專利名稱：一種簡單高效制備純化TaqDNA聚合酶的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及的是分子生物學(xué)領(lǐng)域，一種Taq DNA聚合酶(Thermus aquaticus DNApolymerase)表達純化技術(shù),特別是一種簡單高效低成本純化Taq DNA聚合酶的方法,特別適合用于大量低成本商業(yè)生產(chǎn)制備Taq DNA聚合酶。
背景技術(shù)：
PCR又稱聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，是80年代中期發(fā)展起來的體外核酸擴增技術(shù)。在熱循環(huán)過程中，它使用耐高溫聚合酶和復(fù)合底物使得DNA片斷在短時間內(nèi)迅速擴增。它具有特異，敏感，產(chǎn)率高，快速，簡便，重復(fù)性好，易于自動化等突出優(yōu)點。這些優(yōu)點使得PCR技術(shù)成為分子生物學(xué)中最重要的工具之一，被許多科學(xué)家視為近幾十年來分子生物學(xué)領(lǐng)域最重要的一項技術(shù)突破。 在PCR技術(shù)中，耐高溫DNA聚合酶起著關(guān)鍵性作用.在長達數(shù)十年的分子生物學(xué)研究中，Taq DNA聚合酶一直在分子生物學(xué)相關(guān)實驗室中有著十分重要的地位。Taq DNA聚合酶是從一種水生棲熱菌(Thermus aquaticus) YTl株分離提取的。該菌于1969年從美國黃石國家森林公園火山溫泉中分離。1976年Chien A首先從水生棲熱菌yTl中分離出耐熱DNA聚合酶。隨后Cetus公司又從YTl中分離純化了適用于PCR的94kDa的Taq DNA聚合酶。1988年,Randal. K等從水生棲熱菌Thermus aquaticus中分離純化到了 Taq DNA聚合酶并將它應(yīng)用于PCR技術(shù)。PCR的廣泛應(yīng)用使Taq DNA聚合酶的消耗量與日劇增，依靠YTl天然菌株培養(yǎng)分離Taq DNA聚合酶產(chǎn)量低，既不經(jīng)濟,又難以滿足需要。為此F C Lawyer, Engelke DR等從YTl中克隆了 Taq DNA聚合酶基因，該酶基因在大腸桿菌中得到高效表達，并發(fā)表了一個快速簡便的方法初步純化表達產(chǎn)物的方法。F C Lawyer等將Taq DNA聚合酶基因克隆到半乳糖啟動子下游，得到Taq DNA聚合酶基因表達載體PLGS1，半乳糖啟動子驅(qū)動Taq DNA聚合酶基因的表達，該純化方法為用French press高壓裂解誘導(dǎo)過的細胞沉淀物,得到含有Taq DNA聚合酶的粗提裂解液,通過兩步交換柱去除大部分的核酸和雜質(zhì)蛋白質(zhì)。Engelke DR也通過大腸桿菌過表達純化了Taq DNA聚合酶,通過熱處理細胞裂解液，polyethyleneimine沉淀,一步離子交換,純化得到每升培養(yǎng)物40 50mg Taq DNA聚合酶，整個純化過程持續(xù)8 10個小時。以上方法在現(xiàn)階段解決了 YTl中純化Taq DNA聚合酶參量不高的問題，推進了 PCR技術(shù)的應(yīng)用，但是酶的提取方法步驟較復(fù)雜，這些方法均使用誘導(dǎo)過的大腸桿菌菌體裂解液純化Taq DNA聚合酶，整個過程涉及壓力或者超聲波破碎細胞，酶活力損失的同時，導(dǎo)致了大量的核酸、雜質(zhì)蛋白質(zhì)、蛋白酶釋放污染純化的Taq DNA聚合酶，這些雜質(zhì)的污染將會在下游帶來鑒定中的假陽性，假陰性結(jié)果，給鑒定的結(jié)果帶來很多的不確定性。為了解決除去這些雜質(zhì)污染問題，一系列的純化手段被應(yīng)用，它們包括，金屬離子親和層析，離子交換，肝素純化，凝膠色譜,polyethyleneimine沉淀,雙相抽提等手段。這些方法繁瑣耗時，去除雜質(zhì)的過程中使用到的層析介質(zhì)和凝膠的價格都比較昂貴，導(dǎo)致成本很高，純化的過程降低了聚合酶成品酶的得率和酶活，所以制備和純化Taq DNA聚合酶流程亟待改進。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有技術(shù)的缺點，提出一種簡單高效低成本制備純化TaqDNA聚合酶的方法。該方法操作步驟如下
I.構(gòu)建Taq DNA聚合酶表達載體pET_30aTAQ，pET_30aTAQ為利用novagen公司載體pET-30a (目錄號69909-3)，在ECOR V酶切位點插入Taq DNA聚合酶基因(基因編碼產(chǎn)物UniProtKB/Swiss-Prot 編號，P19821. I)得到。2.在含有終濃度25 100ug/ml的卡那霉素低鹽LB平板上轉(zhuǎn)化Taq DNA聚合酶表達載體pET-30aTAQ得到菌株BL21 (DE3)/pET_30aTAQ。37°C培養(yǎng)箱培養(yǎng)過夜。(低鹽LB固體培養(yǎng)基配方Tryptone 1%, Yeast extract O. 5%, NaCl O. 5%, Agar I. 5%,其余為水)。
3.接種到補加終濃度25 100ug/ml的卡那霉素低鹽LB液體培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)到 0D_=0. 4 0. 9。(低鹽 LB 液體培養(yǎng)基配方Tryptone 1%, Yeast extract O. 5%, NaCl
O.5%，其余為水)。4.培養(yǎng)物中加入2 5mM的IPTG誘導(dǎo)7 24小時。5.收集培養(yǎng)物，以相對離心力(RCF)375 12000g離心5分鐘小心收集培養(yǎng)基上清。6.將上清80 100°C加熱10分鐘后O _20°C冰浴I分鐘。7.以相對離心力375 12000g離心5分鐘小心收集上清。8.收集到的上清，經(jīng)SDS-PAGE電泳后灰度掃描檢測純度為97%，分子量大小為94KD左右，PCR實驗驗證該酶液可以進行PCR實驗，酶液凍存即為成品酶。本發(fā)明的工作原理
常規(guī)的Taq DNA聚合酶的提取純化方法起始工藝材料為離心后的菌體沉淀，培養(yǎng)基上清被排放丟棄，而本方法純化Taq DNA聚合酶的方法起始工藝材料為離心后的培養(yǎng)基上清。該方法同時組合了 Taq DNA聚合酶自分泌的特點和高度耐熱的特點。具體到工藝流程對應(yīng)的步驟上，本方法純化Taq DNA聚合酶第5個步驟是利用了 Taq DNA聚合酶可以大量自行分泌到該聚合酶表達菌株胞外的特點和大腸桿菌內(nèi)源蛋白質(zhì)基本無分泌的特點，通過一次離心收集表達Taq DNA聚合酶培養(yǎng)物的上清，從培養(yǎng)基上清中可以大量提取純度約在93%左右的Taq DNA聚合酶。步驟6和7上清通過一次熱循環(huán)，80°C 10分鐘加熱；0°C冰浴I分鐘充分沉淀雜質(zhì)蛋白，然后離心去除Taq DNA聚合酶中殘留的雜蛋白，純化的Taq DNA聚合酶純度約為97%。該步純化利用Taq DNA聚合酶高度耐受高溫，80°C左右加熱不變性、不沉淀，而大腸桿菌內(nèi)源少量滲透蛋白質(zhì)高溫加熱不可逆變性失活、并沉淀，所以純化Taq DNA聚合酶的步驟十分簡單，僅需要兩步離心，一步熱循環(huán)。該純化方法的關(guān)鍵技術(shù)在于利用了 Taq DNA聚合酶可以大量自行分泌到該表達菌株胞外的特點，可以初步從成分簡單的誘導(dǎo)培養(yǎng)物上清大量制備較純的Taq DNA聚合酶，避免了傳統(tǒng)方法利用菌體沉淀物純化TaqDNA聚合酶需物理破菌而導(dǎo)致的純度極度下降和污染的弊端。本發(fā)明與現(xiàn)有的技術(shù)比較有如下優(yōu)勢
I.純化Taq DNA聚合酶的步驟僅需要兩步離心，一步熱循環(huán)，方法簡單。沒有涉及傳統(tǒng)方法的破菌裂解程序釋放細菌內(nèi)容物，后續(xù)純化步驟無需金屬離子親和層析，離子交換，肝素純化，凝膠色譜等，僅僅需要加熱變性去除胞外的微量雜質(zhì)蛋白即可
2.與F C Lawyer, Engelke DR等人的方法相比無需繁瑣的破菌過程釋放蛋白質(zhì)，降低了蛋白酶、核酸酶、DNA污染的可能性，避免了下游為除去大腸桿菌釋放內(nèi)容雜物而進行的繁瑣純化工藝，節(jié)約了大量的設(shè)備成本，縮短了生產(chǎn)周期。3.由于沒有涉及機械破菌,蛋白質(zhì)直接分泌到胞外,Taq DNA聚合酶被蛋白酶降解和被核酸污染的可能性降低。4.目前該技術(shù)制備的Taq DNA聚合酶酶活每升培養(yǎng)基可得到I. 9 X IO6 Units，純度97%。純化過程簡單，制備Taq DNA聚合酶的成本十分低。不用破壞性一次殺死培養(yǎng)物，可以應(yīng)用于連續(xù)在線固定化生產(chǎn)Taq DNA聚合酶。


圖l.Taq DNA聚合酶在表達菌株BL21 (DE3)中的表達分布和誘導(dǎo)培養(yǎng)物上清表達，
其中M，預(yù)染蛋白質(zhì)分子量，1，誘導(dǎo)7小時全細胞樣品，2，誘導(dǎo)7小時細胞超聲波破菌離心后的沉淀樣品，3，誘導(dǎo)7小時細胞超聲波破菌上清樣品，4，誘導(dǎo)5小時離心后培養(yǎng)基上清樣品，5，誘導(dǎo)7小時離心后培養(yǎng)基上清樣品，6，誘導(dǎo)7小時離心后培養(yǎng)基上清，80°C加熱10分鐘后O°C冰浴I分鐘離心后培養(yǎng)基上清樣品。7，低鹽LB培養(yǎng)基對照。根據(jù)分析Taq DNA聚合酶在表達7小時約有40%的可溶Taq DNA聚合酶分布在培養(yǎng)基上清，20%的可溶TaqDNA聚合酶分布在細胞胞質(zhì)，40%為不可溶形式存在于胞內(nèi)。
圖2.利用培養(yǎng)基上清制備的Taq DNA聚合酶進行PCR擴增
利用不同濃度制備的Taq DNA聚合酶對MAL基因(NCBI :BC000458)進行PCR擴增，50ul體系加酶液O. 3ul仍然可以擴增出目的基因，該實驗證明制備的聚合酶可以用于PCR實驗，實驗中用到的Taq DNA聚合酶為圖I中6號處理樣品。圖3.檢測純化的聚合酶液DNA污染
由于Taq DNA聚合酶基因在宿主菌中的拷貝數(shù)高于一般基因組DNA，實驗以Taq DNA聚合酶基因的污染指標(biāo)陽性來檢測核酸樣本污染，圖3為利用T7通用正反向引物在50ul體系中擴增Taq DNA聚合酶基因檢測核酸污染。1，Iul誘導(dǎo)7小時細胞菌液樣本，2，Iul誘導(dǎo)7小時細胞超聲波破菌離心后沉淀重懸樣本，3，Iul誘導(dǎo)7小時細胞超聲波破菌離心后上清樣本，4，Iul純化酶液樣本，5. lug pET-30aTAQ DNA。數(shù)據(jù)分析得到，制備的純化酶液樣本未檢出陽性信號，無DNA污染。
具體實施例方式下面以實施例對本發(fā)明進行詳細說明
實施例一，制備Taq DNA聚合酶
I.構(gòu)建Taq DNA聚合酶表達載體pET_30aTAQ，pET_30aTAQ為利用novagen公司載體pET-30a (目錄號69909-3)，在ECOR V酶切位點插入Taq DNA聚合酶基因(基因編碼產(chǎn)物UniProtKB/Swi ss-Prot 編號，P19821. I)得到。2.在含有終濃度50ug/ml的卡那霉素低鹽LB平板上轉(zhuǎn)化Taq DNA聚合酶表達載體pET-30aTAQ得到菌株BL21 (DE3)/pET_30aTAQ。37°C培養(yǎng)箱培養(yǎng)過夜。(低鹽LB固體培養(yǎng)基配方Tryptone 1%, Yeast extractO. 5%, NaCl O. 5%, Agar I. 5%,其余為水)。3.接種到補加終濃度100ug/ml的卡那霉素低鹽LB液體培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)到OD600=O. 6。(低鹽 LB 液體培養(yǎng)基配方Tryptone 1%, Yeast extractO. 5%, NaCl O. 5%,其余為水)。4.培養(yǎng)物中加入2mM的IPTG誘導(dǎo)7小時。5.收集培養(yǎng)物，以相對離心力(RCF) 375g離心5分鐘小心收集培養(yǎng)基上清。6.將上清100°C加熱10分鐘后(TC冰浴I分鐘。7.以相對離心力375g離心5分鐘小心收集上清。
8.收集到的上清，經(jīng)SDS-PAGE電泳后灰度掃描檢測純度為97%，分子量約為94KD左右，每升培養(yǎng)物上清產(chǎn)量約120mg，酶活每升培養(yǎng)基可得到I. 3 X IO6Units, PCR實驗驗證該酶液可以進行PCR實驗，酶液凍存即為成品酶。結(jié)果分析如圖1，根據(jù)分析在誘導(dǎo)表達7小時約有40%的可溶Taq DNA聚合酶分布在培養(yǎng)基上清，20%的可溶Taq DNA聚合酶分布在細胞胞質(zhì)，40%為不可溶形式。制備的Taq DNA聚合酶SDS-PAGE檢測上樣量IOul，為單一可見條帶，純度97%，酶活每升培養(yǎng)基可得到I. 3X106u。利用不同濃度聚合酶酶液對同一樣本進行擴增，如圖2，50ul體系加酶液
O.3ul仍然可以擴增出目的基因，該實驗證明制備的聚合酶可以用于PCR實驗。PCR實驗同時檢測了 Taq DNA聚合酶的核酸污染指標(biāo)，如圖3，由于Taq DNA聚合酶基因在宿主菌中的拷貝數(shù)高于一般基因組DNA，實驗以Taq DNA聚合酶基因的污染指標(biāo)陽性來檢測核酸樣本污染，圖3為利用T7通用正反向引物在50ul體系中擴增Taq DNA聚合酶基因檢測DNA污染。數(shù)據(jù)分析得到制備的純化酶液樣本未檢出陽性信號，無DNA污染。實施例二，制備Taq DNA聚合酶二
I.構(gòu)建Taq DNA聚合酶表達載體pET_30aTAQ，pET_30aTAQ為利用novagen公司載體pET-30a (目錄號69909-3)，在ECOR V酶切位點插入Taq DNA聚合酶基因(基因編碼產(chǎn)物UniProtKB/Swi ss-Prot 編號，P19821. I)得到。2.在含有終濃度100ug/ml的卡那霉素低鹽LB平板上轉(zhuǎn)化Taq DNA聚合酶表達載體pET-30aTAQ得到菌株BL21 (DE3)/pET_30aTAQ。37°C培養(yǎng)箱培養(yǎng)過夜。(低鹽LB固體培養(yǎng)基配方Tryptone 1%, Yeast extractO. 5%, NaCl 0. 5%, Agar I. 5%,其余為水)。3.接種到補加終濃度100ug/ml的卡那霉素低鹽LB液體培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)到OD600=O. 4。(低鹽 LB 液體培養(yǎng)基配方Tryptone 1%, Yeast extractO. 5%, NaCl O. 5%,其余為水)。4.培養(yǎng)物中加入4mM的IPTG誘導(dǎo)10小時。5.收集培養(yǎng)物，以相對離心力(RCF) 12000g離心5分鐘小心收集培養(yǎng)基上清。6.將上清90°C加熱10分鐘后-10°C冰浴I分鐘。7.以相對離心力12000g離心5分鐘小心收集上清。8.收集到的上清，經(jīng)SDS-PAGE電泳后灰度掃描檢測純度約為97%，分子量大小約為94KD左右，每升培養(yǎng)物上清產(chǎn)量約125mg，酶活每升培養(yǎng)基可得到I. 4X IO6Units,PCR實驗驗證該酶液可以進行PCR實驗，PCR檢測得到制備的純化酶液樣本未檢出陽性信號，無DNA污染，酶液凍存即為成品酶。實施例三，制備Taq DNA聚合酶三I.構(gòu)建Taq DNA聚合酶表達載體pET_30aTAQ，pET_30aTAQ為利用novagen公司載體pET-30a (目錄號69909-3)，在ECOR V酶切位點插入Taq DNA聚合酶基因(基因編碼產(chǎn)物UniProtKB/Swi ss-Prot 編號，P19821. I)得到。2.在含有終濃度25ug/ml的卡那霉素低鹽LB平板上轉(zhuǎn)化Taq DNA聚合酶表達載體pET-30aTAQ得到菌株BL21 (DE3)/pET_30aTAQ。37°C培養(yǎng)箱培養(yǎng)過夜。(低鹽LB固體培養(yǎng)基配方Tryptone 1%, Yeast extractO. 5%, NaCl O. 5%, Agar I. 5%,其余為水)。3.接種到補加終 濃度50ug/ml的卡那霉素低鹽LB液體培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)到OD600=O. 5 ο (低鹽 LB 液體培養(yǎng)基配方Tryptone 1%, Yeast extractO. 5%, NaCl O. 5%,其余為水)。4.培養(yǎng)物中加入2mM的IPTG誘導(dǎo)24小時。5.收集培養(yǎng)物，以相對離心力(RCF) 12000g離心5分鐘小心收集培養(yǎng)基上清。6.將上清80 V加熱10分鐘后-20 V冰浴I分鐘。7.以相對離心力12000g離心5分鐘小心收集上清。8.收集到的上清，經(jīng)SDS-PAGE電泳后灰度掃描檢測純度為97%，分子量大小約為94KD左右，每升培養(yǎng)物上清產(chǎn)量約128mg，酶活每升培養(yǎng)基可得到I. 9 X IO6Units, PCR實驗驗證該酶液可以進行PCR實驗，制備的純化酶液樣本未檢出陽性信號，無DNA污染。酶液凍存即為成品酶。
權(quán)利要求
1.一種簡單高效制備純化Taq DNA聚合酶的方法，其特征在于步驟為 1).構(gòu)建TaqDNA聚合酶表達載體pET_30aTAQ，pET_30aTAQ為利用novagen公司載體pET_30a(目錄號69909-3)，在ECOR V酶切位點插入Taq DNA聚合酶基因得到；Taq DNA聚合酶基因編碼產(chǎn)物UniProtKB/Swiss-Prot編號為P19821. I ； 2).在含有終濃度25-100ug/ml的卡那霉素低鹽LB平板上轉(zhuǎn)化TaqDNA聚合酶表達載體pET-30aTAQ得到菌株BL21 (DE3) /pET_30aTAQ，37°C培養(yǎng)箱培養(yǎng)過夜； 3).接種到補加終濃25 100ug/ml的卡那霉素低鹽LB液體培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)到OD600=O. 4 O. 9 ; 4).培養(yǎng)物中加入2 5mM的IPTG誘導(dǎo)7 24小時； 5).收集培養(yǎng)物，以相對離心力375 12000g離心5分鐘小心收集培養(yǎng)基上清； 6).將上清80 100°C加熱10分鐘后O _20°C冰浴I分鐘； 7).以相對離心力375 12000g離心5分鐘小心收集上清； 8).酶液經(jīng)檢測后凍存即為成品酶。
全文摘要
本發(fā)明提出了一種簡單高效制備純化TaqDNA聚合酶的方法。該方法操作步驟為1)構(gòu)建TaqDNA聚合酶表達載體pET-30aTAQ；2)在卡那霉素低鹽LB平板上轉(zhuǎn)化TaqDNA聚合酶表達載體pET-30aTAQ得到菌株BL21(DE3)/pET-30aTAQ；3)接種到卡那霉素低鹽LB液體培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)到OD600=0.4～0.9；4)IPTG誘導(dǎo)2～24小時；5)離心收集培養(yǎng)基上清；6)將上清80～100℃加熱10分鐘后0～-20℃冰浴1分鐘；7)再用離心收集上清；8)酶液經(jīng)檢測后凍存即為成品酶。本發(fā)明的具有突出優(yōu)點，純化步驟僅需要兩步離心，一步熱循環(huán)，方法簡單。免除了傳統(tǒng)方法的破菌裂解程序和后續(xù)繁雜的純化步驟。提高了TaqDNA聚合酶的純度，減少了污染，節(jié)約了制備成本，縮短了生產(chǎn)周期，可以應(yīng)用于連續(xù)在線固定化生產(chǎn)TaqDNA聚合酶。
文檔編號C12N9/12GK102816786SQ20121016524
公開日2012年12月12日 申請日期2012年5月25日 優(yōu)先權(quán)日2012年5月25日
發(fā)明者鐘星, 翟超, 馬立新, 余曉嵐, 嚴紅, 蔣思婧 申請人:湖北大學(xué)