相關(guān)申請的交叉引用

本申請要求于2014年12月8日提交的序列號為62/089,097和2015年8月3號提交的序列號為62/200,557的共同待審的美國臨時專利申請的優(yōu)先權(quán)和權(quán)益，所述申請的全部內(nèi)容并入本文作為參考。

本發(fā)明涉及可用于能使免疫效應(yīng)細胞(特別是t細胞)介導(dǎo)抗體依賴性細胞毒作用(adcc)的合成生物學(xué)產(chǎn)品和方法，及它們用于治療和預(yù)防癌癥、傳染性疾病、炎癥性和自身免疫疾病和其他疾病的方法。

背景技術(shù)：

哺乳動物，特別是包括人類的高等脊椎動物，已經(jīng)發(fā)展出高度復(fù)雜的免疫系統(tǒng)，使用多種機制和效應(yīng)器來檢測、破壞、或至少控制外來病原體及病變的或應(yīng)激的自體細胞。這些病變細胞可能已經(jīng)被病毒或細菌感染，或已經(jīng)變成癌性的。

免疫系統(tǒng)識別和消除病變的宿主細胞及侵入細胞內(nèi)的微生物(例如，病毒、細菌或寄生蟲)的機制之一是通過細胞介導(dǎo)的細胞毒作用，其可以由若干白細胞和蛋白實施。這些潛在的細胞毒性效應(yīng)器包括：來自淋巴系的——自然殺傷(nk)細胞和細胞毒性t淋巴細胞(ctls)；和來自骨髓系的——巨噬細胞、中性粒細胞和嗜酸性粒細胞。

免疫系統(tǒng)啟動細胞介導(dǎo)的細胞毒作用的一個重要途徑依賴于抗體。過去十年，靶向于腫瘤特異性細胞表面的蛋白的單克隆抗體(mabs)成為受歡迎的抗癌治療方法。一些mabs已經(jīng)進入常規(guī)臨床實踐，包括利妥昔單抗(rituxan，mabthera)、曲妥珠單抗(herceptin)和西妥昔單抗(erbitux)。mabs因其雙功能的性質(zhì)而受歡迎?？梢允箍贵w的一端(fab)精確地針對特定腫瘤蛋白而不改變招募各種效應(yīng)細胞和蛋白來殺死腫瘤細胞的另一端(fc)。

具體地，抗體首先識別和結(jié)合靶細胞表面抗原后，充當接頭蛋白(adapter)，通過與那些免疫效應(yīng)細胞的某些受體的第二結(jié)合繼而激活免疫效應(yīng)細胞的細胞毒性能力。這就是所謂的抗體依賴性細胞毒作用(adcc)。例如，在抗癌的固有免疫中，adcc主要由表達相對低親和力的fc受體(fcγriiia，又稱為cd16a)的自然殺傷(nk)細胞(和，較少程度上的中性粒細胞、單核細胞和巨噬細胞)介導(dǎo)，fc受體只有通過與覆蓋在靶病變細胞(例如，腫瘤細胞)上的多價抗原的抗體的fc片段結(jié)合才被激活。這一結(jié)合引起如穿孔素和顆粒酶(及很多細胞因子，包括ifn-γ)細胞毒性顆粒的釋放，導(dǎo)致靶細胞的溶解。體外實驗和動物實驗已經(jīng)顯示了adcc的重要性。此外，一些臨床研究顯示，攜帶更低親和力的cd16變體(f158)的患者具有更差的臨床預(yù)后。

然而，主要由內(nèi)源的自然殺傷(nk)細胞介導(dǎo)的adcc的療效在體內(nèi)是局限的(就完全由內(nèi)源的細胞毒性t淋巴細胞參與腫瘤清除而言，發(fā)現(xiàn)其療效也是非常局限和不足的)，歸因于許多生理及病理原因，解釋如下。

第一，參與adcc的大部分細胞，例如，巨噬細胞和中性粒細胞，在被激活時不傾向于增殖。nk細胞對激活的反應(yīng)同樣具有有限的增殖潛能，并且它們也迅速地死亡。因此，即使adcc效應(yīng)器識別覆蓋病變細胞的抗體，體內(nèi)的固有adcc應(yīng)答仍然有抵不過疾病進展(例如，病毒感染、癌癥)的風險。

第二，許多adcc效應(yīng)細胞也表達抑制性受體以減弱它們的免疫應(yīng)答，從而建立制衡系統(tǒng)。這些受體包括對cd56^低的nk細胞的抑制性kirs(殺傷細胞免疫球蛋白樣受體)、單核細胞和b細胞上的fcγriib、和對t細胞的ctla-4(cd152)和pd-1(程序性-死亡-1，cd279)。癌細胞和病毒通過異常地放大這些抑制性通路來抵消體內(nèi)的基于adcc的防御系統(tǒng)。

第三，adcc效應(yīng)細胞上的主要fc受體，fcγriiia(cd16a)，對抗體有相對低的親和力(kd≈10^-6m)——與受體的無效f158型相比，即使受體的v158變體僅具有高兩倍的親和力。通過這一機制，一旦細胞表面靶標下降低于特定水平，則癌細胞變得對一些治療性單克隆抗體(mabs)有抵抗力。

鑒于其在疾病(例如，癌癥或其他疾病)中增殖和親和力的天然局限性及通過抑制性fc受體的進一步衰退，體內(nèi)的adcc功能具有的巨大潛力從未被完全實現(xiàn)。因此，合成生物學(xué)代表新的和高度期望的方法，在預(yù)防和治療人類疾病中釋放adcc活性的所有潛能。

發(fā)明概述

本發(fā)明引進新方法以提高免疫系統(tǒng)對癌癥、傳染性疾病和其他疾病的防御。本發(fā)明設(shè)計了新型、自由結(jié)合的、接頭蛋白樣的adcc增強子，把細胞毒作用和t細胞的增殖潛能結(jié)合到基于抗體的治療中。

根據(jù)本發(fā)明，提供融合蛋白作為自由結(jié)合和循環(huán)的接頭蛋白，使靶向病變細胞(例如，腫瘤細胞)的抗體與cd3⁺t細胞接觸。該新的接頭蛋白分子是可溶性的，且可以注射到患者的血液，進入大部分的組織室。該接頭蛋白樣adcc增強子有如下兩個組分：(a)高親和力的fc-結(jié)合結(jié)構(gòu)域；和(b)高親和力的cd3-結(jié)合結(jié)構(gòu)域。方法的原理是：該接頭蛋白樣adcc增強子將結(jié)合已經(jīng)覆蓋了一種或多種治療性抗體的腫瘤細胞，該增強子同樣可以結(jié)合cd3⁺t細胞。一旦很靠近或接觸t細胞，覆蓋腫瘤細胞的抗體將引起t細胞表面的cd3s交聯(lián)，導(dǎo)致t細胞活化，最終溶解腫瘤細胞。

本發(fā)明的adcc增強子可以與抗體療法聯(lián)合使用或靶向被天然存在的抗體識別或結(jié)合的病變細胞單獨使用。

在第一方面，本發(fā)明著手于建立高親和力的fc受體或抗體片段，例如與野生型人cd16(例如，最普遍的cd16型，即普遍的f158變體)相比對天然抗體有更高親和力的那些。受體(在下文中作為術(shù)語以包含類似于更加傳統(tǒng)的細胞表面受體的實施方案和基于抗體片段的實施方案)，其部分或全部，可以來自免疫系統(tǒng)的另一大分子或重新設(shè)計。高親和力的fc受體能夠與抗體共有的fc片段有效結(jié)合，靶向廣泛的多種細胞表面抗原并由此靶向廣泛的多種疾病和適應(yīng)癥。與抗原依賴性免疫療法(其每次需要針對每個具體的抗原建立不同的抗體)相比，這有極大的優(yōu)勢。

在另一方面，重點建立可溶性的、接頭蛋白樣的adcc增強子，高親和力的cd3-結(jié)合結(jié)構(gòu)域與fc-結(jié)合結(jié)構(gòu)域或第一方面中描述的高親和力的受體融合。此高親和力的cd3-結(jié)合結(jié)構(gòu)域的例子包括okt3和新型抗cd3的scfv。在不同的實施方案中，高親和力的fc-結(jié)合結(jié)構(gòu)域可以選自cd64的胞外域、高親和力的cd16變體和對人fc有高親和力的抗體片段。

在另一方面，本發(fā)明提供藥物組合物，其包括本發(fā)明的融合蛋白，依次含有高親和力的fc-結(jié)合結(jié)構(gòu)域和高親和力的cd3-結(jié)合結(jié)構(gòu)域。該藥物組合物進一步包括藥學(xué)上可接受的賦形劑。

在相關(guān)方面，本發(fā)明提供治療性治療有此需要的受試者狀況的方法，所述方法包含給所述受試者施用治療有效量的本發(fā)明的藥物組合物。方法可以進一步包括施用針對至少一種表示所述狀況的細胞表面抗原的治療性抗體。在一個實施方案中，抗體包含與人igg4基本上相似的fc區(qū)。治療的狀況可以是癌癥、炎癥性疾病、自身免疫疾病、移植排斥和感染等。

在又一個方面，本發(fā)明提供預(yù)防性治療有此需要的受試者狀況的方法，所述方法包含給所述患者施用預(yù)防有效量的本發(fā)明的藥物組合物。方法可以進一步包括施用針對所述狀況的疫苗。在一個實施方案中，狀況是癌癥。

附圖簡述

據(jù)本發(fā)明，圖1示例性地描述了接頭蛋白樣的adcc增強子。

圖2示例性地描述了cd64和cd16的外顯子。cd64有額外的免疫球蛋白折疊，因此，外顯子在胞外區(qū)。該額外的折疊是cd64更高fc親和力的保證。

根據(jù)本發(fā)明的實施方案，圖3列出了接頭蛋白樣的adcc增強子的fc-結(jié)合結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列(seqidno:1)。具體地，在這個實施方案中該結(jié)構(gòu)域包括基于外顯子邊界的cd64胞外域。

根據(jù)本發(fā)明的實施方案，圖4列出了接頭蛋白樣的adcc增強子的抗-cd3結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列(seqidno:2)。具體地，在這個實施方案中該結(jié)構(gòu)域包括兩個間隔區(qū)/連接區(qū)序列(下劃線)和okt3序列的人源化形式。

根據(jù)圖3和圖4中展示的實施方案，圖5列出了接頭蛋白樣的adcc增強子的全部氨基酸序列(seqidno:3)。

根據(jù)圖5展示的實施方案，圖6列出了接頭蛋白樣的adcc增強子的全部dna序列(seqidno:4)。

圖7是免疫印跡(蛋白印跡)的攝影圖像，顯示了在expi293細胞中過表達兩種形式的可溶性、接頭蛋白樣的adcc增強子的時間進程。兩種形式都有相同的cd64-okt3融合蛋白序列，唯一不同的是它們各自的核酸序列(泳道1和2)。蛋白被分泌到介質(zhì)中。預(yù)測的分子質(zhì)量為58kda；可能由于糖基化，抗-cd64抗體選擇了具有75kda的帶。

圖8是考馬斯-染色凝膠的攝影圖像，示出了用商品化的人igg柱(gelifesciences)純化可溶性的adcc增強子。通過多步離心分離、超濾，從培養(yǎng)基的上清液中完全移除轉(zhuǎn)染的細胞。柱在中性緩沖液中平衡，上樣上清液，然后溢流(flow-through)(確保完全結(jié)合)。蛋白通過梯度減少的ph分步純化。純化蛋白立即在高摩爾濃度的堿性tris緩沖液中中和。純化蛋白通過連續(xù)透析或用ultracentrifugal超濾器重復(fù)超濾轉(zhuǎn)移到pbs中。右邊的凝膠泳道展示了當洗滌緩沖液在ph3.05時不同的洗脫片段。

圖9示例性地描述了用jurkat細胞檢測本發(fā)明的接頭蛋白樣的adcc增強子對cd3⁺免疫效應(yīng)細胞的結(jié)合能力的試驗。

根據(jù)圖9的試驗，圖10示出facs的數(shù)據(jù)顯示，jurkat細胞與純化前(“樣品上樣”)和純化后(“純化蛋白”)的本發(fā)明的adcc增強子之間的結(jié)合。未填充的曲線表示陰性對照。除非另有說明，此處和所有后續(xù)的實驗，純化的adcc增強子以10-20ng/μl使用。

圖11示出facs數(shù)據(jù)顯示，jurkat細胞與不同濃度的本發(fā)明的adcc增強子之間的結(jié)合滴定。增強子的體積(以μl記)顯示在六幅圖的右上角，為：50、25、12.5、6.25、3.13和1.56μl。下表總結(jié)了該數(shù)據(jù)。cd⁺jurkat細胞與不同量的增強子一起培養(yǎng)，在pbs中清洗細胞移除過量的增強子，用熒光的抗-人cd64抗體檢測結(jié)合了增強子的蛋白。

圖12示例性地描述了用daudi細胞檢測本發(fā)明的接頭蛋白樣的adcc增強子對覆蓋rituxan的cd20⁺靶細胞的結(jié)合能力的試驗。

根據(jù)圖12的試驗，圖13示出facs的數(shù)據(jù)顯示，daudi細胞與純化前(“樣品上樣”)和純化后(“純化蛋白”)的本發(fā)明的adcc增強子之間的結(jié)合。

圖14示出facs數(shù)據(jù)顯示，daudi細胞與不同濃度的本發(fā)明的adcc增強子之間的結(jié)合滴定。增強子的體積(以μl記)顯示在六幅圖的右上角，為：50、25、12.5、6.25、3.13和1.56μl。下表總結(jié)了該數(shù)據(jù)。cd20⁺daudi細胞由rituxan(抗-cd20抗體)覆蓋，在pbs中清洗細胞移除過量的rituxan。rituxan-覆蓋的細胞與不同量的增強子一起培養(yǎng)，在pbs中清洗細胞移除過量的增強子，用熒光的抗-人cd64抗體檢測結(jié)合了增強子的蛋白。與cd20相比，觀察到adcc增強子對抗體約有30倍更高的親和力。

圖15示例性地描述了用覆蓋了rituxan的daudi細胞和cd8⁺t細胞檢測本發(fā)明的接頭蛋白樣的adcc增強子介導(dǎo)和擴大抗靶癌細胞的細胞毒性的能力的試驗。

根據(jù)圖15的試驗，圖16示出facs的數(shù)據(jù)顯示靶(daudi)細胞(上簇)和效應(yīng)t細胞(下簇)的檢測。數(shù)據(jù)表明本發(fā)明的增強子能招募t細胞裂解許多的daudi細胞群而不衰減t細胞活性(右圖)。在這及所有后續(xù)試驗中，e:t(效應(yīng)細胞：靶細胞)比例為10。

圖17示出細胞毒性實驗的數(shù)據(jù)，包括兩種濃度的rituxan(抗-cd20)、dc20⁺daudi細胞、cd8⁺t細胞和本發(fā)明的增強子。數(shù)據(jù)顯示增強子增加了t細胞對靶細胞的殺傷，殺傷依賴于rituxan和增強子的濃度。天1和天2之間的數(shù)據(jù)表明，更長時間暴露同樣增加了殺傷(時間依賴的adcc)。rituxan以0.1μg/ml(10x)或0.01μg/ml(1x)使用。增強子以12.5μl(+)或50μl(+++)使用。

圖18示出細胞毒性實驗的數(shù)據(jù)，包括兩種濃度的rituxan、raji細胞、cd8⁺t細胞和本發(fā)明的增強子。數(shù)據(jù)顯示與圖17中在相同的rituxan和增強子的濃度下類似的結(jié)果。

圖19示出細胞毒性實驗的數(shù)據(jù)，包括兩種濃度的herceptin、her⁺sk-br3細胞、cd8⁺t細胞和本發(fā)明的增強子。當加入增強子時，數(shù)據(jù)顯示更顯著的細胞毒性效應(yīng)(與圖18中的結(jié)果相比)。herceptin以1μg/ml(10x)或0.1μg/ml(1x)使用。增強子以50μl(+++)使用。

根據(jù)本發(fā)明的實施例，圖20示例性地描述如何在不同乳腺癌細胞中檢測her2的表達。

圖21對比了三種不同的乳腺癌細胞系之間的her2表達水平：mda-mb-231、mcf7和sk-br3。最左邊的峰表示未染色的對照，隨后的峰分別是mda-mb-231、mcf7和sk-br3細胞的。數(shù)據(jù)顯示，在這三個之間，sk-br3有最高的her2表達水平，而mda-mb-231有最低的表達水平。

圖22示出細胞毒性實驗的數(shù)據(jù)，包括herceptin、her-高sk-br3細胞、her-低mda-mb-231細胞和本發(fā)明的增強子。數(shù)據(jù)顯示在兩種乳腺癌細胞型中增強子都有擴大herceptin的殺傷能力。數(shù)據(jù)同樣顯示在sk-br3細胞中的更顯著的效果，表明該效果依賴于her2的表達水平。然而，殺死m(xù)da-mb-231細胞的能力顯示，本發(fā)明的增強子能用于使低表達her2的腫瘤對herceptin敏感。在這些實驗中增強子以50μl使用。

圖23示出細胞毒性實驗的數(shù)據(jù)，包括納武單抗(抗-pd1)、轉(zhuǎn)基因表達pd1的hek-293t細胞(“293t-pd1”)、cd8⁺t細胞和本發(fā)明的增強子。其親本(未修飾的hek293t細胞(“293t”))及igg4計入對照。只有在當增強子存在時，表達pd-1的細胞接觸納武單抗，才能看見靶細胞顯著的裂解。包括最左邊的對照在內(nèi)，cd8⁺t細胞在所有描述的樣本中。

發(fā)明詳述

i.定義

除非另外說明，技術(shù)術(shù)語根據(jù)常規(guī)用法使用。分子生物學(xué)中的常見術(shù)語定義可在，例如，benjaminlewin，genesvii，oxforduniversitypress出版，2000(isbn019879276x)；kendrewetal.(eds.)；theencyclopediaofmolecularbiology，blackwell出版社出版，1994(isbn0632021829)；和roberta.meyers(ed.)，molecularbiologyandbiotechnology:acomprehensivedeskreference,wiley,john&sons,inc.出版，1995(isbn0471186341)，和其他相似的技術(shù)參考資料中找到。

如文中所使用的，“一個”或“一種”可以表示一個或多個。如文中所使用的，當與詞語“包含”結(jié)合使用時，詞語“一個”或“一種”可以表示一個或多于一個。如文中所使用的，“另一個”可以表示至少第二或更多。進一步地，除非上下文另有要求，單數(shù)術(shù)語包括復(fù)數(shù)，復(fù)數(shù)術(shù)語包括單數(shù)。

如文中所使用的，無論是否明確指明，“大約”指數(shù)值，例如，包括整數(shù)、分數(shù)和百分數(shù)。術(shù)語“大約”通常指數(shù)值的范圍(例如，所述值的+/-5-10％)，該數(shù)值范圍本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員會認為等同于所述值(如，有同樣的功能或結(jié)果)。在一些情況下，術(shù)語“大約”包含的數(shù)值四舍五入到最接近的有效數(shù)字。

如文中所使用的，術(shù)語“抗體”或“ab”，廣義上指任何由四條多肽鏈(兩條重(h)鏈和兩條輕(l)鏈)組成的免疫球蛋白(ig)分子，或保留了ig分子基本的表位結(jié)合特征的任何其功能片段、突變體、變體或衍生物。這些突變體、變體或衍生抗體形式在本領(lǐng)域是已知的，包括但不限于單鏈fv(scfv)、fab、f(ab')、f(ab')2、單結(jié)構(gòu)域等。其非限制性實施方案在下文討論。

cd16表達為兩種不同的形式，cd16a和cd16b，其為兩個不同但高度同源基因的產(chǎn)物。cd16a是多肽錨定跨膜蛋白而cd16b是糖基磷脂酰肌醇錨定蛋白。如本文中所使用的，cd16指該蛋白的兩種形式，除非對于技術(shù)人員來說顯而易見不合適。

實施本發(fā)明所用的效應(yīng)細胞可以是自體同源的、同源的或異源的，其選擇依賴于所治療的疾病和可用的方法。

ii.組合物

本發(fā)明公開了可溶性通用的adcc增強子蛋白(suaep)技術(shù)，其提供現(xiàn)成的、接頭蛋白樣、可溶性通用的增強adcc的蛋白，理論上能普遍地用于增強抗體的療效。增強機制可能包括至少以下方面：

1.adcc對抗體療法(例如，或治療)的效能很重要。一些研究表明低親和力的cd16變體(158f)純合的患者有較差的預(yù)后。

2.即使對具有相對高親和力的cd16變體的患者，adcc可能如之前討論的由于多種原因被抑制，例如，免疫抑制環(huán)境、抑制性受體的介入或效應(yīng)細胞的無能力增殖。

3.補體系統(tǒng)同樣對(利妥昔單抗)的效能很重要。例如，即使clls是惰性b細胞癌，患者對經(jīng)常是頑固的，因為他們或補體缺失或在治療開始后不久補體耗盡(xuetal.,2011,internationaljournalofcancer128:2193-2201；kennedyetal.,2004,journalofimmunology172(5)3280-3288)。

在所有這些情況下，添加adcc增強子將能夠避免這個問題且給癌細胞招募細胞毒性t細胞。

另外，本發(fā)明提供的suaep技術(shù)在減少治療所需抗體的數(shù)量中將是有用的，從而最小化(a)抗體的非特異副作用；并(b)減少發(fā)展抗-抗體應(yīng)答的機會。應(yīng)當注意的是，即使是完全人源化抗體也有獨特的cdr3s能引發(fā)免疫應(yīng)答。減少治療中使用的抗體數(shù)量將減少引發(fā)該應(yīng)答的機會。

t細胞接頭蛋白

根據(jù)本發(fā)明的一個實施方案，融合蛋白起著循環(huán)的、自由結(jié)合的接頭蛋白樣的adcc增強子的作用，其有兩個部分：結(jié)合抗體的高親和力的fc-結(jié)合結(jié)構(gòu)域，連接t細胞的高親和力的cd3-結(jié)合結(jié)構(gòu)域(圖3)。

(a)fc結(jié)合結(jié)構(gòu)域

接頭蛋白樣的adcc增強子的fc結(jié)合結(jié)構(gòu)域可以來自多種來源，包括：

(i)cd64(fcγri)的胞外域：

fcγri是高親和力的fc受體(對igg1和igg3的kd≈10^-9)，出現(xiàn)在巨噬細胞和中性粒細胞上，與抗體介導(dǎo)的吞噬作用和介質(zhì)的釋放有關(guān)。fcγri包括糖蛋白α鏈，其細胞外結(jié)構(gòu)域由與結(jié)合抗體有關(guān)的三個免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域組成。

根據(jù)本發(fā)明的一個實施方案，cd64(fcγri)的胞外域的部分或全部與合適的cd3-結(jié)合結(jié)構(gòu)域融合，形成接頭蛋白樣的增強子，從而介導(dǎo)adcc。有利地，由于胞外域源于機體，該實施方案中的增強子是同源的，因此是非免疫原性的。

(ii)高親和力的cd16變體：

在本發(fā)明的另一個實施方案中，本發(fā)明的接頭蛋白樣的adcc增強子的fc-結(jié)合結(jié)構(gòu)域并入具有對抗體fc片段有提高的親和力的cd16(fcγriii)變體的胞外域的部分或全部。在一個實施方案中，fc-結(jié)合結(jié)構(gòu)域的序列由fcγriiia的結(jié)合區(qū)的隨機突變產(chǎn)生，并使用最常用的cd16變體(f158)作為基準對照來挑選。

(iii)高親和力的scfv：

在進一步的實施方案中，本發(fā)明的fc-結(jié)合結(jié)構(gòu)域并入改造的對fc(優(yōu)選人fc)有高親和力的抗體片段。在一個實施方案中，抗體片段是scfv(單鏈可變區(qū)片段)。在可選的實施方案中，片段是fab(抗原結(jié)合片段)。該抗體片段應(yīng)該比基準受體(例如，cd16)展現(xiàn)出更高的fc親和力。改造這些抗體片段的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的，例如，通過使用商購的雜交瘤。例如，將人fc結(jié)構(gòu)域注射到實驗動物(例如，小鼠)中一定時間。從動物脾臟中分離的b細胞與骨髓瘤細胞融合，篩選能產(chǎn)生抗fc結(jié)構(gòu)域的高親和力的單克隆抗體的克隆。這些候選的抗體可用標準方法人源化、去免疫化和/或轉(zhuǎn)換成fab或scfv形式?？蛇x地，通過對從具有人源化免疫系統(tǒng)的動物中得到的高親和力克隆或單克隆抗體進行文庫篩選(例如，噬菌體展示、基于酵母或哺乳動物細胞)，能夠獲得完全人源化抗體。

(b)cd3-結(jié)合結(jié)構(gòu)域

cd3-結(jié)合結(jié)構(gòu)域，優(yōu)選地具有高親和力，同樣能從多種來源制得。

例如，該結(jié)構(gòu)域可以源自okt3，其是抗-cd3單克隆抗體，是1986年第一個被批準用于人類的單克隆抗體。其是鼠源單克隆抗體，多年來其被多次改進以同時使其人源化和使其更低免疫原性(去免疫化)。在一個實施方案中，cd3-結(jié)合結(jié)構(gòu)域包含okt3抗體的scfv部分，優(yōu)選地，去免疫化的、人源化的(dhokt3)形式。

在本發(fā)明的其他實施方案中，可以使用類似于上文(a)(iii)部分中描述的關(guān)于高親和力fc-結(jié)合scfv的方法制作新型抗-cd3scfv。

在一個優(yōu)選的實施方案中，接頭蛋白樣的adcc增強子是一個融合蛋白，其cd64胞外域與dhokt3scfv結(jié)合。

應(yīng)當注意的是，這一治療劑可以用于增強商購的抗癌抗體的效能。然而，該治療劑同樣可以用作單一療法，以增強由于患者固有的低adcc活性而無法清除腫瘤的體內(nèi)天然抗體的效能。

iii.治療和疫苗

adcc增強子對于癌癥治療的臨床意義可以用人癌細胞連同商購的治療抗體來檢測。例如，處理daudi細胞，用(1)利妥昔單抗(商品名)，靶向cd20的抗體，其涉及淋巴瘤、自身免疫疾病和移植排斥，導(dǎo)致效應(yīng)細胞活化、脫粒及增殖，(2)cd8⁺細胞毒性t細胞，和(3)本發(fā)明的接頭蛋白樣的adcc增強子。在一個實施方案中，本發(fā)明的adcc增強子與現(xiàn)有的治療抗體(例如，利妥昔單抗)聯(lián)合使用。同樣觀察到靶細胞殺傷。用商購的nod.scid.il2rγ^-/-小鼠進行體內(nèi)檢測，其有非常低的t細胞和b細胞，且沒有nk細胞?？蛇x地，使用具有非常低的t細胞和b細胞和減少的nk細胞的nod.scid小鼠。這些小鼠移植入標記的daudi細胞，用任何合適的成像技術(shù)觀察和檢測腫瘤的生長。在接受了利妥昔單抗和免疫效應(yīng)細胞、轉(zhuǎn)導(dǎo)了本發(fā)明的adcc增強子的小鼠中觀察到持續(xù)時間的腫瘤緩解、腫瘤消退或長期的無進展。

在另一個實施例中，處理sk-br-3細胞或mda-mb-231細胞，用(1)cd8⁺細胞毒性t細胞，(2)本發(fā)明的接頭蛋白樣的adcc增強子，和(3)曲妥珠單抗(商品名)，靶向her2/neu，其涉及乳腺癌，導(dǎo)致效應(yīng)細胞活化、脫粒及增殖。同樣觀察到靶細胞殺傷。在類似于上方描述的實施例的小鼠模型中觀察到adcc增強子的體內(nèi)抗腫瘤能力。

本發(fā)明的adcc增強子在自身免疫中的臨床應(yīng)用可以用針對每一具體疾病公認的小鼠模型之一來檢測。例如，在nod小鼠中，已顯示抗體介導(dǎo)的b細胞缺失阻止和甚至逆轉(zhuǎn)1型糖尿病。然而，該效果受fc受體低親和力的限制(huetal.jclininvest.2007,117(12):3857-67；xiuetal.jimmunol.2008,180(5):2863-75)。對照小鼠與或者單獨接受抗-cd19或抗-cd20抗體的小鼠，或者接受抗-cd19或抗-cd20抗體聯(lián)合本發(fā)明的adcc增強子的小鼠對比。接受了adcc增強子的小鼠顯示疾病發(fā)生的延遲或癥狀的持續(xù)逆轉(zhuǎn)。

類似的實驗可以在其他小鼠模型中進行，其中抗體介導(dǎo)的缺失已顯示影響疾病，例如多發(fā)性硬化、實驗性自身免疫性腦脊髓炎(barretal.jexpmed.2012,209(5):1001-10)),arthritis(yanabaetal.jimmunol.2007,179(2):1369-80)等。

adcc增強子在病毒性感染(例如hiv感染)中的臨床應(yīng)用可以用公認的人源化小鼠模型來檢測，其中聯(lián)合抗體的治療已顯示控制hiv的復(fù)制(nature,2012,492(7427):118-22)。人源化小鼠最初通過nod.rag1^-/-.il2rγ^-/-小鼠與人胎肝源的cd34+造血干細胞重組形成。這些小鼠有完整的人免疫系統(tǒng)，可以被hiv感染且不會消極地對人抗體做出反應(yīng)。感染的對照小鼠與或者單獨接受中和抗體混合物的小鼠，或者接受中和抗體混合物聯(lián)合任一人免疫效應(yīng)細胞和本發(fā)明的接頭蛋白樣的adcc增強子的小鼠對比。接受了adcc增強子的小鼠顯示病毒血癥的持續(xù)減少和t細胞數(shù)量的恢復(fù)。

檢測adcc增強子的臨床療效的可選的模型系統(tǒng)是猴-人免疫缺陷病毒(shiv)感染的幼兒恒河獼猴模型，其中中和抗體已顯示阻止疾病的快速發(fā)生(jaworskietal.jvirol.2013,87(19):10447-59)。感染的對照獼猴與或者只接受中和抗體混合物的獼猴，或者接受中和抗體混合物聯(lián)合本發(fā)明的接頭蛋白樣的adcc增強子的獼猴對比。接受了adcc增強子的獼猴類似地顯示病毒血癥的持續(xù)減少和t細胞數(shù)量的恢復(fù)。

編碼本發(fā)明adcc增強系統(tǒng)的dna和rna構(gòu)建體可以使用技術(shù)人員所知的技術(shù)配制給受試者施用。包含編碼adcc增強系統(tǒng)的dna和rna構(gòu)建體的制劑可以包括藥學(xué)上可接受的賦形劑。制劑中包括的賦形劑基于，例如，使用的基因構(gòu)建體或效應(yīng)細胞的類型和給藥的模式將有不同的用途。通常使用的賦形劑的例子包括，但不限于：鹽水、緩沖鹽水、葡萄糖、感染水(water-forinfection)、甘油、乙醇、和其組合、穩(wěn)定劑、增溶劑和表面活性劑、緩沖液和防腐劑、張度劑、填充劑和潤滑劑。

在本發(fā)明的另一個實施方案中，給患者施用本發(fā)明的接頭蛋白樣的adcc增強子的藥物制劑。示例性給藥模式包括，但不限于，靜脈注射。其他模式包括，但不限于，瘤內(nèi)、皮內(nèi)、皮下(s.c.，s.q.，sub-q，hypo)、肌肉(i.m.)、腹腔(i.p.)、動脈、髓內(nèi)、心臟、關(guān)節(jié)內(nèi)(關(guān)節(jié))、滑膜內(nèi)(關(guān)節(jié)液區(qū)域)、顱內(nèi)、脊柱內(nèi)和鞘內(nèi)(脊髓液)?？梢允褂萌魏我阎挠糜谥苿┑奈改c外注射或輸注的設(shè)備來進行這些給藥。如文中所使用的，術(shù)語“治療(treat)”、“治療(treating)”、和“治療(treatment)”有其普通及慣用含義，包括以下一個或多個：阻塞、減輕、或減少患者疾病(例如，癌癥)癥狀的嚴重性和/或頻率，和/或抑制癌細胞的生長、分裂、傳播、或增殖，或抑制患者癌癥進展(例如，出現(xiàn)新腫瘤)。相對于未使用本發(fā)明的方法的受試者，治療指阻塞、減輕、降低或抑制約1％到約100％。優(yōu)選地，相對于未使用本發(fā)明的方法的受試者，阻塞、減輕、降低或抑制是約100％、99％、98％、97％、96％、95％、90％、80％、70％、60％、50％、40％、30％、20％、10％、5％或1％。

本發(fā)明adcc增強子的臨床效果，同時作為治療的和預(yù)防的，可以通過使用樹突細胞(dcs)任選地增強。在淋巴器官中，dcs呈遞抗原給輔助性t細胞，進而調(diào)節(jié)免疫效應(yīng)細胞，包括ctls、b細胞、巨噬細胞、嗜酸性粒細胞和nk細胞。已有報道，改造自體同源的dc表達hiv抗原或用外源hiv蛋白沖擊自體同源的dc，能夠在體外致敏ctls對抗hiv(wilsonetal.,jimmunol.,1999,162:3070-78)。因此，在本發(fā)明的一個實施方案中，首先從受試患者中分離dcs，然后通過與目標抗原源培養(yǎng)離體致敏，例如，可以是來自于受試患者或外源的某些腫瘤相關(guān)抗原或其他表面標記物。在用感染了本發(fā)明adcc增強系統(tǒng)的自體同源ctl和/或其他效應(yīng)細胞，、或包含編碼adcc增強系統(tǒng)的dna和rna構(gòu)建體的制劑治療之前，將這些dcs最終灌輸回患者。這提供了在dcs幫助下使用adcc增強子增強治療及疫苗的模型。

本發(fā)明還提供了包含一個或多個容器的試劑盒，容器填充了一定量的編碼接頭蛋白樣的adcc增強子的基因構(gòu)建體和藥學(xué)上可接受的賦形劑。該試劑盒還可以包括使用說明書。進一步地，與試劑盒相關(guān)的可以是一個通知，以管理藥品或生物產(chǎn)品的生產(chǎn)、使用或銷售的政府機構(gòu)規(guī)定的形式，其通知反映該機構(gòu)批準生產(chǎn)、使用或銷售用于人類施用。

iv.實施例

(1)t細胞接頭蛋白構(gòu)建

根據(jù)本發(fā)明的多個實施方案，開發(fā)和檢測了接頭蛋白樣的adcc增強子，即，具有高親和力的fc-結(jié)合結(jié)構(gòu)域連接高親和力的cd3-結(jié)合結(jié)構(gòu)域的融合蛋白。

具體地，合成的cd64-dhokt3dna首先通過化學(xué)合成生成，作為遺傳物質(zhì)來產(chǎn)生接頭蛋白樣的adcc增強子(或，可溶的、自由結(jié)合的、循環(huán)的t細胞接頭蛋白)，其中該cd64的fc-結(jié)合胞外域與orthocloneokt3(又名莫羅單抗-cd3)(抗-cd3的抗體)的去免疫化和人源化的scfv形式融合。

其他的fc-結(jié)合結(jié)構(gòu)域，例如，基于其他fc受體(例如，cd32和cd16)的胞外域，即細胞外結(jié)構(gòu)域，也可以被用于本發(fā)明的其他實施方案中。然而，cd64(即fcγri)對抗體的fc區(qū)的親和力比cd16高約100倍至1000倍，這使cd64的胞外域(cd64與抗體結(jié)合有關(guān)的部分)是融合蛋白中fc-結(jié)合結(jié)構(gòu)域的優(yōu)選候選者。

蛋白融合的連接處由原蛋白的外顯子邊界決定(見圖2)。融合蛋白的cd64結(jié)構(gòu)域包括兩個編碼分泌信號的外顯子接著三個編碼胞外域的外顯子，如圖3中seqidno:1所示。分泌信號序列無需來自cd64，然而，可以被其他合適的分泌信號序列所取代。此外，在可選的實施方案中，蛋白融合的連接處基于原蛋白的胞外域與跨膜結(jié)構(gòu)域之間的預(yù)測的氨基酸邊界。與基于外顯子的融合相比，例如，這個方法可以在兩個原結(jié)構(gòu)域之間給融合蛋白加入部分的連接序列。

融合蛋白的其他部分(seqidno:2)，包括圖4中顯示的兩個間隔區(qū)序列和okt3序列。otk3最初來自小鼠細胞，但已人源化，即被許多團體轉(zhuǎn)換或突變成更接近來自人的抗體。人源化抗體或抗體片段是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的標準流程。圖5顯示接頭蛋白樣的adcc增強子的完整序列(seqidno:3)，其中該cd64的細胞外部分通過柔性的絲氨酸-甘氨酸連接子與去免疫化和人源化的okt3(dhokt3)融合。在可選的實施方案中，可以使用其他激動性抗-cd3序列，例如人源化的tr66。

現(xiàn)在參見圖6，cd64-dhokt3融合蛋白是逆翻譯的(backtranslated)和序列最優(yōu)化的來生成圖中顯示的dna序列(seqidno:4)。該最優(yōu)化依賴于選擇在人類中更加頻繁出現(xiàn)的個別氨基酸密碼子及移除重復(fù)區(qū)域和移除可能形成二級結(jié)構(gòu)的區(qū)域的結(jié)合。

本發(fā)明可選的實施方案包括加入標簽(例如，myc或his)使易于純化。另一個選擇可以是使標簽可裂解以便純化蛋白在用于治療時不受標簽的干擾。兩種方案可以通過本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所熟知的標準程序?qū)嵤辉诖嗽敿毜拿枋觥?/p>

(2)表達和純化

cd64-dhokt3融合蛋白的合成基因通過化學(xué)合成并克隆到哺乳動物表達載體上。使用商購的載體pvitro2-mcs，但有許多常用載體可以提供相同的功能。對于表達，重組表達載體按照制造商的說明書轉(zhuǎn)染expi293細胞(商購于thermofisherscientific)。生成的細胞系產(chǎn)生可溶性分泌蛋白(圖7和8)。簡單地說，expi293細胞在expi293表達培養(yǎng)基(expi293expressionmedia)中生長，用expifectamine293轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染后16-20小時合成的adcc增強子1和2(圖7)進入到培養(yǎng)基中，轉(zhuǎn)染后2-7天收集上清液。在本發(fā)明可選的實施方案中，使用其他的表達系統(tǒng)，例如，cho細胞。在一個可選的實施方案中，表達盒可以穩(wěn)定的整合到細胞系的基因組中，以形成穩(wěn)定的衍生細胞，產(chǎn)生融合蛋白。

adcc增強子蛋白用通常已知的方法親和純化，例如商購的iggsepharose柱(gehealthcarelifesciences)(圖8)。簡單地說，將來自轉(zhuǎn)染的細胞的上清液上樣到裝有與人igg交聯(lián)的sepharose珠的柱子上。然后用中性ph緩沖液和階梯式梯度的更低ph的檸檬酸鹽-磷酸鹽緩沖液清洗柱子。adcc增強子蛋白在低ph(～ph3)下洗脫，然后立即在1mtrishcl(ph7.4)中中和。緩沖液通過透析或超濾交換。

也可以使用其他的標準純化方法，如脫鹽柱。另一個可選的實施方案使用基于proteinl的親和柱。proteinl結(jié)合許多種蛋白的kappa鏈，包括scfv的kappa鏈，例如本文融合蛋白的okt3部分。純化未加標簽的蛋白的其他標準方法，例如，離子交換、分子篩等，也可以單獨使用或在本發(fā)明中聯(lián)合使用。可選地，如前所述，融合蛋白可以用標準標簽標記，便于使用合適的親和柱純化。這些步驟也可以串聯(lián)使用來產(chǎn)生更高純度的蛋白。

(3)結(jié)合親和力

可以以多種方式直接使用上清液或純化蛋白來檢測cd64-抗cd3融合蛋白結(jié)合fc和cd3的能力。例如，如圖9中所顯示的，jurkat細胞能用于檢測該親和力，因為jurkat細胞是表達cd3的t淋巴細胞。根據(jù)一個實施例，在pbs中清洗2x10⁵個jurkat細胞，在50μl的培養(yǎng)液上清液(來自已轉(zhuǎn)染表達載體數(shù)天的expi293細胞)或純化的融合蛋白中、于4℃培養(yǎng)30分鐘。細胞用pbs清洗兩次，然后用商購的熒光素標記的抗-cd64抗體檢測結(jié)合的adcc增強子(圖10)。在圖11中，進行jurkat細胞的結(jié)合滴定，結(jié)果顯示結(jié)合與增強子濃度之間的相關(guān)性。

有標簽的蛋白，結(jié)合親和力同樣可以用熒光素標記的抗-標簽抗體來檢測。這個方法還可以用于檢測覆蓋利妥昔單抗的cd20⁺daudi細胞對cd64結(jié)構(gòu)域的結(jié)合(見圖12)。簡單地說，收集10⁶個daudi細胞，用pbs清洗，用0.1μg/ml的利妥昔單抗(抗cd20的抗體，又名rituxan。mabthera和zytux)、于4℃培養(yǎng)30分鐘。細胞在pbs中再洗清洗，然后如上所述的與上清液或純化蛋白一起培養(yǎng)(圖13)。在圖14中，進行daudi細胞的結(jié)合滴定，結(jié)果顯示結(jié)合與增強子濃度之間非常相關(guān)。事實上，接頭蛋白樣的adcc增強子對fc或抗體的結(jié)合表現(xiàn)出比增強子另一端的對cd3的結(jié)合強約30倍。

在可選的實施方案中，檢測了在共同培養(yǎng)系統(tǒng)中覆蓋利妥昔單抗的daudi細胞和jurkat細胞之間的異源聚合，作為結(jié)合親和力的指標。daudi細胞和jurkat細胞分別用標準方法用活細胞染色(例如cfse或celltracefarred)標記，和/或被改造以表達熒光蛋白，例如gfp。然后將該細胞與利妥昔單抗及本發(fā)明的可溶性adcc增強子共同培養(yǎng)。檢測雙峰的facs數(shù)據(jù)，兩種顏色都是陽性的。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員容易理解，本文描述的實施方案中的細胞系的選擇不局限于jurkat細胞和daudi細胞——本發(fā)明考慮多種細胞系或原代細胞與合適的抗體聯(lián)合使用。

cd64-抗cd3融合蛋白結(jié)合fc和cd3的能力還可以用表面等離子共振，或其他標準的生化或基于細胞的試驗來檢測。

(4)細胞毒性增強

用標準程序從捐贈血液中分離原代cd8⁺t細胞，例如，使用rosettesepcd8tcellenrichment試劑盒(stemcelltechnology)，接著用抗-cd3/cd28擴大?？蛇x地，可以用總t細胞或pbmcs來進行類似實驗。使用這些細胞的任何一種，檢測本發(fā)明的增強子引起活化、增殖和引發(fā)細胞毒作用(尤其是，adcc)的能力。具體地，t細胞的增殖可以通過流式細胞術(shù)或其他傳統(tǒng)方法來檢測，例如，胸苷摻入法、cfse稀釋法等?；罨梢酝ㄟ^檢測多種已知的活化標志物來檢測，例如，hla-dr、cd25、cd69等。典型地，對于這些實驗，增強子可以單獨起作用，但進行附加試驗需要或不需要有：

(a)50iu/ml的il-2；

(b)靶細胞；和/或

(c)合適的抗體

當包括靶細胞，它們可以用絲裂霉素c預(yù)先處理，以停滯增殖和最小化過度擁擠的效果。同樣，溶酶體-相關(guān)的膜蛋白-1(lamp-1或cd107a)已描述是作為cd8⁺t細胞和nk細胞刺激后溶解顆粒脫?；臉酥疚?。因此，在上文所述的共同培養(yǎng)實驗中，通過流式細胞術(shù)可以分析cd107a⁺t細胞的水平來檢測脫?；?/p>

為了評價細胞毒性，在合適的治療抗體存在下將t細胞與celltrace-標簽的靶細胞共同培養(yǎng)一天或兩天。在圖15-23中顯示了幾個實施例的結(jié)果和設(shè)置，提供了接頭蛋白樣的增強子引起、增強或擴大抗體依賴性細胞毒性來對抗多種癌癥細胞的能力的足夠的證據(jù)。在這些圖中展示的數(shù)據(jù)包括有效殺傷b淋巴母細胞(daudi和raji)、乳腺癌細胞(sk-br3和mda-mb-231)和表達pd-1的細胞(293-pd1)。

例如，圖15和16中展示的數(shù)據(jù)和機制顯示，本發(fā)明的增強子在rituxan存在下，通過招募t細胞影響adcc，能夠殺傷許多的cd20⁺daudi細胞群。如另一個實施例，圖19中展示的數(shù)據(jù)顯示本發(fā)明的增強子引發(fā)herceptin(設(shè)計的抗乳腺癌細胞上的her2受體的抗體)對sk-br3乳腺癌細胞的殺傷能力，其大概是因為增強子招募了t細胞來增強adcc。

可以用其他抗體在其他癌癥細胞系或環(huán)境中進行額外的試驗，例如：(a)用抗-cd33抗體(wm-53)處理的cd33+aml系(例如，hl-60、molm-13和thp-1)；(b)用抗-cd19抗體(hib19)處理的cd19+系(例如，nalm-6和mec-1)；和(c)用抗-epcam抗體(hea-125)處理的epcam+系(例如，sw480)。

現(xiàn)在參見圖23，細胞毒性實驗包含納武單抗(抗-pd1抗體)、有轉(zhuǎn)基因表達的pd1(“293t-pd1”)的hek-293t細胞(表達大t抗原的人胚腎細胞)、cd8+t細胞和本發(fā)明的增強子。對照包括親本、未修飾的hek-293t細胞(“293t”)及igg4對照。納武單抗被開發(fā)成igg4抗體以便無任何adcc活性。然而，后續(xù)實驗已顯示，adcc和pd1抗體一起可能作用更好。和cd16不同，cd64有能力結(jié)合igg4，并將原始adcc-陰性的抗體(例如，納武單抗)轉(zhuǎn)變成adcc-陽性的抗體，為了從其他免疫效應(yīng)細胞，如t細胞獲得額外的幫助。如圖中顯示，納武單抗本身，即使當它的濃度提高10倍，仍只有有限的殺傷靶293t-pd1細胞的能力—顯示約75％的靶細胞存活。然而，當把本發(fā)明的接頭蛋白樣的增強子加入到混合物中，靶細胞的存活率大幅下降至少于5％。這為本發(fā)明增強子結(jié)合或聯(lián)合igg4抗體或沒有adcc能力的其他免疫效應(yīng)細胞的有希望的治療用途提供了基礎(chǔ)。

本文包含的數(shù)據(jù)支持將接頭蛋白樣的adcc增強子與抗體(例如rituxan和herceptin)一起使用，以增強它們的功能，減少抗體用量，減少副作用和抗-抗體應(yīng)答。

這些作用不僅僅在于治療癌癥，也治療自身免疫。例如，rituxan或利妥昔單抗在治療自身免疫患者中產(chǎn)生了混合的結(jié)果：它在ra中作用很好但在sle中作用略微。這個的其中一個原因是在sle患者中巨噬細胞介導(dǎo)的b細胞的缺失是飽和的。用adcc增強子作為t細胞接頭蛋白將b細胞殺傷重新定向到t細胞將避免這個問題。

進一步地，可以在有低親和力形式的cd16(158f)的患者中，或其adcc/cdc被以某種方式抑制的患者中(例如，慢性淋巴細胞性白血病(cll)患者)和其他正在經(jīng)受癌癥治療的患者中使用增強子。

有許多抗體，直到這些抗體已經(jīng)用于臨床才發(fā)現(xiàn)adcc在其中的作用，例如，曲妥珠單抗、抗-pd-1、抗-pd-l1、抗-ctla4等。這些抗體中許多是igg4抗體。如上所示，增強子的cd64部分能結(jié)合igg4，并如上文顯示的將原始adcc-陰性抗體轉(zhuǎn)變成adcc-陽性抗體。

對本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的是，在不背離本發(fā)明的范圍或精神的條件下，在本發(fā)明中可以做出多種修改和變化。通過對本文公開發(fā)明的說明書和實踐的考慮，本發(fā)明的其他實施方案將對本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯而易見的。說明書和實施例應(yīng)該被認為僅是示例性的，而本發(fā)明的真實范圍和精神由權(quán)利要求說明。

在整個申請中，參考多種出版物、專利和/或?qū)＠暾堃愿娴孛枋霰景l(fā)明所屬的領(lǐng)域的現(xiàn)狀。這些出版物、專利和/或?qū)＠暾埞_的全部內(nèi)容在此并入作為參考，在同樣程度上，正如每一個獨立的出版物、專利和/或?qū)＠暾埵翘囟ǖ睾蛦为毜卣f明并入作為參考。