本發(fā)明涉及一種黃瓜綠斑駁病毒RT-LAMP檢測試劑盒及檢測方法，具體黃瓜綠斑駁(Cucumber green mottle mosaic virus,CGMMV)RT-LAMP引物組的建立，CGMMV RT-LAMP檢測試劑盒的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

黃瓜綠斑駁病毒為正單鏈RNA病毒，病毒全長約6.5kb，主要侵染西瓜、黃瓜、甜瓜等葫蘆科作物，在黃瓜上產(chǎn)生的典型癥狀為葉片上出現(xiàn)色斑、水泡及變形，植株矮化，產(chǎn)量損失達(dá)15％，受感染果實通常沒有癥狀，但有些株系能夠使果實嚴(yán)重變形及色斑，有些亞洲株系在葉片上并不出現(xiàn)癥狀但造成產(chǎn)量下降。在西瓜上部葉片產(chǎn)生輕花葉，但在果實中卻造成嚴(yán)重的變色或使果實內(nèi)部腐，是這些作物上的檢疫病害之一。CGMMV主要通過接觸、種子等方式傳播，也可通過啤酒菟絲子、桃蚜、棉蚜及帶病殘留物傳播。

環(huán)介導(dǎo)的等溫擴增技術(shù)(Loop-mediated isothermal amplification,LAMP)是根據(jù)目的基因的6個特異區(qū)域，設(shè)計4-6條特異性引物，利用Bst DNA聚合酶在60～65℃等溫條件下特異地擴增目的基因。LAMP擴增反應(yīng)可在60分鐘之內(nèi)完成，其擴增產(chǎn)物是和靶標(biāo)反向重復(fù)的莖環(huán)結(jié)構(gòu)以及多環(huán)的菜花樣結(jié)構(gòu)，反應(yīng)過程中產(chǎn)生大量焦磷酸根離子，并形成焦磷酸鎂白色沉淀。LAMP方法可以通過多種方法判斷結(jié)果，如反應(yīng)后體系內(nèi)是否存在白色沉淀物、電泳結(jié)果是否具有梯狀條帶、加入SYBR Green Ⅰ是否變成綠色等，具有檢測靈敏度高，檢測方法簡單快速、儀器要求不高等特點。然而就引物設(shè)計方面，目前報道的文獻多是以在線方式(Primer Explore)設(shè)計引物，應(yīng)用范圍受到限制，根據(jù)LAMP原理自行設(shè)計多組引物組，通過實驗結(jié)果選取最適引物組，構(gòu)建LAMP檢測方法，這樣將會大大增加LAMP的適用范圍，具有更為廣泛的應(yīng)用前景。

自LAMP技術(shù)建立以來，該技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于對病菌、寄生蟲等的檢測，近年來在動物病毒的檢測研究中逐漸推廣起來，然而對于植物病毒如黃瓜綠斑駁病毒還沒有相應(yīng)的檢測試劑盒的報 道，因此開發(fā)一種針對黃瓜綠斑駁病毒的RT-LAMP試劑盒具有重要的應(yīng)用價值。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

CGMMV檢測主要有DTBIA、ELSA、RT-PCR、RT-nested PCR、real-time RT-PCR等方法。DTBIA靈敏度較低；而RT-PCR、RT-nested PCR和real-time RT-PCR核酸檢測技術(shù)需要昂貴的專業(yè)儀器，且核酸擴增的時間較長。

本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種快速黃瓜綠斑駁病毒RT-LAMP檢測方法。本發(fā)明人在堅持不懈的努力之下，發(fā)明了一種快速提取RNA待測樣品的方法，并結(jié)合自己設(shè)計的引物，使用RT-LAMP檢測方法，能夠快速有效地檢測出黃瓜綠斑駁病毒。

本發(fā)明提供

(1)一種黃瓜綠斑駁病毒RT-LAMP檢測試劑盒，其特征在于，包括RT-LAMP引物，所述RT-LAMP引物為：

(2)如(1)所述的試劑盒，還包括黃瓜綠斑駁病毒的RNA的快速提取液，所述快速提取液由10％的乙酸乙酯、2～10％的二甲基甲硫胺和1M Tris-HClpH7.5構(gòu)成。

(3)如(2)所述的試劑盒，其中，所述二甲基甲硫胺的體積濃度為6％。

本發(fā)明還提供如下檢測黃瓜綠斑駁病毒的方法，

(4)一種黃瓜綠斑駁病毒RT-LAMP檢測方法，其特征在于，包括以下步驟

S1使用由10％的乙酸乙酯、2～10％的二甲基甲硫胺和1M Tris-HClpH7.5構(gòu)成的快速提取液，從待測樣品中提取總RNA，并作為RNA模板；

S2使用如(1)所述試劑盒，構(gòu)建RT-LAMP反應(yīng)體系，所述反應(yīng)體系為20μL，包括：2×反應(yīng)緩沖液(RM)10μL，酶溶液(EM)0.8μL，40pmol/μL上游引物FIP 0.8μL，40pmol/μL上游引 物BIP0.8μL，10pmol/μL下游引物F3 0.4μL，10pmol/μL下游引物B3 0.4μL，濃度均為20pmol/μL的環(huán)引物L(fēng)B0.8μL，RNA模板1.6μL，及去離子水(DW)4.4μL；

S3將所述RT-LAMP反應(yīng)體系，置于59℃水域中，反應(yīng)60分鐘，得到反應(yīng)液；

S4對所述反應(yīng)液進行檢測。

(5)如(4)所述的RT-LAMP檢測方法，其中，所述二甲基甲硫胺的體積濃度為6％。

(6)如(4)所述的RT-LAMP檢測方法，其中所述S4步驟中是在所述反應(yīng)液中加入加入鈣黃綠素?zé)晒馊玖希ㄟ^反應(yīng)管內(nèi)所產(chǎn)生的顏色變化判斷檢測結(jié)果。

本發(fā)明根據(jù)CGMMV的基因序列設(shè)計RT-LAMP引物，通過實驗最終建立了CGMMV的RT-LAMP檢測方法，為CGMMV的檢測提供了一種快速高效、特異靈敏的新方法，靈敏度高，比普通RT-PCR靈敏度高10倍；并可通過肉眼觀察濁度或顏色反應(yīng)直接進行結(jié)果判斷。該方法適用于現(xiàn)場CGMMV的快速檢測。本研究的目的就是研制該病毒的快速高效、靈敏特異的檢測技術(shù)，與以往研究的方法形成一個不同層次的檢測體系，使檢測人員根據(jù)不同條件和目的可以進行廣泛有效的選擇，為瓜類種苗檢驗檢疫、種子認(rèn)證及生產(chǎn)田的病害監(jiān)測提供有效的技術(shù)支持。

附圖說明

圖1最佳反應(yīng)溫度擴增曲線。

圖2特異性實驗中擴增曲線結(jié)果。

圖3特異性試驗中顏色反應(yīng)結(jié)果。

具體實施方式

為解決上述技術(shù)問題，設(shè)計1套用于檢測CGMMV的引物組，包括正向外引物F3-3的序列為SEQ ID NO.1，反向外引物B3-3的序列為SEQ ID NO.2；正向內(nèi)引物FIP-3的序列為SEQ ID NO.3，反向內(nèi)引物BIP-3的序列為SEQ ID NO.4；以及環(huán)引物L(fēng)B，具體序列見表1。

表1引物序列

Loopamp RNA擴增反應(yīng)試劑盒、Loopamp反應(yīng)管、Loopamp FD熒光檢測試劑購自日本榮研化學(xué)株式會社，RNA提取試劑盒購自北京百泰克生物技術(shù)有限公司，其他試劑均為常規(guī)分析純試劑。采用日本榮研化學(xué)株式會社生產(chǎn)的LA-320C實時濁度儀。

試驗例1核酸提取

分別稱取感染CGMMV病毒或未感染的(對照用)的黃瓜葉片0.1g，或者用鑷子獲取相當(dāng)于0.1g大小的黃瓜葉片作為實驗用材料。

RNA提取方法1：使用RNA快速提取試劑盒(離心柱型)提取樣品總RNA，具體操作按試劑盒說明進行。本試驗具體使用了QIAGEN Rneasy Mini kit提取RNA，也可以采取其它試劑盒進行提取，或者通常實驗室提取方法提取RNA。

RNA提取方法2：采用本發(fā)明的試劑盒，更加快速簡便地提取RNA粗提液。具體是用鑷子取黃瓜新生葉片約0.1g，迅速置于研砵中，研砵中預(yù)先加入含有10％的乙酸乙酯、2～10％的二甲基甲硫胺和1M Tris-HClpH7.5構(gòu)成的提取液5mL，并迅速研磨3min，然后靜置2min，取1.6μL作為RNA模板。所述鑷子、研砵、研磨棒及其它試驗用具需要在DEPC水中浸泡12小時后，150度烘烤6小時，然后取出放置于4℃冷藏備用。含有10％的乙酸乙酯、2～10％的二甲基甲硫胺的1M Tris-HClpH7.5溶液為事先配好，高溫高壓消毒處理后，放置于4℃冷藏備用。移液搶的槍頭以及各種反應(yīng)管均使用RNase-free產(chǎn)品。

所述10％的乙酸乙酯的濃度是指100ml溶液中，含有10g乙酸乙酯，二甲基甲硫胺的濃度同樣。

試驗例2RT-LAMP體系的建立及優(yōu)化

RT-LAMP反應(yīng)體系按照Loopamp RNA擴增試劑盒說明，反應(yīng)體系為20μL，包括：2×反應(yīng)緩沖液(RM)10μL，酶溶液(EM)0.8μL，40pmol/μL引物FIP 0.8μL，40pmol/μL BIP0.8μL，10pmol/μL F3 0.4μL，10pmol/μL B3 0.4μL，LB(濃度均為20pmol/μL)0.8μL，RNA模板1.6μL， 及去離子水(DW)4.4μL。反應(yīng)溫度分別設(shè)為59、61、63和65℃，反應(yīng)時間為60min。擴增反應(yīng)在實時濁度儀上進行，根據(jù)60min內(nèi)出現(xiàn)擴增曲線的最短時間確定最佳反應(yīng)溫度。

黃瓜綠斑駁病毒(CGMMV)、馬鈴薯X病毒(PVX)、黃瓜花葉病毒(CMV)、煙草脈帶花葉病毒(TVBMV)及陰性對照(NC)的總RNA和水(作為空白對照，用BC表示)為模板進行RT-LAMP反應(yīng)，體系中同時加入1.0μL鈣黃綠素?zé)晒馊玖?即Loopamp FD熒光檢測試劑)，驗證該方法的特異性。

RT-LAMP擴增產(chǎn)物(1)實時擴增曲線檢測：擴增進行時，如果有產(chǎn)物出現(xiàn)，反應(yīng)液會產(chǎn)生一定的濁度；濁度儀會將濁度信號收集，以擴增曲線的形式反映，從而對結(jié)果進行判斷。(2)染料顏色反應(yīng)檢測：在LAMP反應(yīng)體系中加入1μL Loopamp FD試劑，反應(yīng)結(jié)束后，肉眼觀察反應(yīng)液的熒光顏色反應(yīng)。顯綠色判斷為陽性反應(yīng)；若顯橙色判斷為陰性反應(yīng)。

結(jié)果與分析

1.最佳提取液的確定

分別配制二甲基甲硫胺濃度為2％、4％、6％、8％、10％的并含有10％乙酸乙酯的1M Tris-HCl(pH7.5)溶液，配制方法為在100mL的容量瓶中，加入10g乙酸乙酯，以及2、或4、或6、或8、或10g的二甲基甲硫胺，然后加入已經(jīng)配好的1M Tris-HCl(pH7.5)并定容，得到二甲基甲硫胺濃度為2％(或4％、或6％、或8％、或10％)的并含有10％乙酸乙酯的1M Tris-HCl(pH7.5)溶液。按照上述RNA提取方法2進行提取，并使用分光光度計測量A260和A280的值，計算A260/A280比值，Rneasy Mini kit提取RNA作為陽性對照，其結(jié)果見表2。

表2不同方法得到的RNA溶液的A260/A280比值

因此，本實施例中均使用二甲基甲硫胺濃度為6％并含有10％乙酸乙酯的1M Tris-HCl(pH7.5)溶液提取樣品RNA，但這并不限定于該濃度，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解，其它濃度的溶液所提取到的RNA同樣可以用于本發(fā)明的檢測，并取得同樣檢測效果。

2.最佳反應(yīng)溫度的確定

以RNA提取方法2得到的總RNA為模板，進行RT-LAMP反應(yīng)，實時濁度儀輸出的擴增時間曲線結(jié)果如圖2。由圖中曲線可以看出，RT-LAMP在59、61、63和65℃的反應(yīng)溫度下，分別在約34、36、42和48min時產(chǎn)生了擴增曲線。根據(jù)現(xiàn)場檢測時間盡可能短的要求，確定59℃為最佳反應(yīng)溫度。

3.RT-LAMP特異性實驗

黃瓜綠斑駁病毒(CGMMV)、馬鈴薯X病毒(PVX)、黃瓜花葉病毒(CMV)、煙草脈帶花葉病毒(TVBMV)陽性材料及健康黃瓜葉片(陰性對照，用NC表示)為臨沂大學(xué)生物試驗中心保存的標(biāo)本，從-30℃冰箱中取出這些標(biāo)本，直接用鑷子取出約0.1g葉片，按照本發(fā)明的RNA提取方法2得到總RNA。以總RNA為模板進行RT-LAMP反應(yīng)，溫度為61℃，時間為60min。體系中加入鈣黃綠素?zé)晒馊玖弦允沟梅磻?yīng)結(jié)束后可以通過反應(yīng)管內(nèi)所產(chǎn)生的顏色變化判斷是否擴增，結(jié)果如圖3所示。由圖3可以看出，只有CGMMV能夠檢測到擴增曲線，其他樣品在反應(yīng)時間內(nèi)都未檢測到擴增曲線。反應(yīng)結(jié)束后，加入CGMMV總RNA的反應(yīng)管顯綠色，判斷為陽性；而其他反應(yīng)管均顯橙色，判斷為陰性。擴增曲線結(jié)果與顏色反應(yīng)的結(jié)果一致，表明本研究所建立的RT-LAMP檢測方法具有高度的特異性，檢測結(jié)果十分準(zhǔn)確。

本發(fā)明在建立CGMMV的RT-LAMP檢測方法過程中，采用了日本Eiken Chemical公司研發(fā)配制的LoopampRNA擴增試劑盒，簡化了實驗反應(yīng)前的準(zhǔn)備工作，同時保證了實驗的質(zhì)量。在結(jié)果分析方面，研究使用了LA-320C實時濁度儀，可對實驗結(jié)果定量分析。另外，通過在RT-LAMP反應(yīng)體系中加入試劑盒配套的鈣黃綠素?zé)晒馊玖希沟貌婚_蓋也可觀察到反應(yīng)所產(chǎn)生的顏色變化，避免了二次污染，保證了結(jié)果的準(zhǔn)確性。另外，使用本發(fā)明的RNA快速提取液，可以在現(xiàn)場快速檢測，并現(xiàn)場得到結(jié)果，而不需要進入實驗室使用Rneasy Mini kit提取RNA。本發(fā)明的RNA快速提取液為二甲基甲硫胺濃度為6％并含有10％乙酸乙酯的1M Tris-HCl(pH7.5)溶液，雖然在本發(fā)明中能夠快速提取CGMMV病毒RNA的機理還不明確，但是根據(jù)分析，由于其具有高極性，能夠使CGMMV病毒RNA快速釋放，并在RNA分解前加入到RT-LAMP反應(yīng)體系，從而能夠順利作為模板，進行RT-LAMP擴增。該機理將在今后的試驗中作進一步的闡明。

在建立針對某種病毒LAMP檢測方法時，最重要的是特異引物的設(shè)計，而引物是否特異決定于 所選序列的比對結(jié)果是否特異。因此，一定要在引物設(shè)計的前期做好充足的準(zhǔn)備工作，利用序列分析軟件將目的序列篩選好，然后將序列進行手動處理后再上傳至引物設(shè)計服務(wù)器設(shè)計引物，才能夠得到較為理想的引物組。在進行結(jié)果檢測方面，若有條件盡量使用實時濁度儀，可以對結(jié)果進行定量分析，保證結(jié)果的準(zhǔn)確性；同時，在進行結(jié)果檢測時，一定盡量避免開蓋檢測，防止產(chǎn)生二次污染導(dǎo)致假陽性結(jié)果出現(xiàn)。