本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種產(chǎn)異丁醇和乙醇的大腸桿菌及其制備方法。

背景技術(shù)：

目前全球的液體運輸燃料基本都是以石油為原料煉制的。這些燃料燃燒后會生成大量的溫室氣體，使全球的溫度升高。而全球變暖會引起一系列問題，如海平面上升、亞熱帶地區(qū)沙漠膨脹、冰川融化、凍土解凍、北極雨林和北方森林的面積縮小、海嘯和颶風(fēng)密度增加、物種滅絕等。生物質(zhì)是一種廣泛存在且可再生的清潔資源。通過生物制造法，生物質(zhì)可以被轉(zhuǎn)化為可再生的替代能源。近幾十年來，生物能源的研究開發(fā)主要集中在乙醇、丁醇、沼氣、氫氣和生物柴油等。醇類物質(zhì)由于其具有的易燃性以及可以與汽油混合等優(yōu)點，被認(rèn)為是未來汽油燃料的理想替代品。其中，乙醇是目前研究最成熟、利用微生物進(jìn)行生產(chǎn)并且實現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化的可再生能源。

但是，乙醇燃料具有很多潛在的問題。而與乙醇相比，長鏈醇作為燃料具有更多的優(yōu)勢，如其能量密度高，和汽油基本相同；親水性低，可與汽油高比例混合；能利用現(xiàn)有石油管道進(jìn)行運輸；能降低混合燃料的蒸汽壓，操作更安全等。異丁醇作為長鏈醇的典型代表，其生物合成早已受到廣泛重視。另外，除了作為燃料，異丁醇還可以直接用作溶劑，也可以轉(zhuǎn)化為異丁烯。異丁烯是重要的化工原料，可以用于制備丁基橡膠、聚異丁烯和合成橡膠等。同時，異丁醇在化工市場上也有很多用途，主要用于生產(chǎn)潤滑油添加劑、表面涂料、粘合劑等復(fù)合溶劑，同時還可以用于生產(chǎn)鄰苯二甲酸酯類增塑劑。

自然界中僅有個別微生物(例如釀酒酵母)能產(chǎn)少量的異丁醇。近幾年來，美國杜邦公司、美國gevo公司在構(gòu)建基因工程菌發(fā)酵生產(chǎn)異丁醇方面進(jìn)行了深入的研究。杜邦公司通過利用支鏈氨基酸的生物合成途徑和ehrlich途徑，首次在大腸桿菌中創(chuàng)建了異丁醇的生物合成途徑，并申請了相關(guān)專利。美國加州大學(xué)洛杉磯分校的jamesc.liao課題組，通過纈氨酸合成的中間代謝物2-酮基異戊酸來生產(chǎn)異丁醇。該研究小組通過在大腸桿菌中敲除乙醇脫氫酶基因adhe、乳酸脫氫酶基因ldha、富馬酸還原酶基因frd、轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子fnr、磷酸乙酰轉(zhuǎn)移酶基因pta、丙酮酸甲酸裂解酶基因pflb；過表達(dá)異丁醇合成途徑中的關(guān)鍵基因來自枯草芽孢桿菌的乙酰乳酸合酶基因alss，大腸桿菌來源的醇酮酸還原異構(gòu)酶基因ilvc，二羥基酸脫水酶基因ilvd，2-酮酸脫羧酶基因kivd和醇脫氫酶基因adha，獲得菌株jcl260。該菌株微氧發(fā)酵122h可以生產(chǎn)22g/l的異丁醇，轉(zhuǎn)化率達(dá)到86％。在用1l發(fā)酵罐進(jìn)行好氧發(fā)酵并用汽提法收集時，發(fā)酵72h可以生產(chǎn)50g/l的異丁醇。2009年，該課題組用聚球藻(synechococcuselongatuspcc7942，s.elongatuspcc7942)發(fā)酵生產(chǎn)異丁醇。結(jié)果顯示，發(fā)酵6天可以生產(chǎn)450mg/l異丁醇。jin-hoseo利用酵母菌(saccharomycescerevisiae，s.cerevisiae)作為表達(dá)宿主，采用微氧的發(fā)酵方式可以生產(chǎn)151mg/l的異丁醇。bernhardj.eikmanns用谷氨酸棒桿菌(corynebacteriumglutamicum，c.glutamicum)作為宿主菌，采用兩步法發(fā)酵生產(chǎn)異丁醇。結(jié)果異丁醇產(chǎn)量達(dá)到175mm，糖醇轉(zhuǎn)化率達(dá)到48％。聞建平等利用枯草芽孢桿菌(bacillussubtilis，b.subtilis)進(jìn)行好氧發(fā)酵，可以生產(chǎn)0.607g/l異丁醇。

目前報道的異丁醇工程菌絕大多數(shù)采用好氧工藝。好氧工藝在生產(chǎn)過程中需要用空氣，能耗很大；更關(guān)鍵的是，有相當(dāng)一部分碳源進(jìn)入三羧酸循環(huán)(tca)循環(huán)被用于細(xì)胞生長，導(dǎo)致轉(zhuǎn)化率比理論最大值要低很多。厭氧工藝和好氧相比，具有低能耗、高轉(zhuǎn)化率的優(yōu)點，生產(chǎn)過程中不需要通空氣，大大節(jié)約能耗；產(chǎn)品的轉(zhuǎn)化率通暢接近理論最大值。因此在生產(chǎn)生物能源和大宗化學(xué)品等低價值產(chǎn)品時，非常有必要使用厭氧發(fā)酵工藝。厭氧條件下，葡萄糖轉(zhuǎn)化為異丁醇的理論最大轉(zhuǎn)化率是1mol/mol。然而，異丁醇合成途徑存在的氧化還原問題導(dǎo)致目前的工程菌很難達(dá)到理論最大轉(zhuǎn)化率。從丙酮酸到異丁醇的合成途徑需要消耗2個還原力，一個是將乙酰乳酸還原為2,3-二羥基-3-甲基丁酸，由乙酰羥基酸還原異構(gòu)酶ilvc催化，該酶是nadph依賴型；另一個是將異丁醛轉(zhuǎn)化為異丁醇，由醇脫氫酶催化，該酶既有nadh依賴型，也有nadph依賴型。但是，在厭氧發(fā)酵時，葡萄糖的代謝主要是通過糖酵解途徑(emp途徑)，1mol葡萄糖代謝生產(chǎn)2mol丙酮酸的同時，會生成2molatp和2molnadh。因此，這就導(dǎo)致了厭氧條件下生產(chǎn)異丁醇的代謝工程改造的大腸桿菌中出現(xiàn)氧化還原力供給不平衡的問題，即nadh過剩，而nadph供給不足。

目前已經(jīng)有多種方法用于改造大腸桿菌使其能夠在厭氧條件下生產(chǎn)異丁醇。如通過定向進(jìn)化將酰羥基酸還原異構(gòu)酶ilvc和醇脫氫酶adh的由nadph依賴型改造成nadh依賴型，從而在微氧發(fā)酵時能夠獲得理論轉(zhuǎn)化率。另外，石愛琴等報道，同時激活轉(zhuǎn)氫酶pntab和nad激酶yfjb可以將厭氧條件下異丁醇的轉(zhuǎn)化率由0.66提高到0.92mol/mol。另外計算機(jī)模擬顯示，將異丁醇設(shè)計大腸桿菌厭氧發(fā)酵時的唯一產(chǎn)物是不可行的，該途徑必須與能夠氧化nadh的途徑相結(jié)合獲得的菌株才能同時支持細(xì)胞生長和異丁醇生產(chǎn)。由此設(shè)計的菌株在厭氧條件下能夠生產(chǎn)1.72g/l的異丁醇。但該方法只解決了nadh過剩的問題，而未解決nadph供給不足的問題。

大腸桿菌有三種途徑來合成nadph：磷酸戊糖途徑、tca循環(huán)和轉(zhuǎn)氫酶。在好氧條件下，磷酸戊糖途徑和tca循環(huán)分別貢獻(xiàn)了35-45％和20-25％的nadph，而轉(zhuǎn)氫酶貢獻(xiàn)了35-45％的nadph。在厭氧條件下，磷酸戊糖途徑和tca循環(huán)的活性很低，基本上所有的nadph都通過轉(zhuǎn)氫酶來供給，但由于其活力有限，并不能滿足異丁醇生產(chǎn)的需求。大腸桿菌工程菌株as108是前期構(gòu)建的能夠生產(chǎn)異丁醇的工程菌株。該菌株在厭氧條件下發(fā)酵時，能夠生產(chǎn)35mm的異丁醇，轉(zhuǎn)化率為0.66mol/mol，但是厭氧發(fā)酵中還存在的氧化還原力供給不平衡問題。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

為了進(jìn)一步優(yōu)化as108菌株中異丁醇的生產(chǎn)效率并解決厭氧發(fā)酵存在的氧化還原力供給不平衡問題，進(jìn)行如下：

本發(fā)明的一個目的是提供一種構(gòu)建生產(chǎn)異丁醇和/或乙醇重組菌的方法。

本發(fā)明提供的方法，包括如下步驟：

1)在大腸桿菌as108中表達(dá)乙醇脫氫酶基因adhe和丙酮酸甲酸裂解酶的編碼基因pflb，得到命名為a的重組菌；

2)降低所述命名為a的重組菌中的乙醇脫氫酶和/或提高所述命名為a的重組菌中的6-磷酸葡萄糖脫氫酶的酶活性，得到命名為b的重組菌。

上述方法中，步驟1)中，所述在大腸桿菌as108中表達(dá)乙醇脫氫酶基因adhe和丙酮酸甲酸裂解酶的編碼基因pflb為將所述乙醇脫氫酶基因adhe和所述丙酮酸甲酸裂解酶的編碼基因pflb導(dǎo)入所述大腸桿菌as108。

上述方法中，步驟2)中，所述降低命名為a的重組菌中的乙醇脫氫酶的酶活性為將所述命名為a的重組菌基因組中的乙醇脫氫酶編碼基因調(diào)控元件替換為rbsl調(diào)控元件5、rbsl調(diào)控元件6、rbsl調(diào)控元件7或rbsl調(diào)控元件8；

所述提高命名為a的重組菌中的6-磷酸葡萄糖脫氫酶的酶活性為將所述命名為a的重組菌基因組中的6-磷酸葡萄糖脫氫酶編碼基因調(diào)控元件替換為rbsl調(diào)控元件1、rbsl調(diào)控元件2、rbsl調(diào)控元件3或rbsl調(diào)控元件4；

所述rbsl調(diào)控元件1的核苷酸序列為序列6第54-142位核苷酸；

所述rbsl調(diào)控元件2的核苷酸序列為序列7第54-142位核苷酸；

所述rbsl調(diào)控元件3的核苷酸序列為序列8第54-142位核苷酸；

所述rbsl調(diào)控元件4的核苷酸序列為序列9第54-142位核苷酸；

所述rbsl調(diào)控元件5的核苷酸序列為序列12第51-139位核苷酸；

所述rbsl調(diào)控元件6的核苷酸序列為序列13第51-139位核苷酸；

所述rbsl調(diào)控元件7的核苷酸序列為序列14第51-139位核苷酸；

所述rbsl調(diào)控元件8的核苷酸序列為序列15第51-139位核苷酸。

上述方法中，包括如下步驟：

1)將所述乙醇脫氫酶基因adhe和所述丙酮酸甲酸裂解酶的編碼基因pflb導(dǎo)入所述大腸桿菌as108，得到命名為a的重組菌；

2)步驟2)為將所述命名為a的重組菌基因組中的乙醇脫氫酶編碼基因調(diào)控元件替換為rbsl調(diào)控元件6，且將所述命名為a的重組菌基因組中的6-磷酸葡萄糖脫氫酶編碼基因調(diào)控元件替換為rbsl調(diào)控元件2，得到命名為b的重組菌zl021。

上述導(dǎo)入和替換均通過兩步同源重組的方法進(jìn)行，具體見實施例。

本發(fā)明另一個目的是提供一種構(gòu)建生產(chǎn)異丁醇和/或乙醇重組菌的方法。

本發(fā)明提供的方法，包括如下步驟：在大腸桿菌as108中表達(dá)乙醇脫氫酶基因adhe和丙酮酸甲酸裂解酶的編碼基因pflb，得到命名為a的重組菌zl004。

上述方法中，所述在大腸桿菌as108中表達(dá)乙醇脫氫酶基因adhe和丙酮酸甲酸裂解酶的編碼基因pflb為將所述乙醇脫氫酶基因adhe和所述丙酮酸甲酸裂解酶的編碼基因pflb導(dǎo)入所述大腸桿菌as108。

由上述方法制備的命名為b的重組菌或由上述方法制備的命名為a的重組菌也是本發(fā)明保護(hù)的范圍。

上述方法或上述的重組菌在生產(chǎn)異丁醇和/或乙醇中的應(yīng)用也是本發(fā)明保護(hù)的范圍。

上述方法或上述的重組菌在提高異丁醇和/或乙醇產(chǎn)量中的應(yīng)用也是本發(fā)明保護(hù)的范圍。

本發(fā)明另一個目的是提供一種生產(chǎn)異丁醇和/或乙醇的方法。

本發(fā)明提供的方法，包括如下步驟：發(fā)酵上述的重組菌，得到異丁醇和/或丁醇。

本發(fā)明的實驗證明，本研究將通過在as108菌株中引入乙醇生產(chǎn)途徑來消耗掉過多的nadh，減少其積累對細(xì)胞造成的毒性，同時，激活磷酸戊糖途徑(pentosephosphatepathway，ppp途徑)來提高nadph的供給，從而改善異丁醇的生產(chǎn)能力；具體為將乙醇脫氫酶基因adhe和丙酮酸甲酸裂解酶的編碼基因pflb導(dǎo)入as108菌株，得到中間菌，且降低中間菌中的乙醇脫氫酶和/或提高中間菌中6-磷酸葡萄糖脫氫酶的酶活性，得到目的重組菌，該目的菌可以為用于聯(lián)產(chǎn)異丁醇和乙醇。

附圖說明

圖1為使用大腸桿菌工程菌株聯(lián)產(chǎn)異丁醇和乙醇。

圖2為異丁醇生產(chǎn)和zwf酶活性的關(guān)系；iso：異丁醇；zwf：6-磷酸葡萄糖脫氫酶。

圖3為adhe活性與異丁醇生產(chǎn)的關(guān)系；iso，異丁醇；adhe，醇脫氫酶。

圖4為組合調(diào)控adhe和zwf基因改善異丁醇生產(chǎn)；(a)異丁醇產(chǎn)量和轉(zhuǎn)化率，(b)乙醇產(chǎn)量和轉(zhuǎn)化率。iso,異丁醇；eth,乙醇；zwf,6-磷酸葡萄糖脫氫酶；adhe,醇脫氫酶。

具體實施方式

下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。

下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。

下述實施例中乙醇脫氫酶的氨基酸序列為序列19，其編碼基因adhe為序列2第332-3007位核苷酸；

丙酮酸甲酸裂解酶的氨基酸序列為序列20，其編碼基因pflb為序列4第871-3153位核苷酸；

6-磷酸葡萄糖脫氫酶的氨基酸序列為序列21，其編碼基因zwf為序列22。

本發(fā)明通過下述實施例進(jìn)一步闡明，但任何實施例或其組合不應(yīng)當(dāng)理解為對本發(fā)明的范圍或?qū)嵤┓绞降南拗?。本發(fā)明的范圍由所附權(quán)利要求書限定，結(jié)合本說明書和本領(lǐng)域一般常識，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可以清楚地明白權(quán)利要求書所限定的范圍。在不偏離本發(fā)明的精神和范圍的前提下，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行任何修改或改變，這種修改和改變也包含在本發(fā)明的范圍內(nèi)。

圖1為使用大腸桿菌工程菌株聯(lián)產(chǎn)異丁醇和乙醇。

表1為本發(fā)明所用的大腸桿菌菌株

表2本發(fā)明所用的質(zhì)粒

表3本發(fā)明所用到的引物

實施例1、重組大腸桿菌zl004的構(gòu)建及應(yīng)用

一、重組大腸桿菌zl002的構(gòu)建

1、構(gòu)建質(zhì)粒pxz021c。

第一步，以pxz020質(zhì)粒dna(shi,etal.,metabeng,2013,16:1-10)為模板，使用引物xz-adhe-1和xz-adhe-2進(jìn)行pcr擴(kuò)增，得到一條長4662bp的dna片段，稱為片段i；

上述擴(kuò)增體系為：newenglandbiolabsphusion5x緩沖液10μl、dntp(每種dntp各10mm)1μl、dna模板20ng、引物(10μm)各2μl、phusionhigh-fidelitydna聚合酶(2.5u/μl)0.5μl、蒸餾水33.5μl，總體積為50μl。

上述擴(kuò)增條件為98℃預(yù)變性2分鐘(1個循環(huán))；98℃變性10秒、56℃退火10秒、72℃延伸30秒(30個循環(huán))；72℃延伸5分鐘(1個循環(huán))。

第二步，以pxz-cs質(zhì)粒dna(tan,etal.,applenvironmicrobiol,2013,79:4838-4844)為模板，使用引物cat-sacb-up和cat-sacb-down擴(kuò)增出含有cat-sacb的dna片段，稱為片段ii。擴(kuò)增體系和擴(kuò)增條件參見上文第一步。

第三步，片段i的磷酸化處理，反應(yīng)步驟和體系為：8μl需處理的pcr片段i于70℃水浴處理5min；然后，依次加入1μl的t4dna連接酶緩沖液，加入0.5μl的t4多聚核苷酸激酶，于37℃反應(yīng)60分鐘。然后，于60℃溫浴20分鐘以將t4多聚核苷酸激酶滅活，得到磷酸化處理后的片段i。

pcr純化試劑盒清洗(gel/pcrextrationkit，購自biomiga生物技術(shù)有限公司)磷酸化處理后的片段。

第四步，將第三步得到的磷酸化處理后的片段i和第二步得到的片段ii各取20ng，加入1μl10xt4連接緩沖液(neb公司)、1μlt4-dna連接酶(neb公司)，補充蒸餾水至10μl，25℃反應(yīng)5分鐘；得到質(zhì)粒pxz021c。

2、重組大腸桿菌zl002的構(gòu)建

從大腸桿菌重組菌as108(shi,etal.,metabeng,2013,16:1-10)出發(fā)，采用兩步同源重組的方法恢復(fù)as108中的adhe基因，獲得重組大腸桿菌zl002，具體包括以下步驟：

1)第一次同源重組構(gòu)建重組大腸桿菌zl001

(1)用于同源重組的dna片段i的制備

以上述1制備的質(zhì)粒pxz021c為模板，使用引物xz-adhe-up/xz-adhe-down擴(kuò)增出3689bpdna片段i。

擴(kuò)增體系和擴(kuò)增條件同上。

3689bpdna片段i的核苷酸序列為序列表中序列1，該片段包含約700個堿基乙醇脫氫酶編碼基因adhe上游同源臂(序列1第1-705位核苷酸)、cat-sacbdna片段(序列1第706-3324位核苷酸)、約400個堿基乙醇脫氫酶編碼基因adhe下游同源臂(序列1第3325-3689位核苷酸)。

(2)第一次同源重組

將3689bpdna片段i電轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化至帶有pkd46的大腸桿菌as108，實現(xiàn)第一次同源重組，具體如下：

首先將pkd46質(zhì)粒(datsenkoandwanner2000,procnatlacadsciusa97:6640-6645；質(zhì)粒購買于美國耶魯大學(xué)cgsc大腸桿菌保藏中心，cgsc#7739)通過電轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化至大腸桿菌as108，得到帶有pkd46的大腸桿菌as108；將50μl帶有pkd46的大腸桿菌as108感受態(tài)細(xì)胞置于冰上，加入50ngdna片段i，冰上放置2分鐘，轉(zhuǎn)移至0.2cm的bio-rad電擊杯。使用micropulser(bio-rad公司)電穿孔儀，電擊參數(shù)為電壓2.5kv。電擊后迅速將1mllb培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移至電擊杯中，吹打5次后轉(zhuǎn)移至試管中，75rpm，30℃孵育2小時。取200μl菌液涂在含有氨芐霉素(終濃度為100μg/ml)和氯霉素(終濃度為34μg/ml)的lb平板上，37℃過夜培養(yǎng)后，挑選5個單菌落進(jìn)行pcr驗證，使用引物xz-adhe-up/xz-adhe-down進(jìn)行驗證(得到3689bp為陽性)，挑選一個陽性單菌落，命名為zl001。

2)第二次同源重組構(gòu)建重組大腸桿菌zl002

(1)用于同源重組的dna片段ii的制備

以大腸桿菌atcc8739dna為模板，用引物xz-adhe-up/xz-adhe-down擴(kuò)增出3313bpdna片段ii。

擴(kuò)增體系和擴(kuò)增條件同上。

3313bpdna片段ii的核苷酸序列為序列表中序列2，該片段包含約300個堿基乙醇脫氫酶編碼基因adhe上游同源臂(序列2第1-331位核苷酸)、乙醇脫氫酶編碼基因adhe(序列2第332-3007位核苷酸)、約300個堿基乙醇脫氫酶編碼基因adhe下游同源臂(序列2第3008-3313位核苷酸)。

(2)第二次同源重組

將3313bpdna片段ii電轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化至帶有pkd46的大腸桿菌as108，實現(xiàn)第二次同源重組，具體如下：

首先將pkd46質(zhì)粒通過電轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化至大腸桿菌zl001，得到帶有pkd46的大腸桿菌zl001；將50μl帶有pkd46的大腸桿菌zl001感受態(tài)細(xì)胞置于冰上，加入50ngdna片段ii，冰上放置2分鐘，轉(zhuǎn)移至0.2cm的bio-rad電擊杯。使用micropulser(bio-rad公司)電穿孔儀，電擊參數(shù)為電壓2.5kv。電擊后迅速將1mllb培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移至電擊杯中，吹打5次后轉(zhuǎn)移至試管中，75轉(zhuǎn)，30℃孵育4小時。將菌液轉(zhuǎn)移至含有10％蔗糖的沒有氯化鈉的lb液體培養(yǎng)基(250ml燒瓶中裝50ml培養(yǎng)基)，培養(yǎng)24小時后在含有6％蔗糖的沒有氯化鈉的lb固體培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)。經(jīng)過pcr驗證，所用引物為xz-adhe-up/xz-adhe-down(得到3313bp為陽性)，挑選一個陽性單菌落，將其命名為zl002。

重組菌zl002為將乙醇脫氫酶基因adhe導(dǎo)入大腸桿菌as108中，得到的重組菌。

二、重組大腸桿菌zl004的構(gòu)建

1、質(zhì)粒的構(gòu)建

為了將pflb基因整合在acka-pta位點，需構(gòu)建3個質(zhì)粒：

1)質(zhì)粒pxz023

以e.coliatcc8739基因組為模板，用引物xz-acka-up/xz-pta-down將acka-pta基因及其操縱子和鄰近的513bp擴(kuò)增下來，得到片段i；然后克隆到peasy-blunt克隆載體上，克隆方法為將上面所述pcr所獲得的片段i取1μl，加入1μlpeasy-bluntsimple載體(試劑盒，北京全式金生物技術(shù)有限公司)，25℃反應(yīng)15分鐘；氯化鈣轉(zhuǎn)化法：加入50μltrans10感受態(tài)細(xì)胞(購自北京全式金生物技術(shù)有限公司)中進(jìn)行，冰浴30分鐘。42℃熱激30秒，立即置于冰上2分鐘。加入500μllb培養(yǎng)基，200rpm，37℃孵育1小時。取200μl菌液涂在含有氨芐霉素(終濃度為100μg/ml)的lb平板上，過夜培養(yǎng)后，挑選5個陽性單菌落，進(jìn)行菌落pcr驗證，引物為m13-f/m13-r。送樣測序分析，結(jié)果正確的陽性克隆為dna片段i連接到peasy-bluntsimple載體中的質(zhì)粒，挑取1個正確的質(zhì)粒命名為pxz023。

2)、質(zhì)粒pxz024c

以pxz023質(zhì)粒dna為模板，用引物xz-acka-1/xz-pta-2擴(kuò)增出一條長4662bp的dna片段ii；以pxz-cs質(zhì)粒dna為模板，用引物cat-sacb-up/down擴(kuò)增出含有cat-sacb的dna片段iii。磷酸化處理片段ii，然后用t4快連酶將磷酸化處理的dna片段ii和dna片段iii連接起來得到質(zhì)粒pxz024c。

3)、質(zhì)粒pxz-pl001

以e.coliatcc8739基因組為模板，用引物pflb-up-pp/pflb-down-p擴(kuò)增出含有磷酸化末端的pflb的dna片段iv，將上述第二步中獲得的dna片段ii和片段iv連接起來得到質(zhì)粒pxz-pl001。

2、重組大腸桿菌zl004的構(gòu)建

從大腸桿菌重組菌zl002出發(fā)，采用兩步同源重組的方法將pflb基因整合在重組菌zl002基因組的acka-pta位點，獲得重組大腸桿菌zl002，具體包括以下步驟：

1)第一次同源重組構(gòu)建重組大腸桿菌zl003

(1)用于同源重組的dna片段i的制備

以質(zhì)粒pxz024c質(zhì)粒dna為模板，使用引物xz-acka-up/xz-pta-down擴(kuò)增出3709bpdna片段i。

3709bpdna片段i的核苷酸序列為序列表中序列3，該片段包含約400個堿基acka基因上游同源臂、cat-sacbdna片段(序列3第661-3279位核苷酸)、約400個堿基pta基因下游同源臂。

(2)第一次同源重組

將上述(1)獲得的3709bpdna片段i電轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化至帶有pkd46的大腸桿菌zl002，實現(xiàn)第一次同源重組，得到重組菌zl003；方法同上述步驟一的2。

使用引物xz-acka-up/xz-pta-down進(jìn)行驗證(得到3709bp為陽性)，挑選一個陽性單菌落，命名為zl003。

2)第二次同源重組構(gòu)建重組大腸桿菌zl004

(1)用于同源重組的dna片段ii的制備

以pxz-pl001質(zhì)粒dna為模板，用引物xz-acka-up/xz-pta-down擴(kuò)增出3614bpdna片段ii。

3614bpdna片段ii的核苷酸序列為序列表中序列4，該片段包含約320個堿基acka上游同源臂(序列4第1-320位核苷酸)、pflb基因啟動子區(qū)(序列4第321-870位核苷酸)、pflb基因(序列4第871-3153位核苷酸，請指明)、約400個堿基pta下游同源臂(序列4第3154-3614位核苷酸)。

(2)第二次同源重組

將3614bpdna片段ii電轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化至帶有pkd46的大腸桿菌zl003，實現(xiàn)第二次同源重組，得到重組菌zl004。方法同上述步驟一的2。

使用引物xz-acka-up/xz-pta-down進(jìn)行驗證(得到3614bp為陽性)，挑選一個陽性單菌落，命名為zl004。

重組菌zl004為將乙醇脫氫酶基因adhe和pflb基因?qū)氪竽c桿菌as108中，得到的重組菌。

三、重組大腸桿菌zl004生產(chǎn)異丁醇

種子培養(yǎng)基由以下成分組成(溶劑為水)：

大量元素：葡萄糖20g/l，nh4h2po40.87g/l、(nh4)2hpo42.63g/l、mgso4·7h2o0.18g/l、甜菜堿-hcl0.15g/l。

微量元素：fecl3·6h2o1.5μg/l、cocl2·6h2o0.1μg/l、cucl2·2h2o0.1μg/l、zncl20.1μg/l、na2moo4·2h2o0.1μg/l、mncl2·4h2o0.2μg/l,h3bo30.05μg/l。

發(fā)酵培養(yǎng)基大部分和種子培養(yǎng)基相同，區(qū)別是葡萄糖濃度為50g/l。

1、發(fā)酵培養(yǎng)

將上述二制備的重組菌zl004進(jìn)行厭氧發(fā)酵，包括以下步驟：

(1)種子培養(yǎng)：將lb平板上新鮮的重組菌zl004接種到含有4ml種子培養(yǎng)基的試管中，37℃，250rpm振蕩培養(yǎng)過夜。然后，將1ml培養(yǎng)物轉(zhuǎn)接到含有30ml種子培養(yǎng)基的250ml三角瓶中，37℃，250rpm振蕩培養(yǎng)至od550＝4，即為種子培養(yǎng)液。種子培養(yǎng)液用于發(fā)酵培養(yǎng)基接種。

(2)發(fā)酵培養(yǎng)：100ml厭氧小瓶中發(fā)酵培養(yǎng)基體積為50ml，將種子液按照終濃度od550＝0.1的接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基，37℃靜置培養(yǎng)6天，得到發(fā)酵液。發(fā)酵液為發(fā)酵罐內(nèi)所有物質(zhì)。培養(yǎng)過程沒有通任何氣體。

2、異丁醇檢測

使用安捷倫(agilent-1260)高效液相色譜儀對144小時的發(fā)酵液中的組分(如葡萄糖、有機(jī)酸)進(jìn)行測定，采用伯樂(biorad)公司的aminexhpx–87h有機(jī)酸分析柱(300mm×7.8mm,9.0μm,bio-rad,usa)，上樣量20μl，流動相為5mmh2so4，洗脫時間50min，洗脫流速0.5ml/min。

異丁醇標(biāo)準(zhǔn)品購自sigma公司，產(chǎn)品目錄號為58448，cas.no.78-83-1。異丁醇出峰時間為38.5min，檢測樣品中有相同保留時間的峰確認(rèn)為異丁醇。

乙醇標(biāo)準(zhǔn)品購自sigma公司，產(chǎn)品目錄號為46139，cas.no.64-17-5。乙醇出峰時間為25.3min，檢測樣品中有相同保留時間的峰確認(rèn)為乙醇。

葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品購自sigma公司，產(chǎn)品目錄號為g8270，cas.no.50-99-7。葡萄糖出峰時間為10.8min，檢測樣品中有相同保留時間的峰確認(rèn)為葡萄糖。

異丁醇產(chǎn)量的標(biāo)曲函數(shù)式y(tǒng)g/l＝(x+5445.5)/238871，x為異丁醇濃度g/l，y為峰面積

乙醇產(chǎn)量的標(biāo)曲函數(shù)式y(tǒng)g/l＝(x+54.565)/100673)，x為乙醇濃度g/l，y為峰面積。

葡萄糖含量的標(biāo)曲函數(shù)式y(tǒng)g/l＝(x-107566.495)/409845，x為葡萄糖濃度g/l，y為峰面積。

總的糖醇轉(zhuǎn)化率＝(異丁醇產(chǎn)量+乙醇產(chǎn)量)/(葡萄糖初始量-葡萄糖殘余量)。

異丁醇轉(zhuǎn)化率＝異丁醇產(chǎn)量/(葡萄糖初始量-葡萄糖殘余量)；

乙醇轉(zhuǎn)化率＝乙醇產(chǎn)量/(葡萄糖初始量-葡萄糖殘余量)。

結(jié)果重組菌zl004在厭氧條件下發(fā)酵144小時，能夠生產(chǎn)23mm異丁醇和36mm乙醇?？偟奶谴嫁D(zhuǎn)化率達(dá)到0.74mol/mol。

異丁醇和乙醇的轉(zhuǎn)化率分別為0.29mol/mol和0.45mol/mol。

as108不產(chǎn)乙醇；as108生產(chǎn)的異丁醇產(chǎn)量35mm,異丁醇轉(zhuǎn)化率0.66。

實施例2、重組大腸桿菌zl004中zwf基因的調(diào)控

從zl004出發(fā)，通過rbs文庫調(diào)控葡萄糖-6-磷酸脫氫酶編碼基因zwf，包括以下步驟：

1、第一次同源重組構(gòu)建重組大腸桿菌zl004-zwf

(1)用于同源重組的dna片段i的制備

以pxz-cs質(zhì)粒dna為模板，使用引物zwf-cat-sacb-up/down擴(kuò)增出2722bp的dna片段i。

2722bp的dna片段i的核苷酸序列為序列表中序列5，該片段包含約50bpzwf基因調(diào)控區(qū)域上游同源臂(序列5第1-53位核苷酸)、cat-sacb基因片段(序列5第54-2672位核苷酸)、zwf基因起始50bp作為下游同源臂(序列5第2673-2722位核苷酸)。

(2)第一次同源重組

將上述(1)獲得的2722bp的dna片段i電轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化至帶有pkd46的大腸桿菌zl004，實現(xiàn)第一次同源重組，得到重組菌zl004-zwf；方法同實施例1。

使用引物zwf-yz-up/down進(jìn)行驗證，(得到3198bp為陽性)，挑選一個陽性單菌落，命名為zl004-zwf。

2、第二次同源重組構(gòu)建重組大腸桿菌zl005、zl006、zl007、zl008

(1)用于同源重組的dna片段ii的制備

以m1-93(lu,etal.,applmicrobiolbiotechnol,2012,93:2455-2462)基因組dna為模板，使用引物zwf-p-up/zwf-rbsl1-down擴(kuò)增出193bp的序列6所示的dna片段ii(含有rbsl1)。

以m1-93(lu,etal.,applmicrobiolbiotechnol,2012,93:2455-2462)基因組dna為模板，使用引物zwf-p-up/zwf-rbsl2-down擴(kuò)增出193bp的序列7所示的dna片段ii(含有rbsl2)。

以m1-93(lu,etal.,applmicrobiolbiotechnol,2012,93:2455-2462)基因組dna為模板，使用引物zwf-p-up/zwf-rbsl3-down擴(kuò)增出193bp的序列8所示的dna片段ii(含有rbsl3)。

以m1-93(lu,etal.,applmicrobiolbiotechnol,2012,93:2455-2462)基因組dna為模板，使用引物zwf-p-up/zwf-rbsl4-down擴(kuò)增出193bp的序列9所示的dna片段ii(含有rbsl4)。

(2)第二次同源重組

將上述不同的192bp的dna片段ii電轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化至帶有pkd46的大腸桿菌zl004，實現(xiàn)第二次同源重組，得到重組菌zl005，zl006，zl007和zl008。

重組菌zl005為將重組菌zl004基因組中的zwf調(diào)控因子(序列10)替換為rbsl1(序列6第54-142位核苷酸)。

重組菌zl006為將重組菌zl004基因組中的zwf調(diào)控因子(序列10)替換為rbsl2(序列7第54-142位核苷酸)。

重組菌zl007為將重組菌zl004基因組中的zwf調(diào)控因子(序列10)替換為rbsl3(序列8第54-142位核苷酸)。

重組菌zl008為將重組菌zl004基因組中的zwf調(diào)控因子(序列10)替換為rbsl4(序列9第54-142位核苷酸)。

方法同實施例1。

使用引物zwf-yz-up/down進(jìn)行驗證(得到668bp為陽性)。

3、重組菌株zl005、zl006、zl007、zl008生產(chǎn)異丁醇

方法同實施例1的三，結(jié)果如圖2所示，調(diào)控zwf基因的表達(dá)激活ppp途徑后獲得的菌株zl005，zl006，zl007和zl008中，異丁醇產(chǎn)量都發(fā)生了明顯變化。其中產(chǎn)量最高的菌株zl006發(fā)酵144小時能夠生產(chǎn)33mm異丁醇，轉(zhuǎn)化率為0.41。相比zl004菌株，異丁醇產(chǎn)量提高了43％，轉(zhuǎn)化率提高了41％。

4、重組菌株zl005、zl006、zl007、zl008中zwf酶活測定

對重組菌株zl005，zl006，zl007，zl008中zwf的酶活進(jìn)行測定，具體包括以下步驟：

1)、發(fā)酵培養(yǎng)

重組菌株zl005，zl006，zl007，zl008的發(fā)酵培養(yǎng)同實施例1中zl004的發(fā)酵培養(yǎng)。

2)、細(xì)胞粗酶液制備

取30ml對數(shù)生長中后期的發(fā)酵液于50ml離心管中，4℃，10000rpm離心5min，棄去上清液，收集菌體，用15ml100mmtris-hclbuffer洗滌2次后，用3ml100mmtris-hcl將菌體懸浮，冰浴超聲(功率：25w；開：1s；關(guān)：3s)破碎3-5分鐘，4℃，10000rpm離心30min，收集上清液用于酶活測定。

粗酶液總蛋白濃度的測定：粗酶液總蛋白濃度用bio-radproteinassay(伯樂生物技術(shù)有限公司)試劑盒進(jìn)行測定，操作按照試劑盒提供的說明書進(jìn)行。

3)、zwf的酶活測定

1ml反應(yīng)液中含有100mmtris-hcl(ph7.5),10mmmgcl2,1mmdtt,0.5mmnadp+,2mm6-磷酸葡萄糖，40ml粗酶液。酶活通過測定nadph在340nm的吸收值變化確定zwf的酶活性。nadph在340nm下的消光系數(shù)為6.22cm^-1mm^-1。酶活性單位定義為：反應(yīng)1分鐘，生成1μmolnadph所需要的酶量，為一個酶活性單位。

結(jié)果如圖2所示，與重組菌株zl004相比，重組菌株zl005，zl006，zl007，zl008中zwf的酶活顯著提高。且比較異丁醇產(chǎn)量，可以看出，在一定范圍內(nèi)(≤0.65u/mg)，異丁醇產(chǎn)量和zwf的酶活呈正相關(guān)。但當(dāng)zwf酶活繼續(xù)提高時，異丁醇產(chǎn)量則會降低。

實施例3、重組大腸桿菌zl004中adhe基因的調(diào)控

從zl004出發(fā)，通過rbs文庫調(diào)控乙醇脫氫酶編碼基因adhe，包括以下步驟：

1、第一次同源重組構(gòu)建重組大腸桿菌zl004-adhe

(1)用于同源重組的dna片段i的制備

以pxz-cs質(zhì)粒dna為模板，使用引物adhe-cat-sacb-up/down擴(kuò)增出2719bp的dna片段i。

2719bp的dna片段i的核苷酸序列為序列表中序列11，該片段包含約50bpadhe基因調(diào)控區(qū)域上游同源臂(序列11第1-50位核苷酸)、cat-sacb片段(序列11第51-2669位核苷酸)、adhe基因起始50bp序列為下游同源臂(序列11第2670-2719位核苷酸)。

(2)第一次同源重組

將上述(1)獲得的2719bp的dna片段i電轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化至帶有pkd46的大腸桿菌zl004，實現(xiàn)第一次同源重組，得到重組菌zl004-adhe；方法同實施例1。

使用adhe-yz-up/down進(jìn)行驗證，(得到3710bp為陽性)，挑選一個陽性單菌落，命名為zl004-adhe。

2、第二次同源重組構(gòu)建重組大腸桿菌zl009、zl010、zl015、zl018

(1)用于同源重組的dna片段ii的制備

以m1-93(lu,etal.,applmicrobiolbiotechnol,2012,93:2455-2462)基因組dna為模板，使用引物adhe-p-up/adhe-rbsl1-down擴(kuò)增出189bp的序列12所示的dna片段ii(含有rbsl5)。

以m1-93(lu,etal.,applmicrobiolbiotechnol,2012,93:2455-2462)基因組dna為模板，使用引物adhe-p-up/adhe-rbsl2-down擴(kuò)增出189bp的序列13所示的dna片段ii(含有rbsl6)。

以m1-93(lu,etal.,applmicrobiolbiotechnol,2012,93:2455-2462)基因組dna為模板，使用引物adhe-p-up/adhe-rbsl3-down擴(kuò)增出189bp的序列14所示的dna片段ii(含有rbsl7)。

以m1-93(lu,etal.,applmicrobiolbiotechnol,2012,93:2455-2462)基因組dna為模板，使用引物adhe-p-up/adhe-rbsl4-down擴(kuò)增出189bp的序列15所示的dna片段ii(含有rbsl8)。

(2)第二次同源重組

將上述各種189bp的dna片段ii電轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化至帶有pkd46的大腸桿菌zl004-adhe，實現(xiàn)第二次同源重組，得到重組菌zl009，zl010，zl015和zl018。

重組菌zl009為將重組菌zl004基因組中的adhe調(diào)控因子(序列18)替換為rbsl5(序列12第51-139位)。

重組菌zl010為將重組菌zl004基因組中的adhe調(diào)控因子(序列18)替換為rbsl6(序列13第51-139位)。

重組菌zl015為將重組菌zl004基因組中的adhe調(diào)控因子(序列18)替換為rbsl7(序列14第51-139位)。

重組菌zl018為將重組菌zl004基因組中的adhe調(diào)控因子(序列18)替換為rbsl8(序列15第51-139位)。

方法同實施例1。

使用引物adhe-yz-up/down進(jìn)行驗證(得到1180bp為陽性)。

3、重組大腸桿菌zl009、zl010、zl015、zl018生產(chǎn)異丁醇

方法同實施例1的三，結(jié)果如圖3所示，結(jié)調(diào)控adhe基因的表達(dá)后獲得的菌株zl009，zl0010，zl015和zl018中，異丁醇產(chǎn)量都發(fā)生了明顯變化。其中產(chǎn)量最高的菌株zl010發(fā)酵144小時能夠生產(chǎn)37mm異丁醇，轉(zhuǎn)化率為0.6。相比zl004菌株，異丁醇產(chǎn)量提高了60％，轉(zhuǎn)化率提高了107％。

4、重組菌株zl009，zl0010，zl015和zl018中adhe的酶活測定

對重組菌株zl009，zl0010，zl015和zl018中adhe的酶活進(jìn)行測定，具體包括以下步驟：

1)、發(fā)酵培養(yǎng)

重組菌株zl009，zl0010，zl015和zl018的發(fā)酵培養(yǎng)同實施例1中zl004的發(fā)酵培養(yǎng)。

2)、細(xì)胞粗酶液制備

取30ml對數(shù)生長中后期的發(fā)酵液于50ml離心管中，4℃，10000rpm離心5min，棄去上清液，收集菌體，用15ml100mmtris-hclbuffer洗滌2次后，用3ml100mmtris-hcl將菌體懸浮，冰浴超聲(功率：25w；開：1s；關(guān)：3s)破碎3-5分鐘，4℃，10000rpm離心30min，收集上清液用于酶活測定。

粗酶液總蛋白濃度的測定：粗酶液總蛋白濃度用bio-radproteinassay(伯樂生物技術(shù)有限公司)試劑盒進(jìn)行測定，操作按照試劑盒提供的說明書進(jìn)行。

3)、adhe的酶活測定

1ml反應(yīng)液中含有50mmtris-hcl(ph7.5),0.25mmnadh,0.5mm乙酰輔酶a，50ml粗酶液。酶活通過測定nadh在340nm的吸收值變化確定adhe的酶活性。nadh在340nm下的消光系數(shù)為6.22cm^-1mm^-1。酶活性單位定義為：反應(yīng)1分鐘，消耗1molnadh所需要的酶量，為一個酶活性單位。

結(jié)果如圖3所示，與重組菌株zl004相比，重組菌株zl005，zl006，zl007，zl008中adhe的酶活顯著降低。異丁醇產(chǎn)量和adhe的酶活性呈負(fù)相關(guān)。adhe酶活越低的菌株異丁醇產(chǎn)量越高。含有最低adhe酶活性(0.1u/mgprotein)的菌株zl010生產(chǎn)的異丁醇產(chǎn)量最高，達(dá)到37mm，異丁醇轉(zhuǎn)化率達(dá)到0.6。

實施例4、重組大腸桿菌zl004中adhe基因和zwf基因的組合調(diào)控

根據(jù)實施例2中zwf酶活性測定的結(jié)果，從zwf基因的rbs文庫中分別篩選出低活性(low，l)、中等活性(medium，m)、以及高活性(high，h)的zwf基因的調(diào)控元件，與實施例3中根據(jù)adhe酶活性測定的結(jié)果篩選出的adhe基因rbs文庫中低活性(low，l)、中等活性(medium，m)、以及高活性(high，h)的adhe基因的調(diào)控元件進(jìn)行組合，共獲得9株重組菌株。

表4為9種adhe基因和zwf基因組合調(diào)控獲得的工程菌株

具體如下：

1、adhe基因和zwf基因的組合調(diào)控制備重組菌株zl021、zl022

1)第一次同源重組構(gòu)建重組大腸桿菌zl010-zwf

(1)用于同源重組的dna片段i的制備

用于同源重組的dna片段i為序列5所示的2722bp的dna片段i。

(2)第一次同源重組

將序列5所示的2722bp的dna片段i電轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化至帶有pkd46的大腸桿菌zl010，實現(xiàn)第一次同源重組，得到重組菌zl010-zwf；方法同實施例1。

使用zwf-yz-up/zwf-yz-down進(jìn)行驗證進(jìn)行驗證，(得到3198bp為陽性)，挑選一個陽性單菌落，命名為zl010-zwf。

2)第二次同源重組構(gòu)建重組大腸桿菌zl021、zl022

(1)用于同源重組的dna片段ii的制備

以重組菌株zl006的基因組dna為模板，使用引物zwf-yz-up/zwf-yz-down進(jìn)行pcr擴(kuò)增，獲得667bpdna片段ii。

667bpdna片段ii的核苷酸序列為序列16。

以重組菌株zl007的基因組dna為模板，使用引物zwf-yz-up/zwf-yz-down進(jìn)行pcr擴(kuò)增，獲得667bpdna片段ii。

667bpdna片段ii的核苷酸序列為序列17。

(2)第二次同源重組

將上述序列16所示的dna片段ii電轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化至帶有pkd46的大腸桿菌zl010-zwf，實現(xiàn)第二次同源重組，得到重組菌zl021。

將上述序列17所示的dna片段ii電轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化至帶有pkd46的大腸桿菌zl010-zwf，實現(xiàn)第二次同源重組，得到重組菌zl022。

篩選菌落時使用zwf-yz-up/zwf-yz-down進(jìn)行驗證(得到667bp為陽性)。

重組菌zl021為將重組菌zl004基因組中的乙醇脫氫酶基因adhe的調(diào)控因子替換為rbsl6，且將zwf基因的調(diào)控因子替換為rbsl2得到的重組菌。

重組菌zl022為將重組菌zl004基因組中的乙醇脫氫酶基因adhe的調(diào)控因子替換為rbsl6，且將zwf基因的調(diào)控因子替換為rbsl3得到的重組菌。

2、adhe基因和zwf基因的組合調(diào)控制備重組菌株zl019、zl020

1)第一次同源重組構(gòu)建重組大腸桿菌zl015-zwf

(1)用于同源重組的dna片段i的制備

用于同源重組的dna片段i為序列5所示的2722bp的dna片段i。

(2)第一次同源重組

將序列5所示的2722bp的dna片段i電轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化至帶有pkd46的大腸桿菌zl015，實現(xiàn)第一次同源重組，得到重組菌zl015-zwf；方法同實施例1。

使用zwf-yz-up/zwf-yz-down進(jìn)行驗證進(jìn)行驗證，(得到3198bp為陽性)，挑選一個陽性單菌落，命名為zl015-zwf。

2)第二次同源重組構(gòu)建重組大腸桿菌zl019、zl020

(1)用于同源重組的dna片段ii的制備

以重組菌株zl006的基因組dna為模板，使用引物zwf-yz-up/zwf-yz-down進(jìn)行pcr擴(kuò)增，獲得667bpdna片段ii。

667bpdna片段ii的核苷酸序列為序列16。

以重組菌株zl007的基因組dna為模板，使用引物zwf-yz-up/zwf-yz-down進(jìn)行pcr擴(kuò)增，獲得667bpdna片段ii。

667bpdna片段ii的核苷酸序列為序列17。

(2)第二次同源重組

將上述序列16所示的dna片段ii電轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化至帶有pkd46的大腸桿菌zl015-zwf，實現(xiàn)第二次同源重組，得到重組菌zl019。

將上述序列17所示的dna片段ii電轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化至帶有pkd46的大腸桿菌zl015-zwf，實現(xiàn)第二次同源重組，得到重組菌zl020。

篩選菌落時使用zwf-yz-up/zwf-yz-down進(jìn)行驗證(得到667bp為陽性)。

重組菌zl019為將重組菌zl004基因組中的乙醇脫氫酶基因adhe的調(diào)控因子替換為rbsl7，且將zwf基因的調(diào)控因子替換為rbsl2得到的重組菌。

重組菌zl020為將重組菌zl004基因組中的乙醇脫氫酶基因adhe的調(diào)控因子替換為rbsl7，且將zwf基因的調(diào)控因子替換為rbsl3得到的重組菌。

3、重組大腸桿菌zl021、zl022、zl019、zl020生產(chǎn)異丁醇

方法同實施例1的三，結(jié)果如圖4所示，異丁醇產(chǎn)量和轉(zhuǎn)化率最高的菌株來自含有低活性adhe和中等活性zwf的菌株zl021。該菌株發(fā)酵144小時，能夠生產(chǎn)53mm的異丁醇，轉(zhuǎn)化率為0.74mol/mol。與單純生產(chǎn)異丁醇的工程菌株as108相比，zl021中異丁醇的產(chǎn)量和轉(zhuǎn)化率分別提高了51％和12％。同時，zl021中總的糖醇轉(zhuǎn)化率相對于as108提高了23％，達(dá)到0.81mol/mol。