本發(fā)明涉及一種利用氧化石墨烯-金屬離子配位固定化酶的方法，屬于酶固定化領域。
背景技術：
：在氧化還原酶催化過程中，輔酶的再生利用至關重要，甲酸脫氫酶(FormateDehydrogenase，FDH)在輔酶再生中的應用已成為研究熱點之一。甲酸脫氫酶可用于構建輔酶高效再生系統(tǒng)，并已應用于工業(yè)生產。其優(yōu)勢在于產物為CO2易于從反應體系中逸出，使反應向正方向進行，且便于產物的分離和檢測。底物甲酸鈉或甲酸銨價格低廉，可降低成本。由于游離的甲酸脫氫酶穩(wěn)定性差，采用固定化的方法可進行改善。固定化酶可回收、重復使用，穩(wěn)定性好。固定化酶的性能取決于固定化酶所使用的載體材料的性質和固定化方法。酶的固定化材料包括無機、有機聚合物、凝膠以及生物材料等。酶的固定化方法主要有四種：包埋法、吸附法、共價法和交聯法。氧化石墨烯(GrapheneOxide，GO)是石墨烯(Graphene)的一種重要的衍生物，具有良好的生物相容性，在生物醫(yī)藥、藥物緩釋、包裝材料等領域有廣闊的應用前景。GO具有和石墨烯相似的二維片層結構，不同的是GO在碳骨架的二維平面上以及邊緣含有大量的含氧基團，包括環(huán)氧基、羧基和羥基，這些含氧基團的存在使得GO在水溶液中有了較好的分散性和穩(wěn)定性。由于其帶有負電荷，可基于靜電結合力制備多層膜。因此，氧化石墨烯可作為一種良好的酶固定化載體。但目前利用氧化石墨烯作為酶固定化載體還存在一些負載量低、固定化率低、固定化酶的穩(wěn)定性和重復使用性較差的缺陷。技術實現要素：本發(fā)明提供了一種利用氧化石墨烯-金屬離子配位固定化酶的方法。利用氧化石墨烯-金屬離子配位固定載體固定化酶，可以提高酶的溫度穩(wěn)定性與重復使用次數。帶His-tag標簽的酶均可采用此方法，不限于甲酸脫氫酶。
發(fā)明內容包括以下步驟：1)粗酶液制備：將可表達帶His-tag標簽的目標酶的重組表達菌株接種培養(yǎng)，培養(yǎng)一段時間后加入乳糖誘導劑IPTG；培養(yǎng)所得菌液，離心獲取細胞，配制成細胞懸液；超聲破碎并離心，收集上清液即為含有帶His-tag標簽的目標酶的粗酶液；以甲酸脫氫酶為例：構建可表達帶His-tag標簽的目標酶的重組表達菌株，甲酸脫氫酶(FDH)的基因原始序列來自Candidaboidinii(190-1284nucleotide,GenebankID:AF004096.1)，如SEQIDNO.1所示；根據上述原始序列，采用PCR法構建5’端和3’端分別帶有NdeI和Xhol酶切位點的甲酸脫氫酶基因，用NdeI和Xhol分別雙酶切上述甲酸脫氫酶(FDH)基因和pET28a質粒，連接轉化，得到pET28a-FDH質粒。將上述質粒轉化至E.coliBL21(DE3)，得到可表達帶His-tag標簽的甲酸脫氫酶的重組表達菌株E.coliBL21(DE3)/pET28a。將該可表達帶His-tag標簽的甲酸脫氫酶的重組表達菌株E.coliBL21(DE3)/pET28a接種到含有卡那霉素的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)一段時間后加入乳糖誘導劑IPTG。所述的接種量為1～3％，所述的LB培養(yǎng)基的組成為：胰蛋白胨5.0～15.0g/L，酵母浸膏1.0～10.0g/L，NaCl0.0～15.0g/L，調節(jié)pH7.0～7.5，接種前添加卡那霉素使其終濃度為50～150μg/mL；所述培養(yǎng)條件為37℃，150～250rpm培養(yǎng)15～6h后加入誘導劑IPTG，使其終濃度為5～15mg/ml，繼續(xù)在25～30℃，150～250rpm下培養(yǎng)2～6h。培養(yǎng)所得菌液，在冷凍離心機中離心(優(yōu)選為4℃，8000rpm，15min)獲得細胞，棄上清液，沉淀用Tris-HCl緩沖液(pH6.5～8.0)重懸，充分洗滌后離心，重復操作3次。用Tris-HCl緩沖液(pH6.5～8.0)配制成濃度為50～150g/L的細胞懸液。將制備的細胞懸液置于冰浴中，超聲細胞破碎儀探頭置于液面下1厘米，功率200W，超聲2秒，間隔4秒，超聲20～60次。然后4℃、12000rpm離心15min去除不溶性細胞碎片，上清即為含有帶His-tag標簽的甲酸脫氫酶的粗酶液。2)純酶的制備：采用鎳柱對步驟1)得到的粗酶液進行純化并除鹽；采用的純化柱為能夠特異性純化帶有His-tagged標簽的蛋白質的HisTrapHP柱，其步驟包括平衡、上樣、平衡、洗脫、柱子再生；收集洗脫的部分并利用超濾離心管進行除鹽，除鹽后獲得的液體即為目標酶的純酶溶液。3)向酶活測定體系加入金屬離子溶液(包括Ni2+、Co2+、Zn2+、Mg2+、Sr2+、Ca2+、Fe2+、Fe3+、Cu2+、Mn2+、Cd2+、Ba2+等)，使其終濃度為0.1～10mM?？疾觳煌饘匐x子對目標酶酶活的影響，選擇對游離目標酶酶活無明顯抑制作用金屬離子用于固定化。4)氧化石墨烯溶液的制備：用Bradford改良法等方法制備氧化石墨烯，將氧化石墨烯溶解在純水中，超聲分散后得到濃度為0.1～10mg/mL的分散均勻的氧化石墨烯懸濁液，離心之后取上清液即為氧化石墨烯溶液，該溶液在室溫下可穩(wěn)定保藏。5)氧化石墨烯-金屬離子固定化載體的制備：在氧化石墨烯溶液中加入對游離目標酶酶活無明顯抑制作用的金屬離子溶液(包括Ni2+、Co2+、Zn2+、Mg2+、Sr2+、Ca2+、Fe2+、Fe3+、Cu2+、Mn2+、Mn2+、Cd2+、Ba2+等)，使金屬離子在溶液中配位平衡后的終濃度為0.1～10mM，在恒溫振蕩器(4～35℃)振蕩1～5h，即得到氧化石墨烯-金屬離子懸濁液。6)氧化石墨烯吸附固定化酶的方法：在氧化石墨烯溶液(0.1～10mg/mL)中加入甲酸脫氫酶溶液，使蛋白的終濃度為0.1～10mg/mL，在恒溫振蕩器中(4～35℃)振蕩1～5h，離心除去上清液，用Tris-HCl緩沖溶液(pH7.5～11.5)進行重復洗滌3次后重懸起來，即得氧化石墨烯吸附固定化酶，作為對比。7)固定化酶的制備：在氧化石墨烯-金屬離子懸濁液加入步驟2)得到的帶His-tag標簽的目標酶的酶溶液，并使目標酶的終濃度為0.1～10mg/mL，在恒溫振蕩器中(4～35℃)振蕩1～5h，離心除去上清液，用Tris-HCl緩沖溶液(pH7.5～11.5)進行洗滌3次后重懸起來，即得氧化石墨烯-金屬離子配位固定化酶體系。8)酶活力的檢測方法：以甲酸脫氫酶為例，甲酸脫氫酶的活性測定反應體系包含10μL，1.62mMNAD+、180μL，0.1mol/L磷酸鉀緩沖溶液(pH10.0)、10μL，162mM的甲酸鈉溶液和20μL酶液，37℃下，340nm處，測定酶活。酶活力定義為在上述條件下，每分鐘氧化消耗(或生成)1μmolNADH所需要的酶量為一個酶活力單位。本發(fā)明同時提供了利用上述氧化石墨烯-金屬離子配位固定化酶的方法制備的固定化酶。本發(fā)明的有益效果如下：片層結構的氧化石墨烯是一種優(yōu)良的固定化載體，表面帶有環(huán)氧基、羰基、羧基等功能性基團，負載面積大。在固定化過程中，過渡態(tài)金屬離子可以和氧化石墨烯表面的羧基配位，形成雜化載體，促進氧化石墨烯的均勻分散，進一步增大負載量；所使用的帶His-tag標簽的酶帶有連續(xù)的4～10個組氨酸標簽，能夠通過親和層析柱純化，且相比酶表面其他分布松散的氨基酸殘基，純化標簽的連續(xù)組氨酸殘基，能與金屬離子形成穩(wěn)定的配位鍵，通過金屬離子與酶組氨酸標簽的配位相互作用力，實現酶在石墨烯上的高效、穩(wěn)定的定向固定化。本發(fā)明工藝簡單、制備條件溫和、固定化率高。所得固定化酶的溫度穩(wěn)定性、pH穩(wěn)定性和重復使用穩(wěn)定性明顯增強，同時具有較高的酶活性回收率。附圖說明下面結合附圖和實施例對本發(fā)明作進一步說明。圖1為金屬離子對游離甲酸脫氫酶的活性影響。圖2為實施例1中GO-Ni-FDH與GO-FDH的酶活回收率。圖3為實施例1中GO-Ni-FDH與GO-FDH的溫度穩(wěn)定性。圖4為實施例1中GO-Ni-FDH重復使用穩(wěn)定性。圖5為實施例1中固定化酶的掃描電子顯微鏡表征。(A)氧化石墨烯(GO)SEM圖；(B)固定化載體(GO-Ni)SEM圖；(C)氧化石墨烯吸附固定化酶(GO-FDH)SEM圖；(D)氧化石墨烯-金屬配位固定化酶(GO-Ni-FDH)SEM圖。圖6為實施例2中GO-Zn-FDH的酶活回收率。圖7為實施例2中GO-Zn-FDH溫度穩(wěn)定性。圖8為實施例2中GO-Zn-FDH重復使用穩(wěn)定性。圖9為實施例3中GO-Mg-FDH的酶活回收率。圖10為實施例3中GO-Mg-FDH溫度穩(wěn)定性。圖11為實施例3中GO-Mg-FDH重復使用穩(wěn)定性。圖12為實施例4中GO-Co-FDH的酶活回收率。圖13為實施例4中GO-Co-FDH溫度穩(wěn)定性。圖14為實施例4中GO-Co-FDH重復使用穩(wěn)定性。具體實施方式下面通過實施例具體說明本發(fā)明的內容：實施例11)粗酶液制備：構建可表達帶His-tag標簽的目標酶的重組表達菌株：甲酸脫氫酶(FDH)的基因原始序列來自Candidaboidinii(190-1284nucleotide,GenebankID:AF004096.1)，如SEQIDNO.1所示；根據上述原始序列，設計引物(如表1所示)并采用PCR法構建5’端和3’端分別帶有NdeI和Xhol酶切位點的甲酸脫氫酶基因，PCR合成過程由上海生工生物工程技術服務有限公司完成：表1用于FDH基因擴增的引物引物名稱對應序列表中編號序列(5’-3’)FDH-P1SEQIDNO.2GGAATTCCATATGAAAATTGTCCTGGTCCTGTFDH-P2SEQIDNO.3CCGCTCGAGTTACTTTTTATCGTGTTTGCCATPCR擴增產物經1％瓊脂糖凝膠電泳鑒定后，膠回收FDH基因片段，用NdeⅠ和XhoI酶切酶進行雙酶切，回收酶切產物，與同樣雙酶切的pET-28a質粒(帶有His-tag標簽)進行連接，連接好的質粒轉化到大腸桿菌BL21(DE3)，得到pET28a-FDH質粒。將上述質粒轉化至E.coliBL21(DE3)，得到可表達帶His-tag標簽的甲酸脫氫酶的重組表達菌株E.coliBL21(DE3)/pET28a。重組大腸桿菌E.coliBL21(DE3)/pET28a的培養(yǎng)：以1％的接種量，將菌種接入200mLLB培養(yǎng)基中。LB培養(yǎng)基的組成為10.0g/L胰蛋白胨,5.0g/L酵母粉,10g/LNaCl，接種前添加卡那霉素使其終濃度為50～150μg/mL。培養(yǎng)條件為：起始pH7.0，裝液量體積分數為10％，培養(yǎng)溫度37℃，搖床轉速200rpm，培養(yǎng)時間6小時。加入誘導劑IPTG，使其終濃度為10mg/ml，繼續(xù)在30℃、200rpm條件下培養(yǎng)2小時。培養(yǎng)結束獲得的發(fā)酵液，在冷凍離心機中離心(4℃，8000rpm，15min)獲得細胞，棄上清液，沉淀用Tris-HCl緩沖液(pH7.5)重懸，充分洗滌后離心，重復操作3次，用Tris-HCl緩沖液(pH6.5～8.0)配制成濃度為50～150g/L的細胞懸液。利用超聲細胞破碎儀對細胞懸液進行處理，超聲細胞破碎儀探頭置于液面下1cm，破碎條件為超聲2秒，間隔4秒，超聲40次，功率200W。然后4℃、12,000rpm離心15min去除不溶性細胞碎片，上清即為含有帶His-tag標簽的甲酸脫氫酶的粗酶液。2)甲酸脫氫酶純酶制備：采用GE公司的HisTrap鎳柱(HistrapTMHP,5mL)對步驟1)得到的粗酶液進行分離純化，并用PALL公司的10K的超濾離心管進行超濾除鹽。所述的純化過程采用的純化柱為能夠特異性純化帶有His-tagged標簽的蛋白質的HisTrapHP柱，其步驟包括平衡、上樣、平衡、洗脫、柱子再生；收集洗脫的部分并利用超濾離心管進行除鹽；除鹽后獲得的液體即為純化的甲酸脫氫酶酶溶液。3)氧化石墨烯溶液的制備：用Bradford改良法等方法制備氧化石墨烯，將氧化石墨烯置于純水中，超聲分散(100W，120min)得到0.5mg/mL的氧化石墨烯懸濁液，離心之后取上清液即為氧化石墨烯溶液。4)甲酸脫氫酶酶活測定體系加入金屬離子溶液(包括Ni2+、Co2+、Zn2+、Mg2+、Sr2+、Ca2+、Fe2+、Fe3+、Cu2+、Mn2+、Cd2+、Ba2+等)，使其終濃度為0.5mM，考察不同金屬離子對甲酸脫氫酶酶活的影響，發(fā)現Ni2+、Co2+、Zn2+、Mg2+、Sr2+、Ca2+、Fe2+、Ba2+對甲酸脫氫酶酶活有激活作用，Cd2+、Cu2+、Mn2+、Fe3+對甲酸脫氫酶酶活有一定的抑制作用。選擇對游離甲酸脫氫酶酶活無明顯抑制作用的金屬離子用于固定化。結果如說明書附圖1所示。5)氧化石墨烯-金屬離子固定化載體的制備：在氧化石墨烯溶液加入NiSO4溶液，使其在溶液中配位平衡后的終濃度為0.6mM，在恒溫震蕩儀震蕩(4℃，1h)，即得到氧化石墨烯-金屬離子懸濁液。6)氧化石墨烯吸附固定化酶的制備：在氧化石墨烯溶液中加入步驟2)得到的甲酸脫氫酶溶液并使其終濃度為1mg/mL，在恒溫震蕩儀震蕩(4℃，1h)，形成固定化顆粒，用純水洗滌3次后用Tris-HCl緩沖溶液(0.05M，pH7.5)重懸起來，制備得到固定化酶GO-FDH，即得氧化石墨烯吸附固定化酶，作為對比；其酶活回收率可達到73.30％，如說明書附圖2所示。7)氧化石墨烯-金屬配位固定化酶的制備：在步驟5)得到的氧化石墨烯-金屬離子懸濁液中加入步驟2)得到的甲酸脫氫酶溶液并使其終濃度為1mg/mL，在恒溫震蕩儀震蕩(4℃，1h)，形成固定化顆粒，用純水洗滌3次后用Tris-HCl緩沖溶液(0.05M，pH7.5)重懸起來，制備得到固定化酶GO-Ni-FDH，酶活回收率可達到86.67％，如說明書附圖2所示。8)固定化酶溫度溫度穩(wěn)定性的測定：將游離酶與固定化酶在60℃水浴恒溫3h，在這個過程中每隔30min測定一次酶活。相對于游離酶，固定化酶的溫度穩(wěn)定性明顯提高，以固定化酶的初始酶活為100％，在60℃恒溫水浴3h后得到固定化酶GO-Ni-FDH，其相對酶活為40.94％，而GO-FDH相對酶活為18.25％，如說明書附圖3所示。氧化石墨烯-金屬配位固定化酶與氧化石墨烯吸附固定化酶比較，酶活回收率高，穩(wěn)定性好。9)固定化酶重復使用率的測定：用固定化甲酸脫氫酶催化甲酸鈉的氧化反應，當轉化率大于95％時結束反應，離心回收固定化酶，用Tris-HCl緩沖液(0.05M，pH10)洗滌，用于催化下一輪反應，以第一次反應測定的固定化酶酶活為100％，計算之后每次反應的相對酶活。重復反應8次后，GO-Ni-FDH相對酶活為63.81％，如說明書附圖4所示。10)固定化酶的掃描電子顯微鏡(SEM)表征：運用SEM觀察氧化石墨烯(GO)、固定化載體(GO-Ni)、氧化石墨烯吸附固定化酶(GO-FDH)，氧化石墨烯-金屬配位固定化酶(GO-Ni-FDH)的形貌特征，如說明書附圖5所示。實施例21)～4)實驗步驟如實施例1的步驟1)～4)。5)氧化石墨烯-金屬離子固定化載體的制備：在氧化石墨烯溶液加入ZnCl2溶液，使其在溶液中配位平衡后的終濃度為10mM：在恒溫震蕩儀震蕩(4℃，1h)，即得到氧化石墨烯-金屬離子懸濁液。6)氧化石墨烯-金屬配位固定化酶的制備：在步驟5)得到的氧化石墨烯-金屬離子懸濁液中加入步驟2)得到的甲酸脫氫酶溶液并使其終濃度為10mg/mL，在恒溫震蕩儀震蕩(4℃，1h)，形成固定化顆粒，用純水洗滌三次后用Tris-HCl緩沖溶液(0.1M，pH10)重懸起來，得到固定化酶GO-Zn-FDH，酶活回收率可達到84.28％，如說明書附圖6所示。7)固定化酶溫度溫度穩(wěn)定性的測定：將游離酶與固定化酶在60℃水浴恒溫3h，在這個過程中每隔30min測定一次酶活。相對于游離酶，固定化酶的溫度穩(wěn)定性明顯提高，以固定化酶的初始酶活為100％，在60℃恒溫水浴3h后固定化酶GO-Zn-FDH相對酶活為38.28％，如說明書附圖7所示。8)固定化酶重復使用率的測定：用固定化甲酸脫氫酶催化甲酸鈉氧化反應，當轉化率大于85％時結束反應，離心回收固定化酶，用Tris-HCl緩沖溶液(0.05M，pH10)洗滌，用于催化下一輪反應，以第一次反應測定的酶活為100％，計算之后每次反應的相對酶活。重復反應8次后，GO-Zn-FDH相對酶活為60.47％，如說明書附圖8所示。實施例31)～4)實驗步驟如實施例1的步驟1)～4)。5)氧化石墨烯-金屬離子固定化載體的制備：在氧化石墨烯溶液加入MgCl2溶液，使其在溶液中配位平衡后的的終濃度為0.1mM：在恒溫震蕩儀震蕩(4℃，1h)，即得到氧化石墨烯-金屬離子懸濁液。6)氧化石墨烯-金屬配位固定化酶的制備：在步驟5)得到的氧化石墨烯-金屬離子懸濁液中加入步驟2)得到的甲酸脫氫酶溶液并使其終濃度為0.1mg/mL，在恒溫震蕩儀震蕩(4℃，1h)，形成固定化顆粒，用純水洗滌三次后用Tris-HCl緩沖溶液(0.05M，pH11.5)重懸起來，得到固定化酶GO-Mg-FDH，酶活回收率可達到83.10％，如說明書附圖9所示。7)固定化酶溫度溫度穩(wěn)定性的測定：將游離酶與固定化酶在60℃水浴恒溫3h，在這個過程中每隔30min測定一次酶活。相對于游離酶，固定化酶的溫度穩(wěn)定性明顯提高，以固定化酶的初始酶活為100％，在60℃恒溫水浴3h后GO-Mg-FDH相對酶活為36.30％，如說明書附圖10所示。8)固定化酶重復使用率的測定：用固定化甲酸脫氫酶催化甲酸鈉氧化反應，當轉化率大于85％時結束反應，離心回收固定化酶，用Tris-HCl緩沖溶液(0.05M，pH10)洗滌，用于催化下一輪反應，以第一次反應測定的酶活為100％，計算之后每次反應的相對酶活。重復反應8次后，固定化酶GO-Mg-FDH相對酶活為58.25％，如說明書附圖11所示。實施例41)～4)實驗步驟如實施例1的步驟1)～4)。5)氧化石墨烯-金屬離子固定化載體的制備：在氧化石墨烯溶液加入CoCl2溶液，使其在溶液中配位平衡后的的終濃度為5mM：在恒溫震蕩儀震蕩(4℃，1h)，即得到氧化石墨烯-金屬離子懸濁液。6)氧化石墨烯-金屬配位固定化酶的制備：在步驟5)得到的氧化石墨烯-金屬離子懸濁液中加入步驟2)得到的甲酸脫氫酶溶液并使其終濃度為5mg/mL，在恒溫震蕩儀震蕩(4℃，1h)，形成固定化顆粒，用純水洗滌三次后用Tris-HCl緩沖溶液(0.08M，pH9.0)重懸起來，得到固定化酶GO-Co-FDH，酶活回收率可達到80.43％，如說明書附圖12所示。7)固定化酶溫度溫度穩(wěn)定性的測定：將游離酶與固定化酶在60℃水浴恒溫3h，在這個過程中每隔30min測定一次酶活。相對于游離酶，固定化酶的溫度穩(wěn)定性明顯提高，以固定化酶的初始酶活為100％，在60℃恒溫水浴3h后固定化酶GO-Co-FDH相對酶活為32.56％，如說明書附圖13所示。8)固定化酶重復使用率的測定：用固定化甲酸脫氫酶催化氧化反應的進行，當轉化率大于85％時結束反應，離心回收固定化酶，用Tris-HCl緩沖溶液(0.05M，pH7.5)洗滌，用于催化下一輪反應，以第一次反應測定的酶活為100％，計算之后每次反應的相對酶活。重復反應8次后，固定化酶GO-Co-FDH相對酶活為51.80％，如說明書附圖14所示。以上所述，僅為本發(fā)明較佳實施例而已，故不能依此限定本發(fā)明實施的范圍，即依本發(fā)明專利范圍及說明書內容所作的等效變化與修飾，皆應仍屬本發(fā)明涵蓋的范圍內。當前第1頁1 2 3