發(fā)明的目的，決定簇優(yōu)選地在異常癌細胞上差異地表達，且可以包含cldn家族成員蛋白，或它的剪接變體、同種型、同系物或家族成員，或其特定結(jié)構(gòu)域、區(qū)域或表位中的任一種?！翱乖薄ⅰ懊庖咴詻Q定簇”、“抗原決定簇”或“免疫原”意指當引入免疫活性動物中時可以刺激免疫應(yīng)答且被從所述免疫應(yīng)答產(chǎn)生的抗體識別的任何蛋白或其任何片段、區(qū)域或結(jié)構(gòu)域。本文中預(yù)見到的cldn決定簇的存在或不存在可以用于鑒別細胞、細胞亞群或組織(例如，腫瘤、致瘤性細胞或csc)。2.抗體制備和生產(chǎn)使用本領(lǐng)域已知的多種方法可以生產(chǎn)適合本發(fā)明的抗體，并且可以進一步修飾任何這樣的抗體以提供本發(fā)明的抗-cldn嵌合抗原受體的結(jié)合結(jié)構(gòu)域。a.在宿主動物中制備多克隆抗體在各種宿主動物中生產(chǎn)多克隆抗體是本領(lǐng)域眾所周知的(參見例如，harlow和lane(編)(1988)antibodies:alaboratorymanual,cshpress；和harlow等人(1989)antibodies,ny,coldspringharborpress)。為了制備多克隆抗體，用抗原性蛋白或包含抗原性蛋白的細胞或制備物免疫免疫活性的動物(例如，小鼠、大鼠、兔、山羊、非人靈長類動物等)。在一段時間之后，通過使動物出血或處死動物而獲得含有多克隆抗體的血清。血清可以以得自動物的形式使用，或者可以部分地或完全地純化所述抗體以提供免疫球蛋白級分或分離的抗體制備物。任何形式的抗原或含有抗原的細胞或制備物可以用于制備對決定簇特異性的抗體。術(shù)語“抗原”在廣義上使用，并且可以包含所選靶標的任何免疫原性片段或決定簇，包括單個表位、多個表位、單個或多個結(jié)構(gòu)域或整個細胞外結(jié)構(gòu)域(ecd)。所述抗原可以是分離的全長蛋白、細胞表面蛋白(例如，用在其表面上表達所述抗原的至少一部分的細胞免疫)或可溶性蛋白(例如，用僅具有所述蛋白的ecd部分免疫)。所述抗原可以在遺傳修飾的細胞中產(chǎn)生。任何上述抗原可以單獨使用，或與本領(lǐng)域已知的一種或多種免疫原性增強佐劑組合使用。編碼抗原的dna可以是基因組的或非基因組的(例如，cdna)，并且可以編碼足以引發(fā)免疫原性應(yīng)答的ecd的至少一部分。任何載體都可以用于轉(zhuǎn)化在其中表達所述抗原的細胞，包括、但不限于腺病毒載體、慢病毒載體、質(zhì)粒和非病毒載體，諸如陽離子脂質(zhì)。b.單克隆抗體在選擇的實施方案中，本發(fā)明涵蓋單克隆抗體的用途。術(shù)語“單克隆抗體”或“mab”表示得自基本上均質(zhì)抗體的群體的抗體，即構(gòu)成該群體的各個抗體除了可少量存在的可能突變(例如，天然存在的突變)以外是相同的。使用多種技術(shù)，包括雜交瘤技術(shù)、重組技術(shù)、噬菌體展示技術(shù)、轉(zhuǎn)基因動物(例如，xenomouse?)或它們的某種組合，可以制備單克隆抗體。例如，在優(yōu)選的實施方案中，使用雜交瘤技術(shù)和生化技術(shù)和基因工程技術(shù)，諸如在以下文獻中更詳細地描述的那些，可以生產(chǎn)單克隆抗體：an,zhigiang(編)therapeuticmonoclonalantibodies:frombenchtoclinic,johnwileyandsons,2009年第1版;shire等人(編)currenttrendsinmonoclonalantibodydevelopmentandmanufacturing,springerscience+businessmediallc,2010年第1版;harlow等人,antibodies:alaboratorymanual,coldspringharborlaboratorypress,1988年第2版;hammerling,等人,見：monoclonalantibodiesandt-cellhybridomas563-681(elsevier,n.y.,1981)。在制備許多特異性地結(jié)合決定簇的單克隆抗體以后，通過多種篩選方法可以選擇特別合適的抗體，所述篩選方法基于例如對決定簇的親和力或內(nèi)化速度。在特別優(yōu)選的實施方案中，如本文中所述生產(chǎn)的單克隆抗體可以用作“源”抗體，并進一步修飾以提供可以與公開的car結(jié)合的有效cldn結(jié)合結(jié)構(gòu)域。例如可以操作所述源抗體以提供scfv或其它片段，改善對靶標的親和力，改善它在細胞培養(yǎng)物中的生產(chǎn)，降低體內(nèi)免疫原性，制備多特異性的構(gòu)建體等。在下面和在附加的實施例中闡述了單克隆抗體生產(chǎn)和篩選的更詳細描述。c.人抗體適合本發(fā)明的抗體可以包含全人抗體。術(shù)語“人抗體”表示這樣的抗體(優(yōu)選單克隆抗體)：其氨基酸序列對應(yīng)于由人產(chǎn)生的和/或已經(jīng)使用下述用于制備人抗體的技術(shù)中的任一種制備的抗體的氨基酸序列。在一個實施方案中，通過篩選使用噬菌體展示制備的重組組合抗體文庫，可以分離重組人抗體。在一個實施方案中，所述文庫是scfv噬菌體或酵母展示文庫，其使用使用人vl和vhcdna產(chǎn)生，所述使用人vl和vhcdna從分離自b細胞的mrna制備。通過將人免疫球蛋白基因座引入轉(zhuǎn)基因動物（例如，小鼠，其中內(nèi)源性免疫球蛋白基因已經(jīng)被部分地或完全地滅活和人免疫球蛋白基因已經(jīng)被引入）中，也可以制備人抗體。攻擊后，觀察到抗體產(chǎn)生，其在所有方面緊密地類似于在人類中看到的抗體產(chǎn)生，所述方面包括基因重排、組裝和全人抗體組成成分。該方案描述在，例如，u.s.p.n.5,545,807;5,545,806;5,569,825;5,625,126;5,633,425;5,661,016,和u.s.p.n.6,075,181和6,150,584（關(guān)于xenomouse?技術(shù)）；和lonberg和huszar,1995,pmid:7494109)?？蛇x地，通過使生產(chǎn)針對靶抗原的抗體的人b淋巴細胞(這樣的b淋巴細胞可以從遭受腫瘤病癥的個體回收，或可以已經(jīng)在體外免疫)永生化，可以制備人抗體。參見，例如，cole等人,monoclonalantibodiesandcancertherapy,alanr.liss,第77頁(1985);boerner等人,1991,pmid:2051030；和u.s.p.n.5,750,373。與其它單克隆抗體一樣，這樣的人抗體可以用作源抗體。d.抗體生產(chǎn)和工程改造使用得自生產(chǎn)抗體的細胞的遺傳物質(zhì)和重組技術(shù)，可以生產(chǎn)或修飾抗體及其片段(參見，例如，berger和kimmel,guidetomolecularcloningtechniques,methodsinenzymology第152卷academicpress,inc.,sandiego,ca;sambrook和russell(編)(2000)molecularcloning:alaboratorymanual(第3版),ny,coldspringharborlaboratorypress;ausubel等人(2002)shortprotocolsinmolecularbiology:acompendiumofmethodsfromcurrentprotocolsinmolecularbiology,wiley,john&sons,inc.；和u.s.p.n.7,709,611)。如將在下面更詳細地討論的，本發(fā)明的另一個方面涉及編碼本發(fā)明的cldn結(jié)合結(jié)構(gòu)域和car的核酸分子。核酸可以存在于全細胞中、細胞裂解物中或以部分地純化的或基本上純的形式存在。當通過標準技術(shù)(包括堿性/sds處理、cscl分帶(banding)、柱色譜法、瓊脂糖凝膠電泳和本領(lǐng)域眾所周知的其它技術(shù))從其它細胞組分或其它污染物(例如，其它細胞核酸或蛋白)分離時，核酸是“分離的”或變成基本上純的。本發(fā)明的核酸可以是例如dna(例如基因組dna、cdna)、rna及其人工變體(例如，肽核酸)(無論單鏈或雙鏈或rna)，rna，且可以含有或不含內(nèi)含子。在一個優(yōu)選實施方案中，所述核酸為cdna分子。使用標準分子生物學(xué)技術(shù)可以得到和操作本發(fā)明的核酸。對于由雜交瘤(例如，如下面實施例中所述制備的雜交瘤)表達的抗體，通過標準pcr擴增或cdna克隆技術(shù)可以得到編碼抗體的輕鏈和重鏈的cdna。對于得自免疫球蛋白基因文庫的抗體(例如，使用噬菌體展示技術(shù))，可以從所述文庫回收編碼所述抗體的核酸。通過標準重組dna技術(shù)可以進一步操作編碼vh和vl區(qū)段的dna片段，例如以將所述可變區(qū)基因轉(zhuǎn)化為全長抗體鏈基因，轉(zhuǎn)化為fab片段基因，或優(yōu)選地轉(zhuǎn)化為編碼cldn特異性的scfv的核苷酸序列。在這些操作中，將編碼vl或vh的dna片段可操作地連接至編碼另一種蛋白(諸如抗體恒定區(qū)或柔性接頭)的另一種dna片段。在該上下文中使用的術(shù)語“可操作地連接”意指，連接兩個dna片段，使得由所述兩個dna片段編碼的氨基酸序列保留于框架內(nèi)。通過將編碼vh的dna可操作地連接至另一種編碼重鏈恒定區(qū)(ch1、ch2和ch3)的dna分子，可以將分離的編碼vh區(qū)域的dna轉(zhuǎn)化為全長重鏈基因。人重鏈恒定區(qū)基因的序列是本領(lǐng)域已知的(參見例如，kabat,等人(1991)(出處同上))，且通過標準pcr擴增可以獲得包括這些區(qū)域的dna片段。重鏈恒定區(qū)可以是igg1、igg2、igg3、igg4、iga、ige、igm或igd恒定區(qū)，但是最優(yōu)選地是igg1或igg4恒定區(qū)。一種示例性的igg1恒定區(qū)描述于seqidno:2中。對于fab片段重鏈基因，可以將編碼vh的dna可操作地連接至另一種僅編碼重鏈ch1恒定區(qū)的dna分子。通過將編碼vl的dna可操作地連接至另一種編碼輕鏈恒定區(qū)(cl)的dna分子，可以將分離的編碼vl區(qū)域的dna轉(zhuǎn)化為全長輕鏈基因(以及fab輕鏈基因)。人輕鏈恒定區(qū)基因的序列是本領(lǐng)域已知的(參見例如，kabat,等人(1991)(出處同上))，且通過標準pcr擴增可以獲得包括這些區(qū)域的dna片段。輕鏈恒定區(qū)可以是κ或λ恒定區(qū)，但是最優(yōu)選地是κ恒定區(qū)。在這方面，一種示例性的適當κ輕鏈恒定區(qū)描述于seqidno:1中。本文預(yù)見到表現(xiàn)出與本發(fā)明的多肽的“序列同一性”、序列相似性”或“序列同源性”的某些多肽(例如抗體可變區(qū))。“同源的”多肽可以表現(xiàn)出65%、70%、75%、80%、85%或90%序列同一性。在其它實施方案中，“同源的”多肽可以表現(xiàn)出93%、95%或98%序列同一性。如本文中使用的，兩個氨基酸序列之間的同源性百分比等同于兩個序列之間的同一性百分比。兩個序列之間的同一性百分比是由所述序列共享的相同位置的數(shù)目的函數(shù)，考慮缺口的數(shù)目和每個缺口的長度，所述缺口為了兩個序列的最佳比對而需要引入。使用如以下非限制性實施例中所述的數(shù)學(xué)算法，可以實現(xiàn)兩個序列之間的序列對比和同一性百分比測定。使用已并入align程序(2.0版本)中的e.meyers和w.miller(comput.appl.biosci.,4:11-17(1988))的算法，使用pam120權(quán)重殘基表、12的缺口長度罰分和4的缺口罰分，可以確定兩個氨基酸序列之間的同一性百分比。此外，使用已并入gcg軟件包(可得自www.gcg.com)內(nèi)的gap程序中的needleman和wunsch(j.mol.biol.48:444-453(1970))算法，使用blossum62矩陣或pam250矩陣和16、14、12、10、8、6或4的缺口權(quán)重以及1、2、3、4、5或6的長度權(quán)重，可以確定兩個氨基酸序列之間的同一性百分比。額外地或可選地，本發(fā)明的蛋白序列可以進一步用作“查詢序列”以執(zhí)行針對公共數(shù)據(jù)庫的搜索，以例如鑒別相關(guān)序列。可以使用altschul,等人(1990)j.mol.biol.215:403-10的xblast程序(2.0版本)執(zhí)行這樣的搜索?？梢杂脁blast程序、得分＝50、字長＝3執(zhí)行blast蛋白搜索以獲得與本發(fā)明的抗體分子同源的氨基酸序列。為了獲得缺口比對以用于對比目的，可以如altschul等人,(1997)nucleicacidsres.25(17):3389-3402中所述利用gappedblast。當利用blast和gappedblast程序時，可使用各個程序(例如，xblast和nblast)的默認參數(shù)。不同的殘基位置可以差別在于保守氨基酸置換或非保守氨基酸置換?！氨Ｊ匕被嶂脫Q”是這樣的置換：其中一個氨基酸殘基被置換為另一個含有具有類似化學(xué)性質(zhì)(例如，電荷或疏水性)的側(cè)鏈的氨基酸殘基。一般而言，保守氨基酸置換不會實質(zhì)上改變蛋白的功能性質(zhì)。在兩個或更多個氨基酸序列彼此差別在于保守置換的情況下，可以向上調(diào)節(jié)序列同一性百分比或相似性程度以校正置換的保守性質(zhì)。在存在非保守氨基酸置換的情況下，在優(yōu)選的實施方案中，表現(xiàn)出序列同一性的多肽將保留本發(fā)明的多肽(例如，抗體)的期望功能或活性。本文還預(yù)見到表現(xiàn)出與本發(fā)明的核酸的“序列同一性”、序列相似性”或“序列同源性”的核酸。“同源序列”意指表現(xiàn)出至少約65%、70%、75%、80%、85%或90%序列同一性的核酸分子的序列。在其它實施方案中，核酸的“同源序列”可以表現(xiàn)出與參照核酸細胞或csc的93%、95%或98%序列同一性。3.衍生出的作為cldn結(jié)合結(jié)構(gòu)域的抗體已經(jīng)如上所述制備、選擇和分離源抗體以后，可以進一步改變它們以提供適合本文中的教導(dǎo)的抗-cldncar結(jié)合結(jié)構(gòu)域組分。優(yōu)選地，使用已知的分子工程技術(shù)修飾或改變源抗體以提供衍生出的具有期望的治療性能的結(jié)合結(jié)構(gòu)域組分。a.嵌合的和人源化的抗體如上面討論的，本發(fā)明的選擇的實施方案包含鼠單克隆抗體，其免疫特異性地結(jié)合cldn，且為了本發(fā)明的目的，可以視作cldn結(jié)合結(jié)構(gòu)域的“源”抗體。在選擇的實施方案中，通過任選地修飾源抗體的恒定區(qū)和/或結(jié)合抗原的氨基酸序列，可以從這樣的源抗體衍生出適合本發(fā)明的cldn結(jié)合結(jié)構(gòu)域。在某些實施方案中，如果通過缺失、突變、置換、整合或組合改變源抗體中的選定氨基酸，則從源抗體衍生出抗體。在另一個實施方案中，“衍生出的”抗體是這樣的抗體：其中將源抗體的片段(例如，一個或多個cdr或整個重鏈和輕鏈可變區(qū))與受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域構(gòu)建體組合或者摻入受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域構(gòu)建體中，以提供衍生物cldn結(jié)合結(jié)構(gòu)域(例如嵌合的或人源化的結(jié)合結(jié)構(gòu)域)。使用如下所述的標準分子生物學(xué)技術(shù)可以制備這些衍生出的結(jié)合結(jié)構(gòu)域，例如，以提供scfv；以改善對決定簇的親和力；以改善抗體穩(wěn)定性；以改善表達；以降低體內(nèi)免疫原性；以減小毒性或以促進信號的傳播。通過用化學(xué)方式或翻譯后修飾來修飾成熟的分子(例如，糖基化模式或聚乙二醇化)，也可以從源抗體衍生出這樣的抗體。在一個實施方案中，從已經(jīng)共價地連接的來自至少兩個不同物種或抗體類別的蛋白區(qū)段衍生出本發(fā)明的嵌合的結(jié)合區(qū)域。術(shù)語“嵌合的”抗體涉及構(gòu)建體，其中重鏈和/或輕鏈的一部分與來自特定物種或?qū)儆谔囟贵w類別或亞類的抗體中的相應(yīng)序列相同或同源，而所述鏈的剩余部分與來自另一個物種或?qū)儆诹硪粋€抗體類別或亞類的抗體中的相應(yīng)序列以及這樣的抗體的片段相同或同源(u.s.p.n.4,816,567;morrison等人,1984,pmid:6436822)。在某些優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的嵌合抗體可以包含與人輕鏈和重鏈恒定區(qū)的全部或部分可操作地連接的所選鼠重鏈和輕鏈可變區(qū)的全部或大部分。在其它特別優(yōu)選的實施方案中，可以從本文中公開的小鼠抗體“衍生出”cldn結(jié)合結(jié)構(gòu)域。在其它實施方案中，本發(fā)明的嵌合的結(jié)合結(jié)構(gòu)域是“cdr移植的”結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其中所述cdr(如使用kabat、chothia、mccallum等定義)衍生自特定物種或?qū)儆谔囟贵w類別或亞類，而所述結(jié)合區(qū)域的剩余部分衍生自來自另一個物種或?qū)儆诹硪粋€抗體類別或亞類的抗體。對于在人類中使用，可以將一種或多種選擇的嚙齒動物cdr(例如小鼠cdr)移植進人受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域(即，具有人框架區(qū))中，從而替換人抗體的一個或多個天然存在的cdr。這些構(gòu)建體通常具有以下優(yōu)點：提供有效結(jié)合，同時降低受試者對結(jié)合結(jié)構(gòu)域的不希望的免疫應(yīng)答。在特別優(yōu)選的實施方案中，所述cdr移植的結(jié)合結(jié)構(gòu)域?qū)⑷肴丝蚣苄蛄兄械牡米孕∈蟮囊粋€或多個cdr。與cdr移植的結(jié)合結(jié)構(gòu)域類似的是“人源化的”結(jié)合結(jié)構(gòu)域。本文中使用的“人源化的”結(jié)合結(jié)構(gòu)域是包含從一種或多種非人抗體(供體或源抗體)衍生出的一個或多個氨基酸序列(例如cdr序列)的人結(jié)合結(jié)構(gòu)域(通常包含人框架區(qū)的受體結(jié)構(gòu)域)。在某些實施方案中，可以將“回復(fù)突變”引入人源化的結(jié)合結(jié)構(gòu)域中，其中在受體人結(jié)合結(jié)構(gòu)域的可變區(qū)的一個或多個fr中的殘基被來自非人物種供體抗體的對應(yīng)殘基替換。這樣的回復(fù)突變可以幫助維持移植的cdr的適當三維構(gòu)型并由此改善親和力和結(jié)合結(jié)構(gòu)域穩(wěn)定性?？梢允褂脕碜圆煌w物種的抗體，所述供體物種包括、但不限于小鼠、大鼠、兔或非人靈長類動物。此外，人源化抗體或片段可以包含未在受體抗體或供體抗體中發(fā)現(xiàn)的新殘基，以例如進一步改進抗體表現(xiàn)。因此，使用本文所述的現(xiàn)有技術(shù)，無需過多實驗，可以容易地提供cdr移植的和人源化的抗體(和有關(guān)的cldn結(jié)合結(jié)構(gòu)域)，其適合本發(fā)明且包含如下實施例所述的源鼠抗體。各種本領(lǐng)域公認的技術(shù)可以進一步用于確定哪些人序列用作受體抗體以提供根據(jù)本發(fā)明的人源化構(gòu)建體。適合的人種系序列和確定它們作為受體序列的適合性的方法的匯編公開于例如tomlinson,i.a.等人(1992)j.mol.biol.227:776-798;cook,g.p.等人(1995)immunol.today16:237-242;chothia,d.等人(1992)j.mol.biol.227:799-817；和tomlinson等人(1995)emboj14:4628-4638中，它們中的每一篇整體并入本文。v-base目錄(vbase2-retter等人,nucleicacidres.33;671-674,2005)提供了人免疫球蛋白可變區(qū)序列的綜合性目錄(由tomlinson,i.a.等人編譯，mrccentreforproteinengineering,cambridge,uk)，也可以用于鑒別適合的受體序列。另外，描述在例如u.s.p.n.6,300,064中的共有人框架序列也可以證明是可以根據(jù)本發(fā)明教導(dǎo)使用的適合受體序列。一般而言，基于與鼠源框架序列的同源性以及源抗體和受體抗體的cdr規(guī)范結(jié)構(gòu)的分析來選擇人框架受體序列。然后可以使用本領(lǐng)域公認的技術(shù)合成衍生抗體(或結(jié)合結(jié)構(gòu)域)的重鏈和輕鏈可變區(qū)的衍生序列。作為示例，cdr移植的和人源化的抗體和相關(guān)方法描述于u.s.p.n.6,180,370和5,693,762中。關(guān)于其它細節(jié)，參見，例如，jones等人,1986,pmid:3713831)；和u.s.p.n.6,982,321和7,087,409。cdr移植的或人源化的抗體可變區(qū)與人受體可變區(qū)的序列同一性或同源性可以如本文所討論來確定，且當這樣測量時，將優(yōu)選地共享至少60%或65%序列同一性，更優(yōu)選至少70%、75%、80%、85%或90%序列同一性，甚至更優(yōu)選至少93%、95%、98%或99%序列同一性。優(yōu)選地，不同一的殘基位置因保守氨基酸置換而不同。“保守氨基酸置換”是這樣的置換：其中一個氨基酸殘基被置換為另一個含有具有類似化學(xué)性質(zhì)(例如，電荷或疏水性)的側(cè)鏈(r基團)的氨基酸殘基。一般而言，保守氨基酸置換不會實質(zhì)上改變蛋白的功能性質(zhì)。在兩個或更多個氨基酸序列彼此差別在于保守置換的情況下，可以向上調(diào)節(jié)序列同一性百分比或相似性程度以校正置換的保守性質(zhì)。應(yīng)當理解，使用專有的abysis數(shù)據(jù)庫按照kabat等人來定義如在附帶的圖3a和3b中提供的注解的cdr和框架序列。但是，如本文中討論的，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以容易地鑒別根據(jù)chothia等人、abm或maccallum等人以及kabat等人提供的定義的cdr。這樣，包含根據(jù)前述系統(tǒng)中的任一個衍生出的一個或多個cdr的抗-cldn人源化抗體被明確地保留在本發(fā)明的范圍內(nèi)。b.抗體片段、衍生物或構(gòu)建體在特別優(yōu)選的實施方案中，所述cldn結(jié)合結(jié)構(gòu)域?qū)贵w片段、衍生物或構(gòu)建體。更具體地，不論選擇何種形式的抗體(例如嵌合抗體、人源化抗體等)來實踐本發(fā)明，應(yīng)當理解，根據(jù)本文中的教導(dǎo)，可以使用它們的免疫反應(yīng)片段作為cldncar的部分。在廣義上，“抗體片段”至少包含完整抗體的免疫反應(yīng)部分。也就是說，本文中使用的術(shù)語“抗體片段”至少包括完整抗體的抗原結(jié)合片段或部分，且術(shù)語“抗原結(jié)合片段”表示免疫球蛋白或抗體的多肽片段，所述多肽片段與cldn的免疫原性決定簇免疫特異性地結(jié)合或反應(yīng)，或者與所述片段的來源完整抗體競爭特異性的抗原結(jié)合。此外，為了本發(fā)明的目的，“抗體構(gòu)建體”或“抗體衍生物”應(yīng)當認為是指包含抗體片段的任何分子結(jié)構(gòu)。優(yōu)選地，這樣的衍生物或構(gòu)建體應(yīng)當是非天然的，且將被制造以賦予有益的分子性能，同時維持抗體的免疫反應(yīng)性的(或免疫特異性的)性質(zhì)。示例性的適合的抗體片段、構(gòu)建體或衍生物包括：可變輕鏈片段(vl)、可變重鏈片段(vh)、scfv、f(ab')2片段、fab片段、fd片段、fv片段、單結(jié)構(gòu)域抗體片段、雙體、直鏈抗體、單鏈抗體分子和從抗體片段形成或衍生出的多特異性抗體。在其它實施方案中，本發(fā)明的cldn結(jié)合結(jié)構(gòu)域可以包含完整抗體、scfv-fc構(gòu)建體、微抗體（minibody）、雙體、scfv構(gòu)建體、fab-scfv2構(gòu)建體、fab-scfv構(gòu)建體或肽體（peptibody）。在某些方面，將cldn結(jié)合結(jié)構(gòu)域共價地連接(例如，通過使用本領(lǐng)域公知的基因工程技術(shù))至car的跨膜結(jié)構(gòu)域和細胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域。在其它實施方案中，可以將cldn結(jié)合結(jié)構(gòu)域非共價地連接(例如，經(jīng)由在u.s.p.n.2015/0139943中所述的結(jié)合結(jié)構(gòu)域的fc部分)至car的跨膜結(jié)構(gòu)域和細胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域。只要敏化的淋巴細胞能夠誘導(dǎo)期望的免疫應(yīng)答，結(jié)合結(jié)構(gòu)域連接的每種形式適合本發(fā)明。在特別優(yōu)選的實施方案中，和如在附加的實施例中所示，所述cldn結(jié)合結(jié)構(gòu)域?qū)瑂cfv構(gòu)建體。本文中使用的“單鏈可變片段(scfv)”是指從抗體衍生出的保留結(jié)合抗原的能力的單鏈多肽。scfv的一個例子包括通過重組dna技術(shù)形成的抗體多肽，且其中免疫球蛋白重鏈和輕鏈片段的fv區(qū)域經(jīng)由間隔序列連接。多種用于制備scfv的方法是已知的，且包括在u.s.p.n.4,694,778中描述的方法。在隨本文附帶的實施例中更詳細地描述了適合本發(fā)明的抗-cldnscfv構(gòu)建體。在其它實施方案中，所述cldn結(jié)合結(jié)構(gòu)域是這樣的結(jié)構(gòu)域：其包含fc區(qū)且其保留至少一種通常與存在于完整抗體中的fc區(qū)有關(guān)的生物學(xué)功能，諸如fcrn結(jié)合、抗體半衰期調(diào)節(jié)、adcc功能和補體結(jié)合。在一個實施方案中，抗體片段是具有與完整抗體基本上類似的體內(nèi)半衰期的單價抗體。例如，這樣的結(jié)合結(jié)構(gòu)域可以包含與fc序列連接的免疫反應(yīng)區(qū)域，所述fc序列包含至少一個能夠給所述片段賦予體內(nèi)穩(wěn)定性的游離半胱氨酸。在其它實施方案中，使用本領(lǐng)域公知的技術(shù)可以修飾fc區(qū)以改變公開的car和敏化的淋巴細胞的藥代動力學(xué)或藥效動力學(xué)。在cldn結(jié)合結(jié)構(gòu)域包含fc部分的情況下，它可以經(jīng)由與跨膜結(jié)構(gòu)域和細胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域可操作地結(jié)合的細胞外fc受體或結(jié)合分子(“fc結(jié)合劑”)與car的剩余部分非共價地連接或結(jié)合。本文中使用的術(shù)語“fc結(jié)合劑”被理解為是指與抗體的fc部分(例如，fc受體)結(jié)合或締合的任何分子或其部分。可以使用標準的分子生物學(xué)技術(shù)制造這樣的構(gòu)建體(即，包含fc結(jié)合劑、跨膜結(jié)構(gòu)域和細胞內(nèi)信號傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域的“原-car”)并與如本文中所述的選擇的淋巴細胞(自體或同種異體淋巴細胞)結(jié)合(例如，經(jīng)由轉(zhuǎn)導(dǎo))以產(chǎn)生“致敏的淋巴細胞”。在引入患者中之前的某個時點，然后可以在允許cldn結(jié)合結(jié)構(gòu)域與原-car結(jié)合的條件下將致敏的淋巴細胞暴露于選擇的至少包含fc部分的cldn結(jié)合結(jié)構(gòu)域。所述結(jié)合結(jié)構(gòu)域與原-car的非共價結(jié)合會提供本發(fā)明的cldn敏化的淋巴細胞且可以用于抑制如本文中所述的致瘤性細胞增殖(通常參見u.s.p.n.2015/0139943，其整體并入本文中)。在包含原-car的那些實施方案中，所述fc結(jié)合劑可以包含fc受體諸如fc-γ受體、fc-α受體或fc-ε受體。在某些選擇的實施方案中，所述fc受體可以包含cd16(例如，cd16a或cd16b)、cd32(例如，cd32a或cd32b)或cd64(例如，cd64a、cd64b或cd64c)的配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域。在某些其它實施方案中，所述fc結(jié)合劑不是fc受體。例如，所述fc結(jié)合劑可以包含蛋白a或蛋白g的全部或部分，只要所述原-car具有與cldn結(jié)合結(jié)構(gòu)域結(jié)合的能力。在其它實施方案中，所述fc結(jié)合劑可以包含結(jié)合免疫球蛋白的fc部分的免疫反應(yīng)性抗體或其片段或構(gòu)建體或衍生物。關(guān)于這樣的實施方案，所述fc結(jié)合劑可以例如包含scfv、納米體（nanobody）或微抗體（minibody）。類似地，適合這樣的實施方案的cldn結(jié)合結(jié)構(gòu)域包括能夠被fc結(jié)合劑結(jié)合且與cldn免疫特異性地反應(yīng)的任意分子。在某些實施方案中，所述cldn結(jié)合結(jié)構(gòu)域?qū)暾鹀ldn單克隆抗體或完整cldn單克隆抗體的混合物。在其它實施方案中，所述cldn結(jié)合結(jié)構(gòu)域可以包含完整多克隆cldn抗體(優(yōu)選全人)。在其它的實施方案中，所述cldn結(jié)合結(jié)構(gòu)域可以包含scfv-fc構(gòu)建體。更一般而言，本領(lǐng)域技術(shù)人員基于本發(fā)明的教導(dǎo)的公開內(nèi)容將能夠容易地鑒別適合原-car的cldn結(jié)合區(qū)域。此外，如本領(lǐng)域技術(shù)人員容易認識到的，通過分子工程或通過完整或完全抗體或抗體鏈的化學(xué)或酶處理(諸如木瓜蛋白酶或胃蛋白酶)或通過重組方式，可以得到公開的片段、構(gòu)建體或衍生物。關(guān)于抗體片段的更詳細描述，參見，例如，fundamentalimmunology,w.e.paul,編,ravenpress,n.y.(1999)。c.生產(chǎn)后選擇無論如何獲得，可以選擇、克隆抗體生產(chǎn)細胞(例如，雜交瘤、酵母集落等)，并針對期望特征(包括，例如，對cldn的高親和力)進一步篩選。可以在細胞培養(yǎng)物中在體外擴增雜交瘤，或可以在同基因的免疫受損的動物中在體內(nèi)擴增雜交瘤。選擇、克隆和擴增雜交瘤和/或集落的方法是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員眾所周知的。一旦鑒別出期望的抗體，就可以使用常用的本領(lǐng)域公知的分子生物學(xué)和生化技術(shù)分離、操作和表達相關(guān)的遺傳物質(zhì)。由原初文庫產(chǎn)生的抗體(天然的或合成的)可以具有中等親和力(約106至107m-1的ka)。為了增強親和力，通過構(gòu)建抗體文庫(例如，通過使用易出錯的聚合酶在體外引入隨機突變)和從那些二級文庫再選擇對抗原具有高親和力的抗體(例如通過使用噬菌體或酵母展示)，可以在體外模仿親和力成熟。wo9607754描述了用于誘導(dǎo)免疫球蛋白輕鏈的cdr中的誘變以產(chǎn)生輕鏈基因的文庫的方法?？梢允褂枚喾N技術(shù)來選擇抗體，包括、但不限于噬菌體或酵母展示，其中在噬菌體或酵母上合成人組合抗體或scfv片段的文庫，用目標抗原或其抗體結(jié)合部分篩選所述文庫，并分離結(jié)合所述抗原的噬菌體或酵母，由此可以獲得抗體或免疫反應(yīng)片段(vaughan等人,1996,pmid:9630891;sheets等人,1998,pmid:9600934;boder等人,1997,pmid:9181578；pepper等人,2008,pmid:18336206)。用于生成噬菌體或酵母展示文庫的試劑盒是商購可得的。還存在可用于生成和篩選抗體展示文庫的其它方法和試劑(參見u.s.p.n.5,223,409;wo92/18619,wo91/17271,wo92/20791,wo92/15679,wo93/01288,wo92/01047,wo92/09690；和barbas等人,1991,pmid:1896445)。這樣的技術(shù)有利地允許篩選大量候選抗體并提供相對容易的序列操作(例如，通過重組改組)。4.cldn結(jié)合結(jié)構(gòu)域的特征在選擇的實施方案中，可以選擇、克隆抗體生產(chǎn)細胞(例如雜交瘤、酵母集落)，并針對有利性能(包括例如穩(wěn)健生長、高抗體產(chǎn)量，和如在下面更詳細地討論的，期望的結(jié)合結(jié)構(gòu)域特征)進一步篩選。在其它情況下，通過針對動物的接種選擇特定抗原(例如，特異性的cldn結(jié)構(gòu)域)或靶抗原的免疫反應(yīng)片段，可以賦予抗體的特征。在其它實施方案中，可以如上所述工程改造選擇的抗體以增強或改進免疫化學(xué)特征，諸如親和力或藥代動力學(xué)片段。a.結(jié)合結(jié)構(gòu)域親和力本文中公開了對特定決定簇（例如cldn6）具有高結(jié)合親和力的抗體。術(shù)語“kd”表示特定抗體-抗原相互作用的解離常數(shù)或表觀親和力。當解離常數(shù)kd(koff/kon)≤10-7m時，本發(fā)明的抗體可以免疫特異性地結(jié)合它的靶抗原。當kd≤5x10-9m時，抗體以高親和力特異性地結(jié)合抗原，且當kd≤5x10-10m時，抗體以非常高的親和力特異性地結(jié)合抗原。在本發(fā)明的一個實施方案中，所述抗體具有≤10-9m的kd和約1x10-4/秒的解離速率。在本發(fā)明的一個實施方案中，所述解離速率<1x10-5/秒。在本發(fā)明的其它實施方案中，所述抗體將以約10-7m至10-10m之間的kd結(jié)合決定簇，并且在另一個實施方案中，它將以≤2x10-10m的kd結(jié)合。本發(fā)明的其它選擇的實施方案包含具有小于10-6m、小于5x10-6m、小于10-7m、小于5x10-7m、小于10-8m、小于5x10-8m、小于10-9m、小于5x10-9m、小于10-10m、小于5x10-10m、小于10-11m、小于5x10-11m、小于10-12m、小于5x10-12m、小于10-13m、小于5x10-13m、小于10-14m、小于5x10-14m、小于10-15m或小于5x10-15m的kd(koff/kon)的抗體。在某些實施方案中，本發(fā)明的免疫特異性地結(jié)合決定簇(例如cldn)的抗體可以具有至少105m-ls-l、至少2x105m-ls-l、至少5x105m-ls-l、至少106m-ls-l、至少5x106m-ls-l、至少107m-ls-l、至少5x107m-ls-l或至少108m-ls-l的結(jié)合速率常數(shù)或kon(或ka)速率(抗體+抗原(ag)kon←抗體-ag)。在另一個實施方案中，本發(fā)明的免疫特異性地結(jié)合決定簇(例如cldn)的抗體可以具有小于l0-ls-l、小于5xl0-ls-l、小于l0-2s-l、小于5xl0-2s-l、小于l0-3s-l、小于5xl0-3s-l、小于l0-4s-l、小于5xl04s-l、小于l0-5s-l、小于5xl0-5s-l、小于l0-6s-l、小于5xl0-6s-l小于l0-7s-l、小于5xl0-7s-l、小于l0-8s-l、小于5xl0-8s-l、小于l0-9s-l、小于5xl0-9s-l或小于l0-10s-l的解離速率常數(shù)或koff(或kd)速率(抗體+抗原(ag)koff←抗體-ag)。使用本領(lǐng)域已知的多種技術(shù)，例如，表面等離子體共振、生物層干擾量度法、雙極化干擾量度法、靜態(tài)光散射、動態(tài)光散射、等溫滴定量熱法、elisa、分析超速離心和流式細胞計量術(shù)，可以確定結(jié)合親和力。b.分倉和表位作圖本文中使用的術(shù)語“分倉(binning)”表示用于基于它們的抗原結(jié)合特征和它們是否彼此競爭而將抗體(或結(jié)合結(jié)構(gòu)域)分組至“倉室（bin）”中的方法。倉室的初始確定可以通過如本文所述的表位作圖和其它技術(shù)進一步改進和證實。但是，應(yīng)當理解，抗體向各個倉室的經(jīng)驗分配會提供可以指示公開的抗體的治療潛力的信息。更具體地，通過使用本領(lǐng)域中已知的和本文實施例中描述的方法，可以確定所選參比抗體(或其片段)是否與第二測試抗體競爭結(jié)合(即處于相同倉室中)。在一個實施方案中，參比抗體與cldn抗原在飽和條件下結(jié)合，且然后使用標準的免疫化學(xué)技術(shù)確定第二或測試抗體的結(jié)合cldn的能力。如果測試抗體能夠與參考抗-cldn抗體同時實質(zhì)上結(jié)合cldn，那么與第一或參比抗體相比，第二或測試抗體結(jié)合不同的表位。但是，如果測試抗體不能同時實質(zhì)上結(jié)合cldn，那么測試抗體結(jié)合相同表位、重疊表位或與由第一抗體結(jié)合的表位緊密鄰近(至少在空間上)的表位。也就是說，測試抗體競爭抗原結(jié)合且與參比抗體處于相同倉室中。當在公開的抗體的上下文中使用時，術(shù)語“競爭”或“競爭抗體”意指抗體之間的競爭，如通過其中所測試的測試抗體或免疫學(xué)功能片段抑制參比抗體與共同抗原的特異性結(jié)合的測定法所確定的。通常，此類測定法涉及使用結(jié)合至固體表面或細胞的經(jīng)純化的抗原(例如，cldn或其結(jié)構(gòu)域或片段)、未標記的測試抗體和標記的參比抗體。通過在有測試抗體存在下確定結(jié)合至固體表面或細胞的標記的量，測量競爭性抑制。通常，測試抗體以過量存在和/或被允許首先結(jié)合。關(guān)于確定競爭性結(jié)合的方法的額外細節(jié)提供在本文實施例中。通常，當競爭抗體以過量存在時，它使參比抗體與共同抗原的特異性結(jié)合抑制至少30%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%或75%。在一些情況下，使結(jié)合抑制至少80%、85%、90%、95%或97%或更多。相反，當結(jié)合參比抗體時，它優(yōu)選地使隨后添加的測試抗體(即，cldn抗體)的結(jié)合抑制至少30%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%或75%。在一些情況下，使測試抗體的結(jié)合抑制至少80%、85%、90%、95%或97%或更多。通常，使用多種本領(lǐng)域公知的技術(shù)，例如，免疫測定諸如蛋白質(zhì)印跡、放射免疫測定、酶聯(lián)免疫吸附測定(elisa)、“夾心”免疫測定、免疫沉淀測定、沉淀素反應(yīng)、凝膠擴散沉淀素反應(yīng)、免疫擴散測定、凝集測定、補體結(jié)合測定、免疫放射測定、熒光免疫測定和蛋白a免疫測定，可以確定分倉或競爭性結(jié)合。這樣的免疫測定是常規(guī)的和本領(lǐng)域眾所周知的(參見，ausubel等人,編,(1994)currentprotocolsinmolecularbiology,第1卷,johnwiley&sons,inc.,newyork)。另外，可以使用交叉阻斷測定(參見，例如，wo2003/48731；和harlow等人(1988)antibodies,alaboratorymanual,coldspringharborlaboratory,harlow和davidlane編著)。用于確定競爭性抑制(和因此確定“倉室”)的其它技術(shù)包括：表面等離子體共振，其使用例如biacore?2000系統(tǒng)(gehealthcare)；生物層干擾量度法，其使用例如fortebio?octetred(fortebio)；或流式細胞計量術(shù)珠子陣列，其使用例如facscantoii(bdbiosciences)或多路luminex?檢測測定(luminex)。luminex是一種能夠?qū)崿F(xiàn)大規(guī)模多路抗體配對的基于珠子的免疫測定平臺。所述測定對比抗體對與靶抗原的同時結(jié)合模式。所述對中的一種抗體(捕獲mab)結(jié)合luminex珠子，其中每個捕獲mab結(jié)合不同顏色的珠子。另一種抗體(檢測mab)結(jié)合熒光信號(例如藻紅蛋白(pe))。所述測定分析抗體與抗原的同時結(jié)合(配對)，并將具有類似配對特性的抗體分組在一起。檢測mab和捕獲mab的類似概況指示，兩種抗體結(jié)合相同的或密切相關(guān)的表位。在一個實施方案中，可以使用pearson相關(guān)系數(shù)確定配對概況以鑒別與測試的抗體的集合上的任何特定抗體最密切相關(guān)的抗體。在優(yōu)選的實施方案中，如果抗體對的pearson相關(guān)系數(shù)為至少0.9，則將確定測試/檢測mab與參考/捕獲mab在相同的倉室中。在其它實施方案中，pearson相關(guān)系數(shù)為至少0.8、0.85、0.87或0.89。在其它實施方案中，pearson相關(guān)系數(shù)為至少0.91、0.92、0.93、0.94、0.95、0.96、0.97、0.98、0.99或1。分析得自luminex測定的數(shù)據(jù)的其它方法描述于u.s.p.n.8,568,992。luminex的同時分析100種不同類型的珠子(或更多)的能力會提供幾乎無限的抗原和/或抗體表面，從而導(dǎo)致在生物傳感器測定中的抗體表位繪圖中的通量和分辨率改善(miller,等人,2011,pmid:21223970)?！氨砻娴入x子體共振”表示允許通過檢測生物傳感器基質(zhì)內(nèi)的蛋白濃度的改變來分析實時特異性相互作用的光學(xué)現(xiàn)象。在其它實施方案中，可以用于確定測試抗體是否與參比抗體“競爭”結(jié)合的技術(shù)是“生物層干擾量度法”，即一種分析從以下兩個表面反射的白光的干涉圖樣的光學(xué)分析技術(shù)：在生物傳感器尖部上的固定化蛋白層，和內(nèi)部參比層。與生物傳感器尖部結(jié)合的分子的數(shù)目的任何變化會造成可以實時測量的干涉圖樣遷移。這樣的生物層干擾量度法測定可以如下使用fortebio?octetred機器進行。將參比抗體(ab1)捕獲在抗-小鼠捕獲芯片上，然后使用高濃度的非結(jié)合抗體封閉芯片并收集基線。然后用特異性抗體(ab1)捕獲單體重組靶蛋白，并將尖部浸入含有相同抗體(ab1)作為對照的孔中或浸入含有不同測試抗體(ab2)的孔中。如果沒有發(fā)生進一步結(jié)合（如通過將結(jié)合水平與對照ab1進行對比所確定的），那么確定ab1和ab2是“競爭”抗體。如果用ab2觀察到另外的結(jié)合，那么確定ab1和ab2不會彼此競爭。在代表獨特倉室的96-孔板中使用整行抗體可以擴大該過程以篩選獨特抗體的大文庫。在優(yōu)選的實施方案中，如果參比抗體使測試抗體與共同抗原的特異性結(jié)合抑制至少40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%或75%，測試抗體將與參比抗體競爭。在其它實施方案中，使結(jié)合抑制至少80%、85%、90%、95%或97%或更多。一旦已經(jīng)定義包括一組競爭抗體的倉室，則可以實施進一步表征以確定倉室中的抗體所結(jié)合的抗原上的具體結(jié)構(gòu)域或表位?？梢允褂糜蒫ochran等人,2004,pmid:15099763描述的方案的改良方案進行結(jié)構(gòu)域-水平表位作圖。精細表位作圖是確定抗原上構(gòu)成抗體所結(jié)合的決定簇的表位的具體氨基酸的方法。術(shù)語“表位”以它的普通生物化學(xué)意義使用，并且表示靶抗原的能夠被特定抗體識別且特異性地結(jié)合的部分。在某些實施方案中，表位或免疫原性決定簇包括分子的化學(xué)活性表面分組，諸如氨基酸、糖側(cè)鏈、磷酰基或磺?；以谀承嵤┓桨钢?，可以具有特定三維結(jié)構(gòu)特征和/或比電荷特征。在某些實施方案中，當抗體在蛋白和/或大分子的復(fù)雜混合物中優(yōu)選識別其靶抗原時，將該抗體稱為與抗原特異性結(jié)合。當抗原是多肽(諸如cldn)時，表位通常可以由連續(xù)氨基酸和通過蛋白的三級折疊而靠近的非連續(xù)氨基酸(“構(gòu)象表位”)形成。在這樣的構(gòu)象表位中，存在跨越蛋白上的彼此線性分離的氨基酸殘基的相互作用點。由連續(xù)氨基酸形成的表位(有時被稱作“線性”或“連續(xù)”表位)通常在蛋白變性后保留，而由三級折疊形成的表位通常在蛋白變性后消失。抗體表位通常包括獨特空間構(gòu)象中的至少3個、且更通常至少5個或8-10個氨基酸。表位確定或“表位作圖”的方法是本領(lǐng)域眾所周知的，并且可以與本發(fā)明結(jié)合使用以鑒別cldn上被公開的抗體結(jié)合的表位。適合的表位作圖技術(shù)包括丙氨酸掃描突變體、肽印跡法(reineke(2004)methodsmolbiol248:443-63)或肽切割分析。此外，可以使用諸如表位切除、表位提取和抗原的化學(xué)修飾的方法(tomer(2000)proteinscience9:487-496)。其它適合的方法包括酵母展示方法。在其它實施方案中，修飾輔助繪圖(modification-assistedprofiling；map)，也被稱作基于抗原結(jié)構(gòu)的抗體繪圖(antigenstructure-basedantibodyprofiling；asap)，會提供根據(jù)每種抗體與化學(xué)地或酶促地修飾的抗原表面的結(jié)合概況的相似性來將大量針對相同抗原的單克隆抗體歸類的方法(u.s.p.n.2004/0101920)。該技術(shù)允許快速過濾遺傳上相同的抗體，使得表征可以集中于遺傳上不同的抗體。應(yīng)當理解，可以使用map將本發(fā)明的cldn抗體分選至結(jié)合不同表位的抗體組中。一旦確定抗原上的期望的表位，就可能生成針對該表位的抗體，例如通過使用本發(fā)明中描述的技術(shù)用包含所述表位的肽進行免疫?？蛇x地，在發(fā)現(xiàn)過程期間，抗體的生成和表征可以闡明關(guān)于位于特定結(jié)構(gòu)域或基序中的期望表位的信息。從該信息，則可能針對與相同表位的結(jié)合來競爭性地篩選抗體。一個實現(xiàn)該目的的方案是進行競爭研究以發(fā)現(xiàn)競爭對抗原的結(jié)合的抗體。用于基于抗體的交叉競爭而對抗體進行分倉的高通量方法描述于wo03/48731中。分倉或結(jié)構(gòu)域水平或表位作圖的其它方法(包含抗體競爭或酵母上的抗原片段表達)是本領(lǐng)域眾所周知的。b.任選的鉸鏈區(qū)本文中使用的術(shù)語“鉸鏈區(qū)”表示柔性多肽連接區(qū)(在本文中也被稱作“鉸鏈”)，其可以被包括在car外結(jié)構(gòu)域內(nèi)從而給側(cè)接多肽區(qū)域提供結(jié)構(gòu)柔性。鉸鏈區(qū)可以由天然的或合成的多肽組成。本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，鉸鏈區(qū)可以通過促進抗原識別結(jié)構(gòu)域相對于被所述抗原識別結(jié)構(gòu)域識別的抗原部分的最佳定位來改善car的功能。應(yīng)當理解，在某些實施方案中，鉸鏈區(qū)可以不是最佳car活性所需的。在其它實施方案中，包含短氨基酸序列的有益鉸鏈區(qū)會通過促進抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域或抗體的柔性來促進car活性。編碼鉸鏈區(qū)的序列可以位于抗原識別部分(例如，抗-cldnscfv)和跨膜結(jié)構(gòu)域之間。鉸鏈序列可以是從任意合適的分子衍生出或得到的任意部分或序列。在一個實施方案中，例如，從人cd8α分子或cd28分子衍生出鉸鏈序列。從免疫球蛋白(例如，iggl)衍生出的“鉸鏈區(qū)”通常被定義為人igg1的glu216至pro230的段。可以如下將其它igg同種型的鉸鏈區(qū)與igg1序列比對：將形成重鏈間二硫(s-s)鍵的第一個和最后一個半胱氨酸殘基放在相同位置。在其它實施方案中，所述鉸鏈區(qū)可以是天然存在的或非天然存在的，包括、但不限于如在u.s.p.n.5,677,425中所述的改變的鉸鏈區(qū)。當然，當在car中使用某些結(jié)合結(jié)構(gòu)域諸如(fab’)2或完整抗體時，天然地隨后包括對應(yīng)鉸鏈區(qū)。在其它選擇的實施方案中，鉸鏈區(qū)可以包括從抗體衍生出的完整鉸鏈區(qū)，所述抗體來自與ch1結(jié)構(gòu)域的抗體不同的類別或亞類。術(shù)語“鉸鏈區(qū)”也可以包括從人cd8α分子或cd28分子和在給側(cè)接區(qū)域提供柔性中起類似功能的任意其它受體衍生出的區(qū)域。鉸鏈區(qū)可以具有約4個氨基酸至約50個氨基酸的長度，例如，約4個氨基酸至約10個氨基酸、約10個氨基酸至約15個氨基酸、約15個氨基酸至約20個氨基酸、約20個氨基酸至約25個氨基酸、約25個氨基酸至約30個氨基酸、約30個氨基酸至約40個氨基酸、或約40個氨基酸至約50個氨基酸?？梢匀菀椎剡x擇合適的鉸鏈區(qū)，且可以具有許多合適長度中的任一種，諸如1個氨基酸(例如，gly)至20個氨基酸、2個氨基酸至15個氨基酸、3個氨基酸至12個氨基酸，包括4個氨基酸至10個氨基酸、5個氨基酸至9個氨基酸、6個氨基酸至8個氨基酸或7個氨基酸至8個氨基酸，且可以是1、2、3、4、5、6或7個氨基酸。本領(lǐng)域技術(shù)人員會明白，適合的鉸鏈區(qū)是眾所周知的，且因此，可以容易地選擇可行的實施方案并摻入本發(fā)明的cldncar中。c.跨膜/間隔結(jié)構(gòu)域如上面所提及的，本發(fā)明的cldncar優(yōu)選地包含插入在細胞外cldn結(jié)合結(jié)構(gòu)域和/或鉸鏈區(qū)之間的跨膜結(jié)構(gòu)域、和細胞內(nèi)的或細胞質(zhì)的信號傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域。為了本發(fā)明的討論的目的，術(shù)語“跨膜結(jié)構(gòu)域”將與以下理解一起使用：盡管它總是包括在物理上埋在細胞膜的脂質(zhì)雙層中的氨基酸殘基，它可以包括可延伸超出細胞膜的任一側(cè)的支持或“間隔結(jié)構(gòu)域”。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以容易地區(qū)分car組分的功能方面，且考慮到本發(fā)明容易地確定什么構(gòu)成適合的跨膜結(jié)構(gòu)域。應(yīng)當理解，可以從天然多肽衍生出跨膜結(jié)構(gòu)域，或可以人工地設(shè)計跨膜結(jié)構(gòu)域?？梢詮娜魏文そY(jié)合蛋白或跨膜蛋白（其在必要時可以經(jīng)過修飾或截短）衍生出適合的跨膜結(jié)構(gòu)域。例如，從t細胞受體α或β鏈、igg(諸如igg4)的fc區(qū)、cd3ζ鏈、cd28、cd3ε、cd45、cd4、cd5、cd8、cd9、cd16、cd22、cd33、cd37、cd64、cd80、cd86、cd134、cd137、icos、cd154或gitr衍生出的跨膜結(jié)構(gòu)域都適合公開的cldncar構(gòu)建體的不同實施方案。在某些實施方案中，優(yōu)選的是采用cd8ζ、fcrη、fcεr1-γ和-β、mb1(igα)、b29或cd3-γ、ζ或ε的跨膜結(jié)構(gòu)域，以便保留與受體復(fù)合物的其它成員的物理結(jié)合。適合的人工跨膜結(jié)構(gòu)域可以包含摻入高水平的疏水殘基（諸如亮氨酸和纈氨酸）的各種多肽序列。在其它優(yōu)選的實施方案中，所述跨膜結(jié)構(gòu)域可以包含位于合成的跨膜結(jié)構(gòu)域的每個末端處的苯丙氨酸、色氨酸和纈氨酸的三聯(lián)體。本發(fā)明的某些實施方案將包含具有間隔物的跨膜結(jié)構(gòu)域。在本發(fā)明的cldncar中，“間隔結(jié)構(gòu)域”或“間隔區(qū)域”是可以安排在細胞外功能結(jié)構(gòu)域(例如，抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域或鉸鏈區(qū)，如果包括的話)和跨膜結(jié)構(gòu)域之間、或細胞內(nèi)信號傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域和跨膜結(jié)構(gòu)域之間的氨基酸序列。間隔結(jié)構(gòu)域是指用于連接跨膜結(jié)構(gòu)域和細胞外結(jié)構(gòu)域和/或連接跨膜結(jié)構(gòu)域和細胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域的任意寡肽或多肽，其目的是為了有效的car功能使這些元件在car多肽內(nèi)最佳地定位。間隔結(jié)構(gòu)域包含至多300個氨基酸，優(yōu)選10-100個氨基酸，和最優(yōu)選25-50個氨基酸。間隔結(jié)構(gòu)域優(yōu)選地具有促進cldncar與cldn的結(jié)合并增強向細胞中的跨膜信號傳導(dǎo)的序列。預(yù)期會促進結(jié)合的氨基酸的例子包括在潛在糖基化位點中的半胱氨酸、帶電荷的氨基酸和絲氨酸和蘇氨酸，并且這些氨基酸可以用作構(gòu)成間隔結(jié)構(gòu)域的氨基酸。在優(yōu)選的實施方案中，所述間隔物可以包含抗體恒定區(qū)的全部或部分(例如，igg1ch或cl)，它們可以任選地二聚化。其它適合的間隔物包括本領(lǐng)域已知的甘氨酸聚合物(g)n、甘氨酸-絲氨酸聚合物、甘氨酸-丙氨酸聚合物、丙氨酸-絲氨酸聚合物和其它柔性的間隔物。可以使用甘氨酸和甘氨酸-絲氨酸聚合物；gly和ser都是相對無組織的，且因此可以充當組分之間的中性系鏈（tether）。可以使用甘氨酸聚合物；甘氨酸占用比甚至丙氨酸顯著更多的phi-psi空間，且與具有較長側(cè)鏈的殘基相比受到少得多的限制。本領(lǐng)域技術(shù)人員會明白，適合的跨膜結(jié)構(gòu)域是本領(lǐng)域眾所周知的，且因此，可以容易地選擇可行的實施方案并摻入本發(fā)明的cldncar中。d.細胞內(nèi)信號傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域除了細胞外cldn結(jié)合結(jié)構(gòu)域和跨膜結(jié)構(gòu)域以外，本發(fā)明的cldncar將包含細胞內(nèi)的或細胞質(zhì)的結(jié)構(gòu)域，其含有至少一個信號傳導(dǎo)和/或t細胞活化部分。在本發(fā)明中使用的細胞內(nèi)信號傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域是這樣的分子：當在相同分子內(nèi)存在(或非共價地結(jié)合)的細胞外結(jié)構(gòu)域與cldn結(jié)合(相互作用)時，所述分子可以將一個或多個信號傳導(dǎo)進細胞中。cldn的結(jié)合會觸發(fā)沿著car傳輸并向細胞內(nèi)傳遞以活化敏化的淋巴細胞的信號。該淋巴細胞活化會觸發(fā)期望的免疫應(yīng)答，其導(dǎo)致靶細胞的消除。t-淋巴細胞活化的雙信號理論提出，需要兩個信號才能有效地活化t-細胞：首先，在mhc分子的背景下呈遞的抗原肽會與tcr的α:β鏈異源二聚體相互作用，從而引起構(gòu)象變化，所述構(gòu)象變化導(dǎo)致來自在tcr復(fù)合物的蛋白組分中存在的細胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域的信號的活化；和其次，隨著它們與在細胞上呈遞肽:mhc復(fù)合物的它們的相應(yīng)配體相互作用，單個或幾個共刺激分子從細胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域傳遞信號。更具體地，已知的是，僅經(jīng)由tcr復(fù)合物產(chǎn)生的信號可能不足以活化t細胞，并且還需要次要或共刺激信號以避免被稱作無反應(yīng)性的t-細胞無活性狀態(tài)。天然的t細胞-活化通過兩個不同種類的細胞質(zhì)信號傳導(dǎo)序列來傳遞，也就是說，一個經(jīng)由tcr復(fù)合物起始抗原依賴性的主要活化的序列(主要細胞質(zhì)信號傳導(dǎo)序列)，和一個獨立于抗原起作用以提供次要或共刺激信號的序列(次要細胞質(zhì)信號傳導(dǎo)序列)。在一個優(yōu)選的方面，本發(fā)明的cldncar包含主要細胞質(zhì)信號傳導(dǎo)序列和/或次要細胞質(zhì)信號傳導(dǎo)序列作為car內(nèi)結(jié)構(gòu)域。一般而言，在免疫系統(tǒng)受體的細胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域中存在的信號傳導(dǎo)基序可以是活化性的或抑制性的。刺激活化的主要細胞質(zhì)信號傳導(dǎo)序列可以包含被稱作基于免疫受體酪氨酸的活化基序(itam)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)基序[nature,第338卷,第383-384頁(1989)]。另一方面，以抑制方式起作用的主要細胞質(zhì)信號傳導(dǎo)序列包含被稱作基于免疫受體酪氨酸的抑制基序(itim)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)基序。在本發(fā)明中，可以使用具有itam或itim的細胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域。從天然tcr復(fù)合物傳遞用于t-細胞活化的第一刺激信號的主要細胞質(zhì)信號傳導(dǎo)序列是在cd3ζ鏈中出現(xiàn)的itam，但是已知的是，還可以采用其它itam來傳遞明確的主要活化信號。可以在本發(fā)明中使用的具有itam的細胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域的例子包括具有從cd3ζ、fcrγ、fcrβ、cd3γ、cd3δ、cd3ε、cd5、cd22、cd79a、cd79b和cd66d衍生出的itam的細胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域。具體地，itam的例子包括具有以下序列的肽：cd3ζ(ncbirefseq:np—932170.1)的氨基酸編號51-164、fcεriγ(ncbirefseq:np—004097.1)的氨基酸編號45-86、fcεriβ(ncbirefseq:np—000130.1)的氨基酸編號201-244、cd3γ(ncbirefseq:np—000064.1)的氨基酸編號139-182、cd3δ(ncbirefseq:np—000723.1)的氨基酸編號128-171、cd3ε(ncbirefseq:np—000724.1)的氨基酸編號153-207、cd5(ncbirefseq:np—055022.2)的氨基酸編號402-495、0022(ncbirefseq:np—001762.2)的氨基酸編號707-847、cd79a(ncbirefseq:np—001774.1)的氨基酸編號166-226、cd79b(ncbirefseq:np—000617.1)的氨基酸編號182-229和cd66d(ncbirefseq:np—001806.2)氨基酸編號177-252，以及它們的具有這些肽所具有的相同功能的變體?；诿糠N蛋白的前體(包含信號肽序列等)的全長，進行基于本文描述的ncbirefseqid或genbank的氨基酸序列信息的氨基酸編號。次要共刺激信號可以來自多種共刺激分子的細胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域，其中最佳地表征的是cd28。cd28在t-細胞上表達，且是cd80(b7.1)和cd86(b7.2)的受體。但是，其它共刺激分子包括、但不限于cd27分子、cd137/4-1bb分子、cd134/ox40分子和本領(lǐng)域已知的其它細胞內(nèi)信號傳導(dǎo)分子。已知cd134/ox40會增強t-細胞克隆繁殖（可能通過抑制細胞凋亡），且可能在記憶細胞的建立中起作用。4-1bb（也被稱作cd137）將有效的共刺激信號傳導(dǎo)給t-細胞，從而促進分化和增強t淋巴細胞的長期存活。由于這些共刺激分子中的每一種活化不同的細胞內(nèi)信號傳導(dǎo)途徑且可能在不同的t-淋巴細胞群體中具有不同的作用，可以在car的內(nèi)結(jié)構(gòu)域中包括來自一種、幾種或每一種的結(jié)構(gòu)域，以便使t-細胞活化和car的其它期望性能最大化。在一個優(yōu)選的實施方案中，cd28、cd27、4-1bb和ox40分子是人的?？梢栽诒景l(fā)明中使用的包含次要細胞質(zhì)信號傳導(dǎo)序列的細胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域的例子包括從cd2、cd4、cd5、cd8α、cd8β、cd28、cd134、cd137、icos和cd154衍生出的序列。其具體例子包括具有以下序列的肽：cd2(ncbirefseq:np-001758.2)的氨基酸編號236-351、cd4(ncbirefseq:np-000607.1)的氨基酸編號421-458、cd5(ncbirefseq:np-055022.2)的氨基酸編號402-495、cd8α(ncbirefseq:np-001759.3)的氨基酸編號207-235、cd83(genbank:aaa35664.1)的氨基酸編號196-210、cd28(ncbirefseq:np—006130.1)的氨基酸編號181-220(seqidno.:25)、cd137(4-1bb,ncbirefseq:np-001552.2)的氨基酸編號214-255、cd134(ox40,ncbirefseq:np-003318.1)的氨基酸編號241-277和icos(ncbirefseq:np-036224.1)氨基酸編號166-199，以及它們的具有這些肽所具有的相同功能的變體。由公開的核酸序列編碼的cldncar的信號傳導(dǎo)/活化結(jié)構(gòu)域可以包含前述信號傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域中的任一種和前述細胞間t-細胞活化結(jié)構(gòu)域中的任意一種或多種的任意組合。例如，本發(fā)明的核酸序列可以編碼包含cd28信號傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域以及cd28和cd3ζ的細胞內(nèi)t-細胞活化結(jié)構(gòu)域的car?？蛇x地，例如，本發(fā)明的核酸序列可以編碼包含cd8α信號傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域以及cd28、cd3ζ、fc受體γ(fcrγ)鏈和/或4-1bb的t細胞信號傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域的car。本領(lǐng)域技術(shù)人員會明白，前述信號傳導(dǎo)/刺激結(jié)構(gòu)域中的每一種適合本發(fā)明，且可以與公開的cldncar一起(單獨地或優(yōu)選地組合地)有效地使用。因此，前述部分中的每一種（以任意組合或構(gòu)型）作為細胞內(nèi)/細胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域的組分被明確地預(yù)見到在本發(fā)明的范圍內(nèi)。v.car核酸和載體本發(fā)明提供了一種經(jīng)分離的或經(jīng)純化的核酸序列，其編碼抗-cldn嵌合抗原受體，其中所述car優(yōu)選地包含細胞外結(jié)合結(jié)構(gòu)域(例如，scfv)、跨膜結(jié)構(gòu)域和細胞內(nèi)信號傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域(例如，t-細胞活化部分)。本文中使用的“核酸序列”意圖包括dna或rna的聚合物（即，多核苷酸），其可以是單鏈的或雙鏈的，且其可以含有非天然的或改變的核苷酸。本文中使用的術(shù)語“核酸”和“多核苷酸”表示任意長度的核苷酸的聚合形式，無論是核糖核苷酸(rna)還是脫氧核糖核苷酸(dna)。這些術(shù)語表示分子的一級結(jié)構(gòu)，且因而包括雙鏈和單鏈dna、以及雙鏈和單鏈rna。該術(shù)語包括作為等同物的、從核苷酸類似物和經(jīng)修飾的多核苷酸（例如、但不限于甲基化的和/或加帽的多核苷酸）制成的rna或dna的類似物?！胺蛛x的”是指從它的天然環(huán)境取出核酸?！凹兓摹笔侵福o定的核酸的純度已經(jīng)增加，其中“純度”是相對術(shù)語，而不是“絕對純度”，所述給定的核酸是已經(jīng)從自然界中取出的核酸(包括基因組dna和mrna)或在實驗室條件下合成的(包括cdna)和/或擴增的核酸。但是，應(yīng)當理解，核酸和蛋白可以用稀釋劑或佐劑配制，且仍然為了實用目的而分離。例如，當用于引入細胞中時，通常將核酸與可接受的載體或稀釋劑混合。如本文中所述的和在附加的實施例中證實的，使用本領(lǐng)域已知的方法可以制備適合本發(fā)明的核酸序列。例如，使用標準重組dna方法，可以重組生產(chǎn)核酸序列、多肽和蛋白(參見，例如，sambrook等人,molecularcloning:alaboratorymanual,第3版,coldspringharborpress,coldspringharbor,n.y.2001)。此外，可以從來源（諸如cho細胞、植物、細菌、昆蟲或哺乳動物，例如，大鼠、人等）分離和/或純化合成制備的編碼cldncar的核酸序列。分離和純化的方法是本領(lǐng)域眾所周知的?？蛇x地，可以商業(yè)地合成本文描述的核酸序列。在這方面，本發(fā)明核酸序列可以是合成的、重組的、分離的和/或純化的。本發(fā)明的核酸序列可以編碼任意長度的cldncar，即，所述car可以包含任意數(shù)目的氨基酸，前提條件是，所述car保留它的生物學(xué)活性，例如，特異性地結(jié)合抗原和治療或預(yù)防哺乳動物中的疾病等的能力。例如，所述car可以包含50個或更多個、60個或更多個、100個或更多個、250個或更多個或500個或更多個氨基酸。優(yōu)選地，所述car是約50至約700個氨基酸(例如，約70個、約80個、約90個、約150個、約200個、約300個、約400個、約550個或約650個氨基酸)、約100個至約500個氨基酸(例如，約125個、約175個、約225個、約250個、約275個、約325個、約350個、約375個、約425個、約450個或約475個氨基酸)、或由前述值中的任意2個限定的范圍。在本發(fā)明的范圍內(nèi)包括編碼本文中描述的cldncar的功能部分的核酸序列。當關(guān)于car使用時，術(shù)語“功能部分”表示本發(fā)明的car的任何部分或片段，所述部分或片段保留其來源car(親本car)的生物學(xué)活性。功能部分包括，例如，這樣的car部分：其保留識別靶細胞、或者提供免疫調(diào)節(jié)性信號、或者治療疾病的能力，其達到與親本car相似的程度、相同的程度或更高的程度。關(guān)于編碼親本cldncar的核酸序列，編碼car的功能部分的核酸序列可以編碼這樣的蛋白：其包含親本car的例如約10%、25%、30%、50%、68%、80%、90%、95%或更多。在這點上，適合的核酸序列可以編碼這樣的car功能部分：其含有位于所述部分的氨基或羧基端或者兩端的額外氨基酸，所述額外氨基酸不存在于親本car的氨基酸序列中。理想地，所述額外氨基酸不干擾所述功能部分的生物學(xué)功能，例如，識別靶細胞、檢測癌癥、治療或預(yù)防癌癥等。更理想的是，與親本car的生物學(xué)活性相比，所述額外氨基酸增強所述car的生物學(xué)活性。本發(fā)明還提供了編碼cldncar的功能變體的核酸序列。本文中使用的術(shù)語“功能變體”表示與由公開的核酸序列編碼的car具有基本或顯著序列同一性或相似性的car、多肽或蛋白，所述功能變體保留所述功能變體作為其變體的car的cldn結(jié)合能力。功能變體包括，例如，這樣的本文所述的car(親本car)的變體：所述變體保留識別cldn陽性的靶細胞的能力，達到與親本car相似的程度、相同的程度或更高的程度。關(guān)于編碼親本car的核酸序列，編碼所述car的功能變體的核酸序列可以與編碼親本car的核酸序列具有例如約10%同一性、約25%同一性、約30%同一性、約50%同一性、約65%同一性、約80%同一性、約90%同一性、約95%同一性、或約99%同一性。不論cldncar的精確形式，應(yīng)當理解，本發(fā)明的核酸可以用于所選宿主細胞(例如，淋巴細胞)的離體轉(zhuǎn)化或直接引入受試者中用于體內(nèi)基因治療。在每種情況下，除了本文中公開的其它賦形劑以外，公開的核酸還可以與促進核酸向細胞中的轉(zhuǎn)移的物質(zhì)（例如，用于引入核酸的試劑諸如脂質(zhì)體或陽離子脂質(zhì)）組合。在某些優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的核酸將與載體組合或者摻入載體中，所述載體適合用于體內(nèi)基因治療。因此，與前述內(nèi)容結(jié)合，本發(fā)明提供了包含cldncar核酸的組合物，所述cldncar核酸與藥學(xué)上可接受的載體一起可以用作活性成分或制備敏化的淋巴細胞。合適的藥學(xué)上可接受的添加劑是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的。藥學(xué)上可接受的添加劑或賦形劑的例子包括磷酸鹽緩沖鹽水(例如0.01m磷酸鹽,0.138mnacl,0.0027mkcl,ph7.4)，含有無機酸鹽諸如鹽酸鹽、氫溴酸鹽、磷酸鹽或硫酸鹽的水溶液，鹽水，乙二醇或乙醇的溶液，和有機酸鹽諸如乙酸鹽、丙酸鹽、丙二酸鹽或苯甲酸鹽。還可以使用佐劑（諸如潤濕劑或乳化劑）和ph緩沖劑?？梢詫⒈景l(fā)明的組合物配制成適合于胃腸外施用（例如，注射或輸注）的已知形式。此外，這樣的組合物可以包含配制添加劑諸如助懸劑、防腐劑、穩(wěn)定劑和/或分散劑，和用于在貯存期間延長有效期的保存劑。此外，所述組合物可以呈在使用前用適當?shù)臒o菌液體重構(gòu)的干燥形式。除了編碼cldncar的核酸序列以外，適合的載體優(yōu)選地包含表達控制序列，諸如啟動子、增強子、多腺苷酸化信號、轉(zhuǎn)錄終止子、內(nèi)核糖體進入位點(ires)等，其提供所述核酸序列在宿主細胞中的表達。在這點上，來自多種不同來源的大量啟動子（包括組成型、誘導(dǎo)型和阻抑型啟動子）是本領(lǐng)域眾所周知的。啟動子的代表性來源包括，例如病毒、哺乳動物、昆蟲、植物、酵母和細菌，并且來自這些來源的合適啟動子是容易得到的，或者可以基于公眾可得到的序列（例如從保藏機構(gòu)諸如atcc以及其它商業(yè)或個體來源）合成地制備。啟動子可以是單向的（即，在一個方向起始轉(zhuǎn)錄）或雙向的（即，在3’或5’方向起始轉(zhuǎn)錄）。啟動子的非限制性例子包括例如t7細菌表達系統(tǒng)、pbad(araa)細菌表達系統(tǒng)、巨細胞病毒(cmv)啟動子、sv40啟動子和rsv啟動子。誘導(dǎo)型啟動子包括例如tet系統(tǒng)、蛻皮激素可誘導(dǎo)的系統(tǒng)、t-rex?系統(tǒng)(invitrogen,carlsbad,calif.)、lacswitch?系統(tǒng)(stratagene,sandiego,calif.)和cre-ert他莫昔芬可誘導(dǎo)的重組酶系統(tǒng)。另外，所述cldncar可以與基因結(jié)合，所述基因可以是用于證實核酸的表達的標志物(例如藥物抗性基因、編碼報告酶的基因或編碼熒光蛋白的基因)。在某些實施方案中，可以優(yōu)選地將編碼cldncar的核酸與任何控制元件一起插入載體中，然后可以將所述載體引入選擇的細胞中以提供公開的cldn敏化的淋巴細胞。在優(yōu)選的實施方案中，所述載體可以是，例如，質(zhì)粒、轉(zhuǎn)座子、粘粒或病毒載體(例如，噬菌體、逆轉(zhuǎn)錄病毒、慢病毒或腺病毒)。例如，可以使用病毒載體諸如逆轉(zhuǎn)錄病毒載體(包括腫瘤逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、慢病毒載體和假型載體)、腺病毒載體、腺伴隨病毒(aav)載體、猿猴病毒載體、痘苗病毒載體或仙臺病毒載體、愛潑斯坦-巴爾病毒(ebv)載體和hsv載體。更一般地，術(shù)語“載體”、“克隆載體”和“表達載體”是指媒介物，其可以用于將dna或rna序列(例如，編碼cldncar的外源基因)引入宿主細胞中，從而轉(zhuǎn)化宿主和促進引入的序列的表達(例如轉(zhuǎn)錄和翻譯)。應(yīng)當理解，引入的基因或序列可以包括調(diào)節(jié)或控制序列，諸如由細胞的遺傳機制使用的起始序列、停止序列、啟動子序列、信號序列、分泌序列或其它序列。如本文中所述的，適合的載體是本領(lǐng)域眾所周知的，且包括質(zhì)粒、轉(zhuǎn)座子、噬菌體、病毒等。然后可以使用載體轉(zhuǎn)化選擇的淋巴細胞(自體的或同種異體的)以提供公開的敏化的淋巴細胞。為了本發(fā)明的目的，術(shù)語“轉(zhuǎn)化”將以它的最一般含義使用，且應(yīng)當認為是指將異源基因、dna或rna序列引入宿主細胞(原核細胞或真核細胞)中，使得所述宿主細胞將表達引入的基因或序列以產(chǎn)生期望的物質(zhì)，通常是由引入的基因或序列編碼的蛋白或酶。適合本發(fā)明的示例性細胞轉(zhuǎn)化方法包括轉(zhuǎn)染和轉(zhuǎn)導(dǎo)。本文中使用的術(shù)語“轉(zhuǎn)染”是指使用物理或化學(xué)方式將外來核酸或基因引入細胞(原核細胞或真核細胞)中，而術(shù)語“轉(zhuǎn)導(dǎo)”是指通過使用病毒載體將外來核酸或基因引入細胞(原核細胞或真核細胞)中。就轉(zhuǎn)導(dǎo)而言，可以將噬菌體或病毒載體引入宿主細胞中，優(yōu)選地在合適的包裝細胞（其中許多是商購可得的）中培養(yǎng)感染性顆粒以后。適合的轉(zhuǎn)導(dǎo)方法和包裝細胞如在下面實施例中所述，且考慮到本發(fā)明將是技術(shù)人員可容易地辨別的。作為例子，當要使用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體時，可以如下制備適合本文中的教導(dǎo)的組合物：基于載體具有的ltr序列和包裝信號序列而選擇合適的包裝細胞，和使用所述包裝細胞制備逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒。包裝細胞的例子包括pg13(atcccrl-10686)、pa317(atcccrl-9078)、gp+e-86和gp+envam-12和psi-crip。還可以使用具有高轉(zhuǎn)染效率的293細胞或293t細胞制備逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒。基于逆轉(zhuǎn)錄病毒和可以用于包裝逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的包裝細胞而生產(chǎn)的許多種類的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體可廣泛地商購得自許多公司。也可商購得到用于根據(jù)本文中的教導(dǎo)制造適合慢病毒載體的類似系統(tǒng)。這樣的載體可以用于轉(zhuǎn)導(dǎo)選擇的淋巴細胞群體以提供期望的cldn敏化的淋巴細胞。另外，非病毒包裝載體系統(tǒng)也可以與脂質(zhì)體和縮合劑（諸如在wo96/10038、wo97/18185、wo97/25329、wo97/30170和wo97/31934(它們通過引用并入本文)中描述的陽離子脂質(zhì)）聯(lián)合用在本發(fā)明中。類似地，許多轉(zhuǎn)染方法適合本發(fā)明且可以與本文中的教導(dǎo)結(jié)合使用以提供期望的組合物。如討論的，轉(zhuǎn)染通常表示使用物理或化學(xué)方法將一種或多種外源多核苷酸引入宿主細胞中。許多轉(zhuǎn)染技術(shù)是本領(lǐng)域已知的，且包括，例如，磷酸鈣dna共沉淀；deae-葡聚糖；電穿孔；陽離子脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染；鎢顆粒促進的微粒轟擊；和磷酸鍶dna共沉淀。另外，電穿孔、聲致穿孔、穿刺轉(zhuǎn)染（impalefection）、光學(xué)轉(zhuǎn)染和流體力學(xué)遞送構(gòu)成一些適合本發(fā)明的基于非化學(xué)的基因轉(zhuǎn)染方法。不論選擇的用于實現(xiàn)轉(zhuǎn)化的方法，應(yīng)當理解，可以使用cldncar核酸構(gòu)建體和載體來制備公開的敏化的淋巴細胞。vi.宿主細胞可以將包含編碼cldncar的核酸的載體引入能夠攜帶和/或表達car蛋白的任何宿主細胞中，所述宿主細胞包括任意合適的原核或真核細胞。適合的轉(zhuǎn)化方法包括使用慢病毒和逆轉(zhuǎn)錄病毒系統(tǒng)以及轉(zhuǎn)座子和裸rna。優(yōu)選的宿主細胞是這樣的宿主細胞：其可以容易地且穩(wěn)定地生長，具有相當快速的生長速率，具有良好表征的表達系統(tǒng)，并且可以被容易地和有效地轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染。本文中使用的術(shù)語“宿主細胞”表示可以含有表達載體的任何類型的細胞。所述宿主細胞可以是真核細胞(例如，植物、動物、真菌或藻類)、原核細胞(例如，細菌或原生動物)或病毒或逆轉(zhuǎn)錄病毒載體。所述宿主細胞可以是培養(yǎng)的或“成品(off-the-shelf)”細胞或原代細胞(即，直接分離自受試者)。所述宿主細胞可以是貼壁細胞或懸浮細胞，即，在混懸液中生長的細胞。合適的宿主細胞是本領(lǐng)域已知的，并且包括，例如，dh5α大腸桿菌細胞、中國倉鼠卵巢細胞、猴vero細胞、cos細胞、hek293細胞等。為了擴增或復(fù)制重組表達載體的目的，所述宿主細胞可以是原核細胞，例如，dh5α細胞。為了制備重組car的目的，所述宿主細胞可以是哺乳動物細胞。所述宿主細胞優(yōu)選地是人細胞。所述宿主細胞可以是任何細胞類型，可以源自任何類型的組織，并且可以處于任何發(fā)育階段。例如，可以使用從體液、組織或器官諸如血液(外周血、臍帶血等)或骨髓收集、分離、純化或誘導(dǎo)的細胞?？梢允褂猛庵苎獑魏思毎?pbmc)、免疫細胞[樹突細胞、b細胞、造血干細胞、巨噬細胞、單核細胞、nk細胞或造血細胞(嗜中性粒細胞、嗜堿性粒細胞)]、臍帶血單核細胞、成纖維細胞、前體脂肪細胞、肝細胞、皮膚角質(zhì)形成細胞、間質(zhì)干細胞、脂肪干細胞、各種癌細胞品系或神經(jīng)干細胞。在特別優(yōu)選的實施方案中，所述宿主細胞可以是外周血淋巴細胞(pbl)、外周血單核細胞(pbmc)或天然殺傷(nk)細胞。優(yōu)選地，所述宿主細胞包含天然殺傷(nk)細胞。在其它優(yōu)選的實施方案中，所述宿主細胞將是t-細胞，且在選擇的實施方案中，是細胞毒性的t-細胞。用于選擇合適的哺乳動物宿主細胞的方法和用于轉(zhuǎn)化、培養(yǎng)、繁殖、篩選和純化細胞的方法是本領(lǐng)域已知的。本發(fā)明提供了一種分離的宿主細胞或其組合物，所述宿主細胞表達編碼本文描述的cldncar的核酸序列。在特別優(yōu)選的實施方案中，所述宿主細胞包含淋巴細胞，其在公開的car表達后被轉(zhuǎn)化成cldn敏化的淋巴細胞。在一個實施方案中，所述宿主細胞是t-細胞。本發(fā)明的t-細胞可以是任意t-細胞，諸如培養(yǎng)的t-細胞(例如，原代t-細胞，或者得自培養(yǎng)的t-細胞系的t-細胞，或得自哺乳動物的t-細胞)。如果得自哺乳動物，t-細胞可以得自眾多來源，包括、但不限于血液、骨髓、淋巴結(jié)、胸腺或其它組織或流體。t-細胞也可以被富集或純化。t-細胞優(yōu)選地是人t-細胞(例如，分離自人)。t-細胞可以處于任何發(fā)育階段，包括、但不限于，cd4+/cd8+雙陽性的t-細胞、cd4+輔助性t-細胞，例如，th1和th2細胞、cd8+t-細胞(例如，細胞毒性的t-細胞)、腫瘤浸潤細胞、記憶t-細胞、原初t-細胞等。在一個實施方案中，t-細胞是cd8+t-細胞或cd4+t-細胞。t-細胞系可得自商業(yè)來源(例如，美國典型培養(yǎng)物保藏中心和德國微生物和細胞培養(yǎng)物保藏中心)，且包括，例如，jurkat細胞(atcctib-152)、sup-t1細胞(atcccrl-1942)、rpmi8402細胞(dsmzacc-290)、karpas45細胞(dsmzacc-545)、及其衍生物。在另一個實施方案中，所述宿主細胞是天然殺傷(nk)細胞。nk細胞是在先天性免疫系統(tǒng)中起作用的一類細胞毒性的淋巴細胞。nk細胞被定義為大顆粒淋巴細胞，且構(gòu)成從共同淋巴祖細胞（其也產(chǎn)生b和t淋巴細胞）分化成的第三類細胞(參見，例如，immunobiology,第5版,janeway等人,編,garlandpublishing,newyork,n.y.(2001))。nk細胞在骨髓、淋巴結(jié)、脾、扁桃體和胸腺中分化并成熟。成熟以后，nk細胞作為具有特征性的細胞毒性顆粒的大淋巴細胞進入循環(huán)中。nk細胞能夠識別和殺傷一些異常細胞，例如，一些腫瘤細胞和病毒感染的細胞，并且被認為在對抗細胞內(nèi)病原體的先天性免疫防御中是重要的。如上面關(guān)于t-細胞所述，nk細胞可以是任意nk細胞，諸如培養(yǎng)的nk細胞，例如，原代nk細胞，或得自培養(yǎng)的nk細胞系的nk細胞，或得自哺乳動物的nk細胞。如果得自哺乳動物，nk細胞可以得自眾多來源，包括、但不限于血液、骨髓、淋巴結(jié)、胸腺或其它組織或流體。nk細胞也可以被富集或純化。nk細胞優(yōu)選地是人nk細胞(例如，分離自人)。nk細胞系可得自商業(yè)來源(例如，美國典型培養(yǎng)物保藏中心)，且包括、例如，nk-92細胞(atcccrl-2407)、nk92mi細胞(atcccrl-2408)、及其衍生物。在自體過繼免疫療法中，將患者的循環(huán)淋巴細胞或腫瘤浸潤的淋巴細胞在體外分離(例如，通過血液成分部分清除)，優(yōu)選地用淋巴因子（諸如il-2）活化或刺激，并然后用編碼cldncar構(gòu)建體的核酸轉(zhuǎn)導(dǎo)。轉(zhuǎn)導(dǎo)后，優(yōu)選地將自體敏化的淋巴細胞用本領(lǐng)域已知的細胞因子支持物擴增并重新施用給患者。為了實現(xiàn)該目的，給動物或人患者施用免疫學(xué)上有效量的活化的淋巴細胞，其被遺傳修飾成表達如本文中所述的cldncar基因。在這樣的自體程序中，活化的淋巴細胞(即，cldn敏化的淋巴細胞)是患者自身的細胞，其最優(yōu)選地在以前分離自血液或腫瘤樣品并在體外活化和擴增。在本發(fā)明的某些方面，將來自癌癥患者的t淋巴細胞或nk細胞分離并用sct1-h27.xx多核苷酸(下面實施例9)轉(zhuǎn)導(dǎo)，使得cldncar在t細胞或nk細胞的細胞表面上表達。然后將經(jīng)修飾的細胞重新施用進患者中以靶向和殺傷腫瘤細胞(通常參見圖7)。本發(fā)明的其它優(yōu)選方面包含cldn敏化的淋巴細胞的同種異體移植物。在這樣的實施方案中，可以將公開的cldncar引入(例如，通過轉(zhuǎn)導(dǎo))得自除了要治療的受試者以外的來源的淋巴細胞中。本發(fā)明的一些方面包括使用得自供體的同種異體的淋巴細胞，所述供體已經(jīng)在免疫學(xué)上與接受者匹配以減少排斥的機會。在其它方面，將公開的car引入“成品”同種異體淋巴細胞(參見pmid:26183927其通過引用并入本文)中，其已經(jīng)經(jīng)過修飾以促進移植和在與靶細胞接觸后產(chǎn)生適當?shù)拿庖邞?yīng)答。應(yīng)當理解，這樣的預(yù)先制造的同種異體淋巴細胞制品的應(yīng)用可能在制備藥學(xué)上有活性的敏化的淋巴細胞和減少患者排斥機會的方面提供幾個優(yōu)點。還應(yīng)當理解，可以在用cldncar轉(zhuǎn)化之前或之后在體外擴增cldn敏化的淋巴細胞。擴增選擇的細胞群體的方法是本領(lǐng)域眾所周知的，且?guī)追N適合本發(fā)明的商業(yè)試劑盒是可得到的。在這點上，可以在體外擴增t細胞和/或nk細胞以提供更穩(wěn)健劑量選擇。例如，根據(jù)本發(fā)明，可以通過暴露于特定細胞來優(yōu)先擴增nk細胞，所述特定細胞缺乏或較差地表達主要組織相容性復(fù)合物i和/或ii分子且其已經(jīng)被遺傳修飾成表達膜結(jié)合的il-15和4-1bb配體(cdi37l)。這樣的細胞系包括，但是不一定限于，k562(atcc,ccl243)和腎母細胞瘤細胞系hfwt、子宮內(nèi)膜腫瘤細胞系hhua、黑素瘤細胞系hmv-ii、肝胚細胞瘤細胞系huh-6、肺小細胞癌細胞系lu-130和lu-134-a、神經(jīng)母細胞瘤細胞系nb19和n1369、來自睪丸nec14的胚胎性癌細胞系、子宮頸癌細胞系tco-2和骨髓轉(zhuǎn)移的（metastated）神經(jīng)母細胞瘤細胞系tnb1。優(yōu)選地，使用的細胞系缺乏或較差地表達mhci和ii分子，諸如k562和hfwt細胞系。類似的技術(shù)允許擴增選擇的t細胞群體。在這點上，一些方法采用抗-cd3+自體或同種異體飼養(yǎng)細胞和高劑量的il-2。其它方法使用il-7、il-15、il-21或它們的組合來擴增和刺激t細胞。應(yīng)當理解，前述方法中的每一種，與提供期望數(shù)目的cldn敏化的淋巴細胞的任意方法一起，適合本發(fā)明。vii.cldn敏化的淋巴細胞的制劑和施用如本文所述，可以在體外擴增cldn敏化的淋巴細胞用于用在包含自體或同種異體淋巴細胞的過繼細胞免疫療法中。在這點上，可以使用本發(fā)明的組合物和方法來產(chǎn)生一群優(yōu)選遞送主要信號和共刺激信號的敏化的淋巴細胞用于治療癌癥，和作為例子，治療肺癌（包括小細胞肺癌）、黑素瘤、乳腺癌、前列腺癌、結(jié)腸癌、腎細胞癌、卵巢癌、神經(jīng)母細胞瘤、橫紋肌肉瘤、白血病和淋巴瘤。在本發(fā)明中描述的組合物和方法可以與其它類型的癌癥療法（諸如化學(xué)療法、外科手術(shù)、輻射、基因治療、諸如此類）聯(lián)合使用。優(yōu)選地以包含一種或多種藥學(xué)上可接受的載體的藥物組合物的形式將cldn敏化的淋巴細胞或宿主細胞施用給受試者。在特別優(yōu)選的實施方案中，公開的藥物組合物將包含一群表達cldncar的t細胞或nk細胞(自體細胞或同種異體細胞)。除了這樣的宿主細胞以外，本發(fā)明的藥物組合物可以包含其它藥學(xué)活性劑或藥物，諸如化學(xué)治療劑(例如，天門冬酰胺酶、白消安、卡鉑、順鉑、柔紅霉素、多柔比星、氟尿嘧啶、吉西他濱、羥基脲、甲氨蝶呤、紫杉醇、利妥昔單抗、長春堿、長春新堿等)或進一步促進免疫應(yīng)答的佐劑療法。在一個優(yōu)選的實施方案中，所述藥物組合物包含分離的表達公開的cldncar的t細胞或nk細胞，和更優(yōu)選地包含一群表達公開的cldncar的敏化的t細胞或nk細胞。另外，如本領(lǐng)域眾所周知的，這樣的組合物可以包含藥學(xué)上可接受的緩沖劑、防腐劑、賦形劑等?？蛇x地，可以將編碼cldncar的核酸序列或包含編碼cldncar的核酸序列的載體配制在藥物組合物中并用于轉(zhuǎn)導(dǎo)離體淋巴細胞或直接施用給患者。在這樣的實施方案中，包含病毒載體宿主細胞(例如，慢病毒系統(tǒng)或逆轉(zhuǎn)錄病毒系統(tǒng))或指導(dǎo)的人工病毒包膜的載體系統(tǒng)是優(yōu)選的。這樣的載體允許在體內(nèi)產(chǎn)生cldn敏化的淋巴細胞，其然后可以誘導(dǎo)期望的抗腫瘤免疫應(yīng)答。在任何事件中，本發(fā)明的cldncar宿主細胞和任何輔助試劑可以使用本領(lǐng)域公認的技術(shù)以多種方式配制。在某些實施方案中，本發(fā)明的治療性組合物可以單獨施用或與最少額外組分一起施用，而其它組合物可以任選地配制成含有合適的藥學(xué)上可接受的載體。本文中使用的“藥學(xué)上可接受的載體”包含本領(lǐng)域眾所周知的賦形劑、媒介物、佐劑和稀釋劑，并且可得自用于在藥物制劑中使用的商業(yè)來源(參見，例如，gennaro(2003)remington:thescienceandpracticeofpharmacywithfactsandcomparisons:drugfactsplus,第20版,mackpublishing;ansel等人(2004)pharmaceuticaldosageformsanddrugdeliverysystems,第7版,lippencottwilliams和wilkins;kibbe等人(2000)handbookofpharmaceuticalexcipients,第3版,pharmaceuticalpress)。合適的藥學(xué)上可接受的載體通常包含這樣的物質(zhì)：其是相對惰性的且可以促進敏化的淋巴細胞或宿主細胞的施用，或可以輔助它們加工成對于向作用部位遞送而言經(jīng)過藥學(xué)上優(yōu)化的制品。這樣藥學(xué)上可接受的載體包括可以改變制劑的形式、稠度、粘度、ph、張度、穩(wěn)定性、摩爾滲透壓濃度、藥代動力學(xué)、蛋白聚集或溶解度的試劑，且包括緩沖劑、潤濕劑、乳化劑、稀釋劑、包囊劑和皮膚穿透促進劑。載體的某些非限制性例子包括鹽水、緩沖鹽水、右旋糖、精氨酸、蔗糖、水、甘油、乙醇、山梨醇、葡聚糖、羧甲基纖維素鈉和它們的組合。用于全身施用的敏化的淋巴細胞可配制成用于腸內(nèi)、胃腸外或局部施用。實際上，所有三類制劑可以同時使用以實現(xiàn)活性成分的全身施用。用于胃腸外和非胃腸外藥物遞送的賦形劑以及制劑是本領(lǐng)域眾所周知的。適合用于cldn敏化的淋巴細胞的胃腸外施用(例如通過注射)的制劑包括水性的或非水性的、等滲的、無熱原的、無菌的液體(例如溶液、懸浮液)，其中溶解、懸浮或以其它方式提供活性成分(例如，在脂質(zhì)體或其它微粒中)。此類液體可以額外含有其它藥學(xué)上可接受的載體，諸如抗氧化劑、緩沖劑、防腐劑、穩(wěn)定劑、抑菌劑、助懸劑、增稠劑和使制劑與目標接受者的血液(或其它相關(guān)體液)等滲的溶質(zhì)。賦形劑的例子包括例如水、醇類、多元醇類、甘油、植物油等。用于此類制劑中的合適的等滲的藥學(xué)上可接受的載體的例子包括氯化鈉注射液、林格氏溶液或含乳酸鹽的林格氏注射液。引入細胞組分的方法也是本領(lǐng)域已知的，且包括諸如在u.s.p.n.4,844,893和4,690,915中舉例說明的那些程序。使用的cldn敏化的淋巴細胞(例如，t細胞或nk細胞)的量可以在體外和體內(nèi)應(yīng)用之間變化，以及隨著靶細胞的量和類型變化。施用的量還將隨患者的狀況而變化，并且應(yīng)當由從業(yè)人員在考慮所有適當?shù)囊蛩匾院蟠_定。cldn敏化的淋巴細胞的特定劑量方案(即劑量、時機和重復(fù))將取決于特定個體以及經(jīng)驗考慮諸如藥代動力學(xué)(例如，半衰期、清除率等)。例如，可以給個體施用增加劑量的如本文中所述生產(chǎn)的敏化的淋巴細胞。在選擇的實施方案中，可以分別基于憑經(jīng)驗確定或觀察的副作用或毒性而逐漸增加或降低或減少劑量。本領(lǐng)域技術(shù)人員諸如主治醫(yī)師基于狀況的考慮和正在治療的狀況的嚴重程度、正在治療的受試者的年齡和總體健康狀況等，可以做出施用頻率的確定?？梢栽诏煶讨谢谒x組合物的效力和定量施用方案的評估來調(diào)整施用頻率。此類評估可以基于特定疾病、病癥或狀況的標志物而做出。在其中個體具有癌癥的實施方案中，這些包括經(jīng)由觸診或目視觀察對腫瘤大小的直接測量；通過x-射線或其它成像技術(shù)對腫瘤大小的間接測量；如通過直接腫瘤活組織檢查和腫瘤樣品的顯微鏡檢查所評估的改善；在本文中鑒別的間接腫瘤標志物(例如，psma)或cldn抗原的測量；增殖性或致瘤性細胞的數(shù)目的減少，此類贅生性細胞的減少的維持；贅生性細胞的增殖的減少；或轉(zhuǎn)移的發(fā)展的延遲?？紤]到本發(fā)明，可以按特定計劃表施用cldncar。通常，將有效劑量的敏化的淋巴細胞給受試者施用一次或多次。更具體地，每個月1次、超過每個月1次或小于每個月1次給受試者施用有效劑量的cldncar。在某些實施方案中，可以施用有效劑量的cldn敏化的淋巴細胞多次，包括持續(xù)至少一個月、至少六個月、至少一年、至少兩年或幾年的時段。在其它實施方案中，cldn敏化的淋巴細胞的施用之間可以經(jīng)過幾天(2、3、4、5、6或7)、幾周(1、2、3、4、5、6、7或8)或幾個月(1、2、3、4、5、6、7或8))或甚至一年或幾年。在某些優(yōu)選的實施方案中，涉及cldncar的療程將包含選擇的敏化的淋巴細胞在數(shù)周或數(shù)月時段內(nèi)的多次劑量。更具體地，可以每天一次、每兩天一次、每四天次、每周一次、每十天一次、每兩周一次、每三周一次、每個月一次、每六周一次、每兩個月一次、每十周一次或每三個月一次施用本發(fā)明的cldn敏化的淋巴細胞。在這點上，應(yīng)當理解，可以基于患者應(yīng)答和臨床實踐改變劑量或調(diào)節(jié)間隔。施用給哺乳動物(例如，人)的宿主細胞的典型量可以是，例如，在100萬至1000億個細胞的范圍內(nèi)；但是，低于或高于該示例性范圍的量是在本發(fā)明范圍內(nèi)。例如，本發(fā)明的宿主細胞的每日劑量可以是約100萬至約500億個細胞(例如，約500萬個細胞、約2500萬個細胞、約5億個細胞、約10億個細胞、約50億個細胞、約200億個細胞、約300億個細胞、約400億個細胞、或由前述值中的任意2個限定的范圍)，優(yōu)選約1000萬至約1000億個細胞(例如，約2000萬個細胞、約3000萬個細胞、約4000萬個細胞、約6000萬個細胞、約7000萬個細胞、約8000萬個細胞、約9000萬個細胞、約100億個細胞、約250億個細胞、約500億個細胞、約750億個細胞、約900億個細胞、或由前述值中的任意2個限定的范圍)，更優(yōu)選約1億個細胞至約500億個細胞(例如，約1.2億個細胞、約2.5億個細胞、約3.5億個細胞、約4.5億個細胞、約6.5億個細胞、約8億個細胞、約9億個細胞、約30億個細胞、約300億個細胞、約450億個細胞、或由前述值中的任意2個限定的范圍)。在優(yōu)選的實施方案中，將約5億、10億、15億、20億、25億、30億、35億、40億、45億、50億、55億、60億、65億、70億、75億、80億、85億、90億、95億或100億個細胞在一個或多個劑量中施用給患者。通過定期評估接受治療的患者，可以監(jiān)測治療或預(yù)防效力。對于持續(xù)若干天或更久的重復(fù)給藥而言，根據(jù)情況，重復(fù)所述治療直至疾病征狀得到期望的抑制。但是，其它劑量方案可能是有用的，且在本發(fā)明的范圍內(nèi)。通過所述組合物的單次推注施用，通過所述組合物的多次推注施用，或通過所述組合物的連續(xù)輸注施用，可以遞送期望的劑量。如上面討論的，使用標準的施用技術(shù)，包括靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、皮下、肺、透皮、肌肉內(nèi)或鼻內(nèi)，可以給哺乳動物施用組合物，其包含表達cldncar的敏化的宿主細胞。所述組合物優(yōu)選地適合于胃腸外施用。本文中使用的術(shù)語“胃腸外”包括靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、皮下、直腸、陰道和腹膜內(nèi)施用。更優(yōu)選地，通過靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)或皮下注射，利用外周全身遞送將所述組合物施用給哺乳動物。此外，可以將表達cldncar核酸序列的宿主細胞、或包含編碼car的核酸序列的載體與一種或多種其它治療劑一起施用，它們可以共同施用給哺乳動物。“共同施用”是指，在時間上足夠接近地施用一種或多種其它治療劑以及包含本發(fā)明的宿主細胞或本發(fā)明的載體的組合物，使得cldncar可以增強一種或多種其它治療劑的作用，或反之亦然。在這點上，可以首先施用包含敏化的淋巴細胞的組合物，然后可以施用一種或多種其它治療劑，或反之亦然?？蛇x地，可以同時施用包含cldn敏化的淋巴細胞的組合物以及一種或多種其它治療劑。在選擇的優(yōu)選的實施方案中，將cldn敏化的淋巴細胞與淋巴毒性的療法結(jié)合施用以增加體內(nèi)平衡細胞因子(例如，il-7、il-15等)的可用性從而支持t細胞繁殖。在這樣的方案中，優(yōu)選地在施用敏化的淋巴細胞之前進行淋巴毒性的療法。更具體地，據(jù)信，耗竭淋巴細胞的準備方案可能如下增強過繼細胞療法的效力：減少內(nèi)源性淋巴細胞，由此導(dǎo)致支持施用的敏化的淋巴細胞的繁殖和持久性的體內(nèi)平衡細胞因子的積累。此外，這樣的準備處理可以導(dǎo)致treg的數(shù)目和頻率的短暫減少，由此減少淋巴細胞抑制和腸損傷的誘導(dǎo)（這可能導(dǎo)致活化先天性免疫系統(tǒng)的細菌副產(chǎn)物(例如，脂多糖)的全身性釋放）。這樣的機制一起可以實質(zhì)上增強免疫環(huán)境對移植的cldn敏化的淋巴細胞的接納，由此促進它們的繁殖和持久性。viii.適應(yīng)癥本發(fā)明提供了本發(fā)明的cldn敏化的淋巴細胞用于治療、維持和/或預(yù)防多種病癥（包括腫瘤的、炎癥性的、血管生成性的和免疫學(xué)的cldn相關(guān)病癥）的用途。優(yōu)選的治療靶標是腫瘤狀況，包括實體瘤和血液惡性腫瘤。在某些實施方案中，本發(fā)明的cldncar治療將用于抑制、減少或消除表達cldn的腫瘤或致瘤性細胞。優(yōu)選地，要治療的“受試者”或“患者”將是人，盡管本文中使用的該術(shù)語明確地意在包括任何哺乳動物物種。經(jīng)受根據(jù)本發(fā)明的治療的腫瘤狀況可以是良性的或惡性的；實體瘤或其它血液腫瘤；并且可以選自包括、但不限于以下狀況的組：腎上腺腫瘤、aids相關(guān)的癌癥、軟組織腺泡狀肉瘤、星形細胞腫瘤、自主神經(jīng)節(jié)腫瘤、膀胱癌(鱗狀細胞癌和移行細胞癌)、囊胚腔病癥、骨癌(成釉細胞瘤、動脈瘤性骨囊腫、骨軟骨瘤、骨肉瘤)、腦和脊髓癌、轉(zhuǎn)移性腦腫瘤、乳腺癌（包括三重陰性的乳腺癌）、頸動脈體腫瘤、子宮頸癌、軟骨肉瘤、脊索瘤、嫌色性腎細胞癌、透明細胞癌、結(jié)腸癌、結(jié)腸直腸癌、皮膚良性纖維組織細胞瘤、結(jié)締組織增生性小圓細胞腫瘤、室管膜瘤、上皮病癥、尤因瘤、骨外粘液樣軟骨肉瘤、骨纖維發(fā)育不全、骨纖維性結(jié)構(gòu)不良、膽囊和膽管癌、胃癌、胃腸道疾病、妊娠滋養(yǎng)細胞疾病、生殖細胞腫瘤、腺體病癥、頭頸癌、下丘腦癌、腸癌、胰島細胞腫瘤、卡波西氏肉瘤、腎癌(腎母細胞瘤、乳頭狀腎細胞癌)、白血病、脂肪瘤/良性脂肪瘤、脂肪肉瘤/惡性脂肪瘤、肝癌(肝胚細胞瘤、肝細胞癌)、淋巴瘤、肺癌(小細胞癌、腺癌、鱗狀細胞癌、大細胞癌等)、巨噬細胞病癥、髓母細胞瘤、黑素瘤、腦膜瘤、多發(fā)性內(nèi)分泌腫瘤、多發(fā)性骨髓瘤、骨髓增生異常綜合征、神經(jīng)母細胞瘤、神經(jīng)內(nèi)分泌瘤、卵巢癌、胰腺癌、乳頭狀甲狀腺癌、甲狀旁腺腫瘤、兒科癌癥、周邊神經(jīng)鞘腫瘤、嗜鉻細胞瘤、垂體瘤、前列腺癌、后代眼色素層黑色素瘤(posteriousunvealmelanoma)、罕見性血液學(xué)病癥、腎轉(zhuǎn)移性癌癥、桿狀瘤、橫紋肌肉瘤、肉瘤、皮膚癌、軟組織肉瘤、鱗狀細胞癌、胃癌、間質(zhì)病癥、滑膜肉瘤、睪丸癌、胸腺癌、胸腺瘤、甲狀腺轉(zhuǎn)移性癌和子宮癌(子宮頸癌、子宮內(nèi)膜癌和平滑肌瘤)。在特別優(yōu)選的實施方案中，所述受試者將遭受卵巢癌、胰腺癌、結(jié)直腸癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌和胃癌。在優(yōu)選的實施方案中，所述受試者將是就卵巢癌、胰腺癌、結(jié)直腸癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌和胃癌而言難治的。在其它優(yōu)選的實施方案中，公開的cldncar治療在治療肺癌中是特別有效的，所述肺癌包括下述亞型：小細胞肺癌和非小細胞肺癌(例如鱗狀細胞非小細胞肺癌或鱗狀細胞小細胞肺癌)。在選擇的實施方案中，可以將cldn敏感的淋巴細胞施用給表現(xiàn)出有限階段疾病或廣泛階段疾病的患者。在其它優(yōu)選的實施方案中，將公開的細胞組合物施用給難治性患者(即，其疾病在完成初始療法的進程期間或之后不久復(fù)發(fā)的那些)；敏感的患者(即，其復(fù)發(fā)在初始治療之后長于2-3個月的那些)；或表現(xiàn)出對基于鉑的藥劑(例如卡鉑、順鉑、奧沙利鉑)和/或紫杉烷(例如多西他賽、紫杉醇、拉羅他賽或卡巴他賽)的抗性的患者。在另一個特別優(yōu)選的實施方案中，公開的cldncar治療可有效地治療卵巢癌，包括卵巢-漿液癌和卵巢-乳頭狀漿液癌。在另一個優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的cldncar治療可以用在維持療法中以減少或消除在疾病的初次呈現(xiàn)以后的腫瘤復(fù)發(fā)機會。優(yōu)選地，所述病癥將會得到治療且最初的腫瘤塊被消除、減小或以其它方式改善，使得所述患者無癥狀或緩解。在此時，可以給受試者施用藥學(xué)有效量的公開的cldncar治療一次或多次，即使使用標準的診斷程序幾乎不存在或根本不存在疾病的指征。在某些實施方案中，在一段時間內(nèi)按規(guī)則計劃表施用所述調(diào)節(jié)劑，諸如每周、每兩周、每月、每六周、每兩個月、每三個月、每六個月或每年。鑒于本文中的教導(dǎo)，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以容易地確定有利的劑量和定量施用方案以減少疾病復(fù)發(fā)的潛力。此外，這樣的治療可以持續(xù)數(shù)周、數(shù)月、數(shù)年的時段或甚至無限，取決于患者應(yīng)答和臨床參數(shù)和診斷參數(shù)。在另一個優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的cldncar治療可以用于預(yù)防性地或作為輔助療法來阻止或減少減瘤（debulking）程序以后腫瘤轉(zhuǎn)移的可能性。如在本發(fā)明中使用的，“減瘤程序”被廣泛地定義，且應(yīng)當是指消除、減少、治療或改善腫瘤或腫瘤增殖的任何手術(shù)、技術(shù)或方法。示例性的減瘤程序包括、但不限于外科手術(shù)、輻射處理(即，光束輻射)、化學(xué)療法、免疫療法或切除。在本領(lǐng)域技術(shù)人員考慮到本發(fā)明容易地確定的適當時間，可以將公開的cldncar治療按照臨床、診斷或治療診斷程序提示施用以減少腫瘤轉(zhuǎn)移?？梢栽谑褂脴藴始夹g(shù)確定的藥學(xué)上有效的劑量施用cldn敏化的淋巴細胞一次或多次。優(yōu)選地，所述定量施用方案將伴有允許對它進行修改的適當診斷或監(jiān)測技術(shù)。本發(fā)明的其它實施方案包括給無癥狀的、但是處于發(fā)生增殖性病癥的風(fēng)險中的受試者施用本發(fā)明的cldncar治療。也就是說，本發(fā)明的cldncar治療可以以真實的防止性含義使用，并施用給已經(jīng)經(jīng)過檢查或測試且具有一種或多種記錄的風(fēng)險因素(例如，基因組指征、家族史、體內(nèi)或體外測試結(jié)果等)、但是尚未發(fā)生瘤形成的患者。在這樣的情況下，本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠通過經(jīng)驗觀察或通過公認的臨床實踐確定有效的定量施用方案。ix.聯(lián)合治療如以前討論的，應(yīng)當理解，本文描述的cldncar治療可以與其它臨床腫瘤學(xué)治療聯(lián)合使用。一般而言，本發(fā)明的治療可以與治療部分或藥物諸如抗癌劑（包括、但不限于，細胞毒性劑、細胞抑制劑、抗血管生成劑、減瘤劑、化學(xué)治療劑、放療劑、靶向的抗癌劑、生物應(yīng)答調(diào)節(jié)劑、癌癥疫苗、細胞因子、激素療法、抗轉(zhuǎn)移劑和免疫治療劑）一起使用。聯(lián)合治療可用于預(yù)防或治療癌癥和預(yù)防癌癥的轉(zhuǎn)移或復(fù)發(fā)。本文中使用的“聯(lián)合治療”意指包含至少一種cldncar治療和至少一種治療部分(例如，抗癌劑)的組合的施用，其中所述組合優(yōu)選地具有治療協(xié)同作用或者與以下治療相比改善在癌癥的治療中的可測量的治療效果：(i)單獨使用的cldncar治療，或(ii)單獨使用的治療部分，或(iii)所述治療部分與另一個治療部分的聯(lián)合使用，沒有添加cldncar治療。本文中使用的術(shù)語“治療協(xié)同作用”意指cldncar治療和一種或多種治療部分的組合，所述組合具有比cldncar治療和所述一種或多種治療部分的組合的累加效應(yīng)更大的治療效果。通過與對照或基線測量對比來定量公開的組合的期望結(jié)果。本文中使用的相對術(shù)語諸如“改善”、“增加”或“減少”指示相對于對照的值，所述對照是諸如在起始本文所述的治療之前在相同個體中的測量結(jié)果，或在沒有本文描述的cldncar治療存在下、但是在有其它治療部分（諸如護理標準治療）存在下在一個對照個體(或多個對照個體)中的測量結(jié)果。一種代表性的對照個體是患有與正在治療的個體相同形式的癌癥的個體，其與正在治療的個體的年齡約相同(以確保治療的個體和對照個體中的疾病的階段是可比較的)。響應(yīng)于療法的變化或改善通常是統(tǒng)計上顯著的。本文中使用的術(shù)語“顯著性”或“顯著的”涉及在兩個或更多個實體之間存在非隨機關(guān)聯(lián)的概率的統(tǒng)計分析。為了確定關(guān)聯(lián)是否為“顯著的”或具有“顯著性”，可以計算“p值”。低于用戶定義的截止點的p值被認為是顯著的。小于或等于0.1、小于0.05、小于0.01、小于0.005或小于0.001的p值可以被認為是顯著的。協(xié)同治療效果可以是由單一治療部分或cldncar治療引起的治療效果或由給定組合的cldncar治療或單一治療部分引起的治療效果的總和的至少約兩倍、或至少約五倍、或至少約十倍、或至少約二十倍、或至少約五十倍、或至少約一百倍的效果。協(xié)同治療效果也可觀察為，與由單一治療部分或cldncar治療引起的治療效果或由給定組合的cldncar治療或單一治療部分引起的治療效果的總和相比，治療效果增加至少10％或至少20%、或至少30%、或至少40%、或至少50%、或至少60%、或至少70%、或至少80%、或至少90%、或至少100%或更多。協(xié)同效果還是允許在聯(lián)合使用治療劑時減少所述治療劑的定量施用的效果。在實施聯(lián)合治療中，可以使用相同的或不同的施用途徑在單一組合物中或作為兩種或更多種不同組合物將cldncar治療和治療部分同時施用給受試者?？蛇x地，使用cldncar治療的治療可以在治療部分治療之前或之后，例如，間隔為數(shù)分鐘至數(shù)周。在一個實施方案中，在彼此的約5分鐘至約兩周內(nèi)施用治療部分和car。在其它實施方案中，在car和治療部分的施用之間可以經(jīng)過幾天(2、3、4、5、6或7)、幾周(1、2、3、4、5、6、7或8)或幾個月(1、2、3、4、5、6、7或8)?？梢砸愿鞣N計劃表(諸如每天一次、兩次或三次，每兩天一次，每三天一次，每周一次，每兩周一次，每個月一次，每兩個月一次，每三個月一次，每六個月一次)施用所述聯(lián)合治療，直至所述狀況得到治療、減輕或治愈，或者可以連續(xù)地施用。所述car和治療部分可以隔日或隔周施用；或者可以施用cldncar治療的順序，隨后為一次或多次用額外治療部分的治療。在一個實施方案中，將cldncar與一種或多種治療部分聯(lián)合施用，持續(xù)短治療周期。在其它實施方案中，施用所述聯(lián)合治療，持續(xù)長治療周期?？梢越?jīng)由任何途徑施用所述聯(lián)合治療。在某些實施方案中，所述cldncar治療(即cldn敏化的淋巴細胞的施用)可以與多種第一線癌癥治療聯(lián)合使用。在一個實施方案中，所述聯(lián)合治療包括使用cldncar治療和細胞毒性劑諸如異環(huán)磷酰胺、絲裂霉素c、長春地辛、長春堿、依托泊苷、ironitecan、吉西他濱、紫杉烷類、長春瑞濱、甲氨蝶呤和培美曲塞)和任選的一種或多種其它治療部分。pd-1，與它的配體pd-l1一起，是抗腫瘤t淋巴細胞應(yīng)答的另一種負調(diào)節(jié)劑。在一個實施方案中，所述聯(lián)合治療可以包含cldncar治療以及抗-pd-l1抗體(例如lambrolizumab、nivolumab)和任選的一種或多種其它治療部分。在另一個實施方案中，所述聯(lián)合治療可以包含cldncar治療以及抗-pd-l1抗體(例如mpdl3280a、medi4736)和任選的一種或多種其它治療部分。在另一個實施方案中，所述聯(lián)合治療可以包含施用給患者的cldncar治療以及抗pd-1抗體(例如，pembrolizumab)，所述患者繼續(xù)接受使用其它抗-pd-1和/或靶向braf聯(lián)合治療(例如，伊匹木單抗和威羅菲尼或dabrafinib)的治療。在另一個實施方案中，所述聯(lián)合治療包括使用cldncar治療和基于鉑的藥物(例如卡鉑或順鉑)和任選的一種或多種其它治療部分(例如長春瑞濱；吉西他濱；紫杉烷例如，多西他賽或紫杉醇；irinotican；或培美曲塞)。在一個實施方案中，例如，在br-erpr、br-er或br-pr癌癥的治療中，所述聯(lián)合治療包括使用cldncar治療和一種或多種被描述為“激素療法”的治療部分。本文中使用的“激素療法”表示，例如，他莫昔芬；促性腺素或黃體生成素釋放激素(gnrh或lhrh)；依維莫司和依西美坦；托瑞米芬；或芳香酶抑制劑(例如阿那曲唑、來曲唑、依西美坦或氟維司群)。在另一個實施方案中，例如，在br-her2的治療中，所述聯(lián)合治療包括使用cldncar治療和曲妥珠單抗或ado-trastuzumabemtansine和任選的一種或多種其它治療部分(例如培妥珠單抗和/或多西他賽)。在某些實施方案中，例如，在轉(zhuǎn)移性乳腺癌的治療中，所述聯(lián)合治療包括使用cldncar治療和紫杉烷(例如多西他賽或紫杉醇)和任選的額外治療部分，例如，蒽環(huán)霉素(例如多柔比星或表柔比星)和/或艾立布林。在另一個實施方案中，例如，在轉(zhuǎn)移性或復(fù)發(fā)性乳腺癌或brca-突變體乳腺癌的治療中，所述聯(lián)合治療包括使用cldncar治療和甲地孕酮和任選的額外治療部分。在其它實施方案中，例如，在br-tnbc的治療中，所述聯(lián)合治療包括使用cldncar治療和聚adp核糖聚合酶(parp)抑制劑(例如bmn-673、奧拉帕利、rucaparib和veliparib)和任選的額外治療部分。在另一個實施方案中，例如，在乳腺癌的治療中，所述聯(lián)合治療包括使用cldncar治療和環(huán)磷酰胺和任選的額外治療部分(例如多柔比星、紫杉烷、表柔比星、5-fu和/或甲氨蝶呤)。在另一個實施方案中，用于治療egfr-陽性的nsclc的聯(lián)合治療包括使用cldncar治療和阿法替尼和任選的一種或多種其它治療部分(例如厄洛替尼和/或貝伐珠單抗)。在另一個實施方案中，用于治療egfr-陽性的nsclc的聯(lián)合治療包括使用cldncar治療和厄洛替尼和任選的一種或多種其它治療部分(例如貝伐珠單抗)。在另一個實施方案中，用于治療alk-陽性的nsclc的聯(lián)合治療包括使用cldncar治療和色瑞替尼和任選的一種或多種其它治療部分。在另一個實施方案中，用于治療alk-陽性的nsclc的聯(lián)合治療包括使用cldncar治療和克唑替尼和任選的一種或多種其它治療部分。在另一個實施方案中，所述聯(lián)合治療包括使用cldncar治療和貝伐珠單抗和任選的一種或多種其它治療部分(例如紫杉烷例如，多西他賽或紫杉醇；和/或鉑類似物)。在另一個實施方案中，所述聯(lián)合治療包括使用cldncar治療和貝伐珠單抗和任選的一種或多種其它治療部分(例如吉西他濱和/或鉑類似物)。在一個實施方案中，所述聯(lián)合治療包括使用cldncar治療和基于鉑的藥物(例如卡鉑或順鉑)類似物和任選的一種或多種其它治療部分(例如紫杉烷例如，多西他賽和紫杉醇)。在一個實施方案中，所述聯(lián)合治療包括使用cldncar治療和基于鉑的藥物(例如卡鉑或順鉑)類似物和任選的一種或多種其它治療部分(例如紫杉烷，例如，多西他賽和紫杉醇和/或吉西他濱和/或多柔比星)。在一個特定實施方案中，用于治療鉑抗性腫瘤的聯(lián)合治療包括使用cldncar治療和多柔比星和/或依托泊苷和/或吉西他濱和/或長春瑞濱和/或異環(huán)磷酰胺和/或亞葉酸-調(diào)節(jié)的5-氟尿嘧啶和/或貝伐珠單抗和/或他莫昔芬；和任選的一種或多種其它治療部分。在另一個實施方案中，所述聯(lián)合治療包括使用cldncar治療和parp抑制劑和任選的一種或多種其它治療部分。在另一個實施方案中，所述聯(lián)合治療包括使用cldncar治療和貝伐珠單抗和任選的環(huán)磷酰胺。所述聯(lián)合治療可以包含cldncar治療和對腫瘤有效的化療部分，所述腫瘤包含突變的或異常地表達的基因或蛋白(例如brca1)。更一般地，本發(fā)明的cldncar治療可以與許多抗癌劑聯(lián)合使用。本文中使用的術(shù)語“抗癌劑”或“化學(xué)治療劑”是“治療部分”的一個子集，所述治療部分又是被描述為“藥學(xué)上有活性的部分”的藥劑的子集。更具體地，“抗癌劑”意指可用于治療細胞增殖性病癥諸如癌癥的任何藥劑，包括、但不限于細胞毒性劑、細胞抑制劑、抗血管生成劑、減瘤劑、化學(xué)治療劑、放射療法和放療劑、靶向的抗癌劑、生物反應(yīng)調(diào)節(jié)劑、治療性抗體、癌癥疫苗、細胞因子、激素療法、抗轉(zhuǎn)移劑和免疫治療劑。應(yīng)當理解，在如上面所討論的所選實施方案中，此類抗癌劑可以包含抗體藥物綴合物，并且可以在施用前與抗體結(jié)合。也可以是抗癌劑的術(shù)語“細胞毒性劑”意指對細胞有毒性且降低或抑制細胞的功能和/或造成細胞的破壞的物質(zhì)。通常，所述物質(zhì)是源自活生物體的天然存在的分子(或合成地制備的天然產(chǎn)物)。細胞毒性劑的例子包括、但不限于小分子毒素或細菌的酶活性毒素(例如，白喉毒素、假單胞菌內(nèi)毒素和外毒素、葡萄球菌腸毒素a)、真菌的酶活性毒素(例如，α-帚曲毒蛋白、局限曲菌素)、植物的酶活性毒素(例如，相思豆毒蛋白、蓖麻蛋白、蒴蓮根毒蛋白、viscumin、美洲商陸抗病毒蛋白、皂草素、白樹毒素、momoridin、天花粉蛋白、大麥毒素、油桐蛋白、石竹素蛋白、美洲商陸蛋白(papi、papii和pap-s)、苦瓜抑制劑、麻瘋樹毒蛋白、巴豆毒蛋白、肥皂草抑制劑、絲林霉素(mitegellin)、局限曲菌素、酚霉素、新霉素和單端孢菌毒素)或動物的酶活性毒素(例如，細胞毒性的rna酶，諸如細胞外胰腺rna酶；dna酶i，包括其片段和/或變體)?？拱﹦┛梢园ㄒ种?、或被設(shè)計為抑制癌細胞或可能變?yōu)榘┬曰蛏芍铝鲂院蟠募毎?例如，致瘤性細胞)的任何化學(xué)劑。此類化學(xué)試劑經(jīng)常針對對于細胞生長或分裂而言必需的細胞內(nèi)過程，并且因此對通常迅速生長和分裂的癌細胞是特別有效的。例如，長春新堿使微管解聚，并且因此抑制細胞進入有絲分裂。此類試劑經(jīng)常施用，并且經(jīng)常在組合中（例如，在制劑chop中）是最有效的?？梢耘c本發(fā)明的cldncar治療聯(lián)合使用的抗癌劑的例子包括、但不限于：烷化劑類、烷基磺酸酯類、阿那曲唑、鵝膏亭類、氮丙啶類、乙烯亞胺類和甲基蜜胺類、番荔枝內(nèi)酯類、喜樹堿、bez-235、硼替佐米、苔蘚抑素、callystatin、cc-1065、色瑞替尼、克唑替尼、念珠藻環(huán)肽類、多拉司他汀、多卡米星、軟珊瑚醇、厄洛替尼、水鬼蕉堿、sarcodictyin、海綿抑素、氮芥類、抗生素類、烯二炔達內(nèi)霉素、雙磷酸鹽類、埃斯波霉素、色蛋白烯二炔抗生素生色團、阿克拉霉素類、放線菌素、氨茴霉素(authramycin)、偶氮絲氨酸、博來霉素類、放線菌素c、坎磷酰胺、carabicin、洋紅霉素、嗜癌霉素、色霉素類、環(huán)磷酰胺、更生霉素、柔紅霉素、地托比星、6-重氮基-5-氧代-l-正亮氨酸、多柔比星、表柔比星、依索比星、依西美坦、氟尿嘧啶、氟維司群、吉非替尼、伊達比星、拉帕替尼、來曲唑、氯那法尼、麻西羅霉素、乙酸甲地孕酮、絲裂霉素類、麥考酚酸、諾拉霉素、橄欖霉素類、帕唑帕尼、培洛霉素、泊非霉素(potfiromycin)、嘌呤霉素、三鐵阿霉素、雷帕霉素、羅多比星、索拉非尼、鏈黑霉素、鏈佐星、他莫昔芬、檸檬酸他莫昔芬、替莫唑胺、tepodina、替匹法尼、殺結(jié)核菌素、烏苯美司、凡他尼布、伏氯唑、xl-147、凈司他丁、佐柔比星；抗代謝藥、葉酸類似物、嘌呤類似物、雄激素類、抗-腎上腺類、葉酸補充劑諸如亞葉酸(frolinicacid)、醋葡醛內(nèi)酯、醛磷酰胺糖苷、氨基酮戊酸、恩尿嘧啶、安吖啶、bestrabucil、比生群、依達曲沙(edatraxate)、地磷酰胺(defofamine)、秋水仙胺、地吖醌、elfornithine、依利醋銨、埃博霉素、依托格魯、硝酸鎵、羥基脲、香菇多糖、lonidainine、美坦辛類、米托胍腙、米托蒽醌、mopidanmol、nitraerine、噴司他丁、蛋氨氮芥、吡柔比星、洛索蒽醌、鬼臼酸、2-乙基酰肼、丙卡巴肼、多糖復(fù)合物、雷佐生；根霉素；sf-1126、西佐喃；鍺螺胺；替奴佐酸；三亞胺醌；2,2',2”-三氯三乙胺；單端孢霉烯類(t-2毒素、疣孢菌素(verracurin)a、桿孢菌素a和蛇行菌素)；urethan；長春地辛；達卡巴嗪；甘露莫司??；二溴甘露醇；二溴衛(wèi)矛醇；哌泊溴烷;gacytosine；阿糖胞苷；環(huán)磷酰胺；塞替派；紫杉烷類,chloranbucil；吉西他濱;6-硫鳥嘌呤；巰基嘌呤；甲氨蝶呤；鉑類似物，長春堿；鉑；依托泊苷；異環(huán)磷酰胺；米托蒽醌；長春新堿；長春瑞濱；諾肖林；替尼泊苷；依達曲沙；道諾霉素；氨基蝶呤；希羅達；伊班膦酸鹽；伊立替康，拓撲異構(gòu)酶抑制劑rfs2000；二氟甲基鳥氨酸；維a酸類；卡培他濱；考布他??；亞葉酸；奧沙利鉑;xl518，減少細胞增殖的pkc-α、raf、h-ras、egfr和vegf-a的抑制劑，和以上任一種的藥學(xué)上可接受的鹽或溶劑合物、酸或衍生物。在該定義中還包括抗激素劑（其起作用以調(diào)節(jié)或抑制激素對腫瘤的作用）諸如抗雌激素劑和選擇性的雌激素受體抗體，抑制酶芳香酶（其調(diào)節(jié)腎上腺中的雌激素產(chǎn)生）的芳香酶抑制劑，和抗雄激素類；以及曲沙他濱(一種1,3-二氧雜環(huán)戊烷核苷胞嘧啶類似物)；反義寡核苷酸，核酶諸如vegf表達抑制劑和her2表達抑制劑；疫苗，proleukin?ril-2；lurtotecan?拓撲異構(gòu)酶1抑制劑；abarelix?rmrh；長春瑞濱和埃斯波霉素和以上任一種的藥學(xué)上可接受的鹽或溶劑合物、酸或衍生物。特別優(yōu)選的抗癌劑包括商業(yè)上或臨床上可得到的化合物諸如厄洛替尼(特羅凱?,genentech/osipharm.),多西他賽(泰索帝?,sanofi-aventis),5-fu(氟尿嘧啶,5-氟尿嘧啶,casno.51-21-8),吉西他濱(健擇?,lilly),pd-0325901(casno.391210-10-9,pfizer),順鉑(順式-二胺,二氯鉑(ii),casno.15663-27-1),卡鉑(casno.41575-94-4),紫杉醇(泰素?,bristol-myerssquibboncology,princeton,n.j.),曲妥珠單抗(赫賽汀?,genentech),替莫唑胺(4-甲基-5-氧代-2,3,4,6,8-五氮雜雙環(huán)[4.3.0]壬-2,7,9-三烯-9-甲酰胺,casno.85622-93-1,temodar?,temodal?,scheringplough),他莫昔芬((z)-2-[4-(1,2-二苯基丁-1-烯基)苯氧基]-n,n-二甲基乙胺,諾瓦得士?,istubal?,valodex?),和多柔比星(阿霉素?)。另外的商業(yè)上或臨床上可得到的抗癌劑包括奧沙利鉑(eloxatin?,sanofi),硼替佐米(萬珂?,millenniumpharm.),索坦(舒尼替尼?,su11248,pfizer),來曲唑(弗隆?,novartis),甲磺酸伊馬替尼(格列衛(wèi)?,novartis),xl-518(mek抑制劑,exelixis,wo2007/044515),arry-886(mek抑制劑,azd6244,arraybiopharma,astrazeneca),sf-1126(pi3k抑制劑,semaforepharmaceuticals),bez-235(pi3k抑制劑,novartis),xl-147(pi3k抑制劑,exelixis),ptk787/zk222584(novartis),氟維司群(faslodex?,astrazeneca),甲酰四氫葉酸(亞葉酸),雷帕霉素(西羅莫司,雷帕鳴?,wyeth),拉帕替尼(tykerb?,gsk572016,glaxosmithkline),氯那法尼(sarasar?,sch66336,scheringplough),索拉非尼(多吉美?,bay43-9006,bayerlabs),吉非替尼(易瑞沙?,astrazeneca),伊立替康(camptosar?,cpt-11,pfizer),替匹法尼(zarnestra?,johnson&johnson),abraxane?(不含克列莫佛),紫杉醇的白蛋白工程改造的納米顆粒制劑(americanpharmaceuticalpartners,schaumberg,il),凡他尼布(rinn,zd6474,zactima?,astrazeneca),chloranmbucil,ag1478,ag1571(su5271;sugen),坦羅莫司(torisel?,wyeth),帕唑帕尼(glaxosmithkline),坎磷酰胺(telcyta?,telik),塞替派和環(huán)磷酰胺(cytoxan?,neosar?)；長春瑞濱(諾維本?)；卡培他濱(希羅達?,roche),他莫昔芬(包括諾瓦得士?；檸檬酸他莫昔芬,法樂通?(枸櫞酸托瑞米芬)，megase?(乙酸甲地孕酮),阿諾新?(依西美坦;pfizer),福美坦（formestanie）,法倔唑,rivisor?(伏氯唑),弗隆?(來曲唑;novartis),和瑞寧得?(阿那曲唑;astrazeneca)。術(shù)語“藥學(xué)上可接受的鹽”或“鹽”意指分子或大分子的有機或無機鹽。酸加成鹽可以用氨基形成。示例性的鹽包括，但不限于，硫酸鹽、檸檬酸鹽、乙酸鹽、草酸鹽、氯化物、溴化物、碘化物、硝酸鹽、硫酸氫鹽、磷酸鹽、酸式磷酸鹽、異煙酸鹽、乳酸鹽、水楊酸鹽、酸式檸檬酸鹽、酒石酸鹽、油酸鹽、鞣酸鹽、泛酸鹽、酒石酸氫鹽、抗壞血酸鹽、琥珀酸鹽、馬來酸鹽、龍膽酸鹽（gentisinate）、富馬酸鹽、葡萄糖酸鹽、葡糖醛酸鹽、蔗糖酸鹽、甲酸鹽、苯甲酸鹽、谷氨酸鹽、甲磺酸鹽、乙磺酸鹽、苯磺酸鹽、對甲苯磺酸鹽和撲酸鹽(即，1,1′亞甲基二-(2-羥基3-萘甲酸鹽))。藥學(xué)上可接受的鹽可以涉及包括另一種分子諸如乙酸根離子、琥珀酸根離子或其它平衡離子。所述平衡離子可以是穩(wěn)定母體化合物上的電荷的任何有機或無機部分。此外，藥學(xué)上可接受的鹽可以在其結(jié)構(gòu)中具有超過一個帶電荷的原子。當多個帶電荷的原子是藥學(xué)上可接受的鹽的組成部分時，所述鹽可以具有多個平衡離子。因此，藥學(xué)上可接受的鹽可以具有一個或多個帶電荷的原子和/或一個或多個平衡離子。“藥學(xué)上可接受的溶劑合物”或“溶劑合物”表示一個或多個溶劑分子與分子或大分子的結(jié)合。形成藥學(xué)上可接受的溶劑合物的溶劑的例子包括，但不限于，水、異丙醇、乙醇、甲醇、dmso、乙酸乙酯、乙酸和乙醇胺。在其它實施方案中，本發(fā)明的cldncar治療可以與當前處于臨床試驗或商購可得的多種抗體(或免疫治療劑)中的任一種聯(lián)合使用。為此目的，公開的cldn敏化的淋巴細胞可以與選自以下的抗體聯(lián)合使用：阿巴伏單抗、阿德木單抗、阿托珠單抗、阿侖珠單抗、阿妥莫單抗、amatuximab、anatumomab、阿西莫單抗、巴維昔單抗、貝妥莫單抗、貝伐珠單抗、比伐珠單抗、蘭妥莫單抗、brentuximab、美坎珠單抗、卡妥索單抗、西妥昔單抗、citatuzumab、西妥木單抗、clivatuzumab、可那木單抗、達雷木單抗、drozitumab、duligotumab、dusigitumab、地莫單抗、達西珠單抗、dalotuzumab、依美昔單抗、依洛珠單抗、ensituximab、厄馬索單抗、埃達珠單抗、法利珠單抗、ficlatuzumab、芬妥木單抗、flanvotumab、futuximab、ganitumab、吉妥珠單抗、吉瑞昔單抗、glembatumumab、替伊莫單抗、伊戈伏單抗、imgatuzumab、indatuximab、伊珠單抗、英妥木單抗、伊匹木單抗、伊妥木單抗、拉貝珠單抗、lambrolizumab、來沙木單抗、林妥珠單抗、lorvotuzumab、魯卡木單抗、馬帕木單抗、馬妥珠單抗、米拉珠單抗、明瑞莫單抗、米妥莫單抗、moxetumomab、narnatumab、naptumomab、奈昔木單抗、尼妥珠單抗、nivolumab、若莫單抗、阿托珠單抗、ocaratuzumab、奧法木單抗、olaratumab、奧拉帕利、onartuzumab、oportuzumab、奧戈伏單抗、帕木單抗、parsatuzumab、patritumab、pemtumomab、培妥珠單抗、pidilizumab、平妥單抗、普立木單抗、雷妥莫單抗、radretumab、雷莫蘆單抗、利妥木單抗、利妥昔單抗、羅妥木單抗、沙妥莫單抗、司美替尼、西羅珠單抗、司妥昔單抗、simtuzumab、solitomab、他珠單抗、taplitumomab、替妥莫單抗、替妥木單抗、替加珠單抗、托西莫單抗、曲妥珠單抗、tucotuzumab、ublituximab、維妥珠單抗、vorsetuzumab、伏妥莫單抗、扎蘆木單抗、cc49、3f8、mdx-1105和medi4736和它們的組合。其它特別優(yōu)選的實施方案包括使用被批準用于癌癥治療的抗體，包括，但不限于，利妥昔單抗、吉妥珠單抗奧唑米星、阿侖珠單抗、替伊莫單抗、托西莫單抗、貝伐珠單抗、西妥昔單抗、patitumumab、奧法木單抗、伊匹木單抗和brentuximabvedotin。本領(lǐng)域技術(shù)人員將能夠容易地鑒別適合本文中的教導(dǎo)的額外抗癌劑。本發(fā)明還提供了cldncar治療與放射療法(即，用于在腫瘤細胞內(nèi)局部地誘導(dǎo)dna損傷的任何機制，諸如γ-輻照、x-射線、紫外光照射、微波、電子發(fā)射等)的組合。還預(yù)見到使用放射性同位素向腫瘤細胞的定向遞送的聯(lián)合治療，并且公開的cldncar治療可以與靶向的抗癌劑或其它靶向方式結(jié)合使用。通常，在約1至約2周的時間段中以脈沖形式施用輻射療法?？梢詫⑤椛浏煼ㄊ┯媒o患有頭頸癌的受試者持續(xù)約6至7周。任選地，可以施用輻射療法作為單次劑量或作為多個連續(xù)劑量。x.診斷本發(fā)明提供了用于檢測、診斷或監(jiān)測任何淋巴細胞轉(zhuǎn)導(dǎo)的效率或任何cldn敏化的淋巴細胞對腫瘤細胞（包括致瘤性細胞）的影響的體外和體內(nèi)方法。這樣的方法包括鑒別用于治療的具有癌癥(例如，cldn陽性的腫瘤)的個體或監(jiān)測癌癥的進展，包括在用cldn敏化的淋巴細胞治療之前、過程中或之后用如本文中所述的抗體測試患者或得自患者的樣品(體內(nèi)或體外)，并檢測樣品中所述抗體或游離靶分子的存在或不存在、或所述抗體的結(jié)合水平。在某些實施方案中，所述cldn抗體將包含如本文中所述的可檢測標記或報告分子。在其它的實施方案(例如，原位雜交或ish)中，與基因組cldn決定簇反應(yīng)的核酸探針將用在增殖性病癥的檢測、診斷或監(jiān)測中。更一般地，使用蛋白或核酸分析領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可得到的許多技術(shù)中的任一種，例如，直接物理測量(例如，質(zhì)譜法)、結(jié)合測定(例如，免疫測定、凝集測定和免疫色譜測定)、聚合酶鏈式反應(yīng)(pcr、rt-pcr;rt-qpcr)技術(shù)、支鏈寡核苷酸技術(shù)、rna印跡技術(shù)、寡核苷酸雜交技術(shù)和原位雜交技術(shù)，可以測量cldn決定簇的存在和/或水平。所述方法還可以包括測量從化學(xué)反應(yīng)產(chǎn)生的信號，例如，光學(xué)吸光度的變化，熒光的變化，化學(xué)發(fā)光或電化學(xué)發(fā)光的產(chǎn)生，反射率、折射率或光散射的變化，來自表面的可檢測標記的積累或釋放，氧化或還原或氧化還原物質(zhì)，電流或電勢，磁場的變化等。合適的檢測技術(shù)可以如下檢測結(jié)合事件：通過經(jīng)由標記的光致發(fā)光(例如，經(jīng)由測量熒光、時間分辨熒光、隱失波熒光、上轉(zhuǎn)換磷光體、多光子熒光等)、化學(xué)發(fā)光、電化學(xué)發(fā)光、光散射、光學(xué)吸光度、放射性、磁場、酶活性(例如，通過測量酶活性，這通過造成光學(xué)吸光度或熒光的變化或造成化學(xué)發(fā)光的發(fā)射的酶反應(yīng)實現(xiàn))測量所述標記，從而測量標記結(jié)合試劑的參與?？蛇x地，可以使用不需要使用標記的檢測技術(shù)，例如，基于測量質(zhì)量(例如，表面聲波測量)、折射率(例如，表面等離子體共振測量)或分析物的固有發(fā)光的技術(shù)。在某些實施方案中，檢測劑與樣品中的特定細胞或細胞組分的結(jié)合指示，所述樣品可能含有致瘤性細胞，由此指示可以用如本文中所述的組合物有效地治療所述具有癌癥的個體。在某些優(yōu)選的實施方案中，所述測定可以包含免疫組織化學(xué)(ihc)測定或其變體(例如，熒光、產(chǎn)色、標準abc、標準lsab等)、免疫細胞化學(xué)或其變體(例如，直接、間接、熒光、產(chǎn)色等)或原位雜交(ish)或其變體(例如，產(chǎn)色原位雜交(cish)或熒光原位雜交(dna-fish或rna-fish))。在這點上，本發(fā)明的某些方面包括經(jīng)標記的cldn用于免疫組織化學(xué)(ihc)的用途。更具體地，cldnihc可以用作診斷工具來輔助診斷多種增殖性病癥和監(jiān)測對治療（包括cldn抗體療法）的潛在應(yīng)答。如本文中討論的和在下面實施例中證實的，可以在已經(jīng)化學(xué)固定(包括、但不限于:甲醛、戊二醛、四氧化鋨、重鉻酸鉀、乙酸、醇、鋅鹽、氯化汞、四氧化鉻和苦味酸)和包埋(包括、但不限于:甲基丙烯酸乙二醇酯、石蠟和樹脂)或通過冷凍保存的組織上執(zhí)行適合的診斷測定。這樣的測定可以用于指導(dǎo)治療決定和確定定量施用方案和時機。本發(fā)明的其它特別適合的方面包括使用原位雜交來檢測或監(jiān)測cldn決定簇。原位雜交技術(shù)或ish是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的。簡而言之，將細胞固定，并將含有特定核苷酸序列的可檢測探針加給固定的細胞。如果所述細胞含有互補的核苷酸序列，則所述探針（其可以被檢測到）將與它們雜交。使用本文所述的序列信息，可以設(shè)計探針以鑒別表達基因型cldn決定簇的細胞。探針優(yōu)選地與對應(yīng)于這樣的決定簇的核苷酸序列雜交。常規(guī)地可以優(yōu)化雜交條件以使非完全互補的雜交產(chǎn)生的背景信號最小化，盡管優(yōu)選地所述探針優(yōu)選地與選擇的cldn決定簇完全互補。在選擇的實施方案中，用附著于探針的熒光染料來標記探針，所述熒光染料可容易地通過標準熒光方法學(xué)檢測到。適合的體內(nèi)治療診斷或診斷測定可以包含本領(lǐng)域公知的成像或監(jiān)測技術(shù)諸如磁共振成像、計算機化斷層攝影(例如cat掃描)、正電子斷層攝影術(shù)(例如，pet掃描)放射攝影術(shù)、超聲等，如本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。在一個特別優(yōu)選的實施方案中，本文公開的抗體可以用于檢測和定量患者樣品(例如，血漿或血液)中的特定決定簇(例如，cldn)的水平，所述水平又可以用于在用cldn敏化的淋巴細胞治療之前和之后檢測、診斷或監(jiān)測增殖性病癥。在有關(guān)的實施方案中，本文公開的抗體可以用于與公開的cldn敏化的淋巴細胞治療組合地檢測、監(jiān)測和/或定量體內(nèi)或體外循環(huán)腫瘤細胞(wo2012/0128801)。在其它的實施方案中，所述循環(huán)腫瘤細胞可以包括致瘤性細胞。在本發(fā)明的某些實施方案中，可以在cldncar療法或方案之前使用公開的抗體評估或表征受試者或來自受試者的樣品中的致瘤性細胞，以建立基線。在其它實施例中，可以從衍生自所治療的受試者的樣品評估致瘤性細胞。xi.制成品本發(fā)明還包括藥物包和包含一個或多個容器的試劑盒，其中容器可以包含一個或多個轉(zhuǎn)化劑量的本發(fā)明的cldncar質(zhì)?；蜉d體。在某些實施方案中，所述包或試劑盒含有載體制品(例如，慢病毒或逆轉(zhuǎn)錄病毒)，所述載體制品包含編碼cldncar的核酸，含有或沒有一種或多種另外的試劑和任選的實現(xiàn)轉(zhuǎn)導(dǎo)的工具。優(yōu)選地，所述試劑盒還將包括在施用前監(jiān)測和表征cldn敏感的淋巴細胞的制備的工具。在選擇的實施方案中，適合本發(fā)明的試劑盒將允許用戶生產(chǎn)cldn敏感的淋巴細胞、監(jiān)測轉(zhuǎn)導(dǎo)速率和表征得到的cldn敏感的淋巴細胞群體以確保施用之前的質(zhì)量。因此，本發(fā)明的試劑盒通常含有car核酸(或載體)的藥學(xué)上可接受的制劑，和任選的在相同或不同容器中的一種或多種試劑。在優(yōu)選的實施方案中，所述cldncar載體將包含病毒載體(例如，慢病毒或逆轉(zhuǎn)錄病毒)，其允許轉(zhuǎn)導(dǎo)選擇的宿主細胞以提供公開的敏化的淋巴細胞。在某些實施方案中，所述選擇的宿主細胞將是自體的(即源自要治療的患者)，而在其它實施方案中，所述選擇的宿主細胞將是同種異體的。本發(fā)明的某些方面涉及試劑盒，其包括同種異體細胞以及cldncar載體。其它實施方案包含含有藥物組合物的試劑盒或容器，所述藥物組合物包含同種異體的cldn敏化的淋巴細胞。在這樣的試劑盒中，所述容器可以包含輸注袋，其允許將cldn敏化的淋巴細胞直接施用給患者。所述試劑盒也可以含有用于診斷或聯(lián)合治療的其它藥學(xué)上可接受的制劑或裝置。診斷裝置或器械的例子包括可以用于檢測、監(jiān)測、定量或描繪與cldn敏感的淋巴細胞、轉(zhuǎn)化效率或要治療的增殖性病癥相關(guān)的細胞或標志物的那些。在特別優(yōu)選的實施方案中，所述裝置可以用于體內(nèi)或體外檢測、監(jiān)測和/或定量循環(huán)腫瘤細胞。在其它優(yōu)選的實施方案中，循環(huán)腫瘤細胞可以包含致瘤性細胞。當在一種或多種液體溶液中提供試劑盒的選定組分時，所述液體溶液可以是非水性的，但是，水溶液是優(yōu)選的，其中無菌水溶液是特別優(yōu)選的。試劑盒的制劑(例如，病毒載體)還可以作為干燥粉末或以低壓凍干形式（其可以在添加適當液體后重構(gòu)）提供。用于重構(gòu)的液體可以被包含在單獨的容器中。這樣的液體可以包含無菌的藥學(xué)上可接受的緩沖液或其它稀釋劑，諸如抑制細菌注射用水、磷酸鹽緩沖鹽水、林格氏溶液或右旋糖溶液。在試劑盒包含與另外試劑組合的本發(fā)明的car質(zhì)?；蜉d體的情況下，可以將溶液預(yù)混合（在摩爾當量組合中，或一種組分相對于其它組分過量）?？蛇x地，可以在轉(zhuǎn)化淋巴細胞之前將本發(fā)明的質(zhì)粒和任何任選的輔助試劑分別維持在不同容器內(nèi)。在其它優(yōu)選的實施方案中，試劑盒的容器可以包含同種異體的cldn敏化的淋巴細胞的液體制劑。所述試劑盒可以包含一個或多個容器和在容器內(nèi)、表面上或與容器伴隨的標簽或包裝說明書，其指示包封的組合物用于準備細胞用于治療選擇的疾病狀況。合適的容器包括，例如，瓶子、小瓶、注射器等。所述容器可以由多種材料諸如玻璃或塑料形成。所述容器可以包含無菌接近口，例如，所述容器可以是靜脈內(nèi)溶液袋或具有可以被皮下注射針穿透的塞子的小瓶。在某些實施方案中，所述試劑盒可以含有用于將敏化的淋巴細胞和任何任選的組分施用給患者的裝置，例如，一個或多個針頭或注射器(預(yù)填充的或空的)，滴眼管、移液器、或其它這樣的類似設(shè)備，從所述裝置可以將制劑注射或引入受試者中或應(yīng)用于身體的患病區(qū)域。本發(fā)明的試劑盒還將通常包括用于容納小瓶的裝置，或這樣的類似物，和用于商業(yè)銷售的在密閉空間中的其它組分，例如，吹塑成型的塑料容器，其中放置并保留期望的小瓶和其它設(shè)備。xiii.其它內(nèi)容除非在本文中另外定義，與本發(fā)明結(jié)合使用的科學(xué)和技術(shù)術(shù)語應(yīng)當具有本領(lǐng)域普通技術(shù)人員通常理解的含義。而且，除非上下文有其它規(guī)定，單數(shù)形式的術(shù)語應(yīng)當包括復(fù)數(shù)，而復(fù)數(shù)形式的術(shù)語應(yīng)當包括單數(shù)。另外，在說明書和所附權(quán)利要求中提供的范圍包括兩個端點和在所述端點之間的所有點。因此，2.0-3.0的范圍包括2.0、3.0、和在2.0與3.0之間的所有點。通常，本文描述的細胞和組織培養(yǎng)、分子生物學(xué)、免疫學(xué)、微生物學(xué)、遺傳學(xué)和化學(xué)的技術(shù)是本領(lǐng)域眾所周知和常用的那些。本文所使用的命名法以及此類技術(shù)也是本領(lǐng)域中常用的。通常根據(jù)本領(lǐng)域眾所周知的常規(guī)方法，并且如貫穿本說明書引用的各種參考文獻中所述，執(zhí)行本發(fā)明的方法和技術(shù)，除非另外指出。xiv.參考文獻無論關(guān)于特定參考文獻是否使用短語“通過引用并入”，在本文中引用的所有專利、專利申請和出版物的整個公開內(nèi)容以及電子地可得到的材料(包括，例如，核苷酸序列提交(在例如genbank和refseq中)和氨基酸序列提交(在例如swissprot、pir、prf、pdb中)，以及來自genbank和refseq內(nèi)的標注編碼區(qū)的翻譯)都通過引用并入。僅為了理解清楚的目的，已經(jīng)給出前述詳細描述和隨后的實施例。從其中不應(yīng)理解不必要的限制。本發(fā)明不限于所示和所述的精確細節(jié)。在由權(quán)利要求定義的本發(fā)明中將包括本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的變型。本文使用的任何段落標題僅僅用于組織目的，不應(yīng)解釋為限制主題描述的方法。xv.序列本申請附有附圖和包含許多核酸和氨基酸序列的序列表。以下表2提供了包括的序列的概述。表2seqidno描述1κ輕鏈(lc)恒定區(qū)蛋白2iggi重鏈(hc)恒定區(qū)蛋白3scfv接頭蛋白4sc27.108scfv核酸5sc27.108scfv氨基酸6sc27.204v2scfv核酸7sc27.204v2scfv氨基酸8sct1-h27.108核酸9sct1-h27.108氨基酸10sct1-h27.204v2核酸11sct1-h27.204v2氨基酸12-19保留20sc27.1vldna21sc27.1vl蛋白22sc27.1vhdna23sc27.1vh蛋白24-59如在seqidno:20-23中的額外小鼠克隆60hsc27.1vldna61hsc27.1vl蛋白62hsc27.1vhdna63hsc27.1vh蛋白64-75如在seqidno:60-63中的額外人源化克隆76-77hsc27.108v1vldna和蛋白78-79hsc27.22-vh1-8vhdna和蛋白80-81hsc27.22-vh1-46vhdna和蛋白82-83hsc27.22-vh1-69vhdna和蛋白84-85hsc27.204v1dna和蛋白86-87hsc27.204v2dna和蛋白88-89hsc27.204v3dna和蛋白90-91hsc27.204v4dna和蛋白92-93hsc27.204v5dna和蛋白94-95hsc27.204v6dna和蛋白96-97hsc27.204v7dna和蛋白98-99hsc27.204v8dna和蛋白100-101hsc27.204v9dna和蛋白102-103hsc27.204v10dna和蛋白104-105hsc27.204v11dna和蛋白106-107hsc27.204v12dna和蛋白108-109hsc27.204v13dna和蛋白110-111hsc27.204v14dna和蛋白112-113hsc27.204v15dna和蛋白114-115hsc27.1全長lc和hc蛋白116-117hsc27.22全長lc和hc蛋白118-119hsc27.108全長lc和hc蛋白120-121hsc27.204全長lc和hc蛋白122hsc27.22ss1全長hc蛋白123hsc27.22-vh1-8全長hc蛋白124hsc27.22-vh1-46全長hc蛋白125hsc27.22-vh1-69全長hc蛋白126hsc27.22igg2全長hc蛋白127hsc27.22igg4r409k全長hc蛋白128hsc27.22igg4s228p全長hc蛋白129hsc27.22igg4s228pk370er409k全長hc蛋白130hsc27.22igg4k370e全長hc蛋白131hsc27.22igg4s228pk370e全長hc蛋白132hsc27.22igg4c127ss228p全長hc蛋白133hsc27.22igg4c127sk370e全長hc蛋白134hsc27.22igg4c127ss228pk370e全長hc蛋白135hsc27.108v1全長lc蛋白136hsc27.204v1全長hc蛋白137hsc27.204v2全長hc蛋白138hsc27.204v3全長hc蛋白139hsc27.204v4全長hc蛋白140hsc27.204v5全長hc蛋白141hsc27.204v6全長hc蛋白142hsc27.204v7全長hc蛋白143hsc27.204v8全長hc蛋白144hsc27.204v9全長hc蛋白145hsc27.204v10全長hc蛋白146hsc27.204v11全長hc蛋白147hsc27.204v12全長hc蛋白148hsc27.204v13全長hc蛋白149hsc27.204v14全長hc蛋白150hsc27.204v15全長hc蛋白151-156hsc27.1cdrl1;cdrl2;cdrl3,cdrh1;cdrh2;cdrh3157-162hsc27.22cdrl1;cdrl2;cdrl3,cdrh1;cdrh2;cdrh3163-168hsc27.108cdrl1;cdrl2;cdrl3,cdrh1;cdrh2;cdrh3169-174hsc27.204cdrl1;cdrl2;cdrl3,cdrh1;cdrh2;cdrh3175hsc27.204v1、hsc27.204v5和hsc27.405v13的cdrh2176hsc27.204v2、hsc27.204v6和hsc27.405v14的cdrh2177hsc27.204v3、hsc27.204v7和hsc27.405v15的cdrh2178密碼子優(yōu)化的hsc27.22ss1全長hcdna如在下面實施例4中討論的，上面表2還可以用于指示在圖3a和3b中描繪的示例性kabatcdr的seqidno。更具體地，圖3a和3b表示每個重(cdrh)和輕(cdrl)鏈可變區(qū)序列的三個kabatcdr，且上面表2提供了seqid命名的指定，其可以應(yīng)用于輕鏈的每個cdrl1、cdrl2和cdrl3以及重鏈的每個cdrh1、cdrh2和cdrh3。使用該方法，可以給圖3a和3b所示的每個獨特cdr指定連續(xù)的seqidno且可以用于提供本發(fā)明的衍生抗體。xvi.腫瘤列表pdx腫瘤細胞類型通過縮寫和隨后的數(shù)字表示，其指示特定腫瘤細胞系。測試的樣品的傳代數(shù)由隨附樣品名稱的p0-p#指示，其中p0指示直接得自患者腫瘤的未傳代的樣品，且p#指示在測試之前腫瘤已經(jīng)通過小鼠傳代的次數(shù)。如本文中使用的，腫瘤類型和亞型的縮寫顯示在如下表3中：表3腫瘤類型縮寫腫瘤亞型縮寫乳房br雌激素受體陽性的和/或黃體酮受體陽性的br-erprerbb2/neu陽性的br-erbb2/neuher2陽性的br-her2三重陰性的tnbc三重陰性的封閉蛋白亞型tnbc-cldn結(jié)腸直腸cr子宮內(nèi)膜en胃ga彌散性腺癌ga-ad-dif/muc腸腺癌ga-ad-int間質(zhì)瘤ga-gist膠質(zhì)母細胞瘤gb頭和頸hn腎kdy清晰的腎細胞癌kdy-cc乳頭狀腎細胞癌kdy-pap移行細胞或泌尿道上皮癌kdy-uro未知kdy-unk肝liv肝細胞癌liv-hcc膽管癌liv-chol淋巴瘤ln肺lu腺癌lu-ad類癌lu-car大細胞神經(jīng)內(nèi)分泌的lu-lcc非小細胞nsclc鱗狀細胞lu-scc小細胞sclc梭形細胞lu-spc黑素瘤mel卵巢ov透明細胞ov-cc子宮內(nèi)膜樣的ov-end混合亞型ov-mix惡性的混合中胚層ov-mmmt粘液的ov-muc神經(jīng)內(nèi)分泌的ov-net乳頭狀漿液的ov-ps漿液的ov-s小細胞ov-sc移行細胞癌ov-tcc胰腺pa腺泡細胞癌pa-acc十二指腸癌pa-dc粘液腺癌pa-mad神經(jīng)內(nèi)分泌的pa-net腺癌pa-pac腺癌外分泌型pa-pace導(dǎo)管腺癌pa-pdac壺腹腺癌pa-aac前列腺pr皮膚sk黑素瘤mel鱗狀細胞癌sk-scc實施例通過參考以下實施例將更容易理解至此在上面一般地描述的發(fā)明，所述實施例通過舉例的方式提供，且無意限制本發(fā)明。所述實施例無意表示以下實驗是進行的所有或唯一實驗。除非另外指出，份是重量份，分子量是重量平均分子量，溫度是以攝氏度為單位，且壓力是處于或接近大氣壓。實施例1腫瘤上的cldn4、cldn6和cldn9表達的鑒別為了表征實體瘤當存在于癌癥患者中時的細胞異質(zhì)性、輔助使用特定表型標志物鑒別csc和鑒別臨床上有關(guān)的治療靶標，使用本領(lǐng)域公認的技術(shù)開發(fā)和維持大pdx腫瘤庫。通過最初得自罹患多種實體瘤惡性腫瘤的眾多癌癥患者的異質(zhì)腫瘤細胞的多次傳代，在免疫受損的小鼠中繁殖pdx腫瘤庫，其包含大數(shù)目的離散腫瘤細胞系。大量具有明確定義的譜系的離散早代pdx腫瘤細胞系的持續(xù)可用性極大地促進所述鑒別，且csc作為pdx腫瘤的分離允許可再現(xiàn)地和重復(fù)地表征csc。最少傳代的pdx腫瘤細胞系的應(yīng)用會簡化體內(nèi)實驗并提供容易證實的結(jié)果。此外，早代pdx腫瘤會對治療劑諸如伊立替康(即camptosar?)做出應(yīng)答，這會提供臨床上有關(guān)的洞察力來理解驅(qū)動腫瘤生長、對現(xiàn)有療法的抗性和腫瘤復(fù)發(fā)的相關(guān)機制。為了從pdx腫瘤細胞系生成rna，在腫瘤達到800-2,000mm3之后從小鼠切除腫瘤，并使用本領(lǐng)域公知的酶消化技術(shù)(參見，例如，u.s.p.n.2007/0292414)將腫瘤解離成單細胞懸浮液。將選擇的解離的pdx腫瘤細胞制備物除盡小鼠細胞，并基于其cd46高和/或cd324(csc亞群的標志物)的表達進行分選(關(guān)于cd46高的定義，參見u.s.p.n2013/0260385)。將表達人epcam、cd46高和/或cd324(即csc)或epcam、但不表達cd46高和/或cd324(即ntg細胞)的細胞通過使用bdfacsaria細胞分選儀的facs分離，并根據(jù)生產(chǎn)商的說明書在rltplusrna裂解緩沖液(qiagen)中裂解。然后將裂解物在-80℃儲存，并解凍用于rna提取。解凍后，按照供應(yīng)商的說明書使用rneasy分離試劑盒(qiagen,gmbh)提取總rna，并然后再次使用生產(chǎn)商的方案和推薦的儀器設(shè)置使用nanodrop分光光度計(thermoscientific)和/或bioanalyzer2100(agilenttechnologies)進行定量。通過基因測序和基因表達分析來評估得到的總rna制備物。使用appliedbiosystems(abi)sequencingbyoligoligation/detection(solid)4.5或solid5500xl下一代測序系統(tǒng)(lifetechnologies)進行定量的高質(zhì)量rna的全轉(zhuǎn)錄組測序。使用來自abi的被設(shè)計用于低輸入總rna的改進全轉(zhuǎn)錄組方案或ovationrna-seq系統(tǒng)v2?(nugentechnologies)，從1ng總rna樣品生成cdna。將得到的cdna文庫片段化，并添加條形碼適配子以允許在測序運行過程中合并來自不同樣品的片段文庫。將由solid平臺生成的數(shù)據(jù)映射至使用公布的人基因組的ncbi版本hg19.2由refseq版本47注釋的34,609個基因，并且提供在大多數(shù)樣品中的rna水平的可驗證測量。使用映射至基因的外顯子區(qū)域的度量rpm(每百萬的讀數(shù))和rpkm(每百萬每千堿基的讀數(shù))，將來自solid平臺的測序數(shù)據(jù)名義上表示為轉(zhuǎn)錄物表達值，從而使基礎(chǔ)基因表達分析能夠被歸一化和列舉為rpm_transcript或rpkm_transcript。使用solid的全轉(zhuǎn)錄組測序的結(jié)果顯示與以下pdx細胞系中的ntg相比在分選的csc中的cldn4mrna的表達升高：br13、br22、ov100、pa20和pa3，以及在額外的csc群體(包括br36、ov106met、ov72met和ov91met)中的高表達(圖1)。cldn6mrna在分選的csc群體(包括br36、ov106met、ov72met和ov91met)中升高(圖1)。不同于對于cldn4或cldn6的情況，觀察到相關(guān)的家族成員cldn9在所有分選的腫瘤群體中具有低表達。與腫瘤樣品相反，正常卵巢和胰腺組織顯示所有三種家族成員cldn4、cldn6和cldn9沒有表達或非常低的mrna表達。不同類型的人腫瘤中的升高的cldn4和cldn6mrna表達的鑒別指示這些抗原值得作為潛在的診斷和/或免疫治療靶標進一步評價。實施例2重組cldn蛋白的克隆和表達為了推導(dǎo)封閉蛋白蛋白序列之間的關(guān)系，使用vectornti軟件包的alignx程序比對來自23種人cldn基因的30種封閉蛋白蛋白序列。該比對的結(jié)果被描繪為圖2a中的樹形圖。該圖的概覽顯示，cldn6和cldn9在序列上非常密切地相關(guān)，從而在樹形圖的相同分支上彼此相鄰出現(xiàn)。圖2a還顯示，cldn4是cldn6的下一個最密切相關(guān)的家族成員。數(shù)據(jù)的更詳細的概覽顯示，人cldn6蛋白在細胞外結(jié)構(gòu)域(ecd)中與人cldn9蛋白序列非常密切相關(guān)，其中在ecd1中具有>98％同一性且在ecd2中具有>91％同一性(圖2b)。還發(fā)現(xiàn)人cldn4在ecd序列中與人cldn6密切相關(guān)，其中在ecd1中具有>84％同一性且在ecd2中具有>78％同一性(圖2b)?；谶@些蛋白序列關(guān)系，假定用人cldn6抗原免疫接種可以產(chǎn)生識別人cldn6的抗體，其也將與人cldn9交叉反應(yīng)，且可能還與人cldn4交叉反應(yīng)。為了確定篩選這些多反應(yīng)性的封閉蛋白抗體將需要cldn6、cldn9和cldn4的何種物種直系同源物，分析來自以下物種各自的cldn4、cldn6和cldn9的ecd序列：人、食蟹猴、小鼠和大鼠。當可用時，使用alignx和ncbi數(shù)據(jù)庫蛋白序列進行分析(人、小鼠和大鼠蛋白的np登錄號顯示于圖2c中)?？蛇x地，從通過人cldn可讀框序列相對于食蟹猴全基因組鳥槍法測序重疊群的blast組裝的食蟹猴cldn基因的翻譯推導(dǎo)蛋白序列。這些比對的檢查揭示：(1)cldn4、cldn6和cldn9蛋白的推導(dǎo)的食蟹猴蛋白ecd序列與各自人ecd序列具有100%同一性；(2)小鼠和大鼠cldn9ecd序列與人直系同源物序列具有100%同一性；且(3)小鼠和大鼠cldn4和cldn6ecd序列彼此不同且不同于各自的人直系同源物。因此，包含人cldn4、人cldn6、人cldn9、小鼠cldn4、小鼠cldn6、大鼠cldn4和大鼠cldn6的七種構(gòu)建體的集合的生成應(yīng)當能夠確定任何結(jié)合結(jié)構(gòu)域與所有可能的12種直系同源物的交叉反應(yīng)性。編碼人cldn6、cldn4和cldn9蛋白的dna片段為了生成在本發(fā)明中有用的與人cldn6(hcldn6)蛋白有關(guān)的分子和細胞材料，合成了密碼子優(yōu)化的dna片段，其編碼與ncbi蛋白登錄np_067018相同的蛋白(idt)。將該dna克隆用于表達成熟hcldn6蛋白或其片段的構(gòu)建體的所有后續(xù)工程改造。類似地，購買密碼子優(yōu)化的編碼與ncbi蛋白登錄np_001296（對于人cldn4(hcldn4)）或ncbi蛋白登錄np_066192（對于人cldn9(hcldn9)）相同的蛋白的dna片段，并用于表達hcldn4或hcldn9蛋白或其片段的構(gòu)建體的所有后續(xù)工程改造。編碼小鼠cldn6和cldn4蛋白的dna片段為了生成在本發(fā)明中有用的與小鼠cldn6(mcldn6)蛋白有關(guān)的分子和細胞材料，合成密碼子優(yōu)化的編碼與ncbi蛋白登錄np_061247相同的蛋白的dna片段(idt)。將該dna克隆用于表達成熟mcldn6蛋白或其片段的構(gòu)建體的所有后續(xù)工程改造。類似地，購買密碼子優(yōu)化的編碼與ncbi蛋白登錄np_034033（對于小鼠cldn4(mcldn4)）相同的蛋白的dna片段，且用于表達成熟mcldn4蛋白或其片段的構(gòu)建體的所有后續(xù)工程改造。編碼大鼠cldn6和cldn4蛋白的dna片段為了生成在本發(fā)明中有用的與大鼠cldn6(rcldn6)蛋白有關(guān)的分子和細胞材料，合成密碼子優(yōu)化的編碼與ncbi蛋白登錄np_001095834相同的蛋白的dna片段(idt)。將該dna克隆用于表達成熟rcldn6蛋白或其片段的構(gòu)建體的所有后續(xù)工程改造。類似地，購買密碼子優(yōu)化的編碼與ncbi蛋白登錄np_001012022（對于大鼠cldn4(rcldn4)）相同的蛋白的dna片段，且用于表達成熟rcldn4蛋白或其片段的構(gòu)建體的所有后續(xù)工程改造。細胞系工程改造使用本領(lǐng)域公認的技術(shù)使用慢病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)hek-293t或3t3細胞系，構(gòu)建過表達上面列出的各種cldn蛋白的經(jīng)工程改造的細胞系。首先，使用上述商業(yè)合成的dna片段作為模板，使用pcr擴增編碼目標蛋白(例如，hcldn6、mcldn6、rcldn6、hcldn9、hcldn4、mcldn4或rcldn4)的dna片段。然后，將各種pcr產(chǎn)物亞克隆進慢病毒表達載體pcdh-ef1-mcs-t2a-gfp(systembiosciences)的多克隆位點(mcs)中，以生成一系列慢病毒載體。所得到的pcdh-ef1-cldn-t2a-gfp載體中的t2a序列會促進肽鍵縮合的核糖體跳躍，從而導(dǎo)致兩種獨立蛋白的表達：在t2a肽的上游編碼的特定cldn蛋白的高水平表達，在t2a肽的下游編碼的gfp標記蛋白的共表達。使用本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的標準慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)技術(shù)，使用該組慢病毒載體建立過表達各種cldn蛋白的單獨的穩(wěn)定的hek-293t或3t3細胞系。使用也是gfp強陽性的高表達hek-293t亞克隆，用facs選擇cldn陽性的細胞。實施例3抗-cldn抗體的制備因為cldn6是與cldn4和cldn9最同源的(參見圖2a和上面在實施例2中所述的分析)，所以將cldn6用作用于制備多反應(yīng)性的抗-cldn抗體的免疫原。給小鼠接種過表達hcldn6的hek-293t細胞或3t3細胞(如在實施例2中所述制備)，以便生成產(chǎn)生抗體的雜交瘤。給6只小鼠(以下品系各2只：balb/c、cd-1、fvb)接種100萬個用等體積的titermax?佐劑乳化的hcldn6-hek-293t細胞。使用過表達cldn6的3t3細胞，執(zhí)行6只小鼠(以下品系各2只：balb/c、cd-1、fvb)的第二次單獨接種。在初次接種以后，每周2次給小鼠注射過表達cldn6的細胞（用等體積的明礬佐劑乳化）持續(xù)4周。將小鼠處死并對引流淋巴結(jié)(腘、腹股溝和內(nèi)側(cè)髂)進行解剖并將其用作抗體生產(chǎn)細胞的來源。使用模型btxhybrimmune系統(tǒng)(btxharvardapparatus)通過電細胞融合將b細胞的單細胞懸浮液(305x106個細胞)與非分泌性的p3x63ag8.653骨髓瘤細胞(atcc#crl-1580)以1:1的比例融合。將細胞再懸浮于雜交瘤選擇培養(yǎng)基：補充有偶氮絲氨酸(sigma)、15％胎?？寺血清(hyclone)、10％bmcondimed(rocheappliedsciences)、1mm丙酮酸鈉、4mml-谷氨酰胺、100iu青霉素-鏈霉素、50μm2-巰基乙醇和100μm次黃嘌呤的dmem培養(yǎng)基(cellgro)，并在三個t225燒瓶中在每個燒瓶的90ml選擇培養(yǎng)基中培養(yǎng)。將燒瓶置于含有5％co2和95％空氣的增濕37℃培養(yǎng)箱中6天。將該文庫以約15x106個活細胞/瓶冷凍于6個小瓶的cryostorcs10緩沖液(biolifesolutions)中，且在液氮中儲存。將來自文庫的一個小瓶在37℃解凍，并將冷凍的雜交瘤細胞加入90ml上述的雜交瘤選擇培養(yǎng)基，并置于t150燒瓶中。將細胞在具有5％co2和95％空氣的增濕37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。次日，從燒瓶收集雜交瘤細胞，并以1個細胞/孔(使用facsariai細胞分選儀)在200μl補充的雜交瘤選擇培養(yǎng)基中鋪板到48塊falcon96-孔u-底平板中。將雜交瘤培養(yǎng)10天，并使用流式細胞計量術(shù)針對對hcldn6,hcldn4或hcldn9蛋白特異性的抗體篩選上清液。如下進行流式細胞計量術(shù)：將1x105/孔的hek-293t細胞（用編碼hcldn6、hcldn4或hcldn9的慢病毒載體穩(wěn)定地轉(zhuǎn)導(dǎo)）與100μl雜交瘤上清液一起溫育30分鐘。將細胞用pbs/2%fcs洗滌，然后與每個樣品50μldyelight649標記的山羊-抗-小鼠igg、fc片段特異性的第二抗體(在pbs/2%fcs中1:200稀釋)一起溫育。15分鐘溫育之后，將細胞用pbs/2%fcs洗滌兩次，并且再懸浮于含有dapi(以檢測死細胞)的pbs/2%fcs中，并通過流式細胞計量術(shù)針對超過用同種型對照抗體染色的細胞的熒光的熒光進行分析。在旁邊設(shè)置針對一種或多種cldn抗原的抗體測試陽性的所選雜交瘤，用于進一步表征。將剩余的未使用的雜交瘤文庫細胞在液氮中冷凍用于將來文庫測試和篩選。實施例4抗-cldn抗體的測序如上所述生成抗-cldn抗體，然后如下測序。使用rneasyminiprepkit(qiagen)根據(jù)生產(chǎn)商的說明書從所選雜交瘤細胞純化總rna。每個樣品使用104至105個細胞。將分離的rna樣品在-80℃儲存直至使用。使用與對所有小鼠ig同種型特異性的3'小鼠cγ引物組合的兩種5'引物混合物，擴增每種雜交瘤的ig重鏈的可變區(qū)，所述5'引物混合物包含86種小鼠特異性的前導(dǎo)序列引物，所述引物被設(shè)計成靶向完整小鼠vh所有組成成分。類似地，將兩種引物混合物（其含有64種被設(shè)計成擴增每個vk小鼠家族的5'vk前導(dǎo)序列）與對小鼠κ恒定區(qū)特異性的單一反向引物聯(lián)合使用，以便對κ輕鏈擴增和測序。如下使用qiagen一步(onestep)rt-pcr試劑盒，從100ng總rna擴增vh和vl轉(zhuǎn)錄物。針對每種雜交瘤運行總共四個rt-pcr反應(yīng)，兩個針對vk輕鏈和兩個針對vh重鏈。pcr反應(yīng)混合物包括1.5μlrna、0.4μl100μm重鏈或κ輕鏈引物(由idt定制合成)，5μl5xrt-pcr緩沖液、1μldntp、和0.6μl含有逆轉(zhuǎn)錄酶和dna聚合酶的酶混合物。熱循環(huán)儀程序包括以下步驟：rt步驟50℃持續(xù)60分鐘，95℃持續(xù)15分鐘，隨后是35個循環(huán)(94.5℃持續(xù)30秒，57℃持續(xù)30秒，72℃持續(xù)1分鐘)，和在72℃持續(xù)10分鐘的最終溫育。使用與上文所述相同的特異性可變區(qū)引物，對提取的pcr產(chǎn)物進行測序。將pcr產(chǎn)物送至外部測序供應(yīng)商(mclab)用于pcr純化和測序服務(wù)。圖3a描繪了來自抗-cldn抗體的幾種新穎小鼠輕鏈可變區(qū)的連續(xù)氨基酸序列(seqidno:21-57,奇數(shù))。圖3b描繪了來自相同抗-cldn抗體的新穎小鼠重鏈可變區(qū)的連續(xù)氨基酸序列(seqidno:23-59,奇數(shù))。小鼠輕鏈和重鏈可變區(qū)核酸序列提供于圖3c中(seqidno:20-58,偶數(shù))。綜上，圖3a和3b提供了10種小鼠抗-cldn抗體(稱為sc27.1、sc27.22、sc27.103、sc27.104、sc27.105、sc27.106、sc27.108(等同于sc27.109)、sc27.201、sc27.203和sc27.204)的注解序列。注解氨基酸序列以鑒別根據(jù)kabat定義的框架區(qū)(即fr1-fr4)和互補性決定區(qū)(即圖3a中的cdrl1-cdrl3或圖3b中的cdrh1-cdrh3)。使用abysis數(shù)據(jù)庫的專有版本分析可變區(qū)序列以提供cdr和fr名稱。盡管根據(jù)kabat將cdr編號，本領(lǐng)域技術(shù)人員會明白，也可以根據(jù)chothia、mccallum或任何其它接受的命名系統(tǒng)來定義cdr和fr名稱。每種特定抗體的seqidno是連續(xù)的奇數(shù)。因此，單克隆抗-cldn抗體sc27.1包含氨基酸seqidno:21和23（分別對于vl和vh）；且sc27.22包含seqidno:25和27等。每種抗體氨基酸序列的對應(yīng)核酸序列被包括在圖3c中，且具有在相應(yīng)氨基酸seqidno前面緊鄰的seqidno。因此，例如，sc27.1抗體的vl和vh的核酸序列的seqidno分別是seqidno:20和22。實施例5嵌合的和人源化的抗-cldn抗體的制備如下使用本領(lǐng)域公知的技術(shù)制備嵌合的抗-cldn抗體。使用標準的生化技術(shù)從產(chǎn)生抗-cldn抗體的雜交瘤提取總rna，并pcr擴增所述rna。關(guān)于小鼠抗體的vh和vl鏈的v、d和j基因區(qū)段的數(shù)據(jù)得自本發(fā)明的抗-cldn抗體的核酸序列(關(guān)于核酸序列，參見圖3c)。使用以下限制位點，設(shè)計對抗體的vh和vl鏈的框架序列特異性的引物集合：對于vh片段為agei和xhoi，和對于vl片段為xmai和draiii。用qiaquickpcr純化試劑盒(qiagen)純化pcr產(chǎn)物，然后用限制性酶agei和xhoi（對于vh片段）和xmai和draiii（對于vl片段）消化。將vh和vl消化的pcr產(chǎn)物分別純化并連接進igh或igk表達載體中。在10μl的總體積中進行連接反應(yīng)，所述總體積含有200ut4-dna連接酶(newenglandbiolabs)、7.5μl消化和純化的基因特異性的pcr產(chǎn)物和25ng線性化的載體dna。將感受態(tài)大腸桿菌dh10b細菌(lifetechnologies)在42℃經(jīng)由熱激用3μl連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化，并以100μg/ml的濃度鋪板于氨芐西林平板上。在擴增的連接產(chǎn)物的純化和消化之后，將vh片段克隆進包含huigg1的pee6.4表達載體(lonza)(pee6.4huigg1)的agei-xhoi限制位點，并將vl片段克隆進包含人κ輕鏈恒定區(qū)的pee12.4表達載體(lonza)(pee12.4hu-κ)的xmai-draiii限制位點。通過用pee6.4huigg1和pee12.4hu-κ表達載體共轉(zhuǎn)染hek-293t或cho-s細胞，表達嵌合抗體。轉(zhuǎn)染前，在標準條件下在150mm平板中在dulbecco氏改良的伊格爾培養(yǎng)基(dmem)(其補充有10%熱滅活的fcs、100μg/ml鏈霉素和100u/ml青霉素g)中培養(yǎng)hek-293t細胞。對于瞬時轉(zhuǎn)染，使細胞生長至80％匯合。將2.5μg每種pee6.4huigg1和pee12.4hu-κ載體dna加給在1.5mlopti-mem內(nèi)的10μlhek-293t轉(zhuǎn)染試劑。將該混合物在室溫溫育30分鐘，并添加給細胞。在轉(zhuǎn)染后3-6天，收獲上清液。對于cho-s細胞，將2.5μg每種pee6.4huigg1和pee12.4hu-κ載體dna加給在400μlopti-mem中的15μgpei轉(zhuǎn)染試劑。將混合物在室溫溫育10分鐘，并添加給細胞。在轉(zhuǎn)染后3-6天，收獲上清液。通過在800×g離心10分鐘，從細胞碎片澄清含有重組嵌合抗體的培養(yǎng)物上清液，并在4℃儲存。用蛋白a珠子純化重組嵌合抗體。如下使用專有的計算機輔助的cdr移植方法(abysisdatabase,uclbusiness)和標準分子工程改造技術(shù)，將小鼠抗-cldn抗體人源化?；谌朔N系抗體序列的框架序列和cdr規(guī)范結(jié)構(gòu)以及相關(guān)小鼠抗體的框架序列和cdr之間的最高同源性，設(shè)計可變區(qū)的人框架區(qū)。為了分析的目的，根據(jù)kabat編號將氨基酸分配至每個cdr結(jié)構(gòu)域。一旦選擇出可變區(qū)，從合成基因區(qū)段生成它們(integrateddnatechnologies)。使用上面關(guān)于嵌合抗體所述的分子方法克隆和表達人源化抗體。人源化抗體的vl和vh氨基酸序列衍生自相應(yīng)小鼠抗體的vl和vh序列(例如，hsc27.1衍生自小鼠sc27.1)。在生成的四種人源化抗體(hsc27.1、hsc27.22、hsc17.108和hsc27.204)的輕鏈或重鏈可變區(qū)中沒有產(chǎn)生框架改變或回復(fù)突變。為了解決穩(wěn)定性擔憂，使用相同vh1家族中的不同vh框架產(chǎn)生hsc27.22的三種變體。所述變體被稱為hsc27.22-vh1-8;hsc27.22-vh1-46;hsc27.22-vh1-69。此外，構(gòu)建hsc27.108的一種變體，被稱為hsc27.108v1，其與hsc27.108共享相同的重鏈(seqidno:119)，但是與hsc27.108相比在輕鏈上不同。此外，生成hsc27.204的幾種變體，被稱為hsc27.204v1至hsc27.204v15，它們都共享相同的輕鏈(seqidno:120)，但是在重鏈上不同。hsc27.204和hsc27.204v4的重鏈相差單個框架區(qū)突變t28d。hsc27.204v1至hsc27.204v3和hsc27.204v5至hsc27.204v7在cdr中摻入保守突變以解決穩(wěn)定性擔憂。具體地，hsc27.204v1、hsc27.204v2和hsc27.204v3在hsc27.204重鏈背景上分別含有修飾n58k、n58q和t60n。類似地，hsc27.204v5、hsc27.204v6和hsc27.204v7在hsc27.204v4背景上分別含有修飾n58k、n58q和t60n。最后，變體hsc27.204v8和hsc27.204v9在重鏈的位置93處不包括回復(fù)突變，以使免疫原性最小化。具體地，除了變體8-15缺乏a93t回復(fù)突變以外，變體hsc27.204v8、hsc27.204v9、hsc27.204v10、hsc27.204v11、hsc27.204v12、hsc27.204v13、hsc27.204v14和hsc27.204v15分別對應(yīng)于變體hsc27.204、hsc27.204v1、hsc27.204v2、hsc27.204v3、hsc27.204v4、hsc27.204v5、hsc27.2046和hsc27.204v7。另外，構(gòu)建hsc27.22人源化抗體恒定區(qū)的9種變體。第一變體hsc27.22ss1是位點特異性的變體，并在下面實施例8中更詳細地描述。通過用igg2(被稱為“hsc27.22igg2”)或igg4的突變形式(被稱為“hsc27.22igg4r409k”；“hsc27.22igg4s228p”；“hsc27.22igg4s228pk370er409k”；“hsc27.22igg4k370e”；“hsc27.22igg4s228pk370e”；“hsc27.22igg4c127ss228p”；“hsc27.22igg4c127sk370e”；和“hsc27.22igg4c127ss228pk370e”)置換igg同種型，構(gòu)建其它變體。下表4顯示了根據(jù)kabat等人編號的人源化抗cldn抗體及其變體和殘基變化的概述。在每種情況下，檢查人源化抗體的結(jié)合親和力，以確保其基本上等同于相應(yīng)的小鼠抗體。圖3a描繪了示例性人源化抗體及其變體的vl的連續(xù)氨基酸序列。圖3b描繪了示例性人源化抗體及其變體的vh的連續(xù)氨基酸序列?？?cldn人源化抗體的輕鏈和重鏈可變區(qū)的核酸序列提供在圖3c中。表4應(yīng)當理解，每種前述抗體或其免疫反應(yīng)片段可以用于提供根據(jù)本發(fā)明的cldncar結(jié)合結(jié)構(gòu)域。實施例6抗-cldn抗體的特異性表征如實施例3中所述生成的小鼠抗體，以確定它們是否與cldn家族成員和cldn家族成員的直系同源物交叉反應(yīng)。如下進行流式細胞計量術(shù)分析：用如上述實施例4中所述制備的編碼(i)hcldn6、mcldn6和rcldn6；(ii)hcldn9；或(iii)hcldn4、mcldn4和rcldn4的慢病毒載體穩(wěn)定地轉(zhuǎn)導(dǎo)hek-293t細胞。將用上述表達構(gòu)建體穩(wěn)定地轉(zhuǎn)導(dǎo)的1x105個hek-293t細胞與hsc27.1或hsc27.22抗體（在50μl終體積的pbs/2%fcs中稀釋至10μg/ml）一起在4℃溫育30分鐘。溫育后，將細胞用200μlpbs/2%fcs洗滌，通過離心進行沉淀，棄去上清液，并將細胞沉淀物再懸浮于50μl/樣品的在pbs/2%fcs中1:200稀釋的dyelight649標記的山羊-抗-小鼠igg、fc片段特異性的第二抗體中。在4℃溫育15分鐘之后，將細胞如先前所述用pbs/2%fcs洗滌和沉淀兩次，并再懸浮于100μl含有2μg/ml4',6-二脒基-2-苯基吲哚二鹽酸鹽(dapi)的pbs/2%fcs中。通過流式細胞計量術(shù)分析樣品，并針對超過用同種型對照抗體染色的細胞的熒光的熒光用dyelight649評估活細胞。上述流式細胞計量術(shù)測定導(dǎo)致眾多抗-cldn抗體的鑒別。基于所述抗體與特異性地過表達指示的cldn家族成員的細胞系的結(jié)合相對于使用熒光減去一種(fmo)同種型對照(灰色-實心)確定的信號的幾何平均熒光強度的變化(δmfi)，確定交叉反應(yīng)性(圖4a)。因而，兩種hcldn6結(jié)合抗體sc27.1和sc27.22可以描述為封閉蛋白多反應(yīng)性的抗體，因為它們在該測定中與人cldn家族的三個成員(hcldn6、hcldn4和hcldn9)交叉反應(yīng)。sc27.1和sc27.22抗體也結(jié)合cldn4和cldn9的小鼠和大鼠直系同源物(數(shù)據(jù)未顯示)。為了測試各種額外小鼠抗體的結(jié)合cldn家族成員的能力，使用過表達人cldn4、cldn6或clnd9的細胞系進行流式細胞計量術(shù)，所述細胞系已經(jīng)與10μg/ml的純化的第一抗-cldn抗體或小鼠igg2b對照抗體一起溫育，隨后與alexa647抗-小鼠第二抗體一起溫育。如在圖4b中所示，所有抗體都結(jié)合cldn6，但是一些是cldn6特異性的(例如sc27.102、sc27.105和sc27.108)，且其它是多反應(yīng)性的且結(jié)合cldn6和cldn9(例如，sc27.103和sc27.204)或結(jié)合cldn6和cldn4(例如，sc27.104)。因此，對于本發(fā)明的抗體，獲得廣范圍的多反應(yīng)性結(jié)合概況。為了對比多反應(yīng)性的抗-cldn抗體對cldn6和cldn9的表觀結(jié)合親和力，用人源化的抗-cldn抗體hsc27.22的系列稀釋物進行流式細胞計量術(shù)。將抗體連續(xù)稀釋至在50pg/ml至100μg/ml范圍內(nèi)的濃度，并添加至含有過表達cldn6或cldn9的hek-293t細胞的96孔板，并在冰上保持1小時。添加第二抗-人抗體(jacksonimmunoresearch目錄號109-605-098)，并在暗處溫育1小時。將細胞在pbs中洗滌兩次，此后添加fixableviability染料(ebioscience目錄號65-0863-14)保持10分鐘。用pbs額外洗滌后，將細胞用多聚甲醛(pfa)固定，并根據(jù)生產(chǎn)商的說明書在bdfacscantoii流式細胞計上讀出。使用熒光微球(bangslaboratories)根據(jù)生產(chǎn)商的說明書將mfi值歸一化。使用以下方程式，使用關(guān)于抗體與cldn6或cldn9表達細胞的結(jié)合觀察到的歸一化的最大mfi值，將數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換為每種過表達細胞的分數(shù)最大結(jié)合：分數(shù)最大結(jié)合＝(觀察到的歸一化的mfi/最大歸一化的mfi)。然后使用log(抑制劑)相對于graphpadprism軟件包(lajolla,ca)中提供的應(yīng)答模型的四參數(shù)可變斜率曲線擬合，計算hsc27.22對每種細胞系的結(jié)合的表觀ec50值。圖4c表明，人源化的多反應(yīng)性的抗-cldn6抗體hsc27.22具有的對cldn6的表觀ec50與對cldn9的表觀ec50基本上相同(表觀ec50cldn6-3.45μg/ml(擬合優(yōu)度的r2=0.9987，99%置信界限：2.51-4.75μg/ml)；表觀ec50cldn9-4.66μg/ml(擬合優(yōu)度的r2=0.9998，99%置信界限：4.09-5.31μg/ml))。因此，可以定制公開的car的結(jié)合結(jié)構(gòu)域以與選擇的cldn蛋白(例如，cldn6)或與cldn蛋白的組合(例如，cldn6和cldn9)結(jié)合（取決于期望的治療指數(shù)）。實施例7抗-cldn嵌合抗原受體的制備抗-cd19car的制造為了制備陽性對照car構(gòu)建體，合成了編碼針對人cd19的第二代car的合成可讀框(參見us2014/0271635)(lifetechnologies)，并將其亞克隆進慢病毒表達載體pcdh-cmv-mcs-ef1-gfp-t2a-puro(systembiosciences,mountainviewca)的多克隆位點(mcs)中。然后由cmv啟動子驅(qū)動cd19car構(gòu)建體的表達，而雙順反子gfp-t2a-puro可讀框允許通過分析gfp表達(例如，顯微術(shù)或facs)和使用抗生素嘌呤霉素選擇細胞來檢測轉(zhuǎn)導(dǎo)的細胞?？?cd19car可讀框包含這樣的核苷酸，其從5’至3’編碼來自人cd8α鏈的信號前導(dǎo)序列(氨基酸1-21,uniprotaccessionp01732-1)、從識別人cd19的小鼠單克隆抗體衍生出的scfv(nicholson等人,1997;pmid9566763)、人cd8α鉸鏈、跨膜結(jié)構(gòu)域和近側(cè)區(qū)域(氨基酸138-206,uniprotaccessionp01732-1)、來自人4-1bb蛋白的細胞內(nèi)共刺激性信號傳導(dǎo)區(qū)域(氨基酸214-255,uniprotaccessionq07011-1)和人cd3ζ鏈細胞內(nèi)信號傳導(dǎo)區(qū)域(氨基酸52-164,uniprotaccessionp20963-1)。除了提供陽性對照以外，以這樣的方式用限制位點設(shè)計抗-cd19car/慢病毒表達載體：抗-cd19scfv組分可以被容易地除去并用針對任何選定決定簇的替代結(jié)合區(qū)域組分置換。如下所述，使用在圖5中所示的該盒系統(tǒng)(sct1-xx，其中xx指示特定cldn結(jié)合結(jié)構(gòu)域組分)來驗證本發(fā)明的不同實施方案。應(yīng)當指出，取決于上下文，sct命名可以表示表達的抗-cldncar蛋白、表達car蛋白的細胞毒性的淋巴細胞、抗-cldncarorf或包含相同orf的表達載體(例如，慢病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒、質(zhì)粒等)（取決于上下文）。sct1-h27.108的制造為了制備新穎的抗-cldncar構(gòu)建體(sct1-h27.108)，首先如下合成編碼scfv片段的核苷酸序列：經(jīng)由五聚體多聚體glyglyglyglyser(g4s)3(ggggsggggsggggs;seqidno.3)接頭將抗-hsch27.108vl(seqidno.68)和vh(seqidno.70)核苷酸序列可操作地連接在一起以提供hsc27.108-scfv多核苷酸序列：其編碼下面馬上闡述的氨基酸序列：其中scfv包含在seqidno.69中所示的vl氨基酸序列和在seqidno.71中所示的vh氨基酸序列。隨后使用標準的分子工程改造技術(shù)將hsc27.108-scfv核苷酸序列克隆進sct1盒中以提供包含抗-cldncar的sct1-h27.108慢病毒表達載體。在這點上，sct1-27.108car包含從5’至3’編碼以下元件的可讀框：cd8α鏈前導(dǎo)序列區(qū)域(氨基酸1-21,uniprotp01732-1)、h27.108vl結(jié)構(gòu)域(按照實施例5)、(g4s)3合成接頭序列(氨基酸1-15,huston等人,1988)、h27.108vh結(jié)構(gòu)域(按照實施例5)、人cd8α鉸鏈和跨膜結(jié)構(gòu)域(氨基酸138-206,uniprotaccessionp01732-1)、來自人4-1bb蛋白的細胞內(nèi)共刺激性信號傳導(dǎo)區(qū)域(氨基酸214-255,uniprotaccessionq07011-1)和人cd3ζ鏈細胞內(nèi)信號傳導(dǎo)區(qū)域(氨基酸52-164,uniprotaccessionp20963-1)。對car可讀框進行序列確認。sct1-h27.108car可讀框的示意圖顯示在圖5中，對應(yīng)的核酸序列顯示在圖6a(seqidno.8)中，且得到的氨基酸序列顯示在圖6b(seqidno.9)中。sct1-h27.204v2的制造為了制備新穎的抗-cldncar構(gòu)建體(sct1-h27.204v2)，首先如下合成編碼scfv片段的核苷酸序列：經(jīng)由五聚體多聚體glyglyglyglyser(g4s)3(ggggsggggsggggs;seqidno.3)接頭將抗-hsch27.204vl(seqidno.72)和vh(seqidno.86)核苷酸序列可操作地連接在一起以提供hsc27.204v2-scfv多核苷酸序列：其編碼下面馬上闡述的氨基酸序列：其中scfv包含在seqidno.73中所示的vl氨基酸序列和在seqidno.87中所示的vh氨基酸序列。隨后使用標準的分子工程改造技術(shù)將hsc27.204v2-scfv核苷酸序列克隆進sct1盒中以提供包含抗-cldncar的sct1-h27.204v2慢病毒表達載體。在這點上，sct1-27.204v2car包含從5’至3’編碼以下元件的可讀框：cd8α鏈前導(dǎo)序列區(qū)域(氨基酸1-21,uniprotp01732-1)、h27.204vl結(jié)構(gòu)域(按照實施例5)、(g4s)3合成接頭序列(氨基酸1-15,huston等人,1988)、h27.204v2vh結(jié)構(gòu)域(按照實施例5)、人cd8α鉸鏈和跨膜結(jié)構(gòu)域(氨基酸138-206,uniprotaccessionp01732-1)、來自人4-1bb蛋白的細胞內(nèi)共刺激性信號傳導(dǎo)區(qū)域(氨基酸214-255,uniprotaccessionq07011-1)和人cd3ζ鏈細胞內(nèi)信號傳導(dǎo)區(qū)域(氨基酸52-164,uniprotaccessionp20963-1)。對car可讀框進行序列確認。sct1-h27.204v2car可讀框的示意圖顯示在圖5中，對應(yīng)的核酸序列顯示在圖6c(seqidno.10)中，且得到的氨基酸序列顯示在圖6d(seqidno.11)中。實施例8慢病毒載體顆粒的制備和表征如下進行sct1-h27.108和sct1-h27.204v2的慢病毒載體包裝：在有聚乙烯亞胺(polysciences)存在下，以1:4的dna:pei比率將10ugsct1-h27.108或sct1-h27.204v2質(zhì)粒、7ugpδr8.74和4ugpmd2.g共轉(zhuǎn)染進1000萬個hek-293t細胞(atcc)中。將共轉(zhuǎn)染的細胞在37℃(5%co2)溫育過夜，隨后在次日更換培養(yǎng)基。轉(zhuǎn)染后48小時，將含有慢病毒顆粒的培養(yǎng)基收獲并通過在4℃在1200rpm離心5min進行澄清以除去細胞碎片。為了沉淀慢病毒載體顆粒，將澄清的培養(yǎng)基在4℃在19500rpm超速離心2小時。超速離心以后，拋棄上清液，將病毒沉淀物再懸浮于無菌pbs中，并在-80℃儲存。通過p24elisa(cellbiolabs)評估回收的慢病毒載體儲備物的定量，并通過標準慢病毒載體滴定方法評估基因轉(zhuǎn)移效率(功能滴度)。慢病毒載體儲備物的通常收率是在7-15ug/mlp24抗原范圍內(nèi)，且功能滴度是在1-3x10e8tu/ml范圍內(nèi)。將sct1-h27.108和sct1-27.204v2慢病毒載體儲備物冷凍和儲存直到使用。如在以后的實施例中所述，可以使用載體儲備物來制備敏化的淋巴細胞和誘導(dǎo)期望的免疫應(yīng)答，如貫穿本申請詳細討論的和在隨文附帶的圖7中示意地顯示的。實施例9表達sct1-h27.108和sct1-h27.204v2car構(gòu)建體的t淋巴細胞的制備通過在有10ug/ml聚凝胺(emdmillipore)存在下以約4的感染復(fù)數(shù)(moi)用來自以前實施例的sct1-h27.108或sct1-h27.204v2慢病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)100萬個jurkate6-1(atcc)t淋巴細胞以確保有效的病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)，制備表達sct1-h27.108或sct1-h27.204v2的cldn靶標特異性的jurkat淋巴細胞。將所述細胞在有慢病毒顆粒存在下在37℃(5%co2)溫育72小時。然后，將用過的培養(yǎng)基用含有2ug/ml嘌呤霉素(lifetechnologies)的新鮮培養(yǎng)基替換以陽性地選擇表達sct1-h27.108或sct1-h27.204v2的細胞。將細胞在有嘌呤霉素存在下溫育另外5天，然后通過流式細胞計量術(shù)推斷抗-cldnscfv在細胞表面上的存在(圖8a)。更具體地，然后將表達sct1-h27.108或sct1-h27.204v2的經(jīng)轉(zhuǎn)導(dǎo)的jurkat細胞和未轉(zhuǎn)導(dǎo)的對照細胞如本文中所述沉淀、洗滌并再懸浮于緩沖液中。然后在bdfacscantoii流式細胞計上按照生產(chǎn)商的說明書分析制品以檢測gfp的存在，并因此推斷sct1-h27.108或sct1-h27.204的表達，如在圖8a中所示。還使用流式細胞計量術(shù)檢測hcldn6蛋白在過表達hcldn6的經(jīng)工程改造的hek-293t細胞系的表面上的存在(圖8b)，所述hcldn6用于表征本發(fā)明的car構(gòu)建體。在這點上，將hek-293t母代細胞或過表達hcldn6的hek-293t細胞收獲并用維爾烯（versene）(lifetechnologies)分離成單細胞懸浮液。將分離的細胞如上所述洗滌，并在4℃在暗處與1微克抗-cldn6抗體一起溫育30分鐘，然后在pbs/2%fcs中洗滌3次。然后將細胞與50μl/樣品的alexafluor-647標記的山羊-抗-小鼠igg、fc片段特異性的第二抗體(lifetechnologies)（在pbs/2%fcs中1:200稀釋）一起溫育30分鐘，用pbs/2%fcs洗滌3次，并再懸浮于含有dapi(以檢測死細胞)的pbs/2%fcs中。然后在bdfacscantoii流式細胞計上按照生產(chǎn)商的說明書分析細胞，以提供圖8b所示的數(shù)據(jù)集。圖8a和8b分別證實，sct1-h27.108和sct1-h27.204v2在轉(zhuǎn)導(dǎo)的jurkatt淋巴細胞上表達，但是不在未轉(zhuǎn)導(dǎo)的jurkat細胞上表達，并且人cldn6蛋白在經(jīng)工程改造的hek-293t細胞上表達，但是不在hek-293t-原初細胞上表達。實施例10jurkat-sct1-h27.108或sct1-h27.204v2t淋巴細胞在接觸表達hcldn的細胞后誘導(dǎo)il-2產(chǎn)生通過測量il-2誘導(dǎo)（其指示car介導(dǎo)的t-細胞活化），針對靶標特異性的活性評估轉(zhuǎn)導(dǎo)的jurkat-sct1-h27.108或sct1-h27.204v2淋巴細胞。更具體地，使用來自以前實施例的轉(zhuǎn)導(dǎo)的jurkat淋巴細胞和經(jīng)工程改造的表達hcldn6的293t細胞，監(jiān)測il-2水平以證實，表達car的淋巴細胞被活化并且在與表達hcldn6的細胞接觸后引起免疫應(yīng)答。在這點上，將實施例9的jurkat-sct1-h27.108或sct1-h27.204v2淋巴細胞與hek-293t細胞共培養(yǎng)，所述hek-293t細胞被工程改造成在細胞表面上過表達hcldn6抗原（如通過流式細胞計量術(shù)所證實的）。在圖9a所示的描述的淋巴細胞與靶細胞(l:t)比率執(zhí)行淋巴細胞與靶標hek-293t-hcldn細胞一起的共培養(yǎng)以評估劑量應(yīng)答和確定最大il-2產(chǎn)量條件。將共培養(yǎng)物在37℃(5%co2)溫育48小時，在此時將培養(yǎng)基收獲并通過在1200rpm離心5分鐘來澄清細胞碎片。然后針對il-2產(chǎn)量通過elisa(thermoscientific)按照生產(chǎn)商的說明書評估澄清的上清液。為了評估背景il-2產(chǎn)量，將未轉(zhuǎn)導(dǎo)的jurkat細胞(jurkat-原初)與hek-293t-hcldn細胞一起共培養(yǎng)。如圖9b所示的數(shù)據(jù)集證實的，在暴露于表達hcldn6的細胞后促使jurkat-sct1-h27.108或sct1-h27.204v2淋巴細胞以濃度依賴性的方式生產(chǎn)il-2。這樣的il-2產(chǎn)生指示sct1car在識別表達hcldn6的細胞(包括表達hcldn的致瘤性細胞)上的cldn抗原后實現(xiàn)的t-細胞活化?？捎^察的il-2產(chǎn)生在含有hek-293t-cldn和未轉(zhuǎn)導(dǎo)的jurkat細胞的共培養(yǎng)物中的缺乏，進一步闡明了特異性的car介導(dǎo)的jurkat細胞活化(圖9b)。如以前提及的，用于產(chǎn)生這種期望免疫應(yīng)答的方法（如貫穿本申請詳細討論的）示意地顯示在隨文附帶的圖7中。實施例11表達sct1-h27.108或sct1-h27.204v2car構(gòu)建體的t淋巴細胞的制備為了證實公開的car可以用于提供敏化的淋巴細胞，使用人cd3陽性選擇試劑盒(stemcelltechnologies)從商購可得的外周血單核細胞制品(pbmc：所有細胞)分離原代人cd3+t淋巴細胞。pbmc得自兩種不同的供體(供體1和供體2)。分離后，在含有10%熱滅活的胎牛血清(hyclone)、1%青霉素/鏈霉素(corning)、1%l-谷氨酰胺(corning)和10mmhepes(corning)的rpmi培養(yǎng)基中培養(yǎng)cd3+t細胞。將t淋巴細胞在有cd3/cd28活化珠子(dynabeads)存在下以1:5比率在37℃(5%co2)溫育進行活化。隔日加入il-2(peprotech)至50iu/ml的終濃度。初次活化以后24小時，通過在有10ug/ml聚凝胺(emdmillipore)存在下用sct1-h27.108或sct1-h27.204v2慢病毒載體(基本上如實施例8所述制備)以約5的感染復(fù)數(shù)(moi)轉(zhuǎn)導(dǎo)100萬個t細胞以確保有效的病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)，制備cldn靶標特異性的表達sct1-h27.108或sct1-h27.204v2的t淋巴細胞。將細胞在有慢病毒顆粒存在下在37℃(5%co2)溫育72小時，然后通過流式細胞計量術(shù)評估抗-cldncar表面表達(圖10)。如下執(zhí)行表達sct1-h27.108或sct1-h27.204v2的轉(zhuǎn)導(dǎo)的t淋巴細胞以及不攜帶car的t淋巴細胞對照細胞的流式細胞計量術(shù)分析：將每種樣品的106個細胞收獲并通過在1200rpm在4℃離心5分鐘進行沉淀；除去上清液并將沉淀物在冷pbs/2%fcs中洗滌2次。除去來自最后一次洗滌的上清液以后，為了直接檢測car在細胞表面處的存在，將細胞沉淀物再懸浮于含有1微克alexafluor?647-綴合的affinipure山羊抗-人igg,f(ab’)抗體(jacksonimmunoresearch)的100微升pbs/2%fcs中。將細胞在暗處在4℃溫育30分鐘。溫育以后，將細胞在pbs/2%fcs中洗滌3次，然后再懸浮于含有dapi(以檢測活細胞)的pbs/2%fcs中。然后在bdfacscantoii流式細胞計上按照生產(chǎn)商的說明書分析細胞以提供圖10所示的數(shù)據(jù)集。圖10清楚地表明，sct1-h27.108或sct1-h27.204v2都在轉(zhuǎn)導(dǎo)的原代t淋巴細胞(即，敏化的淋巴細胞)上表達，但是不在未轉(zhuǎn)導(dǎo)的淋巴細胞上表達。實施例12表達cldn靶抗原的細胞的制備和表征如在實施例9中所述，使用流式細胞計量術(shù)來檢測cldn蛋白在經(jīng)工程改造的過表達人cldn6的hek-293t細胞系的表面上的存在。類似地，使用流式細胞計量術(shù)來證實人cldn在患者衍生的xenograph(pdx)腫瘤細胞系(ov78)上的表達。人工工程改造的293t細胞系和衍生的卵巢癌細胞系可以用于表征本發(fā)明的敏化的淋巴細胞。更具體地，將過表達人cldn6的hek-293t細胞(293t-cldn)收獲并用維爾烯(lifetechnologies)分離成單細胞懸浮液。類似地，使用腫瘤解離試劑盒(myltenibiotec)將新鮮收獲的ov78pdx腫瘤處理成單細胞懸浮液。將分離的細胞如本文中所述進行洗滌，并與1微克抗-cldn抗體(sc27.22)或同種型對照一起在4℃在暗處溫育30分鐘，然后在pbs/2%fcs中洗滌3次。然后將細胞與50微升/樣品的alexafluor-647標記的山羊-抗-小鼠igg、fc片段特異性的第二抗體(lifetechnologies)（在pbs/2%fcs中1:200稀釋）一起溫育30分鐘，用pbs/2%fcs洗滌3次，并再懸浮于含有dapi(以檢測活細胞)的pbs/2%fcs中。然后在bdfacscantoii流式細胞計上按照生產(chǎn)商的說明書分析細胞以提供在圖11a和11b中所示的數(shù)據(jù)集。得到的數(shù)據(jù)表明，人cldn蛋白在經(jīng)工程改造的hek-293t細胞(圖11a)和ov78pdx腫瘤細胞(圖11b)上表達。實施例13t淋巴細胞-sct1-h27.108或sct1-h27.204v2在接觸表達cldn的細胞后誘導(dǎo)細胞因子產(chǎn)生通過測量與表達cldn的靶細胞接觸后的ifnγ和tnfα誘導(dǎo)，針對靶標特異性的活化評估包含sct1-h27.108或sct1-h27.204v2的敏化的淋巴細胞。應(yīng)當理解，細胞因子產(chǎn)生(例如，tnfα和ifnγ誘導(dǎo))指示能夠誘導(dǎo)抗腫瘤免疫應(yīng)答的活性嵌合抗原受體。為了評估靶標特異性的(即cldn)活化，將敏化的淋巴細胞（包含來自兩種不同供體的宿主細胞）暴露于cldn+293t細胞和表達cldn的卵巢癌細胞(二者來自實施例11)。更具體地，基本上如上所述使用來自兩種不同供體(供體1和供體2)的pmbc制品提供cd3+t淋巴細胞制品。然后基本上如實施例11所述將各種淋巴細胞制品用sct1-h27.108或sct1-h27.204v2轉(zhuǎn)導(dǎo)以提供供體1和供體2cldn敏化的淋巴細胞制品(與作為對照的未轉(zhuǎn)導(dǎo)的淋巴細胞一起)。然后將每種敏化的淋巴細胞制品(與對照一起)與293t-cldn或ov78pdx靶細胞一起以3:1的效應(yīng)物與靶標(e:t)比率共培養(yǎng)。將共培養(yǎng)物在37℃(5%co2)溫育48小時，在此時將培養(yǎng)基收獲并通過在1200rpm離心5分鐘來澄清細胞碎片。然后針對tnfα產(chǎn)量通過elisa(thermofisher)和針對ifnγ通過elisa(invitrogen)按照生產(chǎn)商的說明書評估澄清的上清液。將得到的ifnγ和tnfα的水平的測量結(jié)果分別顯示在圖12a和12b(ifnγ))和圖13a和13b(tnfα)中。在兩種情況下，較高的細胞因子產(chǎn)量指示更穩(wěn)健的car+群體活化。如圖12a(293細胞)和12b(腫瘤細胞)以及圖13a(293細胞)和13b(腫瘤細胞)所示的數(shù)據(jù)集證實的，在暴露于經(jīng)工程改造的和腫瘤衍生的表達人cldn的細胞后，促進攜帶sct1-h27.108或sct1-h27.204v2的t淋巴細胞生產(chǎn)tnfα和ifnγ，而不攜帶car的t淋巴細胞在與相同靶細胞共培養(yǎng)時表現(xiàn)出微小的tnfα和ifnγ誘導(dǎo)。這證實了本發(fā)明的cldn敏化的淋巴細胞是有活性的，且能夠在暴露于cldn+腫瘤細胞后產(chǎn)生免疫刺激性信號。實施例14sct1-h27.108或sct1-h27.204v2-t淋巴細胞對表達cldn的體外細胞的靶向殺傷為了證實cldn敏化的淋巴細胞以靶標特異性的方式殺傷細胞的能力，將本發(fā)明的car轉(zhuǎn)導(dǎo)的細胞暴露于經(jīng)工程改造的293細胞和表達cldn的腫瘤細胞(各自來自實施例12)。暴露后，計算剩余的活靶細胞的數(shù)目，結(jié)果顯示在圖14a(293細胞)和14b(腫瘤細胞)中。更具體地，將sct1-h27.108或sct1-h27.204v2敏化的淋巴細胞(按照實施例11用來自兩種供體的宿主細胞制備)與293t-cldn或ov78pdx細胞一起以3:1的效應(yīng)物與靶標(e:t)比率共培養(yǎng)(應(yīng)當指出，由于測定條件，暴露于ov78細胞的供體1淋巴細胞的活性的測量結(jié)果是不確定的)。將共培養(yǎng)物在37℃(5%co2)溫育48小時，然后確定剩余的存活的攜帶cldn的細胞。如下計算活細胞的百分比：將共培養(yǎng)物如本文中所述收獲和洗滌，然后與1微克抗-cldn抗體或同種型對照一起在4℃在暗處溫育30分鐘，隨后在pbs/2%fcs中洗滌3次。然后將細胞與50微升/樣品的alexafluor-647標記的山羊-抗-小鼠iggfc片段-特異性的第二抗體(lifetechnologies)（在pbs/2%fcs中1:200稀釋）一起溫育30分鐘。將細胞用pbs/2%fcs洗滌3次，隨后重新懸浮在200微升含有dapi(lifetechnologies)（用于細胞生存力鑒別）和10000個絕對計數(shù)珠子(lifetechnologies)（用于歸一化細胞計數(shù)）的pbs/2%fcs中。通過定量每7500個收集的絕對計數(shù)珠子的存活的攜帶cldn的細胞的各自數(shù)目，在bdfacscantoii流式細胞計上執(zhí)行剩余的存活的攜帶cldn的靶細胞的分析和計數(shù)。在有不攜帶car的t淋巴細胞存在下剩余的存活的靶細胞的數(shù)目用作基準來對比sct1-h27.108或sct1-h27.204v2敏化的淋巴細胞對攜帶cldn的細胞的靶標特異性殺傷。如在圖14a(293細胞)和14b(腫瘤細胞)中所示，293t-cldn6細胞表現(xiàn)出對sct1-h27.108-t淋巴細胞或sct1-h27.204-t淋巴細胞實現(xiàn)的細胞裂解的顯著易感性，大于70%的靶細胞被消除。重要的是，當在有ov78pdx腫瘤細胞存在下培養(yǎng)攜帶抗-cldn6car的t淋巴細胞時，證實了類似的結(jié)果，其中大約50%的ov78細胞被消除?？傊?，這些數(shù)據(jù)證實了通過sct1-h27.108和sct-h27.204car的cldn6特異性識別對表達cldn6的細胞的活化和殺傷。本領(lǐng)域技術(shù)人員進一步明白，本發(fā)明可以以其它具體形式體現(xiàn)，而不背離其精神或中心屬性。因為本發(fā)明的前述描述僅僅公開了其示例性實施方案，應(yīng)當理解，預(yù)見到其它變體是在本發(fā)明范圍內(nèi)。因此，本發(fā)明不限于已經(jīng)在本文中詳細描述的特定實施方案。相反，應(yīng)當提及所附權(quán)利要求作為本發(fā)明的范圍和內(nèi)容的指示。當前第1頁12