本發(fā)明屬于腫瘤檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體為一種microrna檢測探針及石墨烯檢測方法。

背景技術(shù)：

癌癥是全球一個主要死亡原因，中國首當(dāng)其沖，中國新診斷癌癥病例為307萬，占全球總數(shù)的21.8%。癌癥死亡人數(shù)約220萬，占到全球癌癥死亡人數(shù)的26.9%。microrna是基因表達(dá)的重要調(diào)節(jié)器。腫瘤發(fā)生時，microrna調(diào)節(jié)致癌與腫瘤抑制途徑。microrna不僅和癌癥的發(fā)生有關(guān)，而且能夠?yàn)橄嚓P(guān)癌癥的治療提供新的工具和希望。

let-7家族是目前研究最為廣泛的一類mirna，也是腫瘤抑制因子。let-7通過靶向多種原癌基因、細(xì)胞周期及細(xì)胞增殖過程中的關(guān)鍵因子來發(fā)揮調(diào)控作用，在腫瘤的診斷和預(yù)后判斷中起重要作用，與肺癌關(guān)系尤為密切。在正常組織中，let-7隨著細(xì)胞的分化而表達(dá)水平升高，其靶向的原癌基因如hmga2和ras等則表達(dá)下調(diào)。肺癌中l(wèi)et-7表達(dá)時常降低，且let-7所在染色體區(qū)域也常缺失，而其靶基因表達(dá)卻升高。因此可以通過檢測細(xì)胞內(nèi)let-7的含量來預(yù)測細(xì)胞的癌變程度。

石墨烯是一種新型的納米材料，其內(nèi)部結(jié)構(gòu)非常獨(dú)特，它具有六角晶格的結(jié)構(gòu)，每兩個碳原子構(gòu)成一個元胞，每個碳原子與鄰近的原子可以構(gòu)成3個σ鍵和一個π鍵。石墨烯表面具有超強(qiáng)的吸附能力，利用此性能，石墨烯可以吸附染料分子（或者熒光基團(tuán)標(biāo)記的生物分子），發(fā)生高效的能量轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致染料分子的熒光信號碎滅。由于石墨烯這一獨(dú)特性能，可以將其應(yīng)用于生物分子的檢測領(lǐng)域。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

let-7家族是目前研究最為廣泛的一類mirna，在正常的細(xì)胞中，let-7家族正常表達(dá)；而大多數(shù)腫瘤細(xì)胞中，let-7表達(dá)下調(diào)，因此可以通過檢測細(xì)胞內(nèi)let-7的含量來預(yù)測細(xì)胞的癌變程度。本發(fā)明利用氧化石墨烯對dna單雙鏈的吸附性能不一樣，設(shè)計(jì)let-7的熒光探針，并創(chuàng)造性的引入解旋酶和atp，使得本發(fā)明的檢測方法比同類型的檢測方法，在靈敏度上提高20%，可以快速、準(zhǔn)確的檢測出let-7的含量，對腫瘤的早期檢測有一定的實(shí)際意義。

本發(fā)明目的是提供一種高效、靈敏的microrna檢測方法，該方法應(yīng)用了雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（hcr）信號放大和氧化石墨烯（go）表面固定的檢測手段。

本發(fā)明是采用如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：

本發(fā)明的技術(shù)方案之一為，microrna檢測探針，cy3熒光標(biāo)記的莖環(huán)結(jié)構(gòu)的dna探針設(shè)計(jì)為

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本發(fā)明的技術(shù)方案之二為，microrna石墨烯檢測方法，將解旋酶和atp引入雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的mirna檢測體系中，構(gòu)建增強(qiáng)型hcr反應(yīng)體系，其中cy3熒光標(biāo)記的莖環(huán)結(jié)構(gòu)的dna探針設(shè)計(jì)為

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具體步驟如下：

（1）、h1/h2-go復(fù)合物的構(gòu)建

首先，將熒光標(biāo)記的發(fā)夾探針h1與h2分別在95℃下孵化5min；然后，將探針緩慢冷卻至室溫并孵化1h以上；最后，將go與發(fā)夾探針一同加入到1×spsc緩沖溶液當(dāng)中，室溫下孵化0.5h，形成穩(wěn)定的h1/h2-go復(fù)合物；在該體系中，兩種穩(wěn)定的莖環(huán)結(jié)構(gòu)的dna探針在沒有靶標(biāo)mirna的溶液中能夠穩(wěn)定的共存，但是當(dāng)加入靶標(biāo)mirna作為引發(fā)劑之后，靶標(biāo)mirna即會引發(fā)一連串的雜交反應(yīng)，產(chǎn)物是帶有缺口的長鏈雙螺旋dna結(jié)構(gòu)。

（2）、在含有h1/h2-go復(fù)合物的1×spsc緩沖溶液體系中，首先加入靶目標(biāo)mirnas，然后加入recqe以及atp，避光條件下37℃，孵化50min；最后，測量系統(tǒng)hcr產(chǎn)物的熒光信號強(qiáng)度。

為了提高對mirna的檢測靈敏度，本發(fā)明在石墨烯載體上固定了雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（hcr）信號放大技術(shù)，同時創(chuàng)造性的引入了recqe解旋酶輔助hcr以增強(qiáng)檢測信號（如圖1所示），recqe解旋酶利用atp水解能量可以將探針的二級發(fā)夾結(jié)構(gòu)解旋成單鏈。mirna通過與解旋的發(fā)夾探針可以快速有效地啟動hcr，實(shí)現(xiàn)熒光信號快速放大。go作為納米載體可以將hcr產(chǎn)物富集于go表面，使熒光信號集中起來。反應(yīng)結(jié)束后，解旋酶對hcr產(chǎn)品的解旋率與自由的探針結(jié)合hcr產(chǎn)品的速率達(dá)到平衡，從而在go表面產(chǎn)生強(qiáng)而穩(wěn)定的熒光信號。

本發(fā)明創(chuàng)造性的使用解旋酶來增強(qiáng)檢測信號，解旋酶輔助hcr/go檢測平臺的靈敏度比無酶hcr/go檢測平臺高出2個數(shù)量級。同時，反應(yīng)時間從4小時縮短至50分鐘。因此，此檢測平臺在高效精密檢測低豐度mirna和生物標(biāo)志物應(yīng)用中具有極大的潛力。同時，此研究結(jié)果也為進(jìn)一步研究活細(xì)胞內(nèi)mirna成像奠定了試驗(yàn)和理論基礎(chǔ)。

附圖說明

圖1表示基于recqe酶促的雜交鏈反應(yīng)傳感平臺的檢測mirna原理流程圖。

圖2a表示不同濃度的recqe在存在或不存在atp（50μm）情況下對hcr/go檢測系統(tǒng)熒光信號強(qiáng)度的作用，recqe濃度：0，2，4，6，8，10，12nm。

圖2b表示不同濃度的atp在存在或不存在recqe（10nm）情況下對hcr/go檢測系統(tǒng)熒光信號強(qiáng)度的作用，atp濃度：0，10，20，30，40，50，60μm。

圖3表示不同濃度的靶目標(biāo)let-7a的熒光光譜。

圖4表示不同mirna所對應(yīng)的系統(tǒng)熒光信號強(qiáng)度。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合附圖對本發(fā)明的具體實(shí)施例進(jìn)行詳細(xì)說明。

1、h1/h2-go復(fù)合物的構(gòu)建

cy3熒光標(biāo)記的莖環(huán)結(jié)構(gòu)的dna探針設(shè)計(jì)為

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構(gòu)建h1/h2-go復(fù)合物系統(tǒng)中含20nmh1、20nmh2以及12μg/mlgo。首先，將熒光標(biāo)記的發(fā)夾探針h1與h2分別在95℃下孵化5min。然后，將探針緩慢冷卻至室溫并孵化1h以上，以確保探針能夠形成預(yù)期的發(fā)夾結(jié)構(gòu)。最后，將go與發(fā)夾探針一同加入到1×spsc緩沖溶液（0.75mnacl，50mmna2hpo4，ph7.4）當(dāng)中，室溫下孵化0.5h，形成穩(wěn)定的h1/h2-go復(fù)合物。

2、recqe和atp對h1/h2-go復(fù)合物的影響

在含有h1/h2-go復(fù)合物的1ml1×spsc緩沖溶液體系中，加入不同濃度的recqe或atp，37℃孵化50min。然后，分別測量不同recqe或atp濃度下的熒光信號強(qiáng)度。每組數(shù)據(jù)重復(fù)操作三次后測量取平均值，并計(jì)算出標(biāo)準(zhǔn)誤差。

3、recqe和atp各自對hcr/go傳感平臺的影響

在含有h1/h2-go復(fù)合物的1ml1×spsc緩沖溶液體系中，首先加入固定濃度（200pm）的靶目標(biāo)let-7a，然后加入不同濃度的recqe或atp，37℃孵化50min。最后，分別測量系統(tǒng)在不同recqe或atp濃度下的熒光信號強(qiáng)度。每組數(shù)據(jù)重復(fù)操作三次后測量取平均值，并計(jì)算出標(biāo)準(zhǔn)誤差。

4、recqe和atp共同作用對hcr/go傳感平臺的影響

在含有h1/h2-go復(fù)合物的1ml1×spsc緩沖溶液體系中，首先加入固定濃度（200pm）的靶目標(biāo)let-7a，然后加入不同濃度的recqe以及固定濃度的atp（50μm）或不同濃度的atp以及固定濃度的recqe（10nm），避光條件下37℃孵化50min。最后，分別測量系統(tǒng)在不同recqe或atp濃度下的hcr產(chǎn)物的熒光信號強(qiáng)度。每組數(shù)據(jù)重復(fù)操作三次后測量取平均值，并計(jì)算出標(biāo)準(zhǔn)誤差。

5、目標(biāo)mirna的靈敏度檢測

雜交鏈反應(yīng)在含有h1/h2-go復(fù)合物的1ml1×spsc緩沖溶液體系中進(jìn)行，其中包括10nmrecqe，50μmatp，40urna酶抑制劑和不同濃度的let-7a，反應(yīng)體系避光條件下37℃孵化50min。最后，分別測量系統(tǒng)在不同靶目標(biāo)濃度下的hcr產(chǎn)物的熒光信號強(qiáng)度。每組數(shù)據(jù)重復(fù)操作三次后測量取平均值，并計(jì)算出標(biāo)準(zhǔn)誤差。

6、特異性檢測

傳感平臺對靶目標(biāo)的特異性檢測在含有h1/h2-go復(fù)合物的1ml1×spsc緩沖溶液體系中進(jìn)行，其中包括10nmrecqe，50μmatp，40urna酶抑制劑和2pm不同mirnas（let-7a、let-7b、let-7e、let-7f、let-7g和let-7i）。反應(yīng)體系避光條件下37℃孵化50min。最后，分別測量系統(tǒng)在不同靶目標(biāo)存在下的hcr產(chǎn)物的熒光信號強(qiáng)度。每組數(shù)據(jù)重復(fù)操作三次后測量取平均值，并計(jì)算出標(biāo)準(zhǔn)誤差。

實(shí)施結(jié)果如下：

為了系統(tǒng)地探討不同檢測階段解旋酶對雜交鏈反應(yīng)的影響，分別研究了recqe、atp以及recqe和atp共同作用對h1/h2-go復(fù)合物和hcr/go傳感平臺熒光信號強(qiáng)度的影響。同時，進(jìn)一步優(yōu)化了此方案中recqe和atp的最適濃度。試驗(yàn)結(jié)果表明，在靶目標(biāo)let-7a不存在的情況下，單一的recqe和atp對h1/h2-go復(fù)合物熒光信號強(qiáng)度無影響（如圖2a和圖2b所示）。這也充分說明該系統(tǒng)可以有效地消除不相關(guān)因素對背景熒光的干擾，有助于獲得較高的信噪比（s/b）。靶目標(biāo)mirna加入以后，誘導(dǎo)引發(fā)hcr，產(chǎn)生一系列的復(fù)雜的雙鏈hcr產(chǎn)物，使熒光信號強(qiáng)度劇烈增強(qiáng)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，不同濃度的recqe對hcr無影響并且atp也僅僅對hcr產(chǎn)生小幅促進(jìn)作用。與單一的recqe或atp影響的hcr相比，recq利用atp水解能量參與下的hcr系統(tǒng)所增強(qiáng)得熒光信號強(qiáng)度呈現(xiàn)出劇烈的總體上升趨勢。這一結(jié)果表明，recqe在atp提供水解的能量的情況下，可以有效的促進(jìn)hcr。與此同時，從圖線趨勢上可以看出，隨著酶和atp濃度的增加，熒光信號強(qiáng)度趨于穩(wěn)定。這表明，過量的recqe和atp的作用已經(jīng)不再明顯。

因此，在檢測過程中加入解旋酶，解旋酶的使用終濃度為7-15nm；在檢測過程中加入atp，atp的使用終濃度為35-75μm。在整個檢測過程中recqe和atp的最佳使用濃度分別為10nm和50μμ。

解旋酶和atp在hcr/go傳感平臺，最佳反應(yīng)時間：50min，最佳反應(yīng)溫度：37℃。

之后，將優(yōu)化后的分析方案應(yīng)用于靶目標(biāo)let-7a靈敏度檢測當(dāng)中。如圖3所示，隨著let-7a濃度從0fm不斷增加到2000fm，檢測系統(tǒng)的熒光信號強(qiáng)度也隨之升高，這表明熒光信號強(qiáng)度的大小與靶目標(biāo)的濃度具有很大的關(guān)聯(lián)性。通過繪制let-7a濃度與熒光強(qiáng)度大小的線性數(shù)據(jù)圖，在10fm到2000fm三個數(shù)量級之間獲得相關(guān)系數(shù)為0.99915的良好線性關(guān)系曲線。相關(guān)方程f-f0=11.55+395.5c（f和f0代表let-7a存在和缺乏時hcr擴(kuò)增產(chǎn)物的熒光強(qiáng)度，c是let-7a的物質(zhì)的量濃度，10³fm）。11次重復(fù)測量50fmlet-7a獲得的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.2％，說明此系統(tǒng)對檢測microrna重復(fù)性良好。檢測限為4.2fm（3σ，n=11）。然而，let-7a濃度在2pm到200pm濃度范圍內(nèi)，熒光信號強(qiáng)度與濃度沒有良好的線性關(guān)系。主要原因可能是，當(dāng)let-7a濃度達(dá)到2pm時，go表面的hcr產(chǎn)物已經(jīng)達(dá)到飽和，無法繼續(xù)承載hcr產(chǎn)物，這導(dǎo)致液體中的hcr產(chǎn)物被解旋酶解旋，而被go再次猝滅。

因此，本發(fā)明方法對mirna的檢測上限為2pm，此方案的檢測限的檢測靈敏度比無酶hcr方案高出兩個數(shù)量級。

另外，let-7家族成員之間的堿基序列僅有1～4個核苷酸序列的差異，如此高的序列相似性為傳感平臺檢測靶目標(biāo)帶來了巨大的挑戰(zhàn)。本發(fā)明選擇相同濃度（2pm）的let-7a、let-7b、let-7e、let-7f、let-7g和let-7i來探究此傳感平臺的檢測特異性。如圖4所示，傳感平臺檢測let-7a時的熒光強(qiáng)度分別是其他同族mirnas系統(tǒng)信號強(qiáng)度的3.48~4.16倍。這些結(jié)果說明此傳感平臺能夠高特異性的區(qū)分各種堿基錯配的mirnas并能準(zhǔn)確檢測系統(tǒng)相對應(yīng)的靶目標(biāo)。這為此傳感平臺成功應(yīng)用于臨床診斷不同序列的mirnas提供了前提。

綜上所述，本發(fā)明所提出的新型microrna石墨烯檢測方法，相比于無酶hcr/go傳感平臺，recqe酶促hcr/go傳感平臺表現(xiàn)出高達(dá)244.3％的熒光信號增強(qiáng)。在recqe為10nm，atp為50μm時候，37℃下反應(yīng)50min，可以實(shí)現(xiàn)該解旋酶酶促傳感平臺的最佳試驗(yàn)效果，50min的檢測周期也使得此傳感平臺比無酶hcr/go傳感平臺的檢測效率提高了近4.8倍。最后，此傳感平臺能夠高特異性的區(qū)分各種堿基錯配的mirnas并能準(zhǔn)確檢測系統(tǒng)相對應(yīng)的靶目標(biāo)。

本發(fā)明提供一種檢測周期短、特異性、靈敏高的新型mirna檢測方法，其檢測下限為4.2fm，比無酶hcr/go傳感平臺的檢測靈敏度高出兩個數(shù)量級，是目前化學(xué)發(fā)光檢測方法中靈敏度最高的檢測手段，具有重要的潛在應(yīng)用價值。

以上僅為本發(fā)明的具體實(shí)施例，但并不局限于此。任何以本發(fā)明為基礎(chǔ)解決基本相同的技術(shù)問題，或?qū)崿F(xiàn)基本相同的技術(shù)效果，所作出地簡單變化、等同替換或者修飾等，均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。

說明書核苷酸和氨基酸序列表

cy3熒光標(biāo)記的莖環(huán)結(jié)構(gòu)的dna探針

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