本發(fā)明屬于分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種快速純化Stoffel片段Taq酶的方法。

背景技術(shù)：

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)是分子生物學(xué)研究中使用最廣泛的DNA聚合酶，在PCR過程中，需要來源于高溫下穩(wěn)定的Thermus aquaticus的DNA聚合酶。基因工程菌株的發(fā)展，大大提高了Taq酶的產(chǎn)量。Lawyer等首次報道了全長Taq聚合酶的基因序列，其編碼832個氨基酸，產(chǎn)生94KDa的Taq酶。隨后，它們對Taq的N端進(jìn)行了截短改良，使之表達(dá)544個氨基酸，61KDa的蛋白。與全長Taq聚合酶相比，缺失5’-3’內(nèi)切酶活性，可以在PCR擴增中，提高保真度；此外，Stoffel片段Taq酶具有更高的耐熱特性，97.5℃下半衰期為21分鐘，而全長Taq僅為9分鐘。這兩個特性使Stoffel片段Taq酶在生物技術(shù)應(yīng)用中使用更廣泛。

由于Stoffel片段Taq聚合酶的廣泛應(yīng)用，有必要發(fā)展出一種簡單、高效的純化方式來大量獲取Stoffel片段Taq酶，以滿足實驗室對Taq酶的需求。利用Stoffel片段的耐熱特性，本申請發(fā)展了一種簡單、便利的純化方法，使用這一方法，整個純化過程僅需1～2小時，1L菌液可以得到80mg，約1.6×10⁷個單位的Taq酶。與現(xiàn)有純化技術(shù)相比，該方法不僅簡單，而且省時。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種簡單、快速、實用的提取純化TaqDNA聚合酶的方法。

本發(fā)明具體通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)：

一種快速純化Stoffel片段Taq酶的方法，具體包括以下步驟：

1)工程菌的活化和表達(dá)：取Stoffel片段Taq DNA聚合酶工程菌接種在LB培養(yǎng)基中，于37℃培養(yǎng)過夜；

2)按照比例，取菌液接種于LB培養(yǎng)基中，于37℃繼續(xù)培養(yǎng)至OD₆₀₀為0.4，加入IPTG至終濃度為0.5mM，繼續(xù)培養(yǎng)12-16小時；

3)于4000g離心5min，收集菌體，用4×Taq storage buffer重懸菌體，菌體被置于沸水浴中，煮沸裂解；

4)裂解后在4℃下16000g離心10min除去細(xì)胞殘體和變性后的蛋白，上清液采用水相/有機磷酸系統(tǒng)處理后備用。

本發(fā)明所述的LB培養(yǎng)基中含有100μg/ml的Kan。

本發(fā)明所述的菌液與LB培養(yǎng)基按照體積比1:100接種。

本發(fā)明所述的Taq storage buffer具體為：20mM Tris-HCl pH 8.0,10mM DTT,0.1mM EDTA,100mM KCl,0.5％Nonidet P40,0.5％Tween 20。

本發(fā)明所述的沸水浴加熱條件為：每4min一個循環(huán)，共兩個循環(huán)，加熱8min。

本發(fā)明步驟(4)所述的上清液處理方法具體為：加入10％無菌平衡磷酸二氫鉀混勻，加等體積的無水乙醇混勻，2000g離心2min，在含有Taq酶的上層有機相中加入等體積無菌甘油，貯于-20℃。

本發(fā)明的有益效果為：1)快速：在單一的貯存緩沖液，僅需1-2個小時就可完成整個純化過程，且不需特殊設(shè)備和不使用有毒試劑；2)可靠穩(wěn)定：經(jīng)稀釋10倍后的Taq酶于-20℃貯藏12個月后，其活性沒有發(fā)生改變；經(jīng)37℃到72℃的過夜保溫測試，也沒有發(fā)現(xiàn)核酸酶的活性；3)采用aqueous/organic系統(tǒng)來簡便和高效的去除核酸污染，不會降低Taq酶的產(chǎn)量。

附圖說明

圖1是采用所純化的Taq酶進(jìn)行不同濃度稀釋后對aadA基因進(jìn)行PCR擴增的結(jié)果；

圖2是商業(yè)化Taq酶同本技術(shù)純化的Taq酶采用不同片段大小的基因進(jìn)行擴增的結(jié)果；

圖3是所純化的Stoffel片段的SDS-PAGE電泳結(jié)果；

圖4是不同處理時間所純化的Stoffel片段SDS-PAGE電泳結(jié)果；

圖5是Aqueous/Organic biphasic系統(tǒng)處理前后煮沸上清液中核酸污染情況。

具體實施方式

下面結(jié)合實施例對本發(fā)明做進(jìn)一步的說明，以下所述，僅是對本發(fā)明的較佳實施例而已，并非對本發(fā)明做其他形式的限制，任何熟悉本專業(yè)的技術(shù)人員可能利用上述揭示的技術(shù)內(nèi)容加以變更為同等變化的等效實施例。凡是未脫離本發(fā)明方案內(nèi)容，依據(jù)本發(fā)明的技術(shù)實質(zhì)對以下實施例所做的任何簡單修改或等同變化，均落在本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。

實施例1

1)材料和方法

菌株與質(zhì)粒

pBio-Taq表達(dá)載體由丁雄飛博士友好贈送，其基本載體為pET-29a。其中，含有T7啟動子和Taq基因序列。與Lawyer等報道相一致，該基因表達(dá)61KDa的Stoffel片段。BL21(DE3)作為載體寄主，細(xì)菌帶有pLysS質(zhì)粒使其更易于破碎釋放出重組蛋白。

2)截短的Taq聚合酶Stoffel片段的純化

轉(zhuǎn)化BL21細(xì)菌的質(zhì)粒被接種在5ml含kan(100μg/ml)的LB培養(yǎng)基中，于37℃培養(yǎng)過夜。按照1：100比例，取1ml菌液接種于100ml含Amp(100μg/ml)的LB培養(yǎng)基中，于37℃繼續(xù)培養(yǎng)至OD600為0.4，加入IPTG至終濃度為0.5mM，繼續(xù)培養(yǎng)12-16小時。于4000g離心5min，收集菌體，用5ml 4×Taq storage buffer(20mM Tris-HCl(pH 8.0),10mM DTT,0.1mM EDTA,100mM KCl,0.5％Nonidet P40,0.5％Tween 20)重懸菌體，菌體被放入沸水浴不同時間(0-12min)和次數(shù)(4min per cycle)。煮沸裂解后，4℃下16,000g離心10min除去細(xì)胞殘體和變性后的蛋白，然后轉(zhuǎn)上清入新管。為了除去污染的核酸，上清液采用水相/有機磷酸系統(tǒng)，含有Taq酶的上層有機相轉(zhuǎn)入新管，加入等體積無菌甘油，貯于-20℃，使用前進(jìn)行適當(dāng)稀釋。

實施例2蛋白分析和活性測定

1)實驗方法

采用Bradford法測定Taq蛋白的濃度。取10μl實施例1純化所得樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳估計蛋白成分。

將所純化的截短Taq聚合酶稀釋后，進(jìn)行PCR擴增，以測定其酶活性，采用Takara公司Taq酶作為對照。純化的截短Taq聚合酶用1×Taq storage buffer按1:5,1:10,1:20,1:50進(jìn)行稀釋，擴增PU C18的克隆片段。50μl體系中，采用0.2(l的Taq酶，反應(yīng)體系為1×PCR reaction buffer(10mM KCl,20mM Tris-HCl(pH 8.8),10mM(NH4)2SO4,0.1％TritonX-100,0.1mg/ml BSA)，0.2mM d NTPs,2.0mM MgSO4,0.2(M引物(5’-atggcaccacaaacagagg-3’和5’-ttatttgccgactaccttgg-3’)擴增800bp的aadA基因(編碼aminoglycoside 3’-adenylytransferase)，25ng模板DNA。

反應(yīng)條件為:95℃總變性3min，94℃變性60s，55℃退火60s，72℃延伸180s，共進(jìn)行30個循環(huán),PCR反應(yīng)在MJ research Minicycler(美國)反應(yīng)儀上進(jìn)行。PCR程序完成后，分別取1μl,2μl,5μl,10μl PCR產(chǎn)物在1.2％的瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳分析，緩沖液為TBE，分子量標(biāo)準(zhǔn)采用DL2000。為了測試Taq酶對不同大小片段的擴增能力，分別擴增了500bp的IGF-1基因,1500bpBADH基因和2.7kb的煙草葉綠體trnI-trnA基因片段，以驗證Taq酶的擴增效率。

2)結(jié)果

采用商業(yè)化的Taq酶作為對照，進(jìn)行梯度稀釋，對所純化的Taq 酶Stoffel片段通過PCR擴增，進(jìn)行了活性測定(圖1)。

使用稀釋10倍的Taq酶所擴增的0.8kb的片段，取1μl PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳，其產(chǎn)量與商業(yè)化的Taq酶2μl PCR產(chǎn)物相當(dāng)(泳道2)，因此，使用稀釋10倍的Taq酶其活性是商業(yè)化的Taq酶活性的2倍。所以，稀釋10倍的Taq酶活性為10units/μl，母液濃度為100units/μl。根據(jù)這個結(jié)果，可以得出，1L的菌液可以得到1.6×10⁷units的Taq酶。此外，當(dāng)Taq酶稀釋至20或50倍后，僅有很少的酶活力發(fā)現(xiàn)。

為了驗證Taq酶的穩(wěn)定性，采用不同片段大小的DNA片段進(jìn)行擴增，結(jié)果如圖2。稀釋10倍后的Taq酶與商業(yè)化的Taq酶(Takara)分別擴增0.5kb至3.0kb的DNA片段。結(jié)果表明，所純化的Taq酶與商業(yè)化的Taq酶擴增結(jié)果一致。

實施例3純化方法的建立

1)煮沸裂解時間的確定

為了比較不同煮沸裂解時間對Taq酶Sottfel片段純化的影響，采用0,2,4,6,8,10和12min等7個煮沸時間來進(jìn)行分析,結(jié)果如圖3所示。

從圖3中,預(yù)期的Stoffel fragment(61kDa)被釋放到4-fold Taq storage buffer,煮沸8分鐘具有較高的Taq酶產(chǎn)量，且沒有雜蛋白污染。未煮沸對照沒有Taq蛋白發(fā)現(xiàn)。在未采用IPTG誘導(dǎo)的對照中，僅有微量的Taq酶產(chǎn)生。

2)煮沸次數(shù)

本實驗中，采用煮沸4分鐘后，4℃，16,000g離心10min，來作為一個循環(huán)。結(jié)果如圖4，經(jīng)2個循環(huán)，共煮沸8分鐘后，Taq酶被高量產(chǎn)生。同時，發(fā)現(xiàn)經(jīng)三次循環(huán)，Taq酶產(chǎn)量有所降低。同時，從圖中可以看出，很少有其它的雜蛋白污染。

3)通過Aqueous/Organic biphasic系統(tǒng)除去核酸污染

為了驗證核酸污染，取10μl煮沸上清液進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分析，結(jié)果如圖5。

結(jié)果顯示，未經(jīng)biophasic處理的樣品存在有核酸污染(泳道1-3)。為了消除核酸污染，采用2個簡單步驟來進(jìn)行：1)加入10％無菌平衡磷酸二氫鉀(pH10.3)，混勻幾秒；2)加等體積的無水乙醇進(jìn)入上步驟1中的溶液中，混勻幾秒。2,000g離心2min，包含有Taq酶的上清液轉(zhuǎn)入新管，加入等體積無菌甘油后，貯于-20℃。通過以上步驟，可以有效的去除核酸污染(泳道4)。

綜上所述，與前人的報道相比，本方法有以下幾個優(yōu)勢：在單一的貯存緩沖液，僅需1-2個小時就可完成整個純化過程，且不需特殊設(shè)備和不使用有毒試劑。1L菌液可以得到80mg，約1.6×107個單位的Taq酶，結(jié)果與Desai和Lawyer’s等報道的相一致。經(jīng)稀釋10倍后的Taq酶于-20℃貯藏12個月后，其活性沒有發(fā)生改變。經(jīng)37℃到72℃的過夜保溫測試，也沒有發(fā)現(xiàn)核酸酶的活性。

在對純化條件的優(yōu)化過程中，還考慮到了Taq酶的產(chǎn)量，實驗表明，煮沸時間和次數(shù)對酶的產(chǎn)量有一定的影響。2次循環(huán)，煮沸8分鐘是最適的，在這樣的條件下，大量的大腸桿菌蛋白被變性去除，同時，Taq酶釋放進(jìn)上清液中。煮沸時間超過8分鐘，Taq酶產(chǎn)量有所降低。此外，離心率也對蛋白的純化有一定影響，推薦采用4℃下16,000g離心10min來去除蛋白。

在Taq酶純化過程中，如果采用進(jìn)行RAPD等分析，有必要去除核酸的污染。在前人的研究中，幾種方法被用來去除核酸污染，例如PEI制備和離子交換層析、8-methoxypsoralen處理、UV光照處理、限制內(nèi)切酶消化和透析。這些方法不僅費時，且有可能降低Taq酶的產(chǎn)量。本文中采用了aqueous/organic系統(tǒng)來簡便和高效的去除核酸污染。

總之，本申請?zhí)峁┝艘环N更可靠、更快和簡單的純化Taq酶的方法。使用煮沸法，可以在1-2小時完成大量高活性的Taq酶的純化，該方法可為PCR擴增技術(shù)的廣泛應(yīng)用提供新的純化技術(shù)。