本發(fā)明涉及源于hsp70的肽，更具體而言，涉及通過與人白血球抗原結(jié)合而向t細胞呈遞抗原的免疫原性肽、使用所述肽的用于治療或預(yù)防癌癥的醫(yī)藥組合物、免疫誘導(dǎo)劑及抗原呈遞細胞的制造方法等。

背景技術(shù)：

盡管可認為生物體內(nèi)常偶然產(chǎn)生癌細胞，但推測認為：通常，會發(fā)生因自然免疫導(dǎo)致的對源于癌細胞的特異性癌抗原的排斥反應(yīng)，接著，特異性免疫應(yīng)答被誘導(dǎo)出來，發(fā)生通過淋巴細胞等進行的對癌細胞的排斥反應(yīng)。

為了使得源于癌細胞的抗原能被識別，細胞表面上存在的人白血球抗原(hla)與淋巴細胞形成復(fù)合體是必需的。主要組織相容性抗原即hla分子可被大致分類為i類分子(hla-a型、b型、c型)和ii類分子(hla-dp型、dq型、dr型)。細胞毒性t細胞(ctl)引起的癌細胞排斥反應(yīng)是通過癌細胞表面的hlai類分子所呈遞的由8～11個氨基酸組成的癌抗原(ctl表位)被ctl上的t細胞抗原受體(tcr)特異性識別而誘導(dǎo)出的。

目前，出于將免疫原性肽應(yīng)用于治療或預(yù)防各種免疫相關(guān)疾病的期望而進行了各種研究，例如，日本特開平8-151396號公報中，記載了由特定氨基酸序列構(gòu)成的寡肽具有hla結(jié)合性。

現(xiàn)有技術(shù)文獻

專利文獻

專利文獻1：日本特開平8-151396號公報

技術(shù)實現(xiàn)要素：

盡管已知多種具有hla結(jié)合性的肽，但仍有對可用于對各種癌癥進行治療或預(yù)防的肽的需求。另外，hla是多態(tài)性豐富的基因，因此，對應(yīng)于多種hla基因型的多型性(multi-type)免疫原性肽也是人們所需要的。

用于解決課題的手段

本發(fā)明是鑒于上述情況而完成的，其目的在于，提供與hlai類分子結(jié)合的免疫原性肽、尤其是能夠誘導(dǎo)ctl的肽、使用所述肽的用于治療或預(yù)防癌癥的醫(yī)藥組合物、免疫誘導(dǎo)劑、及抗原呈遞細胞的制造方法等。

即，本發(fā)明包含以下的發(fā)明。

(1)一種肽，其含有序列號1～15中的任一項表示的氨基酸序列中連續(xù)8個以上的氨基酸殘基，并且，所述肽由11個以下的氨基酸殘基構(gòu)成。

(2)如(1)所述的肽，其中，所述氨基酸序列中，1個或多個氨基酸被取代、插入、缺失或添加，并且，所述肽具有免疫原性。

(3)如(2)所述的肽，其中，所述氨基酸序列中的第2位的氨基酸被酪氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸、纈氨酸、亮氨酸或谷氨酰胺取代，以及/或者，c末端的氨基酸被苯丙氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、色氨酸、甲硫氨酸或纈氨酸取代。

(4)用于治療或預(yù)防癌癥的醫(yī)藥組合物，其含有(1)～(3)中任一項所述的肽。

(5)如(4)所述的醫(yī)藥組合物，所述醫(yī)藥組合物為疫苗的形式。

(6)如(4)或(5)所述的醫(yī)藥組合物，其中，所述肽能夠與1種或多種類型的hla分子結(jié)合。

(7)免疫誘導(dǎo)劑，其含有(1)～(3)中任一項所述的肽。

(8)如(7)所述的免疫誘導(dǎo)劑，用于誘導(dǎo)細胞毒性t細胞。

(9)如(7)或(8)所述的免疫誘導(dǎo)劑，其中，所述肽能夠與1種或多種類型的hla分子結(jié)合。

(10)具有ctl誘導(dǎo)活性的抗原呈遞細胞的制造方法，所述方法包括使(1)～(3)中任一項所述的肽與抗原呈遞細胞體外(invitro)接觸的工序。

發(fā)明的效果

近年來，作為癌癥的治療方法，免疫療法備受矚目。本發(fā)明的肽因其hla結(jié)合性高、ctl誘導(dǎo)能力強，因此其作為癌癥疫苗的有用性被高度期待。另外，還預(yù)計其可應(yīng)用于各種免疫療法、尤其是樹突細胞療法中。

熱休克蛋白(hsp，heatshockprotein)家族作為分子伴侶，與蛋白質(zhì)的折疊、運輸、修飾、保護等多種細胞功能相關(guān)(zugeluandkaufmannsh:roleofheat-shockproteinsinprotectionfromandpathogenesisofinfectiousdiseases.clinmicrobiolrev12:19-39,1999.)。hsp根據(jù)其分子大小而被分類成hsp110、hsp90、hsp70、hsp60、hsp40、hsp28、hsp27及hsp25這8個家族。進一步地，隨著知曉hsp與細胞死亡(凋亡)相關(guān)，而將其大致上分為抑制凋亡的組和誘導(dǎo)凋亡的組這兩大類。

hsp70是抑制凋亡的熱休克蛋白，已發(fā)現(xiàn)，hsp70的高水平表達與細胞在例如細胞的癌化等各種情況下的生存有關(guān)。實際上，已有報道稱作為本發(fā)明的肽的來源的hsp70蛋白在多種癌癥中表達。

(例如，

1.yoshidaetal.,anticancerres.2009feb；29(2):539-44

2.cioccadr,clarkgm,tandonak,fuquasa,welchwjandmcguirewl:heat-shockproteinhsp70inpatientswithaxillarylymphnode-negativebreastcancer:prognosticimplications.jnatlcancerinst85:570-574,1993

3.kaurjandralhanr:differentialexpressionof70-kdaheatshockproteininhumanoraltumorigenesis.intjcancer63:774-779,1995

4.parkcs,joois,songsy,kimds,baedsandleejh:animmunohistochemicalanalysisofheat-shockprotein70,p53,andestrogenreceptorstatusincarcinomaoftheuterinecervix.gynecoloncol74:53-60,1999

5.cornfordpa,dodsonar,parsonskf,desmondad,woolfendena,fordhamm,neoptolemosjp,keyandfosterc:heat-shockproteinexpressionindependentlypredictsclinicaloutcomeinprostatecancer.cancerres60:7099-7105,2000

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7.chumam,sakamotom,yamazakik,ohtat,ohkim,asakamandhirohashis:expressionprofilinginmultistagehepatocarcinogenesis:identificationofhsp70asamolecularmarkerofearlyhepatocellularcarcinoma.hepatology37:198-207,2003

8.castlepe,ashfaqr,ansarifandmullercy:immunohistochemicalevaluationofheat-shockproteinsinnormalandpreinvasivelesionsofthecervix.cancerlett229:245-252,2005

9.kurahashit,miyakeh,haraiandfujisawam:expressionofmajorheat-shockproteinsinprostatecancer:correlationwithclinicopathologicaloutcomesinpatientsundergoingradicalprostatectomy.jurol177:757-761,2007.)

另外，本發(fā)明的肽中，一些特定的肽能夠與多種類型的hla結(jié)合。由此，通過本發(fā)明的肽，得以提供涵蓋范圍極廣的癌患者群體的癌癥疫苗、樹突細胞療法等。

附圖說明

圖1示出了用序列號7、9或15的肽對來自接受了hsp70樹突細胞療法的肝癌患者(hla基因型：02:01/24:02)的試樣進行刺激的情況下的elispot檢驗的結(jié)果(ifn-γ產(chǎn)生細胞數(shù))。

圖2示出了用序列號7、9或15的肽對來自接受了hsp70樹突細胞療法的肝癌患者(hla基因型：02:01/33:03)的試樣進行刺激的情況下的elispot檢驗的結(jié)果(ifn-γ產(chǎn)生細胞數(shù))。

圖3示出了用序列號7、9或15的肽對來自接受了hsp70樹突細胞療法的肝癌患者(hla基因型：02:06/24:02)的試樣進行刺激的情況下的elispot檢驗的結(jié)果(ifn-γ產(chǎn)生細胞數(shù))。

圖4示出了用序列號7、9或15的肽對來自接受了hsp70樹突細胞療法的肝癌患者(hla基因型：24:02/26:01)的試樣進行刺激的情況下的elisa檢驗的結(jié)果(ifn-γ產(chǎn)生細胞數(shù))。

圖5示出了用序列號5、6、7、9、10或15的肽對來自接受了hsp70樹突細胞療法的肝癌患者(hla基因型：24:02/26:01)的試樣進行刺激的情況下的elisa檢驗的結(jié)果(ifn-γ產(chǎn)生細胞數(shù))。

圖6示出了用序列號5、6、7、9或10的肽對來自接受了hsp70樹突細胞療法的肝癌患者(hla基因型：24:02/24:02)的試樣進行刺激的情況下的elisa檢驗的結(jié)果(ifn-γ產(chǎn)生細胞數(shù))。

具體實施方式

1.免疫原性肽

本發(fā)明涉及的肽含有序列號1～15中的任一項表示的氨基酸序列中連續(xù)8個以上的氨基酸殘基，并且，由總共11個以下、優(yōu)選為10個以下、更優(yōu)選為9個以下的氨基酸殘基構(gòu)成。本發(fā)明的肽可以是由序列號1～15中的任一項表示的氨基酸序列構(gòu)成的肽。本發(fā)明的肽源于作為熱休克蛋白(heatshockprotein)之一的hsp70?；跇?gòu)成hsp70的氨基酸序列通過使用主動學(xué)習(xí)實驗法(activelearningexperiment)(日本特開平8-151396號)得到的假定理論預(yù)測的與hla分子的結(jié)合性換算為-logkd值為3以上的氨基酸序列被選出。

構(gòu)成本發(fā)明的肽的氨基酸序列及它們的hla預(yù)測結(jié)合分值示于下表1。

[表1]

本發(fā)明的肽具有hla結(jié)合性，且具有免疫原性(后文中有時簡稱為“hla肽”或“免疫原性肽”)。在本說明書中使用時，“免疫原性”表示能夠誘導(dǎo)免疫反應(yīng)的特性，例如，具有ctl誘導(dǎo)活性、從而具有對癌細胞的細胞損傷活性。

在優(yōu)選的實施方式中，本發(fā)明的肽是能夠與hla-a基因a的等位基因型中的多種結(jié)合的多型性hla肽。例如，序列號7的肽能與hla-a＊24:02基因的產(chǎn)物(hla-a＊24:02分子)、hla-a＊0201基因的產(chǎn)物(hla-a＊02:01分子)及hla-a＊02:06基因的產(chǎn)物(hla-a＊02:06分子)牢固地結(jié)合，并且具有高的免疫原性。

本發(fā)明的肽能夠結(jié)合的hla亞型不限于hla-a＊24:02、hla-a＊02:01及hla-a＊02:06。然而，鑒于上述hla亞型已涵蓋了東亞人群(包括日本人)的85％左右、及西方人群的55％左右，因此，可認為本發(fā)明的多型性hla肽在免疫療法等中具有廣泛的患者覆蓋率。

對于本發(fā)明的肽而言，只要保持免疫原性，構(gòu)成序列號1～15的氨基酸序列的氨基酸殘基或其一部分也可以是經(jīng)修飾的。盡管以序列號1～15所示的氨基酸序列來表現(xiàn)在抗原呈遞細胞上呈遞的狀態(tài)，但在將本發(fā)明的肽直接施予至體內(nèi)的情況下，有可能因施予途徑而導(dǎo)致肽經(jīng)歷在消化器官等中其末端被消化等變化。因此，本發(fā)明的肽在被抗原呈遞細胞攝入之前也可以以在n末端及/或c末端添加有1個或多個氨基酸殘基等的前體的狀態(tài)存在，從而使得其在抗原呈遞細胞上與規(guī)定的hlai類分子結(jié)合時得以保持序列號1～15表示的氨基酸殘基。

進一步地，本發(fā)明的肽只要具有所期望的免疫原性即可，構(gòu)成本發(fā)明的肽的1個或多個的氨基酸殘基可被取代、插入、缺失或添加，以及/或者，經(jīng)糖鏈添加、側(cè)鏈氧化、及/或磷酸化等修飾。本說明書中，“氨基酸”取其最為寬泛的含義，除了天然氨基酸以外，也包含人工的氨基酸突變體、衍生物。本說明書中，就氨基酸而言，可舉出天然蛋白質(zhì)性的l-氨基酸；d-氨基酸；氨基酸突變體及衍生物等經(jīng)過化學(xué)修飾的氨基酸；正亮氨酸、β-丙氨酸、鳥氨酸等的天然非蛋白質(zhì)性氨基酸；及具有本領(lǐng)域中已知的作為氨基酸特征的特性的以化學(xué)方式合成的化合物等。作為非天然氨基酸的例子，可舉出α-甲基氨基酸(α-甲基丙氨酸等)、d-氨基酸、類組氨酸的氨基酸(β-羥基-組氨酸、高組氨酸、α-氟甲基-組氨酸及α-甲基-組氨酸等)、在側(cè)鏈具有額外亞甲基的氨基酸(“高(homo)”氨基酸)及側(cè)鏈中的羧酸官能團被磺酸基取代的氨基酸(半胱氨酸等)。

關(guān)于氨基酸殘基的取代等，本領(lǐng)域技術(shù)人員在考慮到對hla顯示出結(jié)合性的肽序列的規(guī)則性(j.immunol.,152:p3913,1994；immunogenetics,41:p178,1995；j.immunol.,155:p4307,1994)的基礎(chǔ)上，可以以合適的方式對構(gòu)成本發(fā)明的肽的氨基酸殘基進行取代。

更具體而言，對于與hla-a＊24:02分子結(jié)合的肽而言，構(gòu)成肽的第2位氨基酸可被酪氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸或色氨酸取代，以及/或者，c末端的氨基酸可被苯丙氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、色氨酸或甲硫氨酸取代。另外，對于與hla-a＊02:01分子結(jié)合的肽而言，第2位氨基酸可被亮氨酸或甲硫氨酸取代，以及/或者c末端的氨基酸可被纈氨酸或亮氨酸取代。此外，對于與hla-a＊02:06分子結(jié)合的肽而言，第2位氨基酸可被纈氨酸或谷氨酰胺取代，并且/或者c末端的氨基酸可被纈氨酸或亮氨酸取代。

本發(fā)明的肽均可使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法來制造。例如，可利用fmoc法、tboc法等固相法或液相法進行人工合成。另外，也可通過使編碼本發(fā)明的肽的多核苷酸或含有該多核苷酸的重組載體表達來制造所期望的肽。另外，這樣得到的肽均可使用領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法來鑒定。例如，可使用edman降解法、質(zhì)譜法等進行鑒定。

2.醫(yī)藥組合物

本發(fā)明涉及的用于治療或預(yù)防癌癥的醫(yī)藥組合物中，含有例如下述的肽作為有效成分，所述肽含有選自由序列號1～15組成的組中的1種以上氨基酸序列中連續(xù)8個以上的氨基酸殘基，并且由總共11個以下、優(yōu)選為10個以下、更優(yōu)選為9個以下的氨基酸殘基構(gòu)成。醫(yī)藥組合物中含有的肽也可以是由序列號1～15中的任一項表示的氨基酸序列構(gòu)成的。所述肽如上文所定義。

本發(fā)明的肽通過被呈遞于抗原呈遞細胞上而誘導(dǎo)ctl，該被誘導(dǎo)的ctl殺傷癌細胞。因此，本發(fā)明的醫(yī)藥組合物中的有效成分不僅限于本發(fā)明的肽，也可以是能夠直接或間接誘導(dǎo)ctl的成分、例如編碼該肽的多核苷酸或者含有所述多核苷酸的載體、或?qū)⒃撾呐chla分子的復(fù)合體呈遞至表面的抗原呈遞細胞或由抗原呈遞細胞分泌的外來體(exosome)、或它們的組合。作為使用的抗原呈遞細胞，可舉出巨噬細胞、樹突細胞等，優(yōu)選使用ctl誘導(dǎo)能力高的樹突細胞。本發(fā)明的醫(yī)藥組合物中也可含有已知用于癌癥治療的其他成分、例如趨化因子、細胞因子、腫瘤壞死因子、化療劑等。對于肽的用量而言，例如，患者為成年人的情況下，可以為每天約1～10mg。但是，鑒于用量可能因患者的年齡、體重、施予方法等而變動，因此，其可由本領(lǐng)域技術(shù)人員適當(dāng)決定。

認為本發(fā)明的醫(yī)藥組合物通過下述作用機理而在癌細胞的殺傷等方面有用(但這并非意圖對本發(fā)明進行限定)：通過向特定的癌患者施予本發(fā)明的醫(yī)藥組合物，醫(yī)藥組合物中的肽以與hla分子結(jié)合的狀態(tài)被呈遞至抗原呈遞細胞表面。這樣的抗原呈遞細胞上的肽被識別后，ctl活化、增殖并進入全身循環(huán)。肽特異性的ctl侵入癌組織后，會識別與位于癌細胞的表面hla分子本來自然結(jié)合的源于特異性癌抗原的同樣的肽，從而殺傷該癌細胞。通過這樣的機理而能夠有助于對癌癥的治療。

除了對癌癥的治療以外，本發(fā)明的醫(yī)藥組合物也可用于對癌癥的預(yù)防。例如，通過將本發(fā)明的醫(yī)藥組合物施予至健康的人體，可誘導(dǎo)出ctl，誘導(dǎo)出的細胞毒性t細胞在體內(nèi)蓄積，從而能夠在特定癌細胞產(chǎn)生時損傷該癌細胞。同樣地，通過施予至癌癥治療后的人體，也可預(yù)防癌癥的復(fù)發(fā)。

作為治療或預(yù)防的癌癥，預(yù)計為表達hsp70的任何癌癥?？筛唧w地，胰腺癌、肝細胞癌、前列腺癌、肺癌、乳癌、大腸癌、血液癌、腦腫瘤、腎癌、皮膚癌等可作為對象被舉出(但這并非意圖對本發(fā)明進行限定)。例如，作為本發(fā)明的肽的來源的hsp70在肝細胞癌中過量表達，因此，可認為本發(fā)明的肽尤其對于肝細胞癌癥的治療或預(yù)防有效。存在有多種需要治療或預(yù)防的癌癥的情況下，可以在本發(fā)明的醫(yī)藥組合物中含有多種免疫原性肽等有效成分。

本發(fā)明的醫(yī)藥組合物可被溶解于水溶性溶劑、以制藥上允許的鹽的形式制劑化之后施予至患者。作為這樣的制藥上允許的鹽的形式，可舉出以生理上可接受的水溶性鹽(例如鈉、鉀、鎂、鈣等鹽)的形式緩沖為生理ph值的形式。另外，除了水溶性溶劑以外，也可使用非水溶性溶劑，作為這樣的非水溶性溶劑，例如，可舉出乙醇、丙二醇等醇。

另外，在包含本實施方式的醫(yī)藥組合物的制劑中，可包含針對各種目的的藥物，作為這樣的藥物，可舉出例如防腐劑、緩沖劑等。作為防腐劑，可舉出重亞硫酸鈉、重硫酸鈉、硫代硫酸鈉、苯扎氯銨、氯丁醇、硫柳汞(thimerosal)、乙酸苯汞、硝酸苯汞、對羥基苯甲酸甲酯、聚乙烯醇、苯乙醇、氨、二硫代蘇糖醇、β-巰基乙醇等。另外，作為緩沖劑，可舉出碳酸鈉、硼酸鈉、磷酸鈉、乙酸鈉、重碳酸鈉等。這些試劑可以以能夠?qū)Ⅲw系ph維持在2～9、優(yōu)選為4～8之間的量存在。

對本發(fā)明的醫(yī)藥組合物的劑型也沒有特別限制，在作為疫苗的形式使用的情況下，對其劑型可例示注射劑(肌肉、皮下、皮內(nèi))、口服制劑、滴鼻制劑等。本發(fā)明的醫(yī)藥組合物為疫苗的形式時，也可以是含有多種有效成分的混合雞尾酒式疫苗(cocktailvacine)。例如，這樣的疫苗可含有序列號1～15表示的肽中的任選2種以上，或可與其他有效成分組合而含有多種有效成分。

另外，本發(fā)明的疫苗也可以是含有下述非活性成分的疫苗，所述非活性成分是醫(yī)藥組合物以外的成分，其自身不具有活性，但具有進一步提高醫(yī)藥組合物的作為疫苗的效果。作為非活性成分，可舉出佐劑、類毒素等。作為佐劑的例子，可舉出氫氧化鋁、磷酸鋁、磷酸鈣等沉降性類型的佐劑，弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑等的油性類型的佐劑(但這并非意圖對本發(fā)明進行限定)。

本發(fā)明的醫(yī)藥組合物以疫苗的形式存在時，優(yōu)選地，通過基于皮內(nèi)、皮下、靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)施予等的注射或注入，或通過自皮膚、或鼻腔、咽喉等的粘膜吸收等而施予至體內(nèi)。其單次施予量可被設(shè)定為從能夠顯著地誘導(dǎo)細胞毒性t細胞的量到顯著數(shù)量的非癌細胞不受到損害的量之間。

本發(fā)明的醫(yī)藥組合物不僅可向人體施予，將其在體外使用也在本發(fā)明的意圖之內(nèi)。更具體而言，本發(fā)明的醫(yī)藥組合物也可用于對抗原呈遞細胞進行體外或離體(exvivo)刺激來增強ctl誘導(dǎo)活性。例如，以用于癌癥的樹突細胞療法的情況為例進行說明，可使本發(fā)明的醫(yī)藥組合物與來自于需要癌癥的治療或預(yù)防的患者的樹突細胞等抗原呈遞細胞預(yù)先進行接觸，然后將該抗原呈遞細胞輸回至患者的體內(nèi)，由此施予至患者?？衫美缰|(zhì)體轉(zhuǎn)染法、注射法等將醫(yī)藥組合物中含有的肽導(dǎo)入至抗原呈遞細胞內(nèi)。在上述用途中使用編碼本發(fā)明的肽的多核苷酸時，可利用本領(lǐng)域已知的方法將多核苷酸導(dǎo)入至抗原呈遞細胞。例如，也可利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法、電穿孔法、顯微注射法、細胞融合法、deae葡聚糖法、磷酸鈣法等，使用對象多核苷酸或編碼多核苷酸的載體對來自患者的抗原呈遞細胞進行體外轉(zhuǎn)化等。

3.免疫誘導(dǎo)劑

本發(fā)明涉及的免疫誘導(dǎo)劑中，作為有效成分，含有例如下述的肽，所述的肽含有選自由序列號1～15組成的組中的1種以上氨基酸序列中連續(xù)8個以上的氨基酸殘基，并且由總共11個以下、優(yōu)選為10個以下、更優(yōu)選為9個以下的氨基酸殘基構(gòu)成。免疫誘導(dǎo)劑中含有的肽也可以是由序列號1～15中的任一項表示的氨基酸序列構(gòu)成的。所述肽如上文所定義。

可以認為，本發(fā)明的肽通過在抗原呈遞細胞上被呈遞而誘導(dǎo)免疫。因此，本發(fā)明的免疫誘導(dǎo)劑的有效成分不僅限于本發(fā)明的肽，也可以是能夠直接或間接地進行誘導(dǎo)的成分，例如編碼本發(fā)明的肽的多核苷酸或者含有所述多核苷酸的表達載體、或?qū)⒃撾呐chla分子的復(fù)合體呈遞至表面的抗原呈遞細胞或由抗原呈遞細胞分泌的外來體、或它們的組合。作為使用的抗原呈遞細胞，可舉出巨噬細胞、樹突細胞等，優(yōu)選使用ctl誘導(dǎo)能力高的樹突細胞。

本發(fā)明的免疫誘導(dǎo)劑不僅可向人體施予，將其在體外使用也在本發(fā)明的意圖之內(nèi)。更具體而言，本發(fā)明的醫(yī)藥組合物也可用于對抗原呈遞細胞進行體外或離體刺激來增強ctl誘導(dǎo)活性。例如，以用于樹突細胞療法的情況為例進行說明，可使本發(fā)明的免疫誘導(dǎo)劑與來自于需要癌癥的治療或預(yù)防的患者的樹突細胞等抗原呈遞細胞預(yù)先進行接觸，然后將該抗原呈遞細胞輸回至患者的體內(nèi)，由此施予至患者?？衫美缃橛芍|(zhì)體的轉(zhuǎn)染(脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法)、注射法等將免疫誘導(dǎo)劑中含有的肽導(dǎo)入至抗原呈遞細胞內(nèi)。在上述用途中使用編碼本發(fā)明的肽的多核苷酸時，可利用本領(lǐng)域已知的方法將多核苷酸導(dǎo)入至抗原呈遞細胞。例如，也可利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法、電穿孔法、顯微注射法、細胞融合法、deae葡聚糖法、磷酸鈣法等，使用對象多核苷酸或表達多核苷酸的載體對來自患者的抗原呈遞細胞進行體外轉(zhuǎn)化等。

在本說明書中使用時，“免疫誘導(dǎo)”表示：誘導(dǎo)免疫反應(yīng)，例如增強抗原呈遞細胞的ctl誘導(dǎo)活性、進而使ctl對癌細胞的細胞損傷活性增強。以及，在本說明書中使用時，“ctl誘導(dǎo)”表示以下過程：在體外或體內(nèi)，通過將本發(fā)明的肽呈遞至抗原呈遞細胞表面上來誘導(dǎo)特異性識別某種抗原的ctl或使其增殖，或使幼稚t細胞分化為具有殺傷癌細胞等靶細胞的能力(細胞損傷活性)的效應(yīng)器細胞，以及/或者使ctl的細胞損傷活性增強。ctl誘導(dǎo)活性可通過對ctl導(dǎo)致的細胞因子(例如干擾素(ifn)-γ)的產(chǎn)生進行評價來測定。例如，也可使用elispot(酶聯(lián)免疫斑點試驗，enzyme-linkedimmunospot)等已知的高感度免疫檢驗，對通過經(jīng)本發(fā)明的肽刺激的末梢血單核細胞等抗原呈遞細胞從前體細胞誘導(dǎo)出的細胞因子產(chǎn)生細胞的增加加以評價，來測定ctl誘導(dǎo)活性。細胞損傷活性還可利用⁵¹cr游離法等已知方法進行測定。上述活性與對照相比顯著地增加、例如增加5％以上、10％以上、20％以上、優(yōu)選為50％以上的情況下，可評價為免疫或ctl被誘導(dǎo)。

4.抗原呈遞細胞的制造方法

本發(fā)明涉及的抗原呈遞細胞的制造方法包括將例如下述的肽與抗原呈遞細在體外接觸的工序，所述的肽含有選自由序列號1～15組成的組中的1種以上氨基酸序列中連續(xù)8個以上的氨基酸殘基，并且由總共11個以下、優(yōu)選為10個以下、更優(yōu)選為9個以下的氨基酸殘基構(gòu)成的肽。本發(fā)明的制造方法中使用的肽也可以是由序列號1～15中的任一項表示的氨基酸序列構(gòu)成的。所述的肽如上文所定義。

可以認為，本發(fā)明的制造方法中使用的肽與抗原呈遞細胞表面的hlai類分子結(jié)合，作為抗原肽被呈遞給ctl，由此誘導(dǎo)抗原呈遞細胞的ctl活性。因此，與抗原呈遞細胞接觸的不僅限于本發(fā)明的肽，也可以是能夠直接或間接誘導(dǎo)ctl的成分，例如編碼該肽的多核苷酸或者含有所述多核苷酸的載體、或?qū)⒃撾呐chla分子的復(fù)合體呈遞至表面的抗原呈遞細胞或由抗原呈遞細胞分泌的外來體(exosome)、或它們的組合。作為使用的抗原呈遞細胞，可舉出巨噬細胞、樹突細胞等，優(yōu)選使用ctl誘導(dǎo)能力高的樹突細胞。

通過本發(fā)明的制造方法制造的抗原呈遞細胞不僅可作為上述醫(yī)藥組合物或免疫誘導(dǎo)劑的有效成分使用，將其用于免疫療法等也在本發(fā)明的意圖之內(nèi)。例如，以用于癌癥的樹突細胞療法的情況為例進行說明，可將制造的抗原呈遞細胞與來自于需要免疫誘導(dǎo)的患者的、ctl誘導(dǎo)能力低的樹突細胞等抗原呈遞細胞預(yù)先進行接觸，然后將該抗原呈遞細胞輸回患者的體內(nèi)，由此施予至患者?？衫美缃橛芍|(zhì)體的轉(zhuǎn)染(脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法)、注射法等將本發(fā)明的肽導(dǎo)入至抗原呈遞細胞內(nèi)。在上述用途中使用編碼本發(fā)明的肽的多核苷酸時，可利用本領(lǐng)域已知的方法將多核苷酸導(dǎo)入至抗原呈遞細胞。例如，也可利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法、電穿孔法、顯微注射法、細胞融合法、deae葡聚糖法、磷酸鈣法等，使用對象多核苷酸或編碼多核苷酸的載體對來自患者的抗原呈遞細胞進行體外轉(zhuǎn)化等。

實施例1

以下，舉出實施例更具體地說明本發(fā)明，但本發(fā)明不限于這些實施例。

具體而言，本實施例中的預(yù)測·實驗·評價的步驟基于國際公開2006/004182號小冊子中記載的主動學(xué)習(xí)實驗計劃進行，并創(chuàng)建了將以下步驟作為整體重復(fù)的規(guī)則。

(1)試行一次下文所述的低階學(xué)習(xí)算法(lowranklearningalgorithm)。即，從對累積數(shù)據(jù)的隨機重復(fù)取樣產(chǎn)生多種假定理論，將隨機產(chǎn)生的備選查詢點(肽)的預(yù)測值分散最大的點選用為應(yīng)進行實驗的查詢點。

(2)利用后述的合成·純化方法對作為選用的查詢點的肽加以制造，利用后述的實驗測定實際的結(jié)合能力，加入進累積數(shù)據(jù)中。

通過進行這樣的主動學(xué)習(xí)法，對于由9個氨基酸殘基構(gòu)成的肽而言，原本共需要進行5000億(＝20⁹)次以上的備選hla結(jié)合性肽的結(jié)合實驗的數(shù)量得以被削減。

通過上文說明的規(guī)則，抽選出了序列號1～15所示的氨基酸序列。

<肽合成和純化>

使用fmoc氨基酸、通過merrifield的固相法對具有序列號1～15的氨基酸序列的肽進行人工合成。在去保護之后，使用c18色譜柱實施反相hplc純化，使得純度達到95％以上。肽的鑒定和純度的確通過maldi-tof質(zhì)譜法來進行(absciexmaldi-tof/tof5800)。以bsa作為標(biāo)準(zhǔn)蛋白，通過microbca檢驗(thermoscienftific公司)來確定肽的量。

<肽與hla-a＊24:02分子的結(jié)合實驗>

使用表達hla-a＊24:02分子的c1r-a24細胞(所述細胞是熊本大學(xué)滝口雅文教授制備的，在得到許可后由愛媛大學(xué)安川正貴助理教授提供)，對肽結(jié)合至與hla-a＊24:02分子(其為hla-a＊24:02基因的產(chǎn)物)的能力進行測定。

首先，將c1r-a24細胞在ph3.3的酸性條件下暴露30秒，原本與hla-a＊24:02分子結(jié)合的內(nèi)源性肽以及與hlai類分子共通締合的輕鏈β2m被解離、除去。進行中和后，向c1r-a24細胞添加純化的β2m，并將細胞添加至肽的稀釋系列中，在冰上孵育4小時。使用識別此期間重新締合的hla-a＊24:02分子、肽、β2m這三者的締合物(mhc-pep)的經(jīng)熒光標(biāo)記的單克隆抗體17a12進行染色。

然后，使用熒光細胞分析裝置facscan(becton-dickinson公司)對相對每個c1r-a24細胞的mhc-pep量(與上述熒光抗體的熒光強度成比例)進行定量測定。使用本申請的發(fā)明人發(fā)表于論文(udakaetal.,immunogenetics,51,816-828,2000)中的方法，從相對每個細胞的平均熒光強度計算出hla-a＊24:02分子與肽之間的結(jié)合解離常數(shù)kd值。

<肽與hla-a＊02:01分子的結(jié)合實驗>

使用表達hla-a＊02:01分子的細胞株t2(購自atcc)，對肽結(jié)合至hla-a＊02:01分子(其為hla-a＊02:01基因的產(chǎn)物)的能力進行測定。

向?qū)⒁獪y定結(jié)合能力的肽的階段(stepwise)稀釋系列中添加t2細胞和純化的β2m，然后于37℃孵育4小時。使用締合型特異性熒光標(biāo)記單克隆抗體bb7.2，對表達量在直至該時間點以肽濃度依賴性方式增加的hla-a＊02:01分子進行染色。

然后，使用流式細胞儀對相對每個細胞的熒光量進行測定，通過本申請的發(fā)明人發(fā)表于論文(udakaetal.,immunogenetics,51,816-828,2000)中的方法計算出解離常數(shù)kd值。

<肽與hla-a＊02：06分子的結(jié)合實驗>

使用向rmas(小鼠tap(抗原加工相關(guān)轉(zhuǎn)運體，transporterassociatedwithantigenprocessing)缺陷細胞株)中導(dǎo)入hla-a＊02:06基因的cdna而得到的ra2.6細胞(高知大學(xué)新制備的細胞株)，對肽結(jié)合至hla-a＊02:06分子(其為hla-a＊02:06基因的產(chǎn)物)的結(jié)合能力進行測定。

首先，將ra2.6細胞于26℃過夜培養(yǎng)，未與肽結(jié)合的hla-a＊02:06分子在細胞表面蓄積后，向其中添加肽的稀釋系列，于26℃進行60分鐘的結(jié)合。

然后，通過于35℃培養(yǎng)4小時，使得未結(jié)合肽的空hla-a＊02:06分子變性，喪失立體結(jié)構(gòu)。向其中添加特異性識別肽結(jié)合型hla-a＊02:06分子的經(jīng)熒光標(biāo)記的單克隆抗體bb7.2，在冰上孵育20分鐘，對細胞進行染色。

然后，使用流式細胞儀測定每個細胞的熒光量，通過本申請的發(fā)明人發(fā)表于論文(udakaetal.,immunogenetics,51,816-828,2000)中的方法計算出解離常數(shù)kd值。

<結(jié)合實驗的評價結(jié)果>

結(jié)果，獲得了下表中所示的本發(fā)明的肽對各hla分子的結(jié)合實驗數(shù)據(jù)。

[表2]

需要說明的是，序列號1～15的氨基酸序列源于序列號16所示的hsp70的規(guī)定的基因組蛋白質(zhì)全長序列。

＜肽免疫誘導(dǎo)試驗＞

(1)肽刺激樹突細胞的制備

·第0～9天(樹突細胞的誘導(dǎo))

通過白細胞分離術(shù)(leukapheresismethod)從自肝細胞癌患者采集的末梢血分離出單核細胞。將分離的單核細胞在添加了800u/ml的gm-csf及500u/ml的il-4的條件下培養(yǎng)6天。向培養(yǎng)液中進一步添加300u/ml的tnf-α，培養(yǎng)4天，誘導(dǎo)成熟樹突細胞。然后，使用電穿孔法導(dǎo)入hsp70mrna，制作呈遞有源于hsp70的抗原肽的樹突細胞。

向上述肝細胞癌患者的大腿部通過皮內(nèi)注射施予1×10⁷個或2×10⁷個或3×10⁷個的導(dǎo)入了hsp70mrna的樹突細胞(hsp70-樹突細胞)(hsp70樹突細胞療法)。每3周重復(fù)進行以相同方法制備的hsp70-樹突細胞的皮內(nèi)施予。將通過分離術(shù)(pheresis)從已接受2次以上hsp70樹突細胞療法治療的肝癌患者得到的末梢血單核細胞中粘附于培養(yǎng)燒瓶的細胞組分在aim-cm培養(yǎng)基(gibco公司制)中于37℃培養(yǎng)10天。在培養(yǎng)期間，分別在第0天及第3天向培養(yǎng)基中添加15μl的il-4和30μl粒細胞單核細胞集落刺激因子(gm-csf)，并在第5天添加15μl的il-4、30μl的gm-csf、75μl腫瘤壞死因子(tnf)-α。

·第10天(肽刺激及樹突細胞的回收)

將從單核細胞誘導(dǎo)的樹突細胞重新回收至aim-cm培養(yǎng)基中，添加本發(fā)明的肽(序列號5、6、7、9、10、15)，使得肽濃度為20μg/ml。然后，將含有樹突細胞的培養(yǎng)基于37℃培養(yǎng)2小時。作為陽性對照及陰性對照，使用了以下的肽。

hla-a24:02用陽性對照(ebvlmp2,419-427:tygpvfmcl(序列號17))

hla-a24:02用陰性對照(hivenvgp160,584-592:rylrdqqll(序列號18))

hla-a02:01用陽性對照(fluamp,58-66:gilgfvftl(序列號19))

hla-a02:01用陰性對照(hivgapp17,77-85:slyntvatl(序列號20))

hla-a02:06用陽性對照(ebvlmp2453-461:ltagflifl(序列號21))

hla-a02:06用陰性對照(hivgapp24341-349:atleemmta(序列號22))

回收樹突細胞，使用足量的aim-cm培養(yǎng)基洗滌3次以上，然后進行細胞計數(shù)。

(2)cd8t細胞的制備

·第0～9天

將通過分離術(shù)從接受2次以上hsp70樹突細胞療法的治療后的肝癌患者得到的末梢血單核細胞中未粘附于培養(yǎng)燒瓶的懸浮細胞組分(包含淋巴細胞)在aim-cm培養(yǎng)基(gibco公司制)中于37℃培養(yǎng)10天。在培養(yǎng)期間，分別在第4天及第6天向培養(yǎng)基中添加40μl的il-2。

·第10天

使用cd8陰性選擇試劑盒(negativeselectionkit)(miltenyi公司制)從培養(yǎng)基中分離cd8t細胞，并進行細胞計數(shù)。

(3)共培養(yǎng)

在下述條件下，將上述(1)及(2)中得到的樹突細胞和cd8t細胞在aim培養(yǎng)基中于37℃共培養(yǎng)。

·cd8t細胞：5×10⁵個細胞/孔

·樹突細胞：2×10⁵個細胞/孔

·第12或第13天

向上述培養(yǎng)基中以0.4ml/孔添加含有20u/ml的il-2的aim-cm培養(yǎng)基。

(4)elispot檢驗

·第17天

向涂覆有抗ifn-γ單克隆抗體(mabtech公司制)的elispot用96孔培養(yǎng)板(millipore公司制)中以每孔為2×10⁴個細胞/孔的方式添加上述cd8t細胞。對于各試樣，使用3個孔以上。向各孔中添加100μl的aim-v(gibco公司制)。于37℃對elispot用96孔培養(yǎng)板進行培養(yǎng)。

·第18天

向各孔中添加抗ifn-γ抗體，再使hrp酶標(biāo)記的二抗與其反應(yīng)，利用呈色反應(yīng)測定ifn-γ產(chǎn)生細胞的數(shù)量。作為代表性的elispot檢驗結(jié)果，hla基因型為02:01/24:02的患者的結(jié)果示于圖1，hla基因型為02:01/33:03的患者的結(jié)果示于圖2，以及，hla基因型為02:06/24:02的患者的結(jié)果示于圖3。各圖中，示出了5次結(jié)果的平均值。

(5)elisa檢驗

·第17天

在對t細胞和以上述肽進行了沖擊的樹突細胞進行共培養(yǎng)的第7天，將培養(yǎng)上清液稀釋為×1、×5、×25、×1254個階段，使用humanifn-γelisamaxdeluxeset(biolegend公司制)，對測定限度內(nèi)的稀釋階段進行鑒定。然后，在鑒定出的稀釋階段，針對各試樣分別進行3次測定。作為代表性的elisa檢驗結(jié)果，hla基因型為24:02/26:01的患者的結(jié)果示于圖4及圖5，以及，24:02/24:02的患者的結(jié)果示于圖6。

以上，基于實施例對本發(fā)明進行了說明。上述實施例僅為例示，本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠理解，各種變形例是可行的，并且這些變形例也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。