技術(shù)領(lǐng)域：

本發(fā)明屬于中藥材功能基因技術(shù)領(lǐng)域。具體涉及一個(gè)太子參環(huán)肽hb前體蛋白基因及其編碼的多肽的應(yīng)用。

技術(shù)背景：

中藥太子參為石竹科植物孩兒參pseudostellariaheterophylla(miq.)pax的干燥塊根，具有益氣健脾、生津潤肺的功效。太子參因藥性溫和，為藥食兩用中藥材。隨著太子參在保健食品、化妝品產(chǎn)業(yè)用量的逐年增多，市場需求量增大，刺激了太子參種植產(chǎn)業(yè)的迅速擴(kuò)大。以貴州省為例，十余個(gè)縣市行政區(qū)擬以發(fā)展太子參種植作為改善農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)和推動(dòng)地方經(jīng)濟(jì)發(fā)展的手段之一。

目前已從太子參中分離得到約16種環(huán)肽類成分，其廣泛的生理活性是醫(yī)藥領(lǐng)域研究的新熱點(diǎn)?，F(xiàn)代研究表明，太子參環(huán)肽類成分具有酪氨酸酶抑制活性，有抗皮膚黑色素生成的作用，與將太子參作為保健藥品、化妝品進(jìn)行研制開發(fā)的定位理念相得宜彰，尤其太子參環(huán)肽hb(heterophyllinb，hb)曾被《中國藥典》(2005年版、2010年版)收錄為太子參含量測定的成分。

現(xiàn)代研究證明，植物環(huán)肽的生物合成路徑主要由三部分組成：環(huán)肽前體蛋白基因轉(zhuǎn)錄并表達(dá)成環(huán)肽前體蛋白，經(jīng)蛋白酶剪切生成線性肽，在環(huán)化酶的作用下生成環(huán)肽蛋白。其中，環(huán)肽前體蛋白基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)是合成的第一步，也是關(guān)鍵步驟。本發(fā)明為基于太子參環(huán)肽hb前體蛋白基因的應(yīng)用，如太子參中太子參環(huán)肽hb前體蛋白基因表達(dá)水平的檢測，以及采用生物技術(shù)或化學(xué)技術(shù)合成太子參環(huán)肽hb等方面奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
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本發(fā)明的目的在于提供太子參環(huán)肽hb前體蛋白基因phhb的核苷酸序列、太子參環(huán)肽hb前體蛋白基因phhb的cds序列、太子參環(huán)肽hb前體蛋白基因phhb編碼的氨基酸序列、太子參環(huán)肽hb線性肽prephhb的氨基酸序列、太子參環(huán)肽hb前體蛋白基因phhbcds序列全長的擴(kuò)增引物，太子參環(huán)肽hb前體蛋白基因phhb表達(dá)水平的檢測引物，以及在此序列基礎(chǔ)上進(jìn)行密碼子優(yōu)化或 點(diǎn)突變所產(chǎn)生的與原始序列相似度90％以上的序列。

本發(fā)明所述的太子參環(huán)肽hb前體蛋白基因phhb(如序列表中seqidno.1所示)，其特征在于，太子參環(huán)肽hb前體蛋白基因phhb序列的應(yīng)用。該基因的核苷酸序列長477bp，含有172bp的5′非編碼區(qū)(5′utr)及197bp的3′非編碼區(qū)(3′utr)，其中，cds為108bp，編碼35個(gè)氨基酸。該基因具有典型的植物環(huán)肽前體蛋白基因的結(jié)構(gòu)。

本發(fā)明所述的太子參環(huán)肽hb前體蛋白基因phhb克隆方法，其特征在于，以seqidno.1序列設(shè)計(jì)引物，以太子參cdna為模板擴(kuò)增太子參環(huán)肽hb前體蛋白基因phhb的全長cds，連接轉(zhuǎn)化后，挑選陽性克隆。

本發(fā)明提供了太子參環(huán)肽hb線性肽prephhb的應(yīng)用，如：根據(jù)本發(fā)明提供的基因的氨基酸序列，合成太子參環(huán)肽hb線性肽prephhb，進(jìn)而采用生物技術(shù)或化學(xué)技術(shù)合成太子參環(huán)肽hb。

本發(fā)明提供太子參環(huán)肽hb前體蛋白基因phhb的核苷酸序列在太子參相關(guān)研究中的應(yīng)用，如：根據(jù)基因序列設(shè)計(jì)特異引物，通過pcr技術(shù)檢測和分析太子參環(huán)肽hb前體蛋白基因在不同太子參材料中的表達(dá)水平。

發(fā)明人進(jìn)行了一系列實(shí)驗(yàn)，以探明本發(fā)明提供的太子參環(huán)肽hb前體蛋白基因phhb及其編碼的多肽，通過實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證prephhb為太子參環(huán)肽hb的線性肽，以說明本發(fā)明的有效性。具體如下：

一、構(gòu)建太子參轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫

提取太子參的總rna，利用第二代高通量測序技術(shù)，通過illuminahiseq2500測序平臺(tái)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序，對(duì)測序數(shù)據(jù)進(jìn)行富集、拼接、注釋，構(gòu)建太子參轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫。

二、分析太子參轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫

使用muscle3.6、bioedit、genetyx_version7等多款生物信息軟件綜合分析太子參的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫，得到一條基因序列(其序列如序列表中seqidno.1所示)，本發(fā)明將其命名為phhb。所述phhb基因具有典型的植物環(huán)肽前體蛋白基因結(jié)構(gòu)，其編碼的氨基酸序列中包含太子參環(huán)肽hb的線性肽(本發(fā)明命名為prephhb，其氨基酸序列如序列表中seqidno.4所示)，因此，推測phhb基 因?yàn)樘訁h(huán)肽hb的前體蛋白基因。

三、驗(yàn)證

(1)擴(kuò)增phhb的全長cds根據(jù)phhb的核苷酸序列(如序列表中seqidno.1所示)信息，設(shè)計(jì)全長cds擴(kuò)增引物(其上、下游引物序列分別如序列表中seqidno.5、seqidno.6所示)。以太子參塊根cdna第一鏈為模板，通過pcr擴(kuò)增及克隆測序，所得核苷酸序列與序列表中seqidno.2完全一致，說明前述擴(kuò)增引物可以擴(kuò)增太子參環(huán)肽hb前體蛋白基因phhb的全長cds。

(2)太子參環(huán)肽hb環(huán)化反應(yīng)以化學(xué)方法合成的線性肽prephhb(氨基酸序列如序列表中seqidno.4所示)為底物，經(jīng)緩沖液(ph＝8.5)提取的太子參塊根粗酶催化可生成環(huán)肽hb，說明prephhb是形成太子參環(huán)肽hb的前體蛋白。

(3)太子參phhb基因表達(dá)分析太子參材料可分為太子參環(huán)肽hb含量較高、較低兩類。根據(jù)太子參環(huán)肽hb前體蛋白基因phhb設(shè)計(jì)特異引物(其上、下游引物序列分別如序列表中seqidno.7、seqidno.8所示)，以不同heterophyllinb含量的太子參的塊根cdna第一鏈為模板，分別進(jìn)行pcr反應(yīng)。以2.0％的瓊脂糖凝膠電泳后條帶的明暗程度判定phhb基因的表達(dá)水平。結(jié)果說明phhb的表達(dá)量與太子參中環(huán)肽hb的含量呈正相關(guān)，結(jié)合前述(1)、(2)的驗(yàn)證結(jié)果，進(jìn)一步說明phhb是形成太子參環(huán)肽hb的前體蛋白基因。

附圖說明：

圖1為太子參環(huán)肽hb的化學(xué)分子結(jié)構(gòu)式。

圖2為太子參環(huán)肽hb前體基因phhb全長cds擴(kuò)增電泳檢測圖譜；m：marker(takaradl500)；1～2：太子參環(huán)肽hb前體基因。

圖3為太子參環(huán)肽hb標(biāo)準(zhǔn)品的hplc圖譜。

圖4為環(huán)化反應(yīng)的太子參環(huán)肽hb的hplc圖譜；ck－：環(huán)化反應(yīng)中未加粗酶。

圖5為環(huán)化反應(yīng)的太子參環(huán)肽hb的hplc圖譜；ck+環(huán)化反應(yīng)中未加prephhb。

圖6為環(huán)化反應(yīng)的太子參環(huán)肽hb的hplc圖譜；環(huán)化反應(yīng)中同時(shí)加prephhb 和粗酶。

圖7為環(huán)化反應(yīng)的太子參環(huán)肽hb量比較柱形圖；k－：環(huán)化反應(yīng)中未加粗酶；ck+環(huán)化反應(yīng)中未加prephhb；prephhb：同時(shí)加線性肽prephhb和粗酶。100：環(huán)化反應(yīng)中加入粗酶的量為100μl；150：環(huán)化反應(yīng)中加入粗酶的量為150μl；200：環(huán)化反應(yīng)中加入粗酶的量為200μl。

圖8為不同太子參環(huán)肽hb含量的太子參材料中phhb前體基因表達(dá)的電泳檢測圖譜；m：marker(takaradl500)；1～6：太子參環(huán)肽hb含量高的太子參；7～12：太子參環(huán)肽hb含量極低的太子參。

具體實(shí)施方式：

以下結(jié)合實(shí)施例子來進(jìn)一步解釋本發(fā)明，以使本領(lǐng)域普通技術(shù)人員參閱本說明書后能夠據(jù)以實(shí)施，但實(shí)施例并不對(duì)本發(fā)明做任何形式的限定。

實(shí)施例一：

以貴州施秉太子參塊根為材料，提取總rna，以反轉(zhuǎn)錄cdna的第一鏈作為模板，進(jìn)行pcr擴(kuò)增反應(yīng)。25μl反應(yīng)體系，包括：0.125μltakaraextaq(5u·μl^-1)，2.5μl10×extaqbuffer(mg²⁺plus)，2μldntpmixture(各2.5mmol·l^-1)，1μlseqidno.5所示引物(10μmol·l^-1)、1μlseqidno.6所示引物所示引物(10μmol·l^-1)，1μlcdna模板，ddh2o補(bǔ)至25μl；反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性4min，95℃變性30s，51℃退火30s，72℃延伸45s，35個(gè)循環(huán)后，72℃后延伸7min。pcr產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，切取目的條帶，回收，所得產(chǎn)物直接與pmd19-t載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌dh5α，挑取陽性克隆測序，去除pmd19-t載體序列后，所得核苷酸序列與序列表中seqidno.2一致，其編碼的氨基酸序列與前述phhb基因編碼的氨基酸序列(序列表中seqidno.3所示)相同。

實(shí)施例二：

取貴州施秉縣太子參塊根適量，經(jīng)過提取、純化、濃縮，得粗酶。在30℃恒溫條件下環(huán)化5h，其反應(yīng)體系(1000μl)為：15mm·l^-1tris(ph8.5)，100mm·l^-1nacl，5mm·l^-1dtt，0.2mg·l^-1bsa，15μg·l^-1prephhb(金斯瑞生物科技有限公司合成，純度為99％)以及粗酶(設(shè)100μl，150μl，200 μl三個(gè)梯度)，ddh2o補(bǔ)至1000μl。以不加入prephhb或不加粗酶作為對(duì)照組，每組3個(gè)平行。反應(yīng)完成后加入9倍體積甲醇終止反應(yīng)，置蒸發(fā)皿中，水浴加熱濃縮至干，殘?jiān)由V純甲醇溶解，轉(zhuǎn)移至2ml容量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻，經(jīng)0.45μm濾膜，取續(xù)濾液，按2010年版《中國藥典》太子參項(xiàng)下含量測定條件，檢測環(huán)化反應(yīng)生成的太子參環(huán)肽hb的量。結(jié)果顯示：加入100μl、150μl和200μl三個(gè)梯度的粗酶均能與prephhb反應(yīng)，形成太子參環(huán)肽hb，其含量隨著粗酶用量的增加而增加；未加prephhb對(duì)照組中太子參環(huán)肽hb含量明顯低于實(shí)驗(yàn)組，而未加粗酶的對(duì)照組中太子參環(huán)肽hb的含量低于檢測限。

實(shí)施例三：

參照2010版《中國藥典》太子參項(xiàng)下太子參環(huán)肽hb的含量測定方法，測定太子參塊根中太子參環(huán)肽hb的含量。根據(jù)檢測結(jié)果，把太子參材料分為太子參環(huán)肽hb含量較高(測定為0.0256±0.0049％)、太子參環(huán)肽hb含量極低(測定為0.0000±0.0002％)兩類。分別提取塊根總rna，將等量總rna反轉(zhuǎn)錄為cdna。根據(jù)太子參環(huán)肽hb前體蛋白基因phhb的核苷酸序列設(shè)計(jì)引物(上、下游引物序列如序列表中seqidno.7、seqidno.8所示)，分別以前述cdna為模板進(jìn)行pcr擴(kuò)增。反應(yīng)體系(25μl)為：0.125μltakaraextaq(5u·μl^-1)，2.5μl10×extaqbuffer(mg²⁺plus)，2μldntpmixture(各2.5mm)，前述上、下游引物各1μl(10μmol·l^-1)，cdna模板1μl，ddh2o補(bǔ)至25μl。反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性4min，95℃變性30s，68℃退火30s，72℃延伸45s，30個(gè)循環(huán)后，72℃延伸7min。pcr擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)eb染色后的2.0％的瓊脂糖凝膠電泳后，于凝膠成像系統(tǒng)觀察、拍照、保存。以2.0％的瓊脂糖凝膠電泳后條帶的明暗程度判定phhb基因的表達(dá)水平。結(jié)果表明太子參環(huán)肽hb前體蛋白基因phhb的表達(dá)量與太子參環(huán)肽hb含量呈正相關(guān)(附圖8)。太子參環(huán)肽hb含量較高的條帶清晰明亮，說明phhb基因有較高的表達(dá)量，而太子參環(huán)肽hb含量極低的太子參類型沒有明顯的條帶，說明phhb基因的表達(dá)量極低。