本發(fā)明屬于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種腫瘤特異抗原及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：癌癥是危害人類健康的主要疾病之一。據(jù)國內(nèi)外調(diào)查報告，由癌癥導(dǎo)致的死亡病例占因疾病死亡人數(shù)的首位。其主要原因是癌癥不容易被早期發(fā)現(xiàn)，臨床上確診的大多數(shù)病例已屆疾病的中晚期?，F(xiàn)有的臨床治療癌癥的方法對中晚期癌癥病人療效有限，而對早期病人則效果顯著。因此，治療癌癥最佳途徑之一就是要能夠早期診斷。醫(yī)學(xué)影像學(xué)如CT，B超，X-光以及病理活檢要等到癌細(xì)胞發(fā)展到一定程度時方能發(fā)現(xiàn)。檢測血液或其它體液中腫瘤標(biāo)志物是一種對病人即無損害又能早期發(fā)現(xiàn)癌癥的癌癥診斷手段。過去數(shù)十年，已有大量腫瘤標(biāo)志物用于臨床。但是，至今為止，應(yīng)用的腫瘤標(biāo)志物特異性不強：不僅在癌癥病人增高，而且在良性腫瘤患者或其他非腫瘤疾病亦可能增高；只能作為癌癥診斷的輔助手段。因此，要進行癌癥早期診斷，其中一個途徑就是發(fā)現(xiàn)新的腫瘤標(biāo)志物：不僅能夠確定病人患有癌癥，而且可能出現(xiàn)在癌癥早期?？鼓[瘤相關(guān)抗原的自身抗體就是這樣一類生物標(biāo)記物，因為在健康人群中少有抗腫瘤相關(guān)抗原的自身抗體的存在(ReuschenbachMetal.,CancerImmunolImmunother2009；58:1535-1544)。腫瘤在發(fā)生和發(fā)展過程中可能產(chǎn)生一些相關(guān)的腫瘤抗原，誘發(fā)免疫系統(tǒng)產(chǎn)生抗這些抗原的自身抗體。這些免疫反應(yīng)的啟動同自身免疫疾病不同。在正常生理狀況下，免疫系統(tǒng)存在自身免疫耐受的機制，能防止免疫系統(tǒng)直接產(chǎn)生抗自身抗原的免疫反應(yīng)。自身免疫耐受機制受損能夠?qū)е伦陨砻庖呒膊?，主要表現(xiàn)為慢性炎癥和組織受損(MasonRJetal.,Respiration2006；11(Suppl):S12-S15)。而抗腫瘤相關(guān)抗原的免疫反應(yīng)不僅包括免疫耐受機制受損，而且涉及腫瘤抗原本身變異而引致的免疫反應(yīng)的增強(DobbsLGetal.,AmJPhysiol1997；273:347-354)。腫瘤抗原本身變異包括基因變異產(chǎn)生帶有新的抗原表位的蛋白質(zhì)(如P53)(DeNiuPetal.,MolCellEndocrine2000；162:131-144)，蛋白表達后的修飾產(chǎn)生抗原性(如低糖基化MUC1)(VargheseRetal.,Endocrinol1998；139:4714-4725)以及組織表達特異性的變異(如NY-ESO-1)(ChangACetal.,MolCellEndocrinol1995；112:241-247)等等。早在上世紀(jì)70年代就開始了檢測抗腫瘤自身抗體的研究。到上世紀(jì)90年代由于分子生物學(xué)，多肽合成工藝和測定技術(shù)的發(fā)展，有了很大的進展。但是，現(xiàn)今發(fā)現(xiàn)有臨床應(yīng)用價值的抗腫瘤相關(guān)抗原的自身抗體在癌癥病人陽性率均相對較低(從2％-50％)。因此，一方面科 學(xué)家們繼續(xù)搜尋具有高度敏感性能夠用于癌癥篩查的抗腫瘤相關(guān)抗原的自身抗體，另一方面試圖采用抗腫瘤相關(guān)抗原的特異自身抗體列陣技術(shù)以提高臨床篩查或診斷的敏感性和特異性。最近由美國InnovativeDiagnosticlaboratory公司研發(fā)的EarlyCDT@-Lung試劑盒采用了6-7個抗腫瘤相關(guān)抗原的特異自身抗體作為列陣用于對肺癌高危人群的早期篩查。結(jié)果顯示該試劑盒具有93％的特異性和41％的敏感性(CarolineJetal.,TumorBiol2012；33:1319-1326)。但其敏感性有待于進一步的改進。腫瘤相關(guān)抗原的篩選的研究和臨床應(yīng)用已有相當(dāng)長的時間。研究和臨床應(yīng)用過程分為4個階段。第1階段主要是用人的癌組織免疫兔子或其他動物；然后用各種吸附技術(shù)把動物血清中和正常組織起反應(yīng)的抗體清除；再用免疫沉淀方法分析癌組織有那些特異性抗原與這些動物血清中的抗體起反應(yīng)。有兩個腫瘤標(biāo)志物由此檢定出來。一是CEA(AbelevGIetal.,Transplantation1963；1:174-180)，另一個是AFP(GoldPetal.,JExpMed1965；122:467-468)。第2階段則是用鼠的細(xì)胞毒自身抗體和單克隆抗體技術(shù)發(fā)現(xiàn)了不少的淋巴細(xì)胞表面抗原，如CD8THY-1和PCA等(BoyseEAandOldLJ.AnnuRevGenet1969；3:269-290)。第3階段是用正常細(xì)胞吸附癌癥病人血清中的自身抗體來鑒定腫瘤特異性抗原。在這個階段僅有少量的腫瘤細(xì)胞表面抗原鑒定出來。主要是由于方法靈敏度差；癌癥病人血清中的自身抗體滴度不足以把檢測到的腫瘤抗原的純化和克隆(OldLJ,andChenYT.JExpMed1998；187:1163-7)。第4階段是發(fā)明了稱之為SEREX的技術(shù)。該技術(shù)應(yīng)用癌癥血清學(xué)方法結(jié)合基因芯片技術(shù)篩查腫瘤組織的cDNA文庫(OldLJ,andChenYT.JExpMed1998；187:1163-1167)。第4個階段另一個重要的技術(shù)發(fā)明是應(yīng)用癌癥血清學(xué)方法結(jié)合蛋白組學(xué)篩查腫瘤組織表達蛋白，然后采用質(zhì)譜分析方法推斷與癌癥血清自身抗體特異結(jié)合的蛋白(Kobayashi1R.ClinicalCancerRes2001；7,3325–3327)。DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶是存在于細(xì)胞核內(nèi)的一類酶，他們能夠催化DNA鏈的斷裂和結(jié)合，參與了DNA超螺旋結(jié)構(gòu)模板的調(diào)節(jié)，從而控制DNA的拓?fù)錉顟B(tài)。拓?fù)洚悩?gòu)酶分為兩類：一類叫拓?fù)洚悩?gòu)酶I，另一類叫拓?fù)洚悩?gòu)酶II。拓?fù)洚悩?gòu)酶I催化DNA鏈的斷裂和重新連接，每次只作用于一條鏈。拓?fù)洚悩?gòu)酶II能同時斷裂并連接雙股DNA鏈。在生物體的整個生命過程中，細(xì)胞遺傳物質(zhì)DNA起著十分重要的作用。但是DNA的超長度和雙螺旋性質(zhì)使其在復(fù)制和重組期間經(jīng)常纏繞,阻礙DNA的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和重組。DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶通過在DNA的核糖-磷酸主鏈上產(chǎn)生移過性的斷裂而改變DNA的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)解開DNA的超長度和雙螺旋性質(zhì),再通過逆向的轉(zhuǎn)酯反應(yīng)恢復(fù)DNA的完整性。在腫瘤細(xì)胞中拓?fù)洚悩?gòu)酶的活性及含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于正常細(xì)胞。抑制拓?fù)洚悩?gòu)酶的活性就有可能抑制腫瘤細(xì)胞的快速增值，進而殺死腫瘤細(xì)胞。因此，DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶已經(jīng)被公認(rèn)為抗 癌藥物的作用靶點。其中，拓?fù)洚悩?gòu)酶I的抑制劑喜樹減(CPT)的衍生物：拓?fù)涮婵岛鸵懒⑻婵狄殉蔀樵谂R床上治療直結(jié)腸癌、卵巢癌和肺癌常規(guī)治癌的化療藥物(PommerYetal.,Chenistry&Biology.2010；17:421-433；XuYandHerCT.Biomolecules2015；5:1652-1670)。但是，尚無研究報道將檢測拓?fù)洚悩?gòu)酶表達作為癌癥診斷或篩查的腫瘤標(biāo)志物。不過，早在上世紀(jì)80年代已發(fā)現(xiàn)檢測血清中一種抗拓?fù)洚悩?gòu)酶I的自身抗體，稱為抗SCL-70自身抗體，能夠用于自身免疫疾病的系統(tǒng)性硬皮病的診斷(GuldnerHH。Etal.,Chromosoma1986；94:132–138)。抗SCL-70自身抗體對系統(tǒng)性硬皮病的診斷的敏感性為28-70％。，并與疾病的嚴(yán)重性相關(guān)(deRooijDJetal.,Clin.Rheumatol.1989；8:231–237)。拓?fù)洚悩?gòu)酶I蛋白分子量為100-105kd。SCL-70是分子量為70kd的拓?fù)洚悩?gòu)酶I片段。如上所述，自身免疫疾病發(fā)生主要是由于免疫耐受機制受損。因此，抗SCL-70自身抗體即使與系統(tǒng)性硬皮病同時發(fā)生癌癥的病人也無顯著的相關(guān)關(guān)系(JosephCGetal.,Science.2014；343(6167):152–157)。本研究發(fā)現(xiàn)的拓?fù)洚悩?gòu)酶I蛋白40kd的片段則是在腫瘤發(fā)生和發(fā)展過程中出現(xiàn)的腫瘤相關(guān)抗原，從而引起癌癥病人產(chǎn)生抗該抗原的自身抗體的免疫反應(yīng)。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明目的是提供一種腫瘤特異性抗原及其應(yīng)用，用于腫瘤早期的診斷和篩查。發(fā)明人研究首次發(fā)現(xiàn)，在腫瘤發(fā)生和發(fā)展過程中，出現(xiàn)了一種腫瘤相關(guān)抗原，其為拓?fù)洚悩?gòu)酶I蛋白的片段，分子量大約為40Kd，命名為TOP-1-40，該腫瘤相關(guān)抗原能引起癌癥病人產(chǎn)生抗該抗原的自身抗體的免疫反應(yīng)，產(chǎn)生的抗體命名為抗TOP-1-40自身抗體，該抗TOP-1-40自身抗體為癌癥病人特有的一種產(chǎn)物，因此，通過測定樣本中抗TOP-1-40自身抗體的量，就能判斷是否有腫瘤的發(fā)生。本發(fā)明的技術(shù)方案為：一種腫瘤特異性抗原，命名為TOP-1-40，其氨基酸序列如SEQIDNO:1所示。該新的腫瘤特異性抗原采用蛋白組學(xué)方法結(jié)合腫瘤血清學(xué)方法，從腫瘤組織中分離獲得。本發(fā)明的腫瘤特異性抗原在制備檢測腫瘤的診斷試劑或試劑盒中的應(yīng)用。一種含有本發(fā)明的的腫瘤特異性抗原的酶聯(lián)免疫診斷試劑或試劑盒。本發(fā)明的腫瘤特異性抗原或含有本發(fā)明的腫瘤特異性抗原的酶聯(lián)免疫診斷試劑或試劑盒在檢測抗TOP-1-40自身抗體上的應(yīng)用。腫瘤特異性抗原的酶聯(lián)免疫試劑盒，試劑盒包括TOP-1-40包被的微孔板；濃縮洗滌緩沖液為：200mmol/L的磷酸緩沖液和1.0％的吐溫20；濃縮樣本稀釋液為：1％的小牛白蛋白和100mmol/L的磷酸緩沖液；質(zhì)控品1為：陽性對照和三羥甲基氨基甲烷緩沖液；指控品2為：陰性對照和三羥甲基氨基甲烷緩沖液，校準(zhǔn)品為：抗TOP-1-40自身抗體；酶標(biāo)液為：辣根過 氧化物酶標(biāo)記的600ng/ml的抗人IgG抗體；底物液為：1.2mmoL/L的3,3’,5,5’-四甲基聯(lián)苯胺和2.4mmoL/L過氧化氫；終止液為1mol/L的鹽酸。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有如下優(yōu)點：本發(fā)明涉及一種新的腫瘤特異性抗原，采用蛋白雙向電泳方法結(jié)合癌癥血清學(xué)的免疫印跡、抗體捕獲酶聯(lián)免疫測定方法從癌細(xì)胞株細(xì)胞和癌癥組織中分離獲得。通過特異性的抗該抗原的多克隆抗體，采用重組蛋白方法、免疫印跡、熒光免疫組化、抗體捕獲酶聯(lián)免疫測定等方法確定該抗原為DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶I的一個分子量約為40kd蛋白片段，命名為TOP-1-40。該抗原含量在常見癌癥組織普遍增高，而在相應(yīng)的正常組織則檢測不到或含量很低。通過抗體捕獲酶聯(lián)免疫測定方法檢測血清中抗該抗原的自身抗體的濃度，可以用于常見癌癥的早期篩查。其檢測方法有95-100％的特異性，61-66％的敏感性。具有臨床應(yīng)用的良好前景。附圖說明圖1中A為雙向電泳分離純化非小細(xì)胞肺癌組織勻漿蛋白，考馬斯亮藍染。圖1中B為以非小細(xì)胞肺癌病人的混合血清為抗血清，對肺癌組勻漿蛋白雙向電泳進行免疫印跡分析。圖1(A)上的箭頭指示通過雙向電泳圖譜和免疫印跡比對證明癌組織存在一種特異抗原能被癌癥病人血清中自身抗體識別。圖2中A為比較非小細(xì)胞肺癌患者的混合血清與各種自身抗體陽性血清對該腫瘤抗原的免疫活性。比較的自身抗體陽性血清有：抗細(xì)胞角蛋白19(CK-19)自身抗體、抗環(huán)瓜氨酸肽(CCP)自身抗體、抗胰島(islet)自身抗體、抗雙鏈DNA(dDNA)自身抗體、抗皮肌炎(DM)自身抗體、抗核糖體(Ribosome)自身抗體、抗組織胺(histamine)自身抗體、抗磷脂(aPL)自身抗體、抗P53自身抗體和抗核抗體(ANA)自身抗體。正常健康人的血清作為對照(con)。結(jié)果表示為均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤。*表示與對照相比：P<0.001.圖2中B為比較6種抗核抗體對該腫瘤抗原的免疫活性比較。結(jié)果表示為均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤。*表示與對照相比：P<0.001。圖3中A為抗SCL-70抗體和抗該腫瘤抗原抗體(抗體的制備見實施例2)抗體稀釋曲線的比較。圖3中B為抗SCL-70抗體和抗該腫瘤抗原抗體的競爭實驗，證明這兩種抗體對該腫瘤抗原有交叉反應(yīng)。圖4為免疫印跡分析抗SCL-70抗體和抗腫瘤抗原抗體對人DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶I(TOP-1)分段克隆的重組蛋白的免疫反應(yīng)。1＝TOP-1一個209氨基酸重組蛋白片段，2＝TOP-1一個224氨基酸重組蛋白片段，3＝TOP-1一個149氨基酸重組蛋白片段，4＝TOP-1一個208 氨基酸重組蛋白片段。免疫印跡結(jié)果顯示片段3和4與抗該抗原的特異性抗體有較強的免疫反應(yīng)，合并分子量約為40kd。因此，該抗腫瘤抗原抗體命名為抗TOP-1-40抗體。圖5-1.為免疫印跡分析抗TOP-1-40抗體的特異性。A為SDS-Page電泳，考馬斯亮藍染。B為用抗體進行免疫印跡分析的結(jié)果。M＝蛋白marker，1為MCF乳腺癌細(xì)胞株細(xì)胞勻漿；2為肺癌組織勻漿。3和4為相應(yīng)的免疫印跡結(jié)果。圖5-2.為免疫熒光染色分析抗TOP-1-40抗體的特異性。A為乳腺癌細(xì)胞株MCF-7，B為急性白血病。圖6-1為乳腺癌(A)、正常乳腺組織(B)、卵巢癌(C)、正常卵巢組織(D)、子宮內(nèi)膜癌(E)和正常子宮內(nèi)膜組織(F)的免疫組織化學(xué)染色對比。圖6-2為食道鱗癌(A)、正常食道組織(B)、直結(jié)腸癌(C)、正常直結(jié)腸組織(D)、胃癌(E)和正常胃組織(F)的免疫組織化學(xué)染色對比。圖6-3為肝癌(A)、正常肝臟組織(B)、非小細(xì)胞肺癌(C)、正常肺組織(D)、膀胱癌(E)和正常膀胱組織的免疫組織化學(xué)染色對比。圖7中A為免疫印跡分析各種癌癥病人的血清與重組TOP-1-40的反應(yīng)。第1-10行分別為直結(jié)腸癌病人(CRC367、CRC369)，胃癌病人(GC010、GC017)，食道癌病人(ESCC408、ESCC439),非小細(xì)胞肺癌病人(NSCLC446、NSCLC411)和乳腺癌病人(BC1、BC2)的血清與重組TOP1-F的反應(yīng)。11和12行為正常健康人的血清與重組TOP-1-40的反應(yīng)。圖7中B為上述癌癥病人血清先與重組TOP-1-40孵化后，再用酶聯(lián)免疫方法檢測這些抗原阻斷后的血清與重組TOP-1-40的反應(yīng)。*表示抗原阻斷前后相比：P<0.05。圖8酶聯(lián)免疫方法檢測早期(I-II期)直結(jié)腸癌(N＝47)，胃癌(N＝29)，食道鱗癌(N＝55)和非小細(xì)胞肺癌(N＝71)患者年齡和性別配對的血清中抗TOP-1-40自身抗體反應(yīng)，并與結(jié)腸良性腫瘤(N＝18)，胃良性腫瘤(N＝12)，食道良性腫瘤(N＝30)和肺良性腫瘤(N＝18)和正常健康人(N＝700)比較。水平線表明陽性判斷的臨界值(cutoff)。圖9為抗TOP-1-40自身抗體早期診斷直結(jié)腸癌，胃癌，食道鱗癌和非小細(xì)胞肺癌的ROC曲線圖?？筎OP-1-40自身抗體對直結(jié)腸癌早期診斷有61％的敏感性和100％特異性(AUC＝0.832)。對胃癌早期診斷有64％的敏感性和95％特異性(AUC＝0.847)。對食道鱗癌早期診斷有66％的敏感性和100％特異性(AUC＝0.875)。對非小細(xì)胞肺癌早期診斷有80％的敏感性和100％特異性(AUC＝0.964)。圖10為抗TOP-1-40自身抗體的校準(zhǔn)品曲線。具體實施方式實施例1腫瘤特異性抗原TOP-1-40的分離純化和篩選1.材料和方法(1)組織勻漿：將肺癌組織在裂解液中(0.5％NP40,0.15MNaCl，5mMEDTA，50mMTris，1mMPMSF)用組織勻漿器勻漿。然后4℃，12000rpm離心，合并上清液。(2)雙向電泳分離腫瘤抗原:實驗包括第一向的等電聚焦電泳和第二向的SDS-PAGE電泳。第一向等電聚焦電泳步驟如下：●取-20℃冷凍保存的水化上樣緩沖液(1ml/管)，置室溫溶解。在小管中加入0.01gDTT和Bio-Lyte4-72.5ml，充分混勻?！裨購幕靹虻乃蠘泳彌_液取出400ml，加入100ml樣品，充分混勻?！駨谋渲腥?20℃冷凍保存的IPG預(yù)制膠條(17cmpH4-7)，室溫中放置10分鐘?！裱刂劢贡P中槽的邊緣至左而右線性加入樣品?！駥PG膠條置于聚焦盤中樣品溶液上，覆蓋2-3ml礦物油。●對好正、負(fù)極，蓋上蓋子。設(shè)置等電聚焦程序進行等電聚焦電泳。第二向SDS-PAGE電泳步驟如下：●用含有SDS的緩沖液處理等電聚焦電泳后的IPG膠條30min，使SDS與蛋白質(zhì)充分結(jié)合?！駥⑻幚磉^的凝膠條放在SDS－聚丙烯酰胺凝膠電泳濃縮膠上，然后進行電泳?！耠娪窘Y(jié)束后，取出凝膠，進行染色。(3)腫瘤抗原的篩選：將第二向SDS-PAGE電泳分離的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上,用肺癌患者的自身血清進行免疫印跡分析。(4)腫瘤抗原的鑒定：將用免疫印跡確定的蛋白回收，包被在酶標(biāo)板上，2μg/ml,每孔50μl，4℃過夜。然后將包被的酶標(biāo)板作封閉處理。加入1:100各種自身抗體陽性的血清或各種抗核抗體或抗TOP-1-40抗體(該抗體的制備見實施例2)，每孔50μl，在室溫下孵化1小時。再次洗板4次，加入TMB顯色。(5)腫瘤抗原的確定：(5-1)從(4)腫瘤抗原的鑒定的實驗結(jié)果(見本實施結(jié)果)，可以確定該腫瘤抗原是DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶I(TOP-1)的一個片段。為確是定哪一個片段，進行如下實驗：(5-2)重組TOP-1不同片段：(5-2-1)獲得目的基因●從基因庫中調(diào)取TOP-1基因序列，將CDS區(qū)域247-2544bp分成四段，用Primer5.0軟件設(shè)計引物。片段1(247-873bp)引物為T1F和TIR；片段2(820-1491bp)引物為T2F和T2R；片段3(1474-1920bp)引物為T3F和T3R；片段4(1903-2544bp)引物為T4F和T4R(見表1：加粗部分為BamHⅠ和HindⅢ酶切位點)。并將設(shè)計的引物交生工生物工程(上海)股份有限公司合成。表1:TOP-I擴增引物Primer名稱序列(5'to3')堿基數(shù)T1FCCGGATCCATGAGTGGGGACCAC23T1RAGGGGTACCCTCTTCTTCCCACCAT25T2FATGGATCCAAAAAGAAGCCGAAG23T2RCTCGGTACCGGAAACCAGCCAAGT24T3FATGGATCCGTTACTTGGCTGGTT23T3RCTCGGTACCCTTGTTCTCCATAAA24T4FACGGATCCCTATTTATGGAGAACAA25T4RCGCGGTACCCTAAAACTCATAGTC24●因乳腺癌細(xì)胞株MCF-7有較高的TOP-1-40表達(見實施2)，取細(xì)胞株勻漿處理后，采用TRNzol方法提取總RNA?！癫捎脙刹椒ㄟM行RT-PCR將要克隆的目的基因擴增。反轉(zhuǎn)錄(RT)反應(yīng)體系和反應(yīng)條件如表2；聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)反應(yīng)體系和反應(yīng)條件如表3。表2.反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)表3.PCR反應(yīng)●將擴增出的PCR產(chǎn)物采用瓊脂糖凝膠電泳切膠方法，用天根公司的TIANgelMidiPurificationKit按照操作說明書純化。(5-2-2)質(zhì)粒構(gòu)建：●將表達載體(PQE30UA)用BamHⅠ、HindⅢ酶切體系酶切。酶切產(chǎn)物行瓊脂糖電泳后，用膠回收試劑盒回收載體?！裢瑫rPCR產(chǎn)物用BamHⅠ、HindⅢ酶切體系酶切目的基因，純化后回收，在T4DNA連接酶作用下連接入載體。(5-2-3)獲得含重組表達質(zhì)粒的表達菌種●測序驗證目的基因閱讀框架正確?！褚源酥亟M質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化表達宿主菌的感受態(tài)細(xì)胞。(5-2-4)誘導(dǎo)表達●挑取含重組質(zhì)粒的菌體單斑至2mlLB中37℃過夜培養(yǎng)?！駥?ml菌加入到含50mlLB培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中,37℃震蕩培養(yǎng)至OD600≌0.4-1.0?！袢〔糠忠后w作為未誘導(dǎo)的對照組,余下的加入IPTG誘導(dǎo)劑至終濃度0.4mM作為實驗組,兩組繼續(xù)37℃震蕩培養(yǎng)3hr?！穹謩e取菌體1ml,離心12000g×30s收獲沉淀，用100μl1％SDS重懸，混勻,70℃10m?！耠x心1min(12000g)，取上清作為樣品,做SDS-PAGE分析。(5-2-5)重組蛋白純化●將IPTG誘導(dǎo)表達的菌體用液氮反復(fù)融凍破碎菌體?！袢缓螅?000rpm離心5min，收集上清液進行親和層析純化?！駥i親和層析試劑裝入10x1cm層析柱，試劑體積2ml?！駥⑹占锨逡荷现?。加入洗脫液分步洗脫?！衩?ml分步收集洗脫液。測定各洗脫液的蛋白濃度?！駥OP-1各片段重組蛋白作SDS-PAGE，并將電泳分離的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，用抗TOP-1-40的多克隆抗體和抗SCL-70抗體進行免疫印跡分析。2.結(jié)果用雙向電泳方法分離肺癌組織勻漿上清液，經(jīng)考馬斯亮藍染色后獲得了分辨率較高雙向電泳圖譜(圖1中A)。用患者自身血清進行免疫印跡分析,獲得分辨率較高的免疫印跡反應(yīng)圖譜(圖1中B)。將雙向電泳圖譜和免疫印跡反應(yīng)圖譜比對后確定能與患者自身血清中自身抗體特異反應(yīng)的抗原蛋白(圖1中A上的箭頭所指)。該抗原等電點為6.1，分子量為43kd。用抗體捕獲酶聯(lián)免疫方法測定顯示該分離純化的抗原與抗核抗體(ANA)陽性血清和肺癌患者的血清有較強的抗原-抗體反應(yīng)，而對其他自身抗體的陽性血清或正常健康人血清則沒有發(fā)現(xiàn)較強的抗原-抗體反應(yīng)(圖2中A)。因為ANA是一組抗細(xì)胞核不同組分多種抗體。又因為在上述試驗中發(fā)現(xiàn)該抗原與ANA有較強的抗原-抗體反應(yīng)，我們用不同的抗核抗體進一步進行酶聯(lián)免疫測定。圖2中B顯示抗核抗體中的抗SCL抗體對該抗原有較強抗原-抗體反應(yīng)，而對其他抗核抗體則無反應(yīng)。圖3中A顯示人抗人SCL抗體和我們研發(fā)的兔抗人TOP-1-40多克隆抗體滴度比較。兩種抗體對該抗原(TOP-1-40)的抗體反應(yīng)滴度曲線基本上是平行的。圖3中B顯示當(dāng)TOP-1-40多克隆抗體保持一個濃度時，逐漸增高的抗人SCL抗體能競爭性地結(jié)合抗TOP-1-40多克隆抗體結(jié)合位點。再用純化的TOP-1不同片段重組蛋白采用抗人SCL抗體和我們研發(fā)的兔抗人TOP-1-40多克隆抗體進行免疫印跡分析證明該抗原為TOP-1其中一個片段。氨基酸序列為TOP-1氨基酸序列的410aa-766aa(見SEQIDNO:1)，分子量約為40kd。與TOP-1的SCL片段氨基酸序列有重疊(圖4)。上述結(jié)果證明采用蛋白組學(xué)分離純化癌組織蛋白，然后用癌癥病人混合血清，以免疫印跡方法確定有無腫瘤特異性抗原是一種有效的腫瘤特異性抗原篩選有效的方法。進一步采用各種不同自身抗體陽性血清確定這種自身抗體不同于自身免疫疾病的自身抗體，但與抗DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶I(SCL-70)有一定的交叉反應(yīng)，說明該自身抗體可能是一種抗DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶I的抗體。最后采用重組蛋白的方法，分別用抗SCL-70抗體和抗該抗原的抗體進行免疫印跡分析比較，確定該抗原是不同于DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶I的SCL-70蛋白片段。該蛋白片段含量在各種常見的癌癥表達增高，而在相應(yīng)的正常組織檢測不到或很少(見實施例3)，表明該抗原是一種腫瘤相關(guān)的特異性抗原。實施例2兔抗人TOP-1-40多克隆抗體的制備1.材料和方法●將從雙向電泳分離純化的目標(biāo)蛋白作為免疫原?！駥⒛繕?biāo)蛋白用生理鹽水稀釋至500μg/ml。首次，與完全弗氏佐劑按1:1比例混合，然后 在新西蘭白兔皮下注射免疫。之后，用不完全弗氏佐劑與純化的目標(biāo)蛋白按1:1比例混合，繼續(xù)免疫動物，間隔1-2周，連續(xù)4次。用抗體捕獲酶聯(lián)免疫方法檢測抗該目標(biāo)蛋白的抗體滴度，滴度達到一定高度后，最后再進行一次加強免疫?！袢旌?，從動物的下腔動脈取血，離心3000rpm分離血清?！癫捎玫鞍譍親和柱(Sigma)按商品說明書進行抗體純化。純化的抗體濃縮后儲存在-80C備用。●采用免疫印跡和免疫熒光方法檢測抗體的特異性2.結(jié)果圖5中A顯示該抗目標(biāo)蛋白的的多克隆抗體的免疫印跡圖譜。在乳腺癌細(xì)胞株MCF-7和肺癌組織勻漿具有一條分子量為40Kd的一條免疫印跡帶。圖5中B為用熒光免疫檢測圖譜，顯示該抗體在MCF-7細(xì)胞株和急性白血病患者的血液涂片中的細(xì)胞核有較強的免疫反應(yīng)，在細(xì)胞漿或細(xì)胞膜則無免疫反應(yīng)。上述結(jié)果證明由雙向電泳分離純化的目標(biāo)蛋白作為免疫原得到的多克隆抗體能夠特異性地識別該目標(biāo)蛋白；可以應(yīng)用于各種免疫檢測如免疫組化、免疫印跡和酶聯(lián)免疫測定。為進一步研究TOP-1-40蛋白片段在腫瘤發(fā)生和發(fā)展中的作用和機理以及臨床應(yīng)用提供了有用的工具。實施例3免疫組化檢測TOP-1-40在癌癥的含量1.材料和方法此次研究的癌癥組織樣品包括直結(jié)腸癌(40例)，非小細(xì)胞肺癌(20例)，胃癌(20例)，乳腺癌(35例)，子宮內(nèi)膜癌(20例)，食道癌(15例)，卵巢癌(10例)肝癌(10例)和膀胱癌(10例)，和相應(yīng)的正常組織。這些樣品均經(jīng)四川省人民醫(yī)院病理科病理檢測確認(rèn)。采用抗TOP-1-40多克隆抗體，以常規(guī)免疫組化方法檢測TOP-1-40在各種不同的癌組織的表達并與相應(yīng)的正常組織進行比較?？筎OP-1-40多克隆抗體的特異性，已采用免疫印跡法和免疫熒光法得到證明(見實施例2)。免疫組化方法的操作如下：●第一步為預(yù)處理組織切片；4μm厚的石蠟包埋組織切片貼在多聚左旋賴氨酸處理過的玻片上。組織貼片常規(guī)二甲苯脫蠟，梯度酒精(100％，90％，80％，70％)脫水。然后將組織貼片置于0.01M枸櫞酸緩沖液(PH6.0)中120℃高壓5min進行抗原修復(fù)。用0.01M磷酸鹽緩沖液(0.01MPBS，PH7.0)沖洗3次，每次5min。組織貼片中內(nèi)源性過氧化物酶采用 0.03％過氧化氫在室溫下封閉30分鐘。0.01MPBS沖洗3次，每次5min后，進一步用10％正常羊血清工作液室溫下封閉10min?！竦诙降渭佑?0％BSA溶液稀釋的1:100的抗TOP-1-40片段多克隆抗體(一抗)與預(yù)處理的組織切片4℃孵化過夜。然后0.01MPBS沖洗3次，每次5min。再滴加用10％BSA溶液稀釋的1:200的辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔抗體(二抗)37℃孵育30min,0.01MPBS沖洗3次，每次5min。加入DAB/H2O2顯色液，進行免疫組織化學(xué)顯色。在顯微鏡下進行觀察，待細(xì)胞著色而背底顏色較淡時馬上吸去顯色液，自來水充分沖洗后，蘇木素復(fù)染，經(jīng)梯度酒精脫水干燥，二甲苯透明，中性樹膠封片，拍照?！駥﹃幮詫φ涨衅瑒t不滴加一抗而僅用10％BSA溶液。2.結(jié)果圖6-1、圖6-2和圖6-3中A，B和C分別顯示TOP-1-40在各種常見癌癥有不同程度的表達的免疫組化切片；而在相應(yīng)的正常組織則無或弱表達。將染色的切片分為4類：無標(biāo)達(-，無陽性染色)，低標(biāo)達(+，陽性染色細(xì)胞<25％),中度表達(++，陽性染色細(xì)胞在25％至50％之間)，強表達(+++，陽性染色細(xì)胞>50％)。根據(jù)這種分類的結(jié)果見下表4。在相應(yīng)的正常組織未檢測到或僅有低表達。表4：免疫組化檢測抗TOP-1-40在癌癥的含量本研究應(yīng)用本發(fā)明的抗TOP-1-40多克隆抗體世界上首次發(fā)現(xiàn)TOP-1-40在各種常見癌癥組織含量增高；表明TOP-1-40出現(xiàn)是惡性腫瘤的一個普遍的現(xiàn)象。實施例4酶聯(lián)免疫方法檢測血清中抗TOP-1-40自身抗體和臨床應(yīng)用1.材料和方法(1)檢測樣品收集早期(I-II期)直結(jié)腸癌(N＝47)，胃癌(N＝29)，食道鱗癌(N＝55)和非小細(xì)胞肺癌(N＝71)患者的血清樣品這些癌癥病人中男性155例，女性55例。年齡從30-74歲，平均57歲。同時收集年齡和性別配對的700健康人血清樣品作為該臨床研究的正常對照。這些正常人中男性有511例，女性有189例。此外，收集18例患直結(jié)腸良性腫瘤，12例患胃良性腫瘤，30例患食道良性腫瘤和18例患肺良性腫瘤患者的血清樣品作為檢測抗TOP-1-40自身抗體惡性腫瘤特異性的對照。(2)檢測方法：將純化的TOP-1-40包被在酶標(biāo)扳上；4C過夜。洗滌兩次后對包被的酶標(biāo)板作封閉處理。然后加入1:100稀釋的血清樣品，室溫下孵化1小時，讓血清中的抗TOP-1-40自身抗體與TOP-1-40結(jié)合。洗滌4次后，再加入1:1000的抗人抗體HRP復(fù)合物，室溫下孵化1小時。結(jié)合到抗TOP-1-40自身抗體通過抗人抗體HRP復(fù)合物催化酶底物(TMP)顯色。顯色程度與血清中與TOP-1-40特異性結(jié)合的自身抗體相關(guān)。其濃度則通過與標(biāo)準(zhǔn)血清比較計算確定。為檢驗抗TOP-1-40自身抗體酶聯(lián)免疫檢測的特異性，將1：100的癌癥病人的血清在37℃與30μg/ml的重組TOP-1-40孵化1小時。然后用上述酶聯(lián)免疫方法進行測定。比較用TOP-1-40預(yù)吸收的樣品與未處理的樣品的差別。第二種方法即采用重組的TOP-1-40進行SDS-PAGE電泳分離，然后轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，用1:100的癌癥病人及正常人血清進行免疫印跡分析。(3)統(tǒng)計學(xué)分析用方差分析方法比較各種類型癌癥病人的抗TOP-1-40自身抗體濃度與正常健康人及相應(yīng)良性腫瘤病人進行比較。用ROC曲線分析方法確定測定血清中抗自身抗體濃度對這4種癌癥臨床診斷的特異性，敏感性和臨界值。2.結(jié)果圖7顯示無論采用免疫印跡分析或抗原-抗體競爭性自身抗體酶聯(lián)免疫檢測均證明該抗TOP-1-40自身抗體酶聯(lián)免疫測定的特異性。圖8則顯示早期直結(jié)腸癌、胃癌、食道鱗癌和非小細(xì)胞肺癌患者血清中抗TOP-1-40自身抗體均顯著地高于正常健康人群和相應(yīng)的良性腫瘤患者。圖9顯示采用ROC曲線分析，對早期直結(jié)腸癌、胃癌、食道鱗癌和非小細(xì)胞肺癌診斷的特異性和敏感性分別為：早期直結(jié)腸癌的特異性＝100％，敏感性＝61％；早期胃癌的特異 性＝95％，敏感性＝66％；早期食道鱗癌的特異性＝100％，敏感性＝64％；早期非小細(xì)胞肺癌的特異性＝100％，敏感性＝66％。從上述結(jié)果證明在早期直結(jié)腸癌、胃癌、食道鱗癌和非小細(xì)胞肺癌患者血清中存在較高濃度的抗TOP-1-40自身抗體。表明身體免疫系統(tǒng)能夠較早地對TOP-1-40抗原性的變異作出反應(yīng)。而在正常健康人群以及相應(yīng)良性腫瘤抗TOP-1-40自身抗體很低。因此，檢測抗TOP-1-40自身抗體是一個新的腫瘤標(biāo)志物；有可能用于癌癥的早期篩查。實施例5檢測血清中抗TOP-1-40自身抗體酶聯(lián)免疫試劑盒表5：試劑盒組成及貯藏條件編號及名稱主要成分96孔微孔板抗原包被的微孔板濃縮洗滌緩沖液(10×)磷酸緩沖液(200mmoL/L)、吐溫-20(1.3％)。使用前稀釋。濃縮樣本稀釋液(5×)小牛白蛋白(1％)、磷酸緩沖液(100mmoL/L)。使用前稀釋。質(zhì)控品1(1.0ml×1)陽性對照、三羥甲基氨基甲烷緩沖液質(zhì)控品2(1.0ml×1)陰性對照、三羥甲基氨基甲烷緩沖液校準(zhǔn)品(1.0ml×6)抗TOP-1-40自身抗體酶標(biāo)液(IgG)辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的抗人IgG抗體(600ng/ml)。直接使用。底物液3,3’,5,5’-四甲基聯(lián)苯胺(1.2mmoL/L)、過氧化氫(2.4mmoL/L)。直接使用。終止液鹽酸(1moL/L)。直接使用。測定原理用重組蛋白的方法克隆和純化的TOP-1-40。該抗原與病人血清中的抗TOP-1-40自身抗體特異性結(jié)合后加入抗-人抗體-HRP復(fù)合物形成抗體-抗原-抗體復(fù)合物，加入酶底物顯色。顯色程度與病人血清中抗TOP-1-40自身抗體的含量相關(guān)。操作步驟1.樣品處理取病人全血2ml室溫(25℃)120xg離心800rpm20分鐘。分離血清，當(dāng)日稀釋測定或-20℃儲存?zhèn)溆谩?.ELISA操作步驟●陽性對照、陰性對照和病人血清用樣品稀釋液100倍；在96孔包被板中以復(fù)管方式分別加入陰性對照稀釋樣品，陽性對照稀釋樣品、病人稀釋樣品和校準(zhǔn)品，每孔100 μl●室溫25℃震蕩器搖震1小時●用雙蒸水稀釋20x洗滌液為洗滌工作液稀釋20倍，用洗滌工作液洗板4次●抗人抗體-HRP復(fù)合物用樣品工作液稀釋成1：10000●向每孔加稀釋抗人抗體-HRP符合物100μl●室溫25℃震蕩器搖震1小時●用洗滌工作液洗板4次●依次加入TMBA液和B液各一滴(50μl)，室溫25℃顯色10分鐘●每孔加終止液50μl，終止顯色反應(yīng)●以450nm波長，630nm參考波長在酶標(biāo)儀上讀取ELISA結(jié)果3.質(zhì)量控制：●每次測定時應(yīng)做陰性，陽性對照和校準(zhǔn)品測定，以便對所有試劑和操作做出評價●為了得到有效的測定結(jié)果，須滿足下列要求：1)陽性對照的光密度值＞0.2，而陰性對照值＜0.22)校準(zhǔn)品吸光度值：0＜校準(zhǔn)品1＜校準(zhǔn)品2＜校準(zhǔn)品3＜校準(zhǔn)品4＜校準(zhǔn)品5。4.結(jié)果計算先計算各復(fù)管測定值的平均光密度，然后使用直線回歸擬合進行校準(zhǔn)，分別以校準(zhǔn)品0～5的濃度和其吸光度值為橫、縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)樣品吸光度值計算其在標(biāo)準(zhǔn)曲線上對應(yīng)的抗體濃度(U/ml)。5.本方法測定抗TOP-1-40自身抗體參考值正常人參考值為：0.2–1.40，平均值為：1.13。6.注意事項：1)采樣應(yīng)當(dāng)日分離血清(或血漿)，如不當(dāng)日測定樣品應(yīng)儲存于-20℃2)準(zhǔn)確加入陰陽性對照稀釋樣品，標(biāo)準(zhǔn)血清和病人稀釋樣品3)每次顯色時間應(yīng)嚴(yán)格定為10-15分鐘5.規(guī)格該試劑盒可用于42人份測定。6.有效期該試劑盒有效期為至檢定之日起6個月。結(jié)果1.抗TOP-1-40自身抗體的校準(zhǔn)品曲線如圖10所示。2.正常健康人、早期(I-II期)和晚期(III-IV期)食道癌、胃癌、結(jié)直腸癌和非小細(xì)胞肺癌病人血清中抗TOP-1-40自身抗體濃度的比較：正常健康人抗TOP-1-40自身抗體濃度平均為1.13U+0.05/ml。表3：病人血清中抗TOP-1-40自身抗體濃度的比較結(jié)論從上述研究結(jié)果可得出如下結(jié)論：1)食道癌、胃癌、結(jié)直腸癌和非小細(xì)胞肺癌病人血清 中抗TOP-1-40自身抗體顯著高于正常健康人；早期食道癌、胃癌、結(jié)直腸癌和非小細(xì)胞肺癌病人血清中抗TOP-1-40自身抗體或陽性率明顯高于晚期癌癥病人，說明身體身體免疫系統(tǒng)對該腫瘤相關(guān)抗原的免疫反應(yīng)發(fā)生在疾病的早期。因此，檢測血清中抗TOP-1-40自身抗體可用于這些常見癌癥的早期篩查?？偨Y(jié)TOP-1-40是我們在世界上首次發(fā)現(xiàn)的一種特異性的腫瘤抗原。該抗原在常見的癌癥組織均有出現(xiàn)。癌癥病人對該抗原會產(chǎn)生抗該抗原的特異性自身抗體。我們采用檢測TOP-1-40特異自身抗體的酶聯(lián)免疫試劑盒檢測了多例各種癌癥病人，并與健康人或相應(yīng)良性腫瘤患者比較。確定血清抗TOP-1-40自身抗體的臨界值。早期直結(jié)腸癌、胃癌、食道鱗癌和非小細(xì)胞肺癌患者抗TOP-1-40自身抗體的陽性率為61.8-67.6％不等。而且抗該抗原的特異性自身抗體產(chǎn)生在癌癥早期較癌癥晚期較高。用ROC曲線分析發(fā)現(xiàn)：診斷早期食道癌，肺癌，胃癌和直結(jié)腸癌的敏感性和特異性分別為：61％和100％，66％和95％，64％和100％，66％和100％；遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于國際上現(xiàn)有檢測腫瘤相關(guān)抗原自身抗體的試劑盒。因此，僅檢測抗TOP-1-40自身抗體就可能作為癌癥早期篩查和診斷的新指標(biāo)。以上所述實施例僅表達了本申請的具體實施方式，其描述較為具體和詳細(xì)，但并不能因此而理解為對本申請保護范圍的限制。應(yīng)當(dāng)指出的是，對于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本申請技術(shù)方案構(gòu)思的前提下，還可以做出若干變形和改進，這些都屬于本申請的保護范圍。當(dāng)前第1頁1 2 3