本發(fā)明涉及微生物菌劑
技術(shù)領(lǐng)域:
,具體涉及一種枯草芽孢桿菌T400及其菌劑制備方法。
背景技術(shù):
:隨著世界人口的不斷增長(zhǎng),全球農(nóng)業(yè)對(duì)化學(xué)氮肥的需求也在逐年增加?;瘜W(xué)氮肥使用極大提高了農(nóng)業(yè)糧食的產(chǎn)量,但同時(shí)也帶來(lái)了嚴(yán)重的環(huán)境污染和土壤肥力下降等負(fù)面影響。在自然界中,某些原核微生物在常溫常壓下通過(guò)固氮酶將大氣中的分子氮(N2)轉(zhuǎn)化為氨(NH3),這一過(guò)程稱為生物固氮,這類微生物稱為固氮微生物。據(jù)聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織統(tǒng)計(jì),地球上結(jié)合態(tài)氮總量有70%來(lái)源于生物固氮,每年全球微生物固定的氮素量可達(dá)2億噸,約占全球作物需氮量的3/4,相當(dāng)于工業(yè)生產(chǎn)氮肥的3倍多。通過(guò)生物固氮為農(nóng)作物提供氮源、提高產(chǎn)量、降低化肥用量、減少生產(chǎn)成本,同時(shí)促進(jìn)了農(nóng)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展,是最節(jié)能、環(huán)保、生態(tài)友好的氮素供應(yīng)方式。因此,利用各種方式進(jìn)行生物固氮是目前全球所關(guān)注的一個(gè)重要問(wèn)題。根據(jù)固氮微生物與宿主之間的結(jié)合關(guān)系,可以將固氮作用分為自生固氮和共生固氮,前者如棕色固氮菌、克氏肺炎桿菌、巨大芽孢桿菌等,后者如根瘤菌和放線菌。其中,根瘤菌研究已經(jīng)超過(guò)100年的歷史,是迄今研究的最為清楚的生物固氮體系,并且在美國(guó)、巴西、阿根廷、澳大利亞等應(yīng)用廣泛。但是,根瘤菌具有非??量痰膶R磺秩拘?,僅限于豆科作物生產(chǎn)使用,與禾本科等作物不能實(shí)現(xiàn)共生固氮。因此,通過(guò)定植于根際、根表,或者進(jìn)入根的皮層組織的自生固氮微生物與水稻、玉米、甘蔗等禾本科作物聯(lián)合固氮具有十分重要的應(yīng)用前景。自生固氮微生物是通常在自然環(huán)境或培養(yǎng)基中獨(dú)立生活,而且可以將大氣中的分子態(tài)氮固定為氨的一類微生物。自生固氮微生物不需要和其他生物聯(lián)合就能固氮,有條件寬、適應(yīng)廣的特點(diǎn)而且還能分泌一些植物激素,刺激根系和植株的生長(zhǎng)發(fā)育,自生固氮菌能夠改善植物根際的微生態(tài)群落,起到促進(jìn)植物生長(zhǎng),提高植物抗逆性的作用。但是由于國(guó)內(nèi)外特別是國(guó)內(nèi)對(duì)自生固氮菌的研究起步較晚,大大限制了微生物菌劑在農(nóng)業(yè)上的應(yīng)用。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素:本發(fā)明的目的是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中的上述不足,提供一種枯草芽孢桿菌T400,該功能微生物菌種枯草芽孢桿菌T400可以通過(guò)自生固氮補(bǔ)充作物生長(zhǎng)過(guò)程中所需要的氮素,還能夠分泌生長(zhǎng)素促進(jìn)植物生長(zhǎng)。本發(fā)明的另一目的是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中的上述不足,提供一種枯草芽孢桿菌T400的菌劑制備方法,工藝簡(jiǎn)單成熟,可規(guī)?;a(chǎn),制得的枯草芽孢桿菌T400具有較高的固氮酶活性且能分泌生長(zhǎng)素,應(yīng)用范圍廣,經(jīng)濟(jì)效益高。本發(fā)明的目的通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)。一種枯草芽孢桿菌T400,所述枯草芽孢桿菌分類命名:枯草芽孢桿菌T400BacillussubtilisT400,保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(ChinaCenterforTypeCollection),地址:中國(guó)武漢武漢大學(xué),保藏日期;2015年12月15日,保藏編號(hào):CCTCCNO:M2015755。所述枯草芽孢桿菌T400的固氮酶活性為600.000-800.000nmol/(mL·h),其在生長(zhǎng)代謝過(guò)程中可以產(chǎn)生吲哚乙酸IAA,吲哚乙酸濃度為95-103mg/L。優(yōu)選地,該枯草芽孢桿菌T400為含有芽孢的革蘭氏陽(yáng)性菌。具體地,該枯草芽孢桿菌T400的固氮酶活性測(cè)定方法如下:試驗(yàn)方法:采用乙炔還原法對(duì)各菌株的固氮酶活性進(jìn)行測(cè)定。將保存的各菌株用VM-Ethanol固體培養(yǎng)基活化,用接種環(huán)挑取1環(huán)菌體于1.5mL的無(wú)菌離心管中,用無(wú)菌水稀釋,按相同接種量接入裝有5mL半固體培養(yǎng)基的10mL試管中,用反口橡膠塞密封。37℃培養(yǎng)24h后,注入1/10體積的10%乙炔氣體,繼續(xù)培養(yǎng)24h,從試管中抽取0.5mL氣體注入氣相色譜儀(北京天普分析儀器廠SP-2100)中,測(cè)定乙炔、乙烯的含量。按下列公式計(jì)算固氮酶活性大?。ū本┺r(nóng)業(yè)大學(xué)微生物專業(yè)編,1986):C=(hx×c×V)/(24.9×hs×t)(2.1)其中,hx為樣品峰面積值;hs為標(biāo)準(zhǔn)C2H4峰面積值;c為標(biāo)準(zhǔn)C2H4濃度(nmol/mL);V為培養(yǎng)容器體積(mL);t為樣品培養(yǎng)時(shí)間(h);C為產(chǎn)生的C2H4濃度[nmol/(mL·h)]。試驗(yàn)結(jié)果:結(jié)果分析,如圖4所示,根據(jù)公式(2.1)計(jì)算可得固氮酶活性為600.000-800.000nmol/(mL·h)。由此可以說(shuō)明,枯草芽孢桿菌T400在代謝過(guò)程中可以產(chǎn)生特定的固氮酶,可以自生固定大氣中的氮?dú)?。具體地,該枯草芽孢桿菌T400的吲哚乙酸定性含量測(cè)定方法為:生長(zhǎng)素定性含量測(cè)定(1)挑取菌株分別接種(OD600=1.0,0.5mL菌懸液)到盛有50mLKing液體培養(yǎng)基的250mL三角瓶中,每組3個(gè)重復(fù)。(2)接種完畢后,將三角瓶置于搖床上,28℃,125rpm,培養(yǎng)3d,待測(cè)。(3)取上述在King液體培養(yǎng)基上生長(zhǎng)3d后的菌懸液50μL置于透明離心管中,同時(shí)加50μL比色液。(4)設(shè)陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照,陽(yáng)性對(duì)照中加入50μL濃度為10mg/L的植物生長(zhǎng)激素(IAA),同時(shí)加50μL比色液。陰性對(duì)照中加50μLKing液體培養(yǎng)基,同時(shí)加50μL比色液。(5)將陽(yáng)性對(duì)照液、陰形對(duì)照液和測(cè)定液置于白陶瓷板并置于室溫下15min,觀察其顏色變化,顏色變紅者為陽(yáng)性,表示能夠分泌IAA,且顏色越深表示分泌IAA的能力越強(qiáng);若不變色則為陰性,表示該菌株不能分泌IAA,由此作為判斷依據(jù)進(jìn)行判斷分析。培養(yǎng)基為King培養(yǎng)基(1L);試劑配方為蛋白胨20g,K2HPO41.725g,MgSO4·7H2O1.5g,丙三醇15mL,色氨酸0.1g,蒸餾水1000mL。生長(zhǎng)素定量測(cè)定參照Riberio等的方法略加改動(dòng)。菌株T400接種到含有1g/L色氨酸的LB液體培養(yǎng)基中,30℃,180r/min,振蕩培養(yǎng)48h。將培養(yǎng)液10000r/min離心5min,取100mL上清液加到96孔板中,與100mLSalkowski’s試劑(1mL0.5mol/LFeCl3和49mL35%高氯酸)混勻,室溫靜置30min,在波長(zhǎng)530nm下用酶標(biāo)儀測(cè)定吸光度。如圖5所示,用不同濃度的IAA標(biāo)準(zhǔn)品制作標(biāo)準(zhǔn)曲線,測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表1。表1菌株T400IAA測(cè)定結(jié)果菌株T400T665T808T188IAA濃度(mg/L)98.3690.1286.8621.57從圖5和表1可以看出,枯草芽孢桿菌T400的生長(zhǎng)素濃度為98.36mg/L,因此,可以判斷枯草芽孢桿菌T400在生長(zhǎng)代謝過(guò)程中可以產(chǎn)生IAA,具有促進(jìn)作物生長(zhǎng)的功能。所述枯草芽孢桿菌T400具有序列表NO.1的DNA序列。一種枯草芽孢桿菌T400的菌劑制備方法,包括以下步驟:(1)分離、篩選選取含有枯草芽孢桿菌T400的固氮菌菌落的土樣,經(jīng)分離、篩選,培養(yǎng)得到固氮菌菌落。(2)純化、保存在純化保存培養(yǎng)基上將分離、篩選獲得的固氮菌菌落進(jìn)行劃線純化,培養(yǎng)分離得到枯草芽孢桿菌T400單菌落,保存該單菌落備用。圖1為分離得到的枯草芽孢桿菌T400單菌落在顯微鏡下放大1000倍的菌落圖。(3)培養(yǎng)基培養(yǎng):利用發(fā)酵培養(yǎng)基發(fā)酵培養(yǎng)枯草芽孢桿菌T400單菌落,得到微生物菌液;培養(yǎng)條件為:影響微生物生長(zhǎng)繁殖的環(huán)境因素有很多,對(duì)發(fā)酵影響較大的有裝液量、接種量、培養(yǎng)溫度、轉(zhuǎn)速、通氣量、pH、和發(fā)酵時(shí)間。(4)菌體回收將發(fā)酵罐生產(chǎn)的微生物菌液接入無(wú)菌的碟式分離機(jī),離心收集枯草芽孢桿菌T400菌體,快速脫去水分,制備干燥的純菌粉,測(cè)定芽孢數(shù)為500-800億/g。(5)菌劑制備將干燥純菌粉與基質(zhì)物料滑石粉和草炭完全混合,進(jìn)行活菌數(shù)檢測(cè),檢測(cè)結(jié)果顯示該活菌數(shù)范圍是4-20億/g,產(chǎn)品活菌數(shù)完全符合國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)《微生物菌劑》GB20287-2006要求2億/g以上,即得到枯草芽孢桿菌T400菌劑。優(yōu)選地,所述步驟(1)中,分離、篩選的具體方法為:在土樣中加入無(wú)菌水,震蕩,靜置,取上清液離心處理,棄上清液,保留沉淀物,加入無(wú)菌水懸浮,離心,去沉淀,取上清液再離心,棄上清液,保留沉淀物,加入磷酸緩沖液懸浮,得到樣品液;將樣品液加入磷酸緩沖液懸浮混合,得到稀釋的菌懸液;將稀釋的菌懸液水浴加熱,自然冷卻后吸取菌懸液涂布于無(wú)氮培養(yǎng)基,培養(yǎng)得到固氮菌菌落。更具體地,分離、篩選的方法為:從廣東省東莞市常平鎮(zhèn)黃泥塘農(nóng)場(chǎng)采取500g土樣,加入3L含0.01%吐溫80的無(wú)菌水,震蕩10min,靜置半個(gè)小時(shí),取上清液于20℃下8000rpm離心20min。棄上清液,保留沉淀物,加入30-50mL含0.01%吐溫80的無(wú)菌水懸浮,液體于20℃5000rpm離心5秒鐘,去沉淀,將上清液倒入一個(gè)干無(wú)菌離心管中于20℃下6000rpm離心10min,棄上清液,保留沉淀物,將沉淀物用10mL的pH7.0磷酸緩沖液懸浮,取1mL上述樣品液與9mL磷酸緩沖液懸浮混合,即為10倍稀釋菌懸液。將稀釋的菌懸液置于75℃水浴加熱15min,自然冷卻后吸取100μL涂布于無(wú)氮培養(yǎng)基,30℃培養(yǎng)36-48小時(shí)獲得含枯草芽孢桿菌T400的固氮菌菌落。優(yōu)選地,所述步驟(2)中純化、保存的具體方法為:將步驟(1)培養(yǎng)得到固氮菌菌落于28-33℃恒溫培養(yǎng)36-48小時(shí)分離得到枯草芽孢桿菌T400單菌落,將平板上出現(xiàn)的單菌落保存在試管中,于28-33℃恒溫培養(yǎng)36-48小時(shí)后置于2-5℃冰箱中保存。優(yōu)選地,所述步驟(3)的培養(yǎng)基培養(yǎng)對(duì)發(fā)酵罐裝液量、接種量、培養(yǎng)溫度、轉(zhuǎn)速、通氣量、pH和發(fā)酵時(shí)間作進(jìn)一步限定,具體為:(3.1)裝液量:發(fā)酵罐裝液量為罐體體積的70-75%;發(fā)酵罐裝液量要根據(jù)發(fā)酵罐的實(shí)際大小來(lái)調(diào)控,裝液太多會(huì)導(dǎo)致污染,裝液量太少也會(huì)造成資源浪費(fèi)的情況。(3.2)接種量:枯草芽孢桿菌T400的接種量為5-10%;接種量是指移種的種子液體積與發(fā)酵液體積之比。適當(dāng)?shù)慕臃N量可調(diào)節(jié)培養(yǎng)液黏度和溶解氧含量,縮短生長(zhǎng)達(dá)到高峰的時(shí)間、使產(chǎn)物提前合成。發(fā)酵時(shí)間與菌體生長(zhǎng)繁殖的關(guān)系可以通過(guò)生長(zhǎng)曲線得出,最適的發(fā)酵時(shí)間能夠使得菌體的代謝量達(dá)到最大,而又不會(huì)出現(xiàn)菌體自溶的現(xiàn)象,確保發(fā)酵結(jié)果的準(zhǔn)確性。(3.3)培養(yǎng)溫度:枯草芽孢桿菌T400的搖瓶培養(yǎng)溫度為30-36℃;微生物的生長(zhǎng)和產(chǎn)物的合成均需要在其各自最合適的溫度下進(jìn)行。溫度是保證酶活的重要條件,故在發(fā)酵過(guò)程中必須保證最適的溫度環(huán)境。(3.4)轉(zhuǎn)速:發(fā)酵過(guò)程中枯草芽孢桿菌T400的搖床轉(zhuǎn)速為150-300rpm;發(fā)酵過(guò)程中的搖床轉(zhuǎn)速使培養(yǎng)物混合均勻,確保每一個(gè)液體空間保持相同的生長(zhǎng)時(shí)期,同時(shí)加大轉(zhuǎn)速可以增加空氣接觸面積,提高培養(yǎng)基中溶解氧的濃度。(3.5)通氣量:在發(fā)酵工藝的研究方面,多以好氧發(fā)酵為主,氧主要是作為呼吸鏈的終端電子受體。好氧微生物通過(guò)有氧呼吸將有機(jī)物轉(zhuǎn)化為CO2、H2O,并獲取能量??莶菅挎邨U菌T400的通氣量按照不同培養(yǎng)時(shí)間進(jìn)行設(shè)定,接種后0-12小時(shí),通氣量控制在0.9-1.2vvm,優(yōu)選地,通氣量控制在1.04vvm,接種后13-42小時(shí),通氣量控制在1.15-1.6vvm,優(yōu)選地,通氣量控制在1.35vvm,接種后43-48小時(shí),通氣量控制在1.4-1.8vvm,優(yōu)選地,設(shè)定通氣量為1.63vvm。(3.6)pH:pH是微生物生長(zhǎng)和產(chǎn)物合成的非常重要的影響參數(shù),是衡量代謝活動(dòng)的綜合指標(biāo)。pH的變化會(huì)影響到各種酶活、菌對(duì)基質(zhì)的利用速率和細(xì)胞的構(gòu)造,從而影響菌的生長(zhǎng)和產(chǎn)物的合成。在枯草芽孢桿菌T400發(fā)酵過(guò)程中,通過(guò)補(bǔ)酸或者補(bǔ)堿的方法調(diào)節(jié)pH為7.1-7.4。(3.7)發(fā)酵時(shí)間:根據(jù)枯草芽孢桿菌T400在搖瓶中的生長(zhǎng)情況,設(shè)定42-48小時(shí)為發(fā)酵終點(diǎn)。優(yōu)選地,所述步驟(3)培養(yǎng)基培養(yǎng)中,所述培養(yǎng)基由以下質(zhì)量的原料組成:CaCO31.0-1.4g,MgSO4·7H2O0.6-1.2g,K2HPO41.0-2.0g,NaCl0.1-0.4g,F(xiàn)eSO4·7H2O0.001-0.005g,NaMO4·2H2O0.05-0.1g,蔗糖5-10g,瓊脂18-20g,蒸餾水1000mL,所述培養(yǎng)基的pH為7.1-7.4。當(dāng)然,按照上述質(zhì)量的質(zhì)量比也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。優(yōu)選地,所述步驟(2)和步驟(3)之間還包括有以下步驟:(S1)革蘭氏染色:將純化后的單菌落進(jìn)行革蘭氏染色,篩選得到陽(yáng)性菌;(S2)芽孢染色:將陽(yáng)性菌進(jìn)行芽孢染色,篩選得到含有芽孢的革蘭氏陽(yáng)性菌單菌落。革蘭氏染色和芽孢染色是兩種細(xì)菌鑒定的常規(guī)方法,染色可以縮小鑒定范圍。未經(jīng)染色的細(xì)菌與周圍環(huán)境折光率差別甚小,在顯微鏡下極難觀察。革蘭氏染色后細(xì)菌與環(huán)境形成鮮明對(duì)比,可以清楚地觀察到細(xì)菌的形態(tài)、排列及某些菌種屬于革蘭氏陽(yáng)性(G+)或者革蘭氏陰性菌(G-),用以分類鑒定。革蘭氏陰性菌普遍存在安全隱患,在農(nóng)業(yè)微生物應(yīng)用過(guò)程中直接高溫滅菌后舍棄結(jié)構(gòu)特征,存在可能致病性的隱患。芽孢染色將菌體內(nèi)的芽孢進(jìn)行染色,可以直觀觀察芽孢的大小、位置、形狀等特點(diǎn),進(jìn)一步縮小其鑒定范圍。芽孢桿菌具有保質(zhì)期長(zhǎng),易于存放的特點(diǎn),在農(nóng)業(yè)微生物產(chǎn)品具有廣泛的應(yīng)用基礎(chǔ)。通過(guò)圖2的革蘭氏染色結(jié)果圖和圖3的芽孢染色結(jié)果圖可以看出,枯草芽孢桿菌T400為革蘭氏陽(yáng)性菌,且含有芽孢。優(yōu)選地,所述步驟(S1)革蘭氏染色的具體方法為:(S1.1)涂片:在無(wú)菌操作臺(tái)中,取一塊載玻片,在火焰燈上方略烤,去除玻片上的雜質(zhì);在載玻片中央滴一滴無(wú)菌水,挑取單個(gè)菌落于水滴中,用灼燒過(guò)的接種環(huán)涂抹均勻;將樣品載玻片在火燈上方來(lái)回過(guò)3次,以固定細(xì)胞;(S1.2)初染:滴加2-5滴草酸銨結(jié)晶紫染液,染1min,傾去染液,流水沖洗至無(wú)紫色;(S1.3)媒染:先用新配的碘液(碘1.0g、碘化鉀2.0g、蒸餾水300.0mL)沖去殘水,再用碘液覆蓋涂面1min,后水洗;(S1.4)脫色:除去殘水后,滴加95%酒精進(jìn)行脫色約15-20秒后,立即用流水沖洗;(S1.5)復(fù)染:滴加1滴番紅染色液,染3-5min,水洗后用吸水紙吸干;(S1.6)鏡檢:將載玻片置于光學(xué)顯微鏡下觀察染色結(jié)果。優(yōu)選地,所述步驟(S2)芽孢染色的具體方法為:在無(wú)菌操作臺(tái)中,取一塊載玻片,在火焰燈上方略烤,去除玻片上的雜質(zhì)。在載玻片中央滴一滴無(wú)菌水,挑取單個(gè)菌落水滴中,用灼燒過(guò)的接種環(huán)涂抹均勻。將樣品載玻片在火燈上方來(lái)回過(guò)3次,以固定細(xì)胞。在涂布菌體的區(qū)域滴加1-2滴石碳酸堿性復(fù)紅染液,染色3min。用蒸餾水沖洗掉染液,風(fēng)干后,將載玻片置于光學(xué)顯微鏡下觀察。本發(fā)明的有益效果:(1)固氮:枯草芽孢桿菌屬?gòu)V泛存在于土壤、植物根際等環(huán)境中,具有菌種安全、功能多樣、生產(chǎn)方便、保質(zhì)期長(zhǎng)等優(yōu)點(diǎn),是目前我國(guó)微生物肥料生產(chǎn)廣泛應(yīng)用的菌種之一,在微生物肥料應(yīng)用領(lǐng)域具有十分可觀的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。所述枯草芽孢桿菌T400的固氮酶活性為600.000-800.000nmol/(mL·h),其在生長(zhǎng)代謝過(guò)程中產(chǎn)生的吲哚乙酸濃度為95-103mg/L。(2)減少氮素投入:玉米大田示范試驗(yàn)中,在施肥成本基本一致的基礎(chǔ)上,試驗(yàn)組節(jié)氮率達(dá)17.2%,而增產(chǎn)率達(dá)29.24%,顯著地提高了玉米的產(chǎn)量,說(shuō)明施用T400菌劑在減少氮素投入的同時(shí)能夠帶來(lái)更大的經(jīng)濟(jì)效益。(3)促進(jìn)作物生長(zhǎng):玉米大田示范試驗(yàn)中,試驗(yàn)組的株高、莖粗、棒葉面積均高于對(duì)照組,相對(duì)穗位高和倒伏率均低于對(duì)照組,充分說(shuō)明T400菌劑對(duì)玉米的生長(zhǎng)具有顯著的促進(jìn)作用。附圖說(shuō)明圖1為分離得到的枯草芽孢桿菌T400單菌落在顯微鏡下放大1000倍的菌落圖。圖2為枯草芽孢桿菌T400革蘭氏染色結(jié)果圖。圖3為枯草芽孢桿菌T400芽孢染色結(jié)果圖。圖4為枯草芽孢桿菌T400固氮酶活性測(cè)定結(jié)果圖。圖5為枯草芽孢桿菌T400IAA比色效果圖。圖6為枯草芽孢桿菌T400菌劑的玉米盆栽試驗(yàn)效果圖。具體實(shí)施方式結(jié)合以下實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步描述,見(jiàn)圖1-6所示。實(shí)施例1本實(shí)施例的一種枯草芽孢桿菌T400的菌劑制備方法,包括以下步驟:(1)分離、篩選選取具有枯草芽孢桿菌T400固氮菌菌落的土樣,經(jīng)分離、篩選,培養(yǎng)得到固氮菌菌落;(2)純化、保存在純化保存培養(yǎng)基上將分離、篩選獲得的固氮菌菌落進(jìn)行劃線純化,培養(yǎng)分離得到枯草芽孢桿菌T400單菌落,保存該單菌落備用;(3)培養(yǎng)基培養(yǎng):利用發(fā)酵培養(yǎng)基發(fā)酵培養(yǎng)單菌落,得到微生物菌液;(4)菌體回收將微生物菌液接入無(wú)菌的碟式分離機(jī),離心收集枯草芽孢桿菌T400菌體,快速脫去水分,制備干燥的純菌粉,測(cè)定芽孢數(shù)為500億/g;(5)菌劑制備將干燥純菌粉與基質(zhì)物料混合,進(jìn)行活菌數(shù)檢測(cè),檢測(cè)結(jié)果顯示該活菌數(shù)范圍是5億/g,即得到枯草芽孢桿菌T400菌劑。所述枯草芽孢桿菌T400,保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心,保藏號(hào)為CCTCCM2015755。所述枯草芽孢桿菌T400的固氮酶活性為680.604nmol/(mL·h),其在生長(zhǎng)代謝過(guò)程中可以產(chǎn)生吲哚乙酸,吲哚乙酸濃度為98.36mg/L。所述枯草芽孢桿菌T400具有序列表NO.1的DNA序列。所述步驟(1)中,分離、篩選的具體方法為:在土樣中加入無(wú)菌水,震蕩,靜置,取上清液離心處理,棄上清液,保留沉淀物,加入無(wú)菌水懸浮,離心,去沉淀,取上清液再離心,棄上清液,保留沉淀物,加入磷酸緩沖液懸浮,得到樣品液;將樣品液加入磷酸緩沖液懸浮混合,得到稀釋的菌懸液;將稀釋的菌懸液水浴加熱,自然冷卻后吸取菌懸液涂布于無(wú)氮培養(yǎng)基,培養(yǎng)得到固氮菌菌落。所述步驟(2)中純化、保存的具體方法為:將步驟(1)培養(yǎng)得到固氮菌菌落于32℃恒溫培養(yǎng)38小時(shí)分離得到枯草芽孢桿菌T400單菌落,將平板上出現(xiàn)的單菌落保存在試管中,于31℃恒溫培養(yǎng)42小時(shí)后置于4℃冰箱中保存。所述步驟(3)的培養(yǎng)基培養(yǎng)對(duì)發(fā)酵罐裝液量、接種量、培養(yǎng)溫度、轉(zhuǎn)速、通氣量、pH和發(fā)酵時(shí)間作進(jìn)一步限定,具體為:(3.1)裝液量:發(fā)酵罐裝液量為罐體體積的75%;(3.2)接種量:枯草芽孢桿菌T400的接種量為5%;(3.3)培養(yǎng)溫度:枯草芽孢桿菌T400的搖瓶培養(yǎng)溫度為32℃;(3.4)轉(zhuǎn)速:發(fā)酵過(guò)程中枯草芽孢桿菌T400的搖床轉(zhuǎn)速為200rpm;(3.5)通氣量:枯草芽孢桿菌T400的通氣量按照不同培養(yǎng)時(shí)間進(jìn)行設(shè)定,接種后0-12小時(shí),通氣量控制在1.04vvm,接種后13-42小時(shí),通氣量控制在1.35vvm,接種后43-48小時(shí),設(shè)定通氣量為1.63vvm;(3.6)pH:在枯草芽孢桿菌T400發(fā)酵過(guò)程中,通過(guò)補(bǔ)酸或者補(bǔ)堿的方法調(diào)節(jié)pH為7.2;(3.7)發(fā)酵時(shí)間:根據(jù)枯草芽孢桿菌T400在搖瓶中的生長(zhǎng)情況,設(shè)定46小時(shí)為發(fā)酵終點(diǎn)。所述步驟(3)培養(yǎng)基培養(yǎng)中,所述培養(yǎng)基由以下質(zhì)量的原料組成:CaCO31.0g,MgSO4·7H2O0.6g,K2HPO41.0g,NaCl0.1g,F(xiàn)eSO4·7H2O0.0015g,NaMO4·2H2O0.05g,蔗糖5g,瓊脂18g,蒸餾水1000mL,所述培養(yǎng)基的pH為7.1。實(shí)施例2本實(shí)施例與實(shí)施例1的不同之處在于,所述步驟(2)和步驟(3)之間還包括有以下步驟:(S1)革蘭氏染色:將純化后的單菌落進(jìn)行革蘭氏染色,篩選得到陽(yáng)性菌;(S2)芽孢染色:將陽(yáng)性菌進(jìn)行芽孢染色,篩選得到含有芽孢的革蘭氏陽(yáng)性菌單菌落。所述步驟(S1)革蘭氏染色的具體方法為:(S1.1)涂片:在無(wú)菌操作臺(tái)中,取一塊載玻片,在火焰燈上方略烤,去除玻片上的雜質(zhì);在載玻片中央滴一滴無(wú)菌水,挑取單個(gè)菌落于水滴中,用灼燒過(guò)的接種環(huán)涂抹均勻;將樣品載玻片在火燈上方來(lái)回過(guò)3次,以固定細(xì)胞;(S1.2)初染:滴加4滴草酸銨結(jié)晶紫染液,染1min,傾去染液,流水沖洗至無(wú)紫色;(S1.3)媒染:先用新配的碘液沖去殘水,再用碘液覆蓋涂面1min,后水洗;(S1.4)脫色:除去殘水后,滴加95%酒精進(jìn)行脫色約18秒后,立即用流水沖洗;(S1.5)復(fù)染:滴加1滴番紅染色液,染4min,水洗后用吸水紙吸干;(S1.6)鏡檢:將載玻片置于光學(xué)顯微鏡下觀察染色結(jié)果。所述步驟(S2)芽孢染色的具體方法為:在無(wú)菌操作臺(tái)中,取一塊載玻片,在火焰燈上方略烤,去除玻片上的雜質(zhì)。在載玻片中央滴一滴無(wú)菌水,挑取單個(gè)菌落水滴中,用灼燒過(guò)的接種環(huán)涂抹均勻。將樣品載玻片在火燈上方來(lái)回過(guò)3次,以固定細(xì)胞。在涂布菌體的區(qū)域滴加2滴石碳酸堿性復(fù)紅染液,染色3min。本實(shí)施例的其余內(nèi)容與實(shí)施例1相同,這里不再贅述。實(shí)施例3本實(shí)施例與實(shí)施例1或2的不同之處在于,本實(shí)施例的制備方法中,步驟(4)菌體回收,測(cè)定芽孢數(shù)為600億/g;步驟(5)菌劑制備,檢測(cè)結(jié)果顯示該活菌數(shù)范圍是8億/g。所述枯草芽孢桿菌T400的固氮酶活性為692nmol/(mL·h),其在生長(zhǎng)代謝過(guò)程中可以產(chǎn)生吲哚乙酸,吲哚乙酸濃度為98.2mg/L。所述步驟(2)中純化、保存的具體方法為:將步驟(1)培養(yǎng)得到固氮菌菌落于28℃恒溫培養(yǎng)48小時(shí)分離得到枯草芽孢桿菌T400單菌落,將平板上出現(xiàn)的單菌落保存在試管中,于28℃恒溫培養(yǎng)48小時(shí)后置于2℃冰箱中保存。所述步驟(3)的培養(yǎng)基培養(yǎng)對(duì)發(fā)酵罐裝液量、接種量、培養(yǎng)溫度、轉(zhuǎn)速、通氣量、pH和發(fā)酵時(shí)間作進(jìn)一步限定,具體為:(3.1)裝液量:發(fā)酵罐裝液量為罐體體積的71%;(3.2)接種量:枯草芽孢桿菌T400的接種量為6%;(3.3)培養(yǎng)溫度:枯草芽孢桿菌T400的搖瓶培養(yǎng)溫度為31℃;(3.4)轉(zhuǎn)速:發(fā)酵過(guò)程中枯草芽孢桿菌T400的搖床轉(zhuǎn)速為180rpm;(3.5)通氣量:枯草芽孢桿菌T400的通氣量按照不同培養(yǎng)時(shí)間進(jìn)行設(shè)定,接種后0-12小時(shí),通氣量控制在0.9vvm,接種后13-42小時(shí),通氣量控制在1.15,接種后43-48小時(shí),通氣量控制在1.4vvm;(3.6)pH:在枯草芽孢桿菌T400發(fā)酵過(guò)程中,通過(guò)補(bǔ)酸或者補(bǔ)堿的方法調(diào)節(jié)pH為7.2;(3.7)發(fā)酵時(shí)間:根據(jù)枯草芽孢桿菌T400在搖瓶中的生長(zhǎng)情況,設(shè)定48小時(shí)為發(fā)酵終點(diǎn)。所述步驟(3)培養(yǎng)基培養(yǎng)中,所述培養(yǎng)基由以下質(zhì)量的原料組成:CaCO31.2g,MgSO4·7H2O0.8g,K2HPO41.3g,NaCl0.2g,F(xiàn)eSO4·7H2O0.002g,NaMO4·2H2O0.06g,蔗糖6g,瓊脂18g,蒸餾水1000mL,所述培養(yǎng)基的pH為7.2。本實(shí)施例的其余內(nèi)容與實(shí)施例1或2相同,這里不再贅述。實(shí)施例4本實(shí)施例與實(shí)施例1或2的不同之處在于,本實(shí)施例的制備方法中,步驟(4)菌體回收,測(cè)定芽孢數(shù)為700億/g;步驟(5)菌劑制備,檢測(cè)結(jié)果顯示該活菌數(shù)范圍是10億/g。所述枯草芽孢桿菌T400的固氮酶活性為700nmol/(mL·h),其在生長(zhǎng)代謝過(guò)程中可以產(chǎn)生吲哚乙酸,吲哚乙酸濃度為101.45mg/L。所述步驟(2)中純化、保存的具體方法為:將步驟(1)培養(yǎng)得到固氮菌菌落于30℃恒溫培養(yǎng)36小時(shí)分離得到枯草芽孢桿菌T400單菌落,將平板上出現(xiàn)的單菌落保存在試管中,于30℃恒溫培養(yǎng)36小時(shí)后置于3℃冰箱中保存。所述步驟(3)的培養(yǎng)基培養(yǎng)對(duì)發(fā)酵罐裝液量、接種量、培養(yǎng)溫度、轉(zhuǎn)速、通氣量、pH和發(fā)酵時(shí)間作進(jìn)一步限定,具體為:(3.1)裝液量:發(fā)酵罐裝液量為罐體體積的73%;(3.2)接種量:枯草芽孢桿菌T400的接種量為8%;(3.3)培養(yǎng)溫度:枯草芽孢桿菌T400的搖瓶培養(yǎng)溫度為34℃;(3.4)轉(zhuǎn)速:發(fā)酵過(guò)程中枯草芽孢桿菌T400的搖床轉(zhuǎn)速為250rpm;(3.5)通氣量:枯草芽孢桿菌T400的通氣量按照不同培養(yǎng)時(shí)間進(jìn)行設(shè)定,接種后0-12小時(shí),通氣量控制在1.0vvm,接種后13-42小時(shí),通氣量控制在1.21vvm,接種后43-48小時(shí),通氣量控制在1.6vvm;(3.6)pH:在枯草芽孢桿菌T400發(fā)酵過(guò)程中,通過(guò)補(bǔ)酸或者補(bǔ)堿的方法調(diào)節(jié)pH為7.3;(3.7)發(fā)酵時(shí)間:根據(jù)枯草芽孢桿菌T400在搖瓶中的生長(zhǎng)情況,設(shè)定42小時(shí)為發(fā)酵終點(diǎn)。所述步驟(3)培養(yǎng)基培養(yǎng)中,所述培養(yǎng)基由以下質(zhì)量的原料組成:CaCO31.3g,MgSO4·7H2O1.0g,K2HPO41.6g,NaCl0.3g,F(xiàn)eSO4·7H2O0.003g,NaMO4·2H2O0.08g,蔗糖8g,瓊脂19g,蒸餾水1000mL,所述培養(yǎng)基的pH為7.3。本實(shí)施例的其余內(nèi)容與實(shí)施例1或2相同,這里不再贅述。實(shí)施例5本實(shí)施例與實(shí)施例1或2的不同之處在于,本實(shí)施例的制備方法中,步驟(4)菌體回收,測(cè)定芽孢數(shù)為750億/g;步驟(5)菌劑制備,檢測(cè)結(jié)果顯示該活菌數(shù)范圍是15億/g。所述枯草芽孢桿菌T400的固氮酶活性為750.346nmol/(mL·h),其在生長(zhǎng)代謝過(guò)程中可以產(chǎn)生吲哚乙酸,吲哚乙酸濃度為95.9mg/L。所述步驟(2)中純化、保存的具體方法為:將步驟(1)培養(yǎng)得到固氮菌菌落于32℃恒溫培養(yǎng)40小時(shí)分離得到枯草芽孢桿菌T400單菌落,將平板上出現(xiàn)的單菌落保存在試管中,于32℃恒溫培養(yǎng)40小時(shí)后置于3℃冰箱中保存。所述步驟(3)的培養(yǎng)基培養(yǎng)對(duì)發(fā)酵罐裝液量、接種量、培養(yǎng)溫度、轉(zhuǎn)速、通氣量、pH和發(fā)酵時(shí)間作進(jìn)一步限定,具體為:(3.1)裝液量:發(fā)酵罐裝液量為罐體體積的74%;(3.2)接種量:枯草芽孢桿菌T400的接種量為9%;(3.3)培養(yǎng)溫度:枯草芽孢桿菌T400的搖瓶培養(yǎng)溫度為34℃;(3.4)轉(zhuǎn)速:發(fā)酵過(guò)程中枯草芽孢桿菌T400的搖床轉(zhuǎn)速為285rpm;(3.5)通氣量:枯草芽孢桿菌T400的通氣量按照不同培養(yǎng)時(shí)間進(jìn)行設(shè)定,接種后0-12小時(shí),通氣量控制在1.1vvm,接種后13-42小時(shí),通氣量控制在1.45vvm,接種后43-48小時(shí),通氣量控制在1.72vvm;(3.6)pH:在枯草芽孢桿菌T400發(fā)酵過(guò)程中,通過(guò)補(bǔ)酸或者補(bǔ)堿的方法調(diào)節(jié)pH為7.4;(3.7)發(fā)酵時(shí)間:根據(jù)枯草芽孢桿菌T400在搖瓶中的生長(zhǎng)情況,設(shè)定48小時(shí)為發(fā)酵終點(diǎn)。所述步驟(3)培養(yǎng)基培養(yǎng)中,所述培養(yǎng)基由以下質(zhì)量的原料組成:CaCO31.3g,MgSO4·7H2O1.1g,K2HPO41.8g,NaCl0.3g,F(xiàn)eSO4·7H2O0.004g,NaMO4·2H2O0.09g,蔗糖9g,瓊脂20g,蒸餾水1000mL,所述培養(yǎng)基的pH為7.4。本實(shí)施例的其余內(nèi)容與實(shí)施例1或2相同,這里不再贅述。實(shí)施例6本實(shí)施例與實(shí)施例1或2的不同之處在于,本實(shí)施例的制備方法中,步驟(4)菌體回收,測(cè)定芽孢數(shù)為800億/g;步驟(5)菌劑制備,檢測(cè)結(jié)果顯示該活菌數(shù)范圍是20億/g。所述枯草芽孢桿菌T400的固氮酶活性為786.375nmol/(mL·h),其在生長(zhǎng)代謝過(guò)程中可以產(chǎn)生吲哚乙酸,吲哚乙酸濃度為99.2mg/L。所述步驟(2)中純化、保存的具體方法為:將步驟(1)培養(yǎng)得到固氮菌菌落于33℃恒溫培養(yǎng)36小時(shí)分離得到枯草芽孢桿菌T400單菌落,將平板上出現(xiàn)的單菌落保存在試管中,于33℃恒溫培養(yǎng)36小時(shí)后置于5℃冰箱中保存。所述步驟(3)的培養(yǎng)基培養(yǎng)對(duì)發(fā)酵罐裝液量、接種量、培養(yǎng)溫度、轉(zhuǎn)速、通氣量、pH和發(fā)酵時(shí)間作進(jìn)一步限定,具體為:(3.1)裝液量:發(fā)酵罐裝液量為罐體體積的75%;(3.2)接種量:枯草芽孢桿菌T400的接種量為10%;(3.3)培養(yǎng)溫度:枯草芽孢桿菌T400的搖瓶培養(yǎng)溫度為36℃;(3.4)轉(zhuǎn)速:發(fā)酵過(guò)程中枯草芽孢桿菌T400的搖床轉(zhuǎn)速為300rpm;(3.5)通氣量:枯草芽孢桿菌T400的通氣量按照不同培養(yǎng)時(shí)間進(jìn)行設(shè)定,接種后0-12小時(shí),通氣量控制在1.2vvm,接種后13-42小時(shí),通氣量控制在1.6vvm,接種后43-48小時(shí),通氣量控制在1.8vvm;(3.6)pH:在枯草芽孢桿菌T400發(fā)酵過(guò)程中,通過(guò)補(bǔ)酸或者補(bǔ)堿的方法調(diào)節(jié)pH為7.4;(3.7)發(fā)酵時(shí)間:根據(jù)枯草芽孢桿菌T400在搖瓶中的生長(zhǎng)情況,設(shè)定42小時(shí)為發(fā)酵終點(diǎn)。所述步驟(3)培養(yǎng)基培養(yǎng)中,所述培養(yǎng)基由以下質(zhì)量的原料組成:CaCO31.4g,MgSO4·7H2O1.2g,K2HPO42.0g,NaCl0.4g,F(xiàn)eSO4·7H2O0.005g,NaMO4·2H2O0.1g,蔗糖10g,瓊脂20g,蒸餾水1000mL,所述培養(yǎng)基的pH為7.4。本實(shí)施例的其余內(nèi)容與實(shí)施例1或2相同,這里不再贅述。本發(fā)明的枯草芽孢桿菌T400的16SrDNA基因序列菌種鑒定細(xì)菌的個(gè)體微小,形態(tài)簡(jiǎn)單,傳統(tǒng)方法鑒定細(xì)菌常根據(jù)它們?cè)谏砩系牟煌磻?yīng)作為分類鑒定的主要依據(jù)。20世紀(jì)70年代后期以來(lái),國(guó)際上通用的“正式的”或“官方的”細(xì)菌分類方法是以《伯杰氏鑒定細(xì)菌學(xué)手冊(cè)》為依據(jù)。在生理生化鑒定中,通常會(huì)出現(xiàn)一個(gè)或者幾個(gè)生理指標(biāo)不符合該菌種所具有的獨(dú)特性質(zhì),難以明確對(duì)該菌株進(jìn)行鑒定。目前,細(xì)菌鑒定的方法通常將菌株的生理生化指標(biāo)與分子生物學(xué)特性相結(jié)合,得出較為可靠地結(jié)論。其中DNA序列分析的16SrRNA基因進(jìn)化發(fā)育系統(tǒng)已經(jīng)成為目前國(guó)際上細(xì)菌多相分類鑒定常用的技術(shù)手段(Kimetal,2004;Prapetal,1997)。核糖體16SrDNA基因序列全長(zhǎng)約1550bp,是由交替的保守區(qū)和可變區(qū)組成。利用保守區(qū)域設(shè)計(jì)的通用引物,可以擴(kuò)增出所有細(xì)菌的16SrDNA片段。16SrDNA序列分析技術(shù)的基本原理是從微生物樣本中提取16SrDNA片段,通過(guò)克隆、測(cè)序或酶切、探針雜交獲得16SrDNA的序列信息,再與16SrDNA數(shù)據(jù)庫(kù)的序列數(shù)據(jù)或者其他數(shù)據(jù)進(jìn)行比較,確定其在進(jìn)化樹中的位置,從而鑒定樣本中可能存在的微生物種類。利用16SrDNA片段保守區(qū)域設(shè)計(jì)的通用引物,不會(huì)對(duì)非細(xì)菌的DNA互補(bǔ),而細(xì)菌的16SrDNA可變區(qū)的差異可以用來(lái)區(qū)分不同的菌。因此通過(guò)對(duì)某菌株16SrDNA序列測(cè)定來(lái)獲得最終鑒定證明的做法是被普遍認(rèn)可的。、鑒定方法(1)PCR反應(yīng)體系(25μL):10×PCRBuffer2.5μLdNTP(2.5mM)m2.0μL引物27F(10μM)0.5μL引物1492R(10μM)0.5μLDNA模板100ngTaq酶(5U/μL)0.5μLddH2O19μL(2)PCR反應(yīng)條件:95℃預(yù)變性5min,95℃變性30s,58℃退火30s,72℃延伸80s,35個(gè)循環(huán),72℃延伸10min。使用ABI3730xlDNA分析儀(應(yīng)用生物系統(tǒng)公司)進(jìn)行DNA測(cè)序。、測(cè)序結(jié)果tgcaagtcgagcggacagatgggagcttgctccctgatgttagcggcggacgggtgagtaacacgtgggtaacctgcctgtaagactgggataactccgggaaaccggggctaataccggatggttgtttgaaccgcatggttcagacataaaaggtggcttcggctaccacttacagatggacccgcggcgcattagctagttggtgaggtaacggctcaccaaggcaacgatgcgtagccgacctgagagggtgatcggccacactgggactgagacacggcccagactcctacgggaggcagcagtagggaatcttccgcaatggacgaaagtctgacggagcaacgccgcgtgagtgatgaaggttttcggatcgtaaagctctgttgttagggaagaacaagtgccgttcaaatagggcggcaccttgacggtacctaaccagaaagccacggctaactacgtgccagcagccgcggtaatacgtaggtggcaagcgttgtccggaattattgggcgtaaagggctcgcaggcggtttcttaagtctgatgtgaaagcccccggctcaaccggggagggtcattggaaactggggaacttgagtgcagaagaggagagtggaattccacgtgtagcggtgaaatgcgtagagatgtggaggaacaccagtggcgaaggcgactctctggtctgtaactgacgctgaggagcgaaagcgtggggagcgaacaggattagataccctggtagtccacgccgtaaacgatgagtgctaagtgttagggggtttccgccccttagtgctgcagctaacgcattaagcactccgcctggggagtacggtcgcaagactgaaactcaaaggaattgacgggggcccgcacaagcggtggagcatgtggtttaattcgaagcaacgcgaagaaccttaccaggtcttgacatcctctgaca3、同源性分析鑒定本細(xì)菌為Bacillussubtilis,枯草芽孢桿菌。應(yīng)用例:將本發(fā)明的枯草芽孢桿菌T400菌劑進(jìn)行玉米和水稻盆栽試驗(yàn)1、育苗將玉米和水稻種子溫水中浸泡過(guò)夜,播種于裝有土壤的塑料杯,自然條件育苗12-14天,植株大約10cm時(shí),選擇長(zhǎng)勢(shì)均勻的玉米和水稻移栽到花盆中。2、土壤預(yù)處理土壤風(fēng)干后,過(guò)1mm篩。每個(gè)處理設(shè)置3個(gè)重復(fù)。每個(gè)花盆分別裝有土壤4.0kg,尿素407mg、過(guò)磷酸鈣162mg和硫酸鉀418mg。。3、試驗(yàn)設(shè)置選用具有自生固氮及促進(jìn)作物生長(zhǎng)功能的枯草芽孢桿菌T400菌劑進(jìn)行盆栽效果對(duì)比試驗(yàn),每盆添加菌劑1g。設(shè)置膨潤(rùn)土添加為對(duì)照實(shí)驗(yàn),每盆添加膨潤(rùn)土1g。每天澆水適量,每盆的水量相同、播灑均勻,不要使水流出盆底以免肥料損失而產(chǎn)生誤差。4、試驗(yàn)結(jié)果移苗45天后,測(cè)定水稻分蘗數(shù)、株高和葉綠素含量。數(shù)據(jù)采用SPSS17.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。第64天后,測(cè)定玉米株高、葉片數(shù)及其單株鮮重。可以得出接種T400枯草芽孢桿菌菌劑可以明顯促進(jìn)玉米和水稻生長(zhǎng),見(jiàn)表2,表3和圖6。表2菌劑T400水稻盆栽試驗(yàn)結(jié)果注:同列肩注不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05).表3菌劑T400玉米盆栽試驗(yàn)結(jié)果菌株株高(cm)葉片數(shù)(片)單株鮮重(g)T400106.010.542.2CK77.68.829.2從表2,表3和圖6可以看出,利用本發(fā)明的枯草芽孢桿菌T400菌劑進(jìn)行水稻和玉米盆栽試驗(yàn),菌劑T400顯著地提高了水稻的分蘗數(shù)、株高和葉綠素含量,分蘗數(shù)的增加率達(dá)70.67%,株高的增加率為19.34%,葉綠素含量的增加率為49.34%。玉米植株的株高為對(duì)照處理的植株株高的1.36倍,葉片數(shù)為對(duì)照處理的葉片數(shù)的1.19倍,單株植株鮮重是對(duì)照處理的1.44倍。本發(fā)明由廣東省引進(jìn)創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目資助研發(fā),制得的枯草芽孢桿菌T400及其菌劑具有廣闊的市場(chǎng)前景,經(jīng)濟(jì)效益高。最后應(yīng)當(dāng)說(shuō)明的是,以上實(shí)施例僅用以說(shuō)明本發(fā)明的技術(shù)方案,而非對(duì)本發(fā)明保護(hù)范圍的限制,盡管參照較佳實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作了詳細(xì)地說(shuō)明,本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解,可以對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行修改或者等同替換,而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的實(shí)質(zhì)和范圍。SEQUENCELISTING<110>東莞市保得生物工程有限公司<120>一種枯草芽孢桿菌T400及其菌劑制備方法<130>0<160>1<170>PatentInversion3.3<210>1<211>959<212>DNA<213>枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)T400的16srDNA基因序列<400>1tgcaagtcgagcggacagatgggagcttgctccctgatgttagcggcggacgggtgagta60acacgtgggtaacctgcctgtaagactgggataactccgggaaaccggggctaataccgg120atggttgtttgaaccgcatggttcagacataaaaggtggcttcggctaccacttacagat180ggacccgcggcgcattagctagttggtgaggtaacggctcaccaaggcaacgatgcgtag240ccgacctgagagggtgatcggccacactgggactgagacacggcccagactcctacggga300ggcagcagtagggaatcttccgcaatggacgaaagtctgacggagcaacgccgcgtgagt360gatgaaggttttcggatcgtaaagctctgttgttagggaagaacaagtgccgttcaaata420gggcggcaccttgacggtacctaaccagaaagccacggctaactacgtgccagcagccgc480ggtaatacgtaggtggcaagcgttgtccggaattattgggcgtaaagggctcgcaggcgg540tttcttaagtctgatgtgaaagcccccggctcaaccggggagggtcattggaaactgggg600aacttgagtgcagaagaggagagtggaattccacgtgtagcggtgaaatgcgtagagatg660tggaggaacaccagtggcgaaggcgactctctggtctgtaactgacgctgaggagcgaaa720gcgtggggagcgaacaggattagataccctggtagtccacgccgtaaacgatgagtgcta780agtgttagggggtttccgccccttagtgctgcagctaacgcattaagcactccgcctggg840gagtacggtcgcaagactgaaactcaaaggaattgacgggggcccgcacaagcggtggag900catgtggtttaattcgaagcaacgcgaagaaccttaccaggtcttgacatcctctgaca959當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3