一種牛支原體環(huán)介導等溫擴增試劑盒及其應用
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及微生物檢測技術領域，具體說是涉及一種快速、可視化并且可實時定 量檢測牛支原體的環(huán)介導等溫擴增試劑盒及其應用。
【背景技術】
[0002] 牛支原體（My cop lasma bovis)是感染牛的一種重要的致病性病原體，1961年 Hale在美國首次從患乳腺炎的牛乳中分離到該病原，1976年首次報道與牛呼吸系統(tǒng)疾病 有關。目前已證實牛支原體除導致牛肺炎、乳腺炎外，還可導致關節(jié)炎、角膜結(jié)膜炎、耳炎、 生殖道炎癥、流產(chǎn)與不孕等多種疾病。
[0003] 該病在世界范圍內(nèi)存在，歐洲每年約有25%~33%的犢牛肺炎是由牛支原體引起 的，相當于每年損失1. 44億~1. 92億歐元，其中英國每年有190萬頭?；寂Ｖгw肺炎， 死亡達15. 7萬頭。美國每年由于牛支原體導致的牛呼吸系統(tǒng)疾病和乳腺疾病所造成損失 達1. 4億美元，單個牛場最高感染率達70%。在我國，1983年黎濟申首次報道從乳腺炎牛 乳中牛分離到牛支原體，此后只有零星臨床報道證實牛支原體導致奶牛乳腺炎。2008年以 來，我國部分地區(qū)新從外地引進肉牛暴發(fā)了以壞死性肺炎為主要特征的傳染性牛支原體肺 炎疫情，發(fā)病率為50%~100%，病死率高達10%~50%，給我國養(yǎng)牛業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失。
[0004] 對牛支原體的準確、快速檢測，有利于養(yǎng)殖場對牛支原體病做出正確的處理措施， 以及有利于日常的防治。牛支原體的病原檢測，病原分離是牛支原體確診的"金標準"，但其 分離鑒定難度大、靈敏度低、耗時、需要復雜的設備及培養(yǎng)條件。聚合酶鏈式反應（PCR)法 等雖然特導性和敏感性都較高，但卻需要昂貴的PCR儀、電泳槽等精密儀器，不適用于基層 開展。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0005] 本發(fā)明的目的是提供一種為基層簡便、快捷準確地檢測牛支原體的方法，公開一 種快速、實時定量的檢測牛支原體環(huán)介導等溫擴增試劑盒。為實現(xiàn)本發(fā)明目的所使用的技 術方案為：一種牛支原體環(huán)介導等溫擴增試劑盒，該試劑盒包括LAMP引物、2X反應緩沖 液、BstDNA聚合酶、熒光目視檢測試劑、超純水和牛支原體DNA模板，所述的LAMP引物包 括外引物F3(SEQIDN0:1)與B3(SEQIDN0:2)和內(nèi)引物FIP(SEQIDN0:3)與BIP (SEQIDNO：4)； 其中引物的序列分別為： F3AGGAGGAGAAAAAAGCCTAT B3GCTAAAACTGAAGCTTGCA FIPCGCCACTTAATGTATGTGGATATCTGGCCTTTTGGAAAGATTTGG BIPACAATGGTTGTTGCTTTAAAACCACAGTTGGATCTAAAGCAGTAG； 所述的 2X反應緩沖液包括Tris-HCL、KCL、MgS04、（NH4)2S04、Tween20、Betaine和dNTPs〇
[0006] 所述的牛支原體DNA模板，是使用細菌基因組DNA提取試劑盒提取的牛支原體培 養(yǎng)物或疑似感染牛支原體的臨床病變肺組織的基因組DNA。
[0007] 所述的熒光目視檢測試劑采用鈣黃綠素熒光試劑，熒光試劑在反應前加入。
[0008]所述的 2X反應緩沖液包括Tris-HCL25-60mM、KCL15-40mM、MgS04 1 0-20mM、 (NH4)2S04 15-25mM、Tween20 0? 3-0. 8%、Betaine1. 5-4M和dNTPs2. 5-5mM，其配制方法 在pH為8. 5左右條件下，將上述溶劑混合均勻獲得。
[0009] -種牛支原體環(huán)介導等溫擴增試劑盒的應用，用于檢測疑似牛支原體或檢測疑似 感染牛支原體的臨床病變肺組織是否存在牛支原體，具體檢測步驟包括： (1) LAMP引物的設計與合成 (2) 牛支原體DNA模板的提取 (3) LAMP反應體系建立 (4) LAMP檢測方法。
[0010] 所述的LAMP反應體系建立以25i!L計， 2X反應緩沖液 12. 5yL BstDNA聚合酶 1iiL FIP 40 pmol BIP 40pmol F3 5 pmol B3 5 pmol 牛支原體DNA 2 uL 超純水 補足25iiL。
[0011] 所述的LAMP檢測方法是采用特異性檢測、敏感性檢測和熒光可視化檢測的方法。
[0012] 所述的LAMP檢測方法采用LoopampLA-320C實時濁度儀進行密閉全程監(jiān)控。 本發(fā)明的實質(zhì)性特點和顯著的進步是： 1)特異性強 本發(fā)明的LAMP方法特異性檢測出牛支原體，所檢測的陰性對照支原體、細菌和水對照 均無陽性結(jié)果出來，與PCR檢測結(jié)果一致。
[0013] 2)靈敏度高 普通PCR檢測方法的靈敏度為2. 29X1(T3ng/yL，而使用本發(fā)明的LAMP檢測方法，檢 測限約為2. 29X10_5ng/iiL，是普通PCR的100倍。
[0014] 3)迅速獲得結(jié)果 普通的PCR整個過程在24小時左右才能得出結(jié)果，目前多數(shù)建立的LAMP反應方法在 反應結(jié)束后，須采用瓊脂糖凝膠電泳紫外線顯像分析來判讀結(jié)果，從基因組DNA提取到獲 取試驗結(jié)果，需要4-5小時左右。本發(fā)明提供的LAMP檢測方法反應在25分鐘左右出現(xiàn)擴 增，60分鐘內(nèi)即可完成擴增，且結(jié)果判讀方式簡便，在可見光下將陽、陰性管進行比較，通過 肉眼可明顯看到陽性反應呈明顯渾濁，陰性反應管透明；短暫離心后，陽性反應管底部有明 顯的白色焦磷酸鎂沉淀物，而陰性反應管底部無沉淀物；或加入熒光染料，陽性反應管在紫 外光下呈綠色，用肉眼便可觀察實驗結(jié)果。不需要再進行瓊脂糖凝膠電泳紫外線分析顯像 或者開蓋加入熒光染料進行來判讀結(jié)果，從基因組DNA提取到獲得最終結(jié)果可在2-3小時 內(nèi)完成。
[0015] 4)不造成污染 目前LAMP方法用于直接觀察的熒光染料為反應后加入，而本發(fā)明的熒光染料是在反 應前加入的鈣黃綠素商用染料(非syber-green)，檢測過程不需要開蓋，有效的避免污染試 驗環(huán)境。此外，本發(fā)明的LAMP檢測方法在結(jié)果判讀上，直接通過濁度儀檢測反應管的濁度 值來判定結(jié)果，可不進行熒光染料法檢測結(jié)果或者進行瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果，不需要 開蓋，能有效避免污染。
[0016] 5)可實時定量 本發(fā)明利用Tubidimeter real-time LA-320池度儀來實時分析LAMP反應的結(jié)果，不 同的標準樣品的濃度對應的濁度值的時間繪制成的標準曲線，代入標準曲線方程，即可求 出各時間的牛支原體拷貝數(shù)，達到定量檢測產(chǎn)物的目的。
【附圖說明】
[0017]圖1是本發(fā)明LAMP方法特異性檢測結(jié)果；其中1 :牛支原體；2 :綿羊肺炎支原體； 3 :中度無膽甾原體；4 :絲狀支原體；5 :大腸桿菌；6 :2型鏈球菌；7 :沙門氏菌；8 :波氏桿 菌；9:空白對照(水)。牛支原體反應管出現(xiàn)濁度的上升曲線，為陽性結(jié)果，3株對照支原體 反應管、4株對照細菌反應管和水對照反應管均無擴增，為陰性結(jié)果。
[0018] 圖2和圖3是分別使用本發(fā)明LAMP方法和普通PCR方法進行的牛支原體敏感 性檢測的結(jié)果，其中1 :2. 29X 102 ng/ii L ;2 :2. 29X101 ng/ii L ;3 :2. 29X10〇ng/ii L ;4 : 2. 29X lO^ig/ii L ; 5 :2. 29X l(T2ng/ii L ;6 :2. 29X l(T3ng/ii L ;7 :2. 29X l(T4ng/ii L ;8 : 2. 29 X 10_5ng/ u L ；9：2. 29 X 10-6 ng/ u L； 10 :2. 29X10-7 ng/iiL ;11:water。牛支原體原始DNA的起始濃度為2. 29X 102 ng/ UL，經(jīng)10倍倍比連續(xù)稀釋后，進行LAMP和PCR擴增，結(jié)果顯示本發(fā)明的LAMP法檢測限約 為2. 29 X 10_5ng/ ii L，而普通PCR方法檢測限約為2. 29 X 10_3ng/ ii L。
[0019]圖4是加入熒光染料后肉眼觀察結(jié)果：左管為以牛支原體基因組DNA為模板的反 應情況，為陽性結(jié)果，右管為陰性對照的反應情況，為陰性結(jié)果。
[0020] 圖5是本發(fā)明牛支原體定量標準曲線；利用不同的標準樣品的濃度對應的濁度值 對時間繪制成的標準曲線，代入標準曲線方程，即可求出各時間的牛支原體拷貝數(shù)。
【具體實施方式】
[0021] 1、材料的準備 牛支原體、綿羊肺炎支原體、中度無膽留原體、絲狀支原體、大腸桿菌、鏈球菌2型、沙 門氏菌和波氏桿菌，為廣西獸醫(yī)研究所分離鑒定和保存。LAMPDNA擴增試劑盒購自北京藍 譜生物科技有限公司，貨號LMP204 ;細菌基因組DNA提取試劑盒購自康為世紀生物科技有 限公司，貨號CW0552。
[0022] 2、LAMP引物的設計與合成 根據(jù)GenBank中的牛支原體OPro/F基因序列，利用LAMP法引物輔助設計軟件PrimerExplorerV4軟件設計一套LAMP引物，其中F3、B3為外引物，F(xiàn)IP、BIP為內(nèi)引物， 其中F3、B3為牛支原體PCR檢測引物，其中 F3AGGAGGAGAAAAAAGCCTAT B3GCTAAAACTGAAGCTTGCA FIPCGCCACTTAATGTATGTGGATATCTGGCCTTTTGGAAAGATTTGG BIPACAATGGTTGTTGCTTTAAAACCACAGTTGGATCTAAAGCAGTAG 3、細菌基因組D