本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種腦卒中預(yù)警和早期診斷相關(guān)標志物及應(yīng)用。

背景技術(shù)：

腦卒中(stroke)為一組器質(zhì)性腦損傷導(dǎo)致的腦血管疾病，以突然發(fā)病、迅速出現(xiàn)局限性或彌散性腦功能缺損為共同臨床特征，包括缺血性腦卒中和出血性腦卒中。前者又稱腦梗死(cerebral infarction，CI)，是卒中最常見類型，約占70％-80％；后者包括腦出血(intracerebral hemorrhage,ICH)及蛛網(wǎng)膜下腔出血(subarachnoid hemorrhage,SAH)。腦卒中是世界范圍內(nèi)第二大常見死亡原因，也是成人致殘的第一位原因，2008年衛(wèi)生部公布的全國第三次死因回顧抽樣調(diào)查報告顯示，卒中(136.64/10萬)已超過惡性腫瘤(135.88/10萬)成為中國第一致死病因。我國卒中發(fā)病率120-180/10萬，患病率400-700/10萬，每年新發(fā)病例>200萬，每年死亡病例>150萬，存活者600萬-700萬，且2/3存活者遺留有不同程度的殘疾。卒中也是單病種致殘率最高的疾病。腦卒中高發(fā)病率、高死亡率和高致殘率的特征嚴重危害人類的身心健康，給患者及家庭帶來了沉重的負擔和痛苦。

腦卒中主要是在諸多危險因素長期、共同作用中發(fā)生的，這些主要危險因素包括腦卒中家族史、高血壓病、糖尿病、血脂異常、房顫、吸煙、肥胖和缺乏運動。對腦卒中高危人群進行普遍篩查，可以強化高危人群健康意識，降低我國腦血管病的發(fā)病率與死亡率，對預(yù)防腦卒中的發(fā)生具有重要的意義，有助于減輕個人、家庭及社會的經(jīng)濟負擔。如今神經(jīng)影像診斷技術(shù)的發(fā)展、早期溶栓、血管內(nèi)介入、卒中一級、二級預(yù)防等臨床技術(shù)和理念的進步，促使腦卒中的診療有較大改進，較大程度改善了患者預(yù)后。但腦卒中的巨大危害仍提示腦卒中臨床診療技術(shù)有巨大的發(fā)展空間。尋求穩(wěn)定易測、特異性和敏感性均較高且能反映腦組織損傷及修復(fù)情況的血液生物標志物，使之應(yīng)用于腦卒中高危人群篩查、預(yù)警及對腦卒中患者的早期診斷、病情監(jiān)測和療效評估，對于腦卒中的防治將具有重要意義。

長鏈非編碼RNA(non-coding RNA,ncRNA)與腦卒中密切相關(guān)。LncRNA約占ncRNA的80％，長度200-100000個核苷酸不等，位于細胞核內(nèi)或胞質(zhì)內(nèi)。lncRNA具有類型多、作用模式多和數(shù)量多的特點。它們在表觀遺傳調(diào)控、轉(zhuǎn)錄調(diào)控以及轉(zhuǎn)錄后調(diào)控等不同水平進行基因表達調(diào)控，并且參與了X染色體沉默，基因組印記現(xiàn)象以及染色質(zhì)修飾、轉(zhuǎn)錄激活、轉(zhuǎn)錄干擾，及轉(zhuǎn)錄后調(diào)控、核內(nèi)運輸、調(diào)節(jié)原癌基因活化等多種重要的調(diào)控過程。NcRNA幾乎可以調(diào)控基因表達的任何階段，參與了神經(jīng)系統(tǒng)不同生理和病理過程的調(diào)控。MALAT1(metastasis-associated lung adenocarcinoma transcript 1,肺腺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)轉(zhuǎn)錄子1)屬lncRNA家族重要成員，在神經(jīng)細胞中的表達相當豐富，能通過調(diào)控參與突觸形成或維持的基因的表達來調(diào)節(jié)突觸形成，其基因敲除后突觸密度將減小。MALAT1也高度表達于人類內(nèi)皮細胞，參與調(diào)控內(nèi)皮細胞的血管生成；低氧狀態(tài)可以誘導(dǎo)人類內(nèi)皮細胞中MALAT1的表達增加，使血管增殖，提示其可能在腦卒中后腦血管內(nèi)皮細胞的病理過程中起調(diào)控作用，MALAT1是腦卒中潛在的生物標志物，可能作為腦卒中預(yù)警、早期診斷和療效評估的指標。

隨著對長鏈非編碼RNA研究的日益深入，對非編碼RNA的更深層次的認識及其調(diào)控靶點的研究，將有助于闡明非編碼RNA在腦卒中發(fā)生、發(fā)展中的調(diào)節(jié)機制，為腦卒中的預(yù)警篩查、診斷和治療提供新方法和新靶點。目前對腦卒中患者血漿MALAT1的表達情況還沒有相關(guān)報道；已有的臨床研究多僅初步篩選出腦卒中急性期有變化的非編碼RNA，它們在腦卒中預(yù)警、早期診斷和療效評估中的應(yīng)用價值及與腦卒中患者病情嚴重程度的關(guān)系尚不明確。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明旨在通過檢測健康人群、腦卒中高危人群及腦卒中急性期患者血漿中長鏈非編碼RNA MALAT1的表達水平,結(jié)合卒中患者的病情嚴重程度及轉(zhuǎn)歸情況尋找并評價其在腦卒中預(yù)警、早期診斷及療效評估中可能的臨床意義。本發(fā)明提出MALAT1與腦卒中相關(guān)，是腦卒中預(yù)警和早期診斷相關(guān)標志物，可用作制備腦卒中預(yù)警和早期診斷藥物、腦卒中預(yù)防和治療藥物(靶點設(shè)計)，可用作制備腦卒中預(yù)警和早期診斷芯片、制劑或試劑盒。本發(fā)明所述MALAT1序列如SEQ ID N.1所示。

下面結(jié)合相關(guān)技術(shù)對本發(fā)明作進一步說明：

本發(fā)明研究發(fā)現(xiàn)相對健康對照組，血漿MALAT1在腦卒中高危人群組的相對表達量降低(p＝0.002)；而在腦梗死、腦出血及蛛網(wǎng)膜下腔出血患者發(fā)病24h內(nèi)的相對表達量均顯著增高(p<0.01)，但這三組之間血漿MALAT1的表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義(p>0.05)。缺血性腦卒中患者發(fā)病24h內(nèi)血漿MALAT1表達增高，再次證明了缺血刺激后可誘導(dǎo)MALAT1的表達增加，這與以往的研究結(jié)論一致。本發(fā)明的結(jié)果還首次觀察到出血性腦卒中患者發(fā)病24h內(nèi)MALAT1的表達同樣明顯增高，而腦卒中高危人群較健康對照的相對表達量降低。雖然MALAT1在腦卒中高危人群及腦卒中急性期患者血漿中表達改變的原因及其調(diào)控機制仍不清楚，但提示了MALAT1很可能在腦卒中發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮作用。

進一步對腦卒中急性期患者組(包括腦梗死組、腦出血組及蛛網(wǎng)膜下腔出血組)、腦卒中高危人群組及健康對照組之間血漿MALAT1的表達差異進行ROC曲線分析，發(fā)現(xiàn)在腦卒中急性期患者組與健康對照組之間、腦卒中高危人群與健康對照組之間、腦卒中高危人群與腦卒中急性期患者組之間，MALAT1均有中等水平的診斷價值。尤其是腦卒中高危人群與腦卒中急性期患者組之間的診斷效率、敏感性及特異性均較高，提示MALAT1可能作為腦卒中高危人群篩查、預(yù)警的指標和腦卒中發(fā)病早期潛在的分子診斷標志物。

本發(fā)明運用qRT-PCR檢測同一腦卒中急性期患者不同發(fā)病時間點(發(fā)病后24h內(nèi)、2d、7d、14d、21d)血漿中MALAT1的相對表達水平，結(jié)果表明血漿MALAT1在腦梗死患者組發(fā)病24h內(nèi)與發(fā)病7d時的相對表達量差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(p＝0.016)；而在腦出血及蛛網(wǎng)膜下腔出血患者組不同發(fā)病時間點的相對表達量差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(p>0.05)。此外，本發(fā)明收集了入選腦卒中急性期患者的臨床資料(發(fā)病時間、癥狀、入院時NHISS評分、影像及化驗結(jié)果、臨床診斷、腦梗死TOAST分型、在院診療及神經(jīng)功能恢復(fù)狀況等)，結(jié)合這些資料進行統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)，MALAT1在不同嚴重程度、腦梗死不同TOAST分型、不同療效的腦卒中患者發(fā)病24h內(nèi)血漿中的相對表達量差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(p>0.05)。鑒于本發(fā)明僅為初步探索，腦卒中急性期患者組研究對象數(shù)目較少，動態(tài)追蹤采血時間點較短，血漿MALAT1在同一腦卒中患者不同發(fā)病時間點的相對表達量變化及其與病情嚴重程度、腦梗死TOAST分型、療效預(yù)后的真正關(guān)系尚需要進一步大樣本的實驗分析來驗證其在腦卒中病情監(jiān)測、療效評估中的潛在價值。另一方面，如果能夠?qū)ν荒X卒中急性期患者發(fā)病前后血漿中MALAT1的表達進行檢測分析，將有助于更準確地闡明MALAT1在腦卒中發(fā)生發(fā)展過程中的作用。這些都是我們在以后的實驗中需要解決的問題。

目前人們對于循環(huán)lncRNAs的生物學(xué)認識還不足，到底是lncRNAs表達水平的改變引起了某些疾病，還是疾病狀態(tài)引起了lncRNAs表達水平的改變?nèi)匀徊磺宄ALAT1在腦卒中發(fā)生發(fā)展中的作用途徑、調(diào)節(jié)機制及網(wǎng)絡(luò)通路等方面尚不清楚，仍需要人們進行深入研究。這些作用機制的闡明將有助于加深我們對腦卒中的理解和認識，為腦卒中的預(yù)防、臨床診療及預(yù)后判斷提供全新的思路。

總之，本發(fā)明證明了血漿中可穩(wěn)定測得MALAT1的表達；首次發(fā)現(xiàn)了MALAT1在腦卒中高危人群血漿中表達降低，在腦卒中急性期患者血漿中表達增高，預(yù)示其作為腦卒中預(yù)警指標和腦卒中早期診斷標志物的潛在可能性。

附圖說明

圖1血漿MALAT1檢測的敏感性和特異性：圖中，(A,B)分別為血漿MALAT1擴增產(chǎn)物的熔解峰及擴增曲線；(C,D)分別為內(nèi)參GAPDH擴增產(chǎn)物的熔解峰及擴增曲線；(E)瓊脂糖凝膠電泳檢驗MALAT1及GAPDH的PCR產(chǎn)物，NC：陰性對照，S：樣本；(F,G)分別為MALAT1及GAPDH擴增產(chǎn)物的測序結(jié)果；

圖2血漿MALAT1在不同組中差異表達：圖中，(A)健康對照組(HC)、腦卒中高危人群組(HR)與腦梗死組(CI)血漿MALAT1相對表達量比較；(B)健康對照組(HC)、腦卒中高危人群組(HR)與腦出血組(ICH)血漿MALAT1相對表達量比較；(C)健康對照組(HC)、腦卒中高危人群組(HR)與蛛網(wǎng)膜下腔出血組(SAH)血漿MALAT1相對表達量比較；

圖3MALAT1在腦卒中急性期患者不同發(fā)病時間點血漿中的表達：圖中，(A-C)分別為血漿MALAT1在腦梗死組(CI)、腦出血組(ICH)及蛛網(wǎng)膜下腔出血組(SAH)中不同發(fā)病時間點的表達情況；

圖4MALAT1對腦卒中高危人群篩查及腦卒中發(fā)病早期的診斷價值：圖中，(A-G)分別為血漿MALAT1在腦卒中高危人群組與健康對照組、腦梗死與健康對照組、腦出血與健康對照組、蛛網(wǎng)膜下腔出血與健康對照組、腦梗死與腦卒中高危人群組、腦出血與腦卒中高危人群組、蛛網(wǎng)膜下腔出血與腦卒中高危人群組之間所對應(yīng)的ROC曲線及曲線下面積。

具體實施方式

研究對象：

(1)腦卒中急性期患者組：選取2014年10月至2015年10月發(fā)病24小時內(nèi)來南華大學(xué)附屬郴州醫(yī)院就診且臨床診斷為腦卒中的住院患者97例，診斷標準參照《中國急性缺血性腦卒中診治指南2014》、《中國腦出血診治指南2014》及《神經(jīng)病學(xué)》(第7版)，包括腦梗死患者50例、腦出血患者25例及蛛網(wǎng)膜下腔出血患者22例；并對入選的腦卒中急性期患者進行動態(tài)追蹤采血，分別于發(fā)病后24h內(nèi)、2d、7d、14d(視住院時間而定)采集其外周靜脈血樣，其中有52例采血次數(shù)達3次及以上(腦梗死患者29例、腦出血患者13例及蛛網(wǎng)膜下腔出血患者10例)。同時收集其個人基本資料和臨床資料(發(fā)病時間、癥狀、入院時按美國國立衛(wèi)生研究院卒中量表(the national institutes of health stroke scale，NHISS)進行的神經(jīng)功能缺損評分、影像及檢驗結(jié)果、臨床診斷、腦梗死TOAST分型、在院診療及轉(zhuǎn)歸情況等)。

(2)腦卒中高危人群組：選取在2014年度腦卒中篩查與干預(yù)項目中被評估為腦卒中高危人群的調(diào)查對象51例(存在有高血壓、糖尿病、血脂異常、肥胖、房顫、吸煙、卒中家族史、缺乏運動這8項腦卒中高危因素中的3項及以上者，同時排除既往有腦卒中病史者)，評估標準詳見《衛(wèi)計委腦卒中篩查與干預(yù)項目腦卒中高危人群風險評估表》(附件1)。并于早晨采集入選腦卒中高危人群的空腹外周靜脈血樣，同時記錄其存在的腦卒中高危因素及影像檢驗結(jié)果。

(3)健康對照組：選取來南華大學(xué)附屬郴州醫(yī)院的健康體檢者50例，于早晨采集其空腹外周靜脈血樣，并收集其各項體檢結(jié)果。

所有研究對象中均排除患者或家屬不同意參與或拒絕留取標本者、有動脈炎和其它血管炎者、有嚴重肝腎疾病和(或)肝腎功能損害者、有嚴重貧血、凝血功能障礙或其它嚴重血液系統(tǒng)疾病者、有嚴重自身免疫性疾病和(或)惡性腫瘤者、近期有手術(shù)史、妊娠史、傳染性疾病以及寄生蟲疾病史者。以上每組研究對象的性別、年齡相匹配。在遵循研究對象知情同意原則的前提下，共收集325例血液樣本。

實驗試劑與耗材

LS(美國MRC公司)

氯仿，異丙醇，無水乙醇(天津市北聯(lián)精細化學(xué)品開發(fā)有限公司)

GoScript^TM Reverse Transcription System(美國Promega公司)

480SYBR Green I Master(瑞士Roche公司)

2×Es Taq MasterMix(北京康為世紀生物科技有限公司)

PCR引物(上海生工生物工程有限公司)

Base，EDTA，boric acid，瓊脂糖(Sigma-Aldrich公司)

Good View^TM Nuclelc Acid Stain(上海賽百盛基因技術(shù)有限公司)

6×DNA Loading Buffer(天根生化科技(北京)有限公司)

100bp DNA Ladder(天根生化科技(北京)有限公司)

RNase-free Tip頭、離心管(美國AXYGEN公司)

熒光定量PCR96孔板(瑞士Roche公司)

血漿總RNA的抽提

(1)取血漿樣本(300ul/管)，加入Trizol LS 900ul，漩渦振蕩10s，室溫靜置5min，4℃12000rpm離心10min；

(2)取上層粉紅色液體(約1000ul)至1.5mlRNase-free離心管中；

(3)加0.2ml氯仿，漩渦振蕩10s，室溫靜置5min，4℃12000rpm離心15min；

(4)取上層水相至1.5mlRNase-free離心管中；

(5)加入等體積異丙醇，混勻，4℃靜置20min后，4℃12000rpm離心10min，棄上清；

(6)加入-20℃預(yù)冷的用無酶水配制的75％乙醇1ml，顛倒數(shù)次，洗滌RNA沉淀，4℃12000rpm離心5min，棄上清；

(7)重復(fù)洗滌一次，4℃12000rpm離心5min，棄上清；

(8)4℃12000rpm離心1min，用移液器緩慢吸除殘余液體，注意不要吸棄RNA沉淀；

(9)將RNA沉淀于室溫下干燥1min；

(10)加入10ul無酶水溶解RNA，反復(fù)吹打，得RNA提取液，至完全溶解后用分光光度計測得RNA的濃度和純度，-80℃保存。

逆轉(zhuǎn)錄(Reverse Transcription，RT)反應(yīng)合成cDNA

按以下步驟配制20ul RT反應(yīng)體系(反應(yīng)體系的配制在冰上進行)：

(1)于200ul RNase-Free離心管中加入RNA提取液和RT引物，混合后進行預(yù)變性，預(yù)變性反應(yīng)體系如表1所示。

表1預(yù)變性反應(yīng)體系

將離心管置于預(yù)熱的PCR儀進行預(yù)變性反應(yīng)，70℃5min,反應(yīng)結(jié)束立即將離心管置于冰上至少5min，小離心機離心10s，冰上保存。

(2)配制RT反應(yīng)體系(如表2)，向每個反應(yīng)管中加入10ul RT反應(yīng)液，混合后進行RT反應(yīng)合成cDNA。

表2RT反應(yīng)體系

利用PCR擴增儀進行RT反應(yīng)，反應(yīng)條件為：25℃5min，42℃60min，70℃15min。反應(yīng)結(jié)束后，將其放在冰上待用或-20℃保存。

實時熒光定量PCR(Real-time quantitative PCR，qPCR)檢測

(1)用引物設(shè)計軟件Primer 5.0設(shè)計qPCR特異性引物(見表3)，并由上海生工生物工程有限公司合成。

表3qPCR特異性引物序列

(2)按下列組份配制qPCR反應(yīng)體系(如表4)，反應(yīng)液配制在冰上進行。

表4qPCR反應(yīng)體系

(3)向每個qPCR96孔板對應(yīng)的孔中加入18ul反應(yīng)液，再加對應(yīng)的cDNA模板2ul，qPCR總反應(yīng)體系為20ul。每個樣本設(shè)3個復(fù)孔(所得結(jié)果取平均值用于計算)。使用專用封口膜封板，短暫離心混合。

(4)將96孔板放入480Ⅱ?qū)崟r熒光定量PCR儀中，啟動qPCR程序(如表5)，系統(tǒng)自動記錄實時熒光信號動態(tài)曲線，分析每個反應(yīng)管中的熒光信號到達設(shè)定域值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)(Ct值)，并建立PCR產(chǎn)物熔解曲線。

表5qPCR反應(yīng)程序

(5)記錄所有樣本3個復(fù)孔的Ct值，取平均值用于計算。以GAPDH作為內(nèi)參，以健康對照組作為對照樣本；采用2^-△△Ct法計算各樣本MALAT1的相對含量：ΔCt＝Ct(MALAT1)–Ct(GAPDH)；ΔΔCt＝ΔCt樣本－ΔCt對照。

瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物

(1)制備2％瓊脂糖凝膠：按2％比例將瓊脂糖加于1×TBE電泳緩沖液中，微波爐加熱至完全熔化，冷卻至60℃后加入Good View核酸染色劑，搖勻后倒入凝膠板，室溫放置至膠凝固。膠凝后取出梳子，將凝膠板放進電泳槽內(nèi)，加足量的1×TBE電泳緩沖液至覆蓋膠面幾個毫米。

(2)電泳：將qPCR產(chǎn)物與DNALoading Buffer混勻后取10ul上樣于膠孔中，調(diào)整電壓至100V，約半小時后電泳完成。取出凝膠置于紫外透射光下觀察并拍照。

PCR產(chǎn)物測序

由上海生工生物工程有限公司對PCR產(chǎn)物進行克隆測序，得到PCR產(chǎn)物的堿基序列。

統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS19.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。分類資料組間比較采用卡方檢驗；運用單樣本K-S檢驗方法對連續(xù)性變量進行正態(tài)性檢驗，定量資料中服從正態(tài)分布者采用均數(shù)±標準差()表示，兩樣本均數(shù)比較行獨立樣本t檢驗，多個樣本均數(shù)比較行單因素ANOVA檢驗。定量資料中不滿足正態(tài)分布的資料釆用中位數(shù)和四分位數(shù)間距表示，兩組或多組樣本間比較采用Mann-Whitney U檢驗或Kruskal-Wallis H檢驗，兩關(guān)聯(lián)樣本間的比較采用Wilcoxon檢驗。兩組變量相關(guān)性分析采用Pearson積矩相關(guān)分析或Spearman秩相關(guān)分析。采用ROC曲線分析評價MALAT1的診斷價值。本發(fā)明研究所有運用到的統(tǒng)計檢驗，均為雙側(cè)檢驗，當p<0.05時為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

研究對象的一般臨床資料如下：

本研究共收集了97例腦卒中急性期患者(包括腦梗死患者50例、腦出血患者25例及蛛網(wǎng)膜下腔出血患者22例)、51例腦卒中高危人群及50例健康對照組的一般臨床資料及血液樣本。對研究對象的一般臨床資料進行分析，各組間人員性別和年齡組成上的差異無統(tǒng)計學(xué)意義(p>0.05)。通過對各組研究對象的高血壓、糖尿病、冠心病、高血脂的患病情況與MALAT1的相對表達水平進行分析，發(fā)現(xiàn)在高血壓與非高血壓人群、糖尿病與非糖尿病人群、冠心病與非冠心病人群、髙血脂與非高血脂人群之間MALAT1表達水平的差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。表6所示為各組研究對象的一般臨床資料，數(shù)據(jù)采用均數(shù)土標準差或例(％)表示。

表6研究對象的一般臨床資料

注：NHISS：美國國立衛(wèi)生研究院卒中量表；mRS：改良RANKIN量表；LAA:大動脈粥樣硬化性卒中；SAA：小動脈閉塞性卒中或腔隙性卒中；CE：心源性腦栓塞；SOE：其他原因所致的缺血性卒中；SUE：不明原因的缺血性卒中。

血漿MALAT1檢測的敏感性和特異性

通過qRT-PCR對所有研究對象血漿中的MALAT1進行擴增，同時以GAPDH作為內(nèi)參。結(jié)果顯示qPCR產(chǎn)物的擴增曲線、熔解曲線以及熔解峰穩(wěn)定。擴增曲線中可見明顯的對數(shù)擴增前期、對數(shù)擴增期及平臺期，說明PCR產(chǎn)物豐富，MALAT1及內(nèi)參GAPDH的PCR引物敏感度較高(圖1B,D)；qPCR產(chǎn)物的熔解峰均為單峰，產(chǎn)物單一，表明引物特異性較好(圖1A,C)。瓊脂糖凝膠電泳檢驗qPCR產(chǎn)物同樣可見產(chǎn)物條帶特異，無引物二聚體干擾，條帶位置正確(圖1E)。通過對PCR產(chǎn)物進行測序得到其堿基序列，與理論上MALAT1及GAPDH的擴增產(chǎn)物序列相同(圖1F-G)。以上都說明血漿MALAT1及GAPDH得到了特異性擴增，結(jié)果可信。

血漿MALAT1在不同組中差異表達

通過qRT-PCR的檢測，可以得到血漿MALAT1在腦卒中急性期患者組、腦卒中高危人群組及健康對照組樣本中相對于內(nèi)參GAPDH的表達水平。選取腦卒中急性期患者組發(fā)病24小時以內(nèi)的血樣檢測結(jié)果進行統(tǒng)計，結(jié)果表明：血漿MALAT1在腦卒中高危人群組的相對表達量為0.92(0.97)，低于健康對照組的相對表達量1.79(7.44)，兩者差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(p＝0.002)。血漿MALAT1在腦梗死組、腦出血組及蛛網(wǎng)膜下腔出血組的相對表達量(以中位數(shù)和四分位數(shù)間距表示)分別為5.66(28.4)、6.68(40.56)、20.39(39.19)，均高于健康對照及腦卒中高危人群組的相對表達量，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(p<0.01)；但三種腦卒中亞組間的表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義(p>0.05)，見圖2A-C。

MALAT1在腦卒中急性期患者不同發(fā)病時間點血漿中的表達

對入選腦卒中急性期患者進行動態(tài)追蹤采血，分別于發(fā)病24h內(nèi)、2d、7d、14d(視住院時間而定)采集其外周靜脈血樣，其中有52例在3個及以上不同時間點采血(腦梗死患者29例、腦出血患者13例及蛛網(wǎng)膜下腔出血患者10例)。通過qRT-PCR的檢測，可以得到血漿MALAT1在腦梗死組、腦出血組及蛛網(wǎng)膜下腔出血組不同時間點的相對表達量(以中位數(shù)和四分位數(shù)間距表示)。血漿MALAT1在腦梗死組發(fā)病24h內(nèi)、2d、7d、14d、21d不同時間點的相對表達量分別為5.66(28.41)、4.78(9.62)、3.44(4.54)、7.62(31.42)、7.26(27.32)，發(fā)病24h內(nèi)與發(fā)病7d時的相對表達量差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(p＝0.016),見圖3A；血漿MALAT1在腦出血組發(fā)病24h內(nèi)、2d、7d、14d不同時間點的相對表達量分別為6.68(40.56)、5.45(19.07)、4.03(20.96)、9.25(15.87)，各時間點的表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義(p>0.05)，見圖3B。血漿MALAT1在蛛網(wǎng)膜下腔出血組發(fā)病24h內(nèi)、2d、7d、14d不同時間點的相對表達量分別為20.39(39.19)、7.31(11.51)、3.63(34.44)、3.3(2.51)，各時間點的表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義(p>0.05)，見圖3C。

MALAT1對腦卒中高危人群篩查及腦卒中發(fā)病早期的診斷價值

ROC曲線(receiver operating characteristic curve)即受試者工作特征曲線?？梢杂肦OC曲線下面積(area under the curve，AUC)來評價診斷的準確度，AUC值為0.7-0.9時表示診斷價值中等；AUC值大于0.9時表示診斷價值較高。運用ROC曲線分析評價血漿MALAT1在腦卒中高危人群篩查和腦卒中發(fā)病早期的診斷價值。對發(fā)病24h以內(nèi)的腦卒中患者組(包括腦梗死組、腦出血組及蛛網(wǎng)膜下腔出血組)、腦卒中高危人群組及健康對照組之間血漿MALAT1的表達差異進行ROC曲線分析，對腦卒中高危人群篩查及腦梗死、腦出血、蛛網(wǎng)膜下腔出血發(fā)病早期的診斷，MALAT1均有中等水平的診斷價值，見表7、圖4A-G。

表7MALAT1在各組間的ROC曲線分析

注：HC：健康對照組；HR：腦卒中高危人群組；CI：腦梗死組；ICH：腦出血組；

SAH：蛛網(wǎng)膜下腔出血組。

MALAT1在不同嚴重程度腦卒中患者血漿中的表達

對入選的97例腦卒中急性期患者(腦梗死患者50例、腦出血患者25例及蛛網(wǎng)膜下腔出血患者22例)，入院時按美國國立衛(wèi)生研究院卒中量表(NIHSS)進行神經(jīng)功能缺損評分并記錄，評分標準見附件2。按照評分結(jié)果進行分組，NIHSSS≤7分為輕型，NIHSS>7分為重型，對輕型和重型腦卒中患者發(fā)病24小時以內(nèi)血漿MALAT1的表達水平進行比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(p>0.05)，見表8。

表8MALAT1在不同嚴重程度腦卒中患者血漿中的表達

注：表中數(shù)據(jù)以中位數(shù)(四分位數(shù)間距)表示。

MALAT1在不同TOAST分型腦梗死急性期患者血漿中的表達

類肝素藥物治療急性缺血性腦卒中試驗(TOAST)分型標準是目前被廣泛應(yīng)用于臨床的缺血性腦卒中的病因?qū)W分類標準。按照TOAST分型可以將腦梗死分為五種亞型：(1)大動脈粥樣硬化型卒中(large-artery atherosclerosis，LAA)；(2)心源性腦栓塞(cardiogenic embolism，CE)；(3)小動脈閉塞性卒中或腔隙性卒中(small-artery occlusion，SAA)；(4)其他原因所致的缺血性卒中(stroke of other determined etiology，SOE)；(5)不明原因的缺血性卒中(stroke of undetermined etiology，SUE)。對入選的50例腦梗死急性期患者進行TOAST分型，可以分為LAA型38例、SAA型6例、CE型6例。對不同TOAST分型腦梗死患者發(fā)病24小時以內(nèi)血漿MALAT1的表達水平進行兩兩比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(p>0.05)，見表9。

表9MALAT1在不同TOAST分型腦梗死急性期患者血漿中的表達

注：表中數(shù)據(jù)以中位數(shù)(四分位數(shù)間距)表示。

MALAT1在不同療效腦卒中患者血漿中的表達

改良Rankin量表(modified Rankin Scales,mRS)可以用來衡量腦卒中后患者的神經(jīng)功能恢復(fù)狀況，作為功能殘疾水平的療效判定指標，具體評分標準見附件3。對入選腦卒中患者卒中后半年進行電話隨訪，通過mRS評分評估其療效。依據(jù)mRS評分≤2作為劃分卒中患者是否殘疾的分界值，將mRS評分≤2的腦卒中患者視為預(yù)后良好，mRS評分＞2者視為預(yù)后不佳。對不同療效的腦卒中患者發(fā)病24小時以內(nèi)血漿MALAT1的表達水平進行比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(p>0.05)，見表10。

表10MALAT1在不同療效腦卒中患者血漿中的表達

注：表中數(shù)據(jù)以中位數(shù)(四分位數(shù)間距)表示。