本發(fā)明涉及菌種培養(yǎng)領(lǐng)域，具體而言，涉及一種秀珍菇液體菌種、菌絲體及半連續(xù)制備工藝。
背景技術(shù)：
食用菌作為一種重要的生物資源，不僅味道鮮美、低脂肪、低能量，還富含膳食纖維、維生素和蛋白質(zhì)等營(yíng)養(yǎng)素，正發(fā)展成為繼動(dòng)物性食品、植物性食品之外的第三類食品，即菌物性食品。此外，食用菌還可以提高人體免疫功能、防治多種慢性病，在抗衰老等方面也具有顯著的功效。在眾多食用菌中，秀珍菇(Pleurotus geesteranus)是側(cè)耳科側(cè)耳屬的一種，俗稱環(huán)柄香菇。秀珍菇中含有許多營(yíng)養(yǎng)成分，如氨基酸、礦物質(zhì)等，還有豐富的蛋白質(zhì)，而且脂肪的量較低，經(jīng)過烹飪的秀珍菇風(fēng)味獨(dú)特，十分可口。食用秀珍菇對(duì)我們的身體也是具有相當(dāng)多的益處，因?yàn)樗軌蚋纳莆覀冏陨淼拿庖吡?，也可以?duì)人們所擔(dān)心的血脂及膽固醇起到一定的降低作用，倍受廣大消費(fèi)者喜愛。秀珍菇具有很好的發(fā)展?jié)摿徒?jīng)濟(jì)效益，而且具有非常好的國(guó)內(nèi)市場(chǎng)和出口前景，因此市場(chǎng)需求量越來越大。以前小作坊式的固體培養(yǎng)方式已經(jīng)遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足秀珍菇產(chǎn)業(yè)快速發(fā)展的趨勢(shì)，大規(guī)模機(jī)械化的生產(chǎn)已是必然，因此采用現(xiàn)代生物工程技術(shù)的液體深層發(fā)酵培養(yǎng)越來越受到重視。液體深層發(fā)酵是采用生物培養(yǎng)(發(fā)酵)設(shè)備，通過液體深層培養(yǎng)(發(fā)酵)的方式生產(chǎn)食用菌菌球，作為食用菌栽培的種子，或作為有效成分提取分離及深加工的原料。液體深層發(fā)酵培養(yǎng)的液體菌種具有固體菌種不可比擬的優(yōu)勢(shì)：制種快、活力強(qiáng)、純度高、防污染、縮短栽培周期。
另外，根據(jù)生產(chǎn)過程中發(fā)酵連續(xù)度的不同以及對(duì)微生物培養(yǎng)情況的不同，可以將液體深層發(fā)酵分為三種類型：連續(xù)發(fā)酵、分批發(fā)酵以及補(bǔ)料分批發(fā)酵。其中，補(bǔ)料分批發(fā)酵是在整個(gè)分批發(fā)酵的過程中，向發(fā)酵罐或者是發(fā)酵瓶中有間斷性的添加新鮮培養(yǎng)基，但是不會(huì)將用過的發(fā)酵液連續(xù)地倒出，因此最終發(fā)酵液的含量會(huì)增加。補(bǔ)料分批發(fā)酵是處于連續(xù)發(fā)酵與分批發(fā)酵中間的一類發(fā)酵方式，對(duì)比分批發(fā)酵，補(bǔ)料分批發(fā)酵能夠減少發(fā)酵液的粘度以及底物的濃度，也能提升微生物利用營(yíng)養(yǎng)因素及氧氣的能力，同時(shí)可以緩解底物的遏制作用，最終使微生物的產(chǎn)量有較大的提升。但是目前補(bǔ)料分批發(fā)酵多應(yīng)用在酶制劑、有機(jī)酸以及抗生素等微生物產(chǎn)品的制備，很少應(yīng)用于培養(yǎng)食用菌的液體菌種。究其原因，是因?yàn)槟壳暗难a(bǔ)料分批發(fā)酵培養(yǎng)食用菌雖然可在一定程度上提交產(chǎn)量，但是由于工序太過繁瑣，導(dǎo)致成本高，很難推廣使用。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的在于提供一種秀珍菇液體菌種的制備方法，秀珍菇液體菌種的產(chǎn)量很高、成本低，易于推廣使用。
本發(fā)明的另一目的在于提供一種秀珍菇液體菌種，其成活率高，質(zhì)量好，易于保藏。
本發(fā)明的另一目的在于提供一種秀珍菇菌絲體，可作為秀珍菇有效成分提取分離及深加工的原料。
本發(fā)明的實(shí)施例是這樣實(shí)現(xiàn)的：
一種秀珍菇液體菌種的半連續(xù)制備工藝，其包括以下步驟：
將秀珍菇母種經(jīng)過活化發(fā)酵培養(yǎng)，得到秀珍菇菌種；
將秀珍菇菌種放入發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)3-5天，得到培養(yǎng)菌液，將培養(yǎng)菌液按重量分為N等份，N＝4-6，在每等份培養(yǎng)菌液中加入新鮮的發(fā)酵培養(yǎng)基，使添加發(fā)酵培養(yǎng)基后的每等份培養(yǎng)菌液的重量與培養(yǎng)菌液總重量相等，繼續(xù)培養(yǎng)2-4天，得到秀珍菇液體菌種。
在本發(fā)明較佳的實(shí)施例中，上述發(fā)酵培養(yǎng)基的制備工藝為：
按重量份數(shù)計(jì)，稱取30-50份可溶性淀粉，35-65份酵母膏放入800-1200份水中煮15-25min，用3-5層紗布過濾，得濾液；
在濾液中加入1-2份KCl，0.004-0.006份維生素B1，分裝后，于120-122℃高溫滅菌15-25min。
在本發(fā)明較佳的實(shí)施例中，上述秀珍菇菌種和培養(yǎng)菌液培養(yǎng)方式為：于20-30℃，轉(zhuǎn)速120-160r/min的條件下?lián)u床培養(yǎng)。
在本發(fā)明較佳的實(shí)施例中，上述秀珍菇菌種的加入量為發(fā)酵培養(yǎng)基質(zhì)量的8-12％。
在本發(fā)明較佳的實(shí)施例中，上述將秀珍菇母種進(jìn)行活化發(fā)酵培養(yǎng)的方法是：
將秀珍菇母種活化后，轉(zhuǎn)接到斜面培養(yǎng)基上，放入26-30℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，得到斜面菌種；
將斜面菌種接入液體培養(yǎng)基中，斜面菌種的加入量為液體培養(yǎng)基的3-6g/L，于25-29℃，轉(zhuǎn)速170-230r/min的條件下?lián)u床培養(yǎng)5-7天。
在本發(fā)明較佳的實(shí)施例中，上述斜面培養(yǎng)基的制備工藝為：
按重量份數(shù)計(jì)，稱取30-50份去皮馬鈴薯，加入160-240份水，煮15-25min，用3-5層紗布過濾，得濾液；
向?yàn)V液添加3-5份蔗糖，3-5份瓊脂粉，補(bǔ)水至總重量為160-240份，混勻融化后進(jìn)行分裝，于120-122℃高溫滅菌15-25min。
在本發(fā)明較佳的實(shí)施例中，上述液體培養(yǎng)基的制備工藝為：
按重量份數(shù)計(jì)，稱取30-50份去皮馬鈴薯，加入160-240份水，煮15-25min，用3-5層紗布過濾，得濾液；
向?yàn)V液添加3-5份蔗糖，補(bǔ)水至總重量為160-240份，混勻融化后進(jìn)行分裝，于120-122℃高溫滅菌15-25min。
一種秀珍菇液體菌種，采用上述的半連續(xù)制備工藝制得。
在本發(fā)明較佳的實(shí)施例中，上述秀珍菇液體菌種的保藏溫度為0-5℃。
一種秀珍菇菌絲體，將上述的秀珍菇液體菌種經(jīng)過微濾膜過濾去除濾液得到。
本發(fā)明實(shí)施例的有益效果是：本發(fā)明實(shí)施例將秀珍菇母種經(jīng)過活化發(fā)酵培養(yǎng)，得到秀珍菇菌種，然后將秀珍菇菌種放入發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)3-5天，得到培養(yǎng)菌液，將培養(yǎng)菌液按重量分為N等份，在每等份培養(yǎng)菌液中加入新鮮的發(fā)酵培養(yǎng)基，使每等份添加發(fā)酵培養(yǎng)基后的培養(yǎng)菌液的重量與培養(yǎng)菌液總重量相等，繼續(xù)培養(yǎng)2-4天，得到秀珍菇液體菌種。本發(fā)明實(shí)施例間隔相同時(shí)間，倒出之前發(fā)酵液的一部分，然后增添同等體積的新鮮發(fā)酵液發(fā)酵，秀珍菇液體菌種的產(chǎn)量很高、成本低，易于推廣使用；而且制得的秀珍菇液體菌種成活率高，質(zhì)量好，易于保藏；進(jìn)一步得到的秀珍菇菌絲體，可作為秀珍菇有效成分提取分離及深加工的原料。
具體實(shí)施方式
為使本發(fā)明實(shí)施例的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點(diǎn)更加清楚，下面將對(duì)本發(fā)明實(shí)施例中的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述。實(shí)施例中未注明具體條件者，按照常規(guī)條件或制造商建議的條件進(jìn)行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可以通過市售購(gòu)買獲得的常規(guī)產(chǎn)品。
下面對(duì)本發(fā)明實(shí)施例的秀珍菇液體菌種、菌絲體及半連續(xù)制備工藝進(jìn)行具體說明。
本發(fā)明實(shí)施例提供一種秀珍菇液體菌種的半連續(xù)制備工藝，其包括以下步驟：
S1、將秀珍菇母種經(jīng)過活化發(fā)酵培養(yǎng)，得到秀珍菇菌種，具體方法如下：
S1A、將秀珍菇母種活化后，轉(zhuǎn)接到斜面培養(yǎng)基上，放入26-30℃，優(yōu)選28℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，得到斜面菌種。
其中，斜面培養(yǎng)基的制備工藝為：按重量份數(shù)計(jì)，稱取30-50份去皮馬鈴薯，加入160-240份水，煮15-25min，用3-5層紗布過濾，得濾液；向?yàn)V液添加3-5份蔗糖，3-5份瓊脂粉，補(bǔ)水至總重量為160-240份，混勻融化后進(jìn)行分裝，于120-122℃高溫滅菌15-25min。優(yōu)選地，按重量份數(shù)計(jì)，稱取40份去皮馬鈴薯，加入200份水，煮20min，用4層紗布過濾，得濾液；向?yàn)V液添加4份蔗糖，4份瓊脂粉，補(bǔ)水至總重量為200份，混勻融化后進(jìn)行分裝，于121℃高溫滅菌20min，即得。
S1B、將斜面菌種接入液體培養(yǎng)基中，斜面菌種的加入量為液體培養(yǎng)基的3-6g/L，于25-29℃，轉(zhuǎn)速170-230r/min的條件下?lián)u床培養(yǎng)5-7天。優(yōu)選地，斜面菌種的加入量為液體培養(yǎng)基的4.5g/L，于27℃，轉(zhuǎn)速200r/min的條件下?lián)u床培養(yǎng)6天。
其中，液體培養(yǎng)基的制備工藝為：按重量份數(shù)計(jì)，稱取30-50份去皮馬鈴薯，加入160-240份水，煮15-25min，用3-5層紗布過濾，得濾液；向?yàn)V液添加3-5份蔗糖，補(bǔ)水至總重量為160-240份，混勻融化后進(jìn)行分裝，于120-122℃高溫滅菌15-25min。優(yōu)選地，按重量份數(shù)計(jì)，稱取40份去皮馬鈴薯，加入200份水，煮20min，用4層紗布過濾，得濾液；向?yàn)V液添加4份蔗糖，補(bǔ)水至總重量為200份，混勻融化后進(jìn)行分裝，于121℃高溫滅菌20min，即得。
S2、將秀珍菇菌種放入發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)3-5天，優(yōu)選培養(yǎng)4天，其中，秀珍菇菌種的加入量為發(fā)酵培養(yǎng)基重量的8-12％，優(yōu)選為10％，培養(yǎng)是于20-30℃，轉(zhuǎn)速120-160r/min的條件下?lián)u床培養(yǎng)，優(yōu)選于25℃，轉(zhuǎn)速140r/min的條件下?lián)u床培養(yǎng)，得到培養(yǎng)菌液。
將培養(yǎng)菌液按重量分為N等份，在每等份培養(yǎng)菌液中加入新鮮的發(fā)酵培養(yǎng)基，直至添加發(fā)酵培養(yǎng)基后的每等份培養(yǎng)菌液的重量與培養(yǎng)菌液總重量相等，繼續(xù)培養(yǎng)2-4天，其中，N＝4-6，N優(yōu)選為5，即在每等份培養(yǎng)菌液中加入的發(fā)酵培養(yǎng)基占總重量的80％(補(bǔ)料量為80％)，優(yōu)選再繼續(xù)培養(yǎng)3天，培養(yǎng)條件與之前的培養(yǎng)條件相同，于20-30℃，轉(zhuǎn)速120-160r/min的條件下?lián)u床培養(yǎng)，培養(yǎng)結(jié)束后，吸取其中的液體發(fā)酵培養(yǎng)基，得到秀珍菇液體菌種。
秀珍菇菌種放入發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)，總發(fā)酵時(shí)間過短，菌種得不到有效增值，但是總發(fā)酵時(shí)間太長(zhǎng)，培養(yǎng)基中的能量消耗完畢后，菌種會(huì)自我消耗，得到秀珍菇液體菌種的數(shù)量和質(zhì)量都會(huì)下降，因此，總發(fā)酵時(shí)間優(yōu)選為6-8天，7天最佳。
其中，發(fā)酵培養(yǎng)基的制備工藝為：按重量份數(shù)計(jì)，稱取30-50份可溶性淀粉，35-65份酵母膏放入800-1200份水中煮15-25min，用3-5層紗布過濾，得濾液；在濾液中加入1-2份KCl，0.004-0.006份維生素B1，分裝后，于120-122℃高溫滅菌15-25min。優(yōu)選地，按重量份數(shù)計(jì)，稱取40份可溶性淀粉，50份酵母膏放入1000份水中煮20min，用4層紗布過濾，得濾液；在濾液中加入1.5份KCl，0.005份維生素B1，分裝后，于121℃高溫滅菌20min，即得。
本發(fā)明實(shí)施例還提供一種秀珍菇液體菌種，是采用上述的半連續(xù)制備工藝制得。
該秀珍菇液體菌種保藏的較佳溫度為0-5℃。另外，該秀珍菇液體菌種可于6-15℃下保藏12天，于16-20℃下保藏8天，于21-25℃下保藏4天，保藏后的秀珍菇液體菌種質(zhì)量?jī)?yōu)。
本發(fā)明實(shí)施例還提供一種秀珍菇菌絲體，是將上述的秀珍菇液體菌種經(jīng)過微濾膜過濾去除濾液，收集濾渣，即得秀珍菇菌絲體。
以下結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的特征和性能作進(jìn)一步的詳細(xì)描述。
實(shí)施例1
本實(shí)施例提供一種秀珍菇液體菌種，按以下過程制備：
制備斜面培養(yǎng)基(200mL)：稱去皮馬鈴薯40g，加入200mL水，煮20min，然后用4層紗布過濾，向得到的濾液中添加蔗糖與瓊脂粉各4g，補(bǔ)水至200mL，混勻融化后進(jìn)行分裝，置于121℃高溫下滅菌20min。制備液體培養(yǎng)基(200mL)：不加瓊脂，其他操作與制備斜面培養(yǎng)基相同。對(duì)上述斜面培養(yǎng)基和液體培養(yǎng)基滅菌后，分別將斜面培養(yǎng)基和液體培養(yǎng)基放入恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)2d，觀察沒有雜菌，說明沒有被污染。
制備秀珍菇發(fā)酵培養(yǎng)基：稱可溶性淀粉40g，酵母膏50g放入1000mL水中煮20min，4層紗布過濾，得濾液，加1.5gKCl，5mg維生素B1，pH自然，分裝后，于121℃高溫滅菌20min。
將秀珍菇母種活化后，轉(zhuǎn)接到斜面培養(yǎng)基上，放入28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，得到斜面菌種；從培養(yǎng)好的斜面菌種上取1/5接入液體培養(yǎng)基中，斜面菌種的加入量為液體培養(yǎng)基的4.5g/L，于27℃，轉(zhuǎn)速200r/min的條件下?lián)u床培養(yǎng)6天，得到秀珍菇菌種。
將秀珍菇液體菌種放入發(fā)酵培養(yǎng)基培養(yǎng)4天，秀珍菇菌種的加入量為發(fā)酵培養(yǎng)基重量的10％，于25℃，轉(zhuǎn)速140r/min的條件下?lián)u床培養(yǎng)，得到培養(yǎng)菌液；將培養(yǎng)菌液分為5等份，每等份培養(yǎng)菌液的重量為培養(yǎng)菌液總重量的20％，在每等份培養(yǎng)菌液中分別加入培養(yǎng)菌液總重量80％的發(fā)酵培養(yǎng)基，每等份添加發(fā)酵培養(yǎng)基后的培養(yǎng)菌液的重量與培養(yǎng)菌液總重量相等，繼續(xù)培養(yǎng)3天，吸取收集其中的液體發(fā)酵培養(yǎng)基，得到秀珍菇液體菌種。
實(shí)施例2
本實(shí)施例提供一種秀珍菇液體菌種，按以下過程制備：
制備斜面培養(yǎng)基(200mL)：稱去皮馬鈴薯30g，加入160mL水，煮15min，然后用3層紗布過濾，向得到的濾液中添加蔗糖與瓊脂粉各3g，補(bǔ)水至200mL，混勻融化后進(jìn)行分裝，置于120℃高溫下滅菌15min。制備液體培養(yǎng)基(200mL)：不加瓊脂，其他操作與制備斜面培養(yǎng)基相同。
制備秀珍菇發(fā)酵培養(yǎng)基：稱可溶性淀粉30g，酵母膏35g放入800mL水中煮15min，3層紗布過濾，得濾液，加1gKCl，4mg維生素B1，分裝后，于120℃高溫滅菌15min。
將秀珍菇母種活化后，轉(zhuǎn)接到斜面培養(yǎng)基上，放入26℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，得到斜面菌種；取斜面菌種上接入液體培養(yǎng)基中，斜面菌種的加入量為液體培養(yǎng)基的3g/L，于25℃，轉(zhuǎn)速170r/min的條件下?lián)u床培養(yǎng)5天，得到秀珍菇菌種。
將秀珍菇液體菌種放入發(fā)酵培養(yǎng)基培養(yǎng)3天，秀珍菇菌種的加入量為發(fā)酵培養(yǎng)基重量的8％，于20℃，轉(zhuǎn)速120r/min的條件下?lián)u床培養(yǎng)，得到培養(yǎng)菌液；將培養(yǎng)菌液分為4等份，每等份培養(yǎng)菌液的重量為培養(yǎng)菌液總重量的25％，在每等份培養(yǎng)菌液中分別加入培養(yǎng)菌液總重量75％的發(fā)酵培養(yǎng)基，每等份添加發(fā)酵培養(yǎng)基后的培養(yǎng)菌液的重量與培養(yǎng)菌液總重量相等，繼續(xù)培養(yǎng)4天，吸取收集其中的液體發(fā)酵培養(yǎng)基，得到秀珍菇液體菌種。
實(shí)施例3
本實(shí)施例提供一種秀珍菇液體菌種，按以下過程制備：
制備斜面培養(yǎng)基(200mL)：稱去皮馬鈴薯50g，加入240mL水，煮25min，然后用5層紗布過濾，向得到的濾液中添加蔗糖與瓊脂粉各5g，補(bǔ)水至200mL，混勻融化后進(jìn)行分裝，置于122℃高溫下滅菌25min。制備液體培養(yǎng)基(200mL)：不加瓊脂，其他操作與制備斜面培養(yǎng)基相同。
制備秀珍菇發(fā)酵培養(yǎng)基：稱可溶性淀粉50g，酵母膏65g放入1200mL水中煮25min，5層紗布過濾，得濾液，加2gKCl，6mg維生素B1，分裝后，于122℃高溫滅菌25min。
將秀珍菇母種活化后，轉(zhuǎn)接到斜面培養(yǎng)基上，放入30℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，得到斜面菌種；取斜面菌種接入液體培養(yǎng)基中，斜面菌種的加入量為液體培養(yǎng)基的6g/L，于29℃，轉(zhuǎn)速230r/min的條件下?lián)u床培養(yǎng)7天，得到秀珍菇菌種。
將秀珍菇液體菌種放入發(fā)酵培養(yǎng)基培養(yǎng)5天，秀珍菇菌種的加入量為發(fā)酵培養(yǎng)基重量的12％，于30℃，轉(zhuǎn)速160r/min的條件下?lián)u床培養(yǎng)，得到培養(yǎng)菌液；將培養(yǎng)菌液分為6等份，每等份培養(yǎng)菌液的重量為培養(yǎng)菌液總重量的15％，在每等份培養(yǎng)菌液中分別加入培養(yǎng)菌液總重量85％的發(fā)酵培養(yǎng)基，每等份添加發(fā)酵培養(yǎng)基后的培養(yǎng)菌液的重量與培養(yǎng)菌液總重量相等，繼續(xù)培養(yǎng)2天，吸取收集其中的液體發(fā)酵培養(yǎng)基，得到秀珍菇液體菌種。
對(duì)比例
本實(shí)施例提供一種秀珍菇液體菌種，按分批發(fā)酵制備工藝制備，具體過程如下：
按照與實(shí)施例1中相同的方法制備斜面培養(yǎng)基、液體培養(yǎng)基和秀珍菇發(fā)酵培養(yǎng)基，并按照與實(shí)施例1中相同的方法，將秀珍菇母種經(jīng)過活化發(fā)酵培養(yǎng)，得到秀珍菇菌種。
將秀珍菇菌種分為5等份，在每等份中加入發(fā)酵培養(yǎng)基，直至每等份添加發(fā)酵培養(yǎng)基后的秀珍菇菌種的重量與秀珍菇菌種總重量相等，于25℃，轉(zhuǎn)速140r/min的條件下?lián)u床培養(yǎng)7天，吸取收集其中的液體發(fā)酵培養(yǎng)基，得到秀珍菇液體菌種。
以下對(duì)實(shí)施例1-3中采用半連續(xù)制備工藝制得的秀珍菇液體菌種和對(duì)比例中采用分批發(fā)酵制備工藝制得的秀珍菇液體菌種進(jìn)行檢測(cè)。在指標(biāo)測(cè)定之前，先進(jìn)行鏡檢，觀察液體菌種是否被污染雜菌，若沒有則進(jìn)行下一步。檢測(cè)項(xiàng)目如下：
1、菌絲球數(shù)量
吸取10mL液體發(fā)酵培養(yǎng)基，將其倒入平皿中，在其下方墊方格紙，然后計(jì)菌球數(shù)。
2、采用DNS法測(cè)定還原糖
首先在15mL的試管中加入不同濃度的葡糖糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，以0.2為一個(gè)濃度，每隔0.2再取四個(gè)濃度，一共取5個(gè)，對(duì)照管是不含葡萄糖，取完溶液后，都要將它們補(bǔ)到1.0mL，之后再加相同體積的DNS試劑，然后煮沸2min，待溶液的溫度降下來之后，補(bǔ)水至試管的最大體積。最后，測(cè)540nm波長(zhǎng)下的吸光值，繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線。
取1.0mL液體發(fā)酵培養(yǎng)基，然后稀釋為100mL，使含糖量為0.1-1.0mg/mL。吸取1mL稀釋液，按照上述的測(cè)定步驟，測(cè)出稀釋液的吸光度，然后對(duì)照葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線查出還原糖含量。
3、氨基氮的測(cè)定
先取3個(gè)一樣大小的錐形瓶，然后編號(hào)。將5mL水和2mL液體發(fā)酵培養(yǎng)基同時(shí)加入1、2號(hào)瓶?jī)?nèi)，混勻。將7mL水加入3號(hào)瓶中。然后在3個(gè)錐形瓶中分別滴加滴酚酞指示劑，混勻后再加入2mL的甲醛溶液，再次將其混勻，接著用0.02mol/L標(biāo)準(zhǔn)氫氧化鈉溶液進(jìn)行滴定，使溶液呈微紅色。氨基氮含量＝100×[(V樣品-V空白)×NNaOH×14.008]/2，單位是mg/100mL。
4、pH值的測(cè)定
先校正pH計(jì)，校正之后取適量的液體發(fā)酵培養(yǎng)基，然后進(jìn)行測(cè)量。
5、菌絲球干重
用濾紙收集50mL液體發(fā)酵培養(yǎng)基中的菌絲球，并清洗3次，將其置于處理好的平皿上，然后烘0.5h，再稱量菌絲球重量，然后接著烘干，直至恒重。
6、淀粉酶活性的測(cè)定
淀粉酶活性測(cè)定時(shí)先取5mL的液體發(fā)酵培養(yǎng)基，然后以3000r/min離心10min，倒出上清液，放入50mL容量瓶中，加蒸餾水定容至刻度，制成淀粉酶原液。吸取淀粉酶原液5mL，放入50mL容量瓶中，用蒸餾水定容至刻度，搖勻，即為淀粉酶稀釋液。接下來取一定量淀粉酶稀釋液將其放在40℃、pH6.0的條件下，使其在一定的作用時(shí)間里把淀粉轉(zhuǎn)化為還原糖，然后與DNS試劑作用，在540nm波長(zhǎng)下進(jìn)行比色測(cè)定，查圖得出還原糖的生成量，進(jìn)一步計(jì)算淀粉酶活性。淀粉酶活性＝C×VT/(w×VS×t)，單位是u/mL。式中：C—從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得的麥芽糖含量(mg)；w—吸取的發(fā)酵液(w＝5ml)；VT—淀粉酶總體積(VT＝500mL)；VS—反應(yīng)所用的淀粉酶體積(VS＝1mL)；t—反應(yīng)時(shí)間(t＝5min)。得到麥芽糖標(biāo)準(zhǔn)曲線。
7、蛋白酶活性的測(cè)定
蛋白酶活性測(cè)定時(shí)先取5mL的液體發(fā)酵培養(yǎng)基，然后以12000r/min離心5min，倒出上清液。在實(shí)驗(yàn)中以1％酪蛋白為底物，它是以緩沖溶液為溶劑的。我們將一定量的酶液放入其中，然后在37℃水浴中讓它們有10分鐘的反應(yīng)時(shí)間，再加入5％的TCA，將其與水浴之前添加5％的TCA相比，測(cè)量它們?cè)?80nm波長(zhǎng)下的OD值。蛋白酶活性＝ΔA×1000/(t×VS)，單位是u/mL。式中：ΔA—樣品與空白吸光度差值；t—酶作用時(shí)間(t＝10min)；VS—反應(yīng)中酶的體積，mL。
8、纖維素酶活性的測(cè)定
首先要繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，以0.2mL為一個(gè)梯度，一共取5個(gè)值，將它們置于25mL的試管，并補(bǔ)水至1.0mL，接著添加3mL的DNS試劑，煮沸10min，等溫度降低至室溫，補(bǔ)水至25mL，測(cè)量它們?cè)?50nm波長(zhǎng)下的OD值，繪制葡萄糖標(biāo)曲。
先吸取1mL液體發(fā)酵培養(yǎng)基稀釋至100mL，從稀釋的液體發(fā)酵培養(yǎng)基中取出1mL于25mL的刻度試管中，再加入3mL0.5％的羧甲基纖維素鈉溶液，50℃水浴0.5h，取出后立即煮沸10min，為了使酶失去活性。取出冷卻后加入顯色液3mL，再煮沸10min，冷卻定容至25mL，混勻后，在550nm波長(zhǎng)下測(cè)OD值?？瞻坠軠y(cè)定是將1mL稀釋液放入沸水浴中5min，待之冷卻后，其它操作同樣品管的測(cè)定。纖維素酶活性＝100×C/(t×VS)，單位是u/mL。式中：C—從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得的葡萄糖含量(mg)；t—酶作用時(shí)間(t＝30min)；VS—反應(yīng)中酶的體積(VS＝1mL)。
檢測(cè)結(jié)果：
一、不同制備工藝對(duì)秀珍菇液體菌種產(chǎn)量的影響。
表1不同制備工藝生產(chǎn)秀珍菇液體菌種
從上表可知，本發(fā)明實(shí)施例1-3中按照半連續(xù)制備工藝制得的秀珍菇液體菌種的菌絲球數(shù)量較多，菌絲干重比較高，而且經(jīng)檢測(cè)得出，其中的淀粉酶及蛋白酶的活力較好，尤其是實(shí)施例2制得的秀珍菇液體菌種的菌絲球數(shù)量最多，菌絲干重最高，其中的淀粉酶及蛋白酶的活力最好。
二、不同制備工藝對(duì)秀珍菇液體菌種質(zhì)量的影響。
本發(fā)明實(shí)施例1-3中采用半連續(xù)制備工藝制得的秀珍菇液體菌種和對(duì)比例采用分批發(fā)酵制備工藝制得的秀珍菇液體菌種，它們的pH在整個(gè)發(fā)酵過程中都是趨于平穩(wěn)，而且還原糖含量都先升高后減少，這是因?yàn)榕囵B(yǎng)前期發(fā)酵培養(yǎng)基中的淀粉酶及纖維素酶等份解培養(yǎng)基，產(chǎn)生了還原糖，但是碳源的利用少于還原糖的生成，所以產(chǎn)生該趨勢(shì)。在對(duì)比例中，氨基氮含量在持續(xù)減少，因?yàn)榫z球生長(zhǎng)消耗了氮源，而補(bǔ)料后氨基氮含量有所上升，這是因?yàn)榧尤肓说?，之后也成下降趨?shì)，但是本發(fā)明實(shí)施例1-3測(cè)得的氨基氮含量比分批發(fā)酵略高，表明分批發(fā)酵時(shí)，氮源利用地更好，而且淀粉酶活力和纖維素酶活力都高于對(duì)比例，蛋白酶活力比對(duì)比例略高。綜合其它指標(biāo)，可以看出，按照本發(fā)明實(shí)施例的半連續(xù)制備工藝制得的秀珍菇液體菌種的質(zhì)量更好。
三、秀珍菇液體菌種保藏結(jié)果。
1、秀珍菇液體菌種平皿復(fù)活試驗(yàn)
以下是0-5℃下保藏2d的半連續(xù)發(fā)酵和分批發(fā)酵秀珍菇液體菌種的平皿復(fù)活結(jié)果。
表2秀珍菇平皿復(fù)活結(jié)果(h)
2、秀珍菇液體菌種成活率試驗(yàn)
表3秀珍菇成活率(％)
由上表可以發(fā)現(xiàn)：延長(zhǎng)保藏的時(shí)間，菌種的萌發(fā)時(shí)間也會(huì)相應(yīng)延長(zhǎng)，兩種發(fā)酵方法制備的液體菌種在0-5℃下保藏12天后菌種都能存活，這表明以此溫度保藏液體菌種，菌種的質(zhì)量基本沒有降低，隨著溫度的升高，同一保藏時(shí)間下的菌種會(huì)延遲萌發(fā)期，成活率有所下降。當(dāng)溫度一定，增加菌種的保藏時(shí)間，萌發(fā)時(shí)間也會(huì)往后推遲，成活率下降。當(dāng)菌種成活后，有污染情況，這表明菌種在該保藏時(shí)間下可能已經(jīng)被污染。另外，我們發(fā)現(xiàn)纖維素酶活力的變化基本與保藏時(shí)間呈負(fù)相關(guān)，同時(shí)保藏溫度越高，纖維素酶活力下降得更快，這就說明了菌種的質(zhì)量也下降得更快。
綜上所述，本發(fā)明實(shí)施例的秀珍菇液體菌種的制備方法，秀珍菇液體菌種的產(chǎn)量很高、成本低，易于推廣使用；而且制得的秀珍菇液體菌種成活率高，質(zhì)量好，易于保藏；進(jìn)一步得到的秀珍菇菌絲體，可作為秀珍菇有效成分提取分離及深加工的原料。
以上所描述的實(shí)施例是本發(fā)明一部分實(shí)施例，而不是全部的實(shí)施例。本發(fā)明的實(shí)施例的詳細(xì)描述并非旨在限制要求保護(hù)的本發(fā)明的范圍，而是僅僅表示本發(fā)明的選定實(shí)施例?；诒景l(fā)明中的實(shí)施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒有作出創(chuàng)造性勞動(dòng)前提下所獲得的所有其他實(shí)施例，都屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。