對氧磷酶1基因的表達(dá)純化方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于基因工程和蛋白工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及對氧磷酶I基因的表達(dá)純化方法。
【背景技術(shù)】
[0002]對氧磷酶I (paraoxonasel, PONI)在研究有機(jī)磷中毒預(yù)防和治療方面具有重要作用，但目前天然PONl很難獲得，利用大腸桿菌表達(dá)的PONl雖然廉價且生產(chǎn)周期短，但獲得的蛋白因缺少糖基化及磷酸化修飾，在體內(nèi)應(yīng)用時存在免疫排斥，半衰期短，易降解等問題。
[0003]目前雖然也有通過基因工程方法表達(dá)出具有活性的PONl基因的報道，但未能得到純化的重組蛋白，也就沒有比較完善的對氧磷酶I的表達(dá)純化方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]為了解決現(xiàn)有技術(shù)中表達(dá)、純化具有活性的PONl基因困難的問題，本發(fā)明提供了一種對氧磷酶I基因的表達(dá)純化方法。
[0005]本發(fā)明的對氧磷酶I基因的表達(dá)純化方法，步驟如下:
(1)擴(kuò)增對氧磷酶I基因，連接到轉(zhuǎn)移載體pFastBaC?l上構(gòu)建重組轉(zhuǎn)移載體，重組轉(zhuǎn)移載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌DHlOBac感受態(tài)細(xì)胞，獲得含有對氧磷酶I基因的重組桿狀病毒DNA，將重組桿狀病毒DNA轉(zhuǎn)染家蠶BmN細(xì)胞使其在細(xì)胞內(nèi)復(fù)制裝配成含對氧磷酶I基因的重組病毒;
(2)步驟(I)的重組病毒接種家蠶五齡幼蟲，發(fā)病后取蠶血，經(jīng)離心過濾除雜并經(jīng)濃縮后用汽巴藍(lán)親和層析以及抗體親和層析純化蠶血，獲得對氧磷酶I蛋白。
[0006]優(yōu)選地，上述對氧磷酶I基因的表達(dá)純化方法中，步驟(I)所述擴(kuò)增使用的引物核苷酸序列如SEQ ID NO: Γ2所示。
[0007]優(yōu)選地，上述對氧磷酶I基因的表達(dá)純化方中，步驟(2)所述離心為4°C條件下以10000 rpm的轉(zhuǎn)速離心30 min ;所述過濾除雜是采用9層醫(yī)用紗布過濾后再經(jīng)過0.45 μ m濾膜；所述濃縮是用10 kD超濾管進(jìn)行。
[0008]優(yōu)選地，上述對氧磷酶I基因的表達(dá)純化方法中，步驟(2)所述汽巴藍(lán)親和層析使用的固定相為汽巴藍(lán)瓊脂糖-3GA3000-CL。
[0009]優(yōu)選地，上述對氧磷酶I基因的表達(dá)純化方法中，步驟(2)所述抗體親和層析所用抗體是通過原核表達(dá)的對氧磷酶I基因四次免疫新西蘭雄兔后取血然后通過ProteinA純化制得。
[0010]本發(fā)明的有益效果:通過設(shè)計引物,構(gòu)建重組病毒vBm-Z^W/，將其接種家蠶五齡幼蟲，使其表達(dá)目的蛋白PONl，通過汽巴藍(lán)親和層析和抗體親和層析純化得到了純度較高的PONl。此方法解決了天然PONl含量低，純化難得問題，為以后研究PONl功能奠定基礎(chǔ)。
【附圖說明】
[0011]圖1為重組轉(zhuǎn)移載體pFastBacTMl-ZYW/的雙酶切-PCR鑒定圖M:DNA laddermarker ；1:雙酶切產(chǎn)物；2:PCR產(chǎn)物。
[0012]圖 2 為重組 Bacmid-ZYW/ 的 PCR 鑒定圖；M.DNA ladder marker, 1.PONl F/P0N1RPCR 產(chǎn)物，2.PONl F/M13R PCR 產(chǎn)物，3.M13F/P0N1R PCR 產(chǎn)物，4.M13F/M13R PCR 產(chǎn)物。
[0013]圖3為重組桿狀病毒BmNPV-Z^W/在家蠶五齡幼蟲中表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE圖，M.蛋白質(zhì)低分子質(zhì)量標(biāo)記，1.接種野生病毒的蠶血，2.接種重組病毒的蠶血。
[0014]圖4為重組桿狀病毒BmNPV-Z^W/在家蠶五齡幼蟲中表達(dá)產(chǎn)物的Westernblotting鑒定圖，Μ.蛋白質(zhì)低分子質(zhì)量標(biāo)記，I’.接種野生病毒的蠶血，2’.接種重組病毒的蠶血。
[0015]圖5為純化蠶血的SDS-PAGE鑒定圖，Μ.:蛋白質(zhì)低分子質(zhì)量標(biāo)記，1:接種野生病毒的蠶血,2:接種重組病毒的蠶血原樣，3:汽巴藍(lán)親和層析柱初步純化的蠶血，4:抗體親和層析柱進(jìn)一步純化的蠶血。
[0016]圖6為純化蠶血的Western blotting鑒定圖，Μ.:蛋白質(zhì)低分子質(zhì)量標(biāo)記，I’:接種野生病毒的蠶血，2’:接種重組病毒的蠶血原樣，3’:汽巴藍(lán)親和層析柱初步純化的蠶血，4’:抗體親和層析柱進(jìn)一步純化的蠶血。
【具體實(shí)施方式】
[0017]下面結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步說明，以使本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以更好地理解本發(fā)明并能予以實(shí)施，但所舉實(shí)施例不作為對本發(fā)明的限定。
[0018]生物材料及試劑來源:
pFastBac?l載體購自Invitrogen公司，限制性內(nèi)切酶及?07? I和ZSo I購自Fermentas公司，連接酶Ligat1n high購自Fermentas公司，大腸桿菌TGl感受態(tài)細(xì)胞和大腸桿菌DHlOBac感受態(tài)細(xì)胞購自Fermentas公司，Sf_900 II SFM(IX)無血清培養(yǎng)基購于美國GIBCO公司，胎牛血清(FBS)購于奧地利PAA公司。本實(shí)施例中的家蠶BmN細(xì)胞和家蠶五齡幼蟲由上海生化所吳祥甫老師惠贈，公眾可在市面購買同類商品，本發(fā)明申請人也可以提供，不會影響發(fā)明目的的實(shí)現(xiàn)。
[0019]實(shí)施例1:重組轉(zhuǎn)移載體pFastBacTMl-ZYW/的構(gòu)建
根據(jù)對氧磷酶I基因特性，設(shè)計引物F和R，以家蠶總RNA為模板進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以cDNA為模板，F(xiàn)和R為引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。
[0020]h游引物 F: 5’ -CCGGAATTCATGGCTAAACTGACAGCG-3，(SEQ ID N0:1),其中下劃線為EC?！稩酶切位點(diǎn)；
下游引物 R:5’-CCGCTCGAGCTACAGCTCACAGTAAAG-3’ (SEQ ID NO: 2)，下劃線為ZAo I 酶切位點(diǎn)。
[0021]擴(kuò)增程序?yàn)?95°C預(yù)變性5min，95°C變性45s，59°C退火30s，72°C延伸lmin，循環(huán)30次；最后72°C延伸8min，回收產(chǎn)物，得到對氧磷酶I (PONl)基因。
[0022]將PONl基因及pFastBac?l載體分別用EcoR I和沿ο I同時進(jìn)行雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳回收酶切產(chǎn)物；將回收的PONl基因片段用Ligat1n high連接酶連接到經(jīng)酶切的pFastBacTMl載體上，使PONl基因位于多角體啟動子控制之下，構(gòu)建轉(zhuǎn)移載體pFastBac?l-PONl，轉(zhuǎn)化大腸桿菌TGl感受態(tài)細(xì)胞，常規(guī)方法篩選陽性克隆，將該重組轉(zhuǎn)移載體進(jìn)行PCR與雙酶切，產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行鑒定，結(jié)果如圖1所示，I號泳道雙酶切產(chǎn)物出現(xiàn)兩條亮帶，其中一條為1065bp的PONl基因片段，另一條為質(zhì)粒酶切后片段；2號泳道中的亮帶為1065bp的PONl基因片段的PCR產(chǎn)物，瓊脂糖凝膠電泳初步鑒定質(zhì)粒構(gòu)建成功，然后送去測序，經(jīng)測序知其序列如SEQ ID N0:3所示，目的基因已成功克隆到pFastBac?l 載體上。
[0023]實(shí)施例2:家蠶重組桿狀病毒vBm-PONl的構(gòu)建 (I)重組桿狀病毒DNA (Bacmid-PONl)的獲得
將實(shí)施例1構(gòu)建好的重組轉(zhuǎn)移載體pFastBacTMl-PONl轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DHlOBac感受態(tài)細(xì)胞中，通過藍(lán)白斑篩選獲得陽性克隆，分別以M13上下游引物、PONl上下游、M13下游引物和PONl上游引物以及M13上游引物和PONl下游引物四組引物對，進(jìn)行 PCR 鑒定，其中 M13F:5 ' -CCCAGTCACGACGTTGTAAAACG-3 ' (SEQ ID NO:4) ；M13R:5' -AGCGGATAACAATTTTCACACAGG-3' (SEQ ID NO: 5)，取少量 PCR 產(chǎn)物進(jìn)