本發(fā)明涉及一種植物抗病必需基因及其應(yīng)用，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

番茄是一種很好的用于遺傳研究的茄科模式植物，具有豐富標(biāo)記的多個(gè)遺傳連鎖圖和物理圖譜，其全基因組測(cè)序也已經(jīng)完成和公布(http：//solgenomics.net/)。番茄具有很大的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，是一種栽培最廣泛的蔬菜作物之一。根據(jù)FAO的統(tǒng)計(jì)，2013年世界番茄總產(chǎn)量已達(dá)1.639億噸，約占世界蔬菜(含瓜類)總產(chǎn)量的14.43％。我國番茄總產(chǎn)量達(dá)到了0.506億噸，約占世界番茄生產(chǎn)總量的30.8％?？梢姺言谥袊酥潦澜缡卟松a(chǎn)和供應(yīng)中具有舉足輕重的地位。但是病蟲害嚴(yán)重影響番茄生產(chǎn)，不僅導(dǎo)致減產(chǎn)也因農(nóng)藥的施用而增加了番茄生產(chǎn)成本和環(huán)境污染，據(jù)估計(jì)，病蟲害可以造成番茄減產(chǎn)達(dá)30％-80％，因噴施農(nóng)藥增加成本達(dá)10％-15％。

番茄白粉病是一種非常嚴(yán)重的世界性植物病害，特別是在溫室生產(chǎn)番茄上尤為嚴(yán)重(Jones et al.，2001)，番茄白粉病不僅影響番茄產(chǎn)量還影響番茄質(zhì)量。由于抗病番茄品種較少，目前防治這種真菌病害的方法主要靠施用殺菌劑，造成了蔬菜農(nóng)藥殘留和環(huán)境污染，因此是無公害番茄生產(chǎn)的一個(gè)障礙。該病害的致病菌是番茄白粉菌(Oidium neolycopersici)，番茄白粉菌是一種活體寄生真菌，只侵染番茄表皮細(xì)胞。近年來，番茄白粉病在中國也被發(fā)現(xiàn)并在各地頻頻爆發(fā)，我們也對(duì)番茄白粉病致病菌進(jìn)行了形態(tài)學(xué)和核糖體轉(zhuǎn)錄單元間隔區(qū)(ITS)序列的分析，明確了該致病菌為番茄白粉菌中國菌系，并在國際上進(jìn)行了報(bào)道(Li et al.，2008)。

番茄晚疫病是由半活體寄生類型病原物-致病疫霉(Phytophthora infestans)引起的真菌病害，一直是世界范圍內(nèi)番茄生產(chǎn)的重大病害之一。在我國晚疫病不僅危害南方番茄生產(chǎn)，對(duì)北方保護(hù)地番茄生產(chǎn)也造成了很大的危害，一般年份減產(chǎn)可達(dá)30％，發(fā)病嚴(yán)重年份可以達(dá)到80％以上(薛敏菊等，2002；馮蘭香等，2004；趙同敏等，2006)。近年來，由于番茄周年生產(chǎn)、保護(hù)地生產(chǎn)環(huán)境利于晚疫病發(fā)生、長期施用農(nóng)藥導(dǎo)致病菌抗藥性提高、我國生態(tài)環(huán)境多樣等因素，致病疫霉引起的晚疫病頻繁爆發(fā)成為周年病害(薛敏菊等，2002；趙同敏等，2006)。

番茄黃萎病是由大麗輪枝菌(Verticillium dahliae)引起的一種土傳腐生真菌病害，是影響番茄生產(chǎn)特別是保護(hù)地番茄生產(chǎn)的重要病害，近年來該病害在我國已經(jīng)由次要病害變?yōu)橹饕『?雷娜等，2011)。雖然2個(gè)番茄抗黃萎病基因Ve1和Ve2被克隆(Kawchuk et al.，2001)，Ve1基因介導(dǎo)的抗病反應(yīng)信號(hào)途徑及其與Cf基因介導(dǎo)的信號(hào)途徑的重疊也被詮釋(Fradin et al.，2009)，但是，對(duì)該病菌與番茄的互作機(jī)理仍不清楚。

番茄Rcr1和Rcr2是Cf-9介導(dǎo)對(duì)攜帶Avr9葉霉病菌抗性反應(yīng)的必需基因(Hammond-Kosack et al.，1994)；Rcr3是Cf-2介導(dǎo)對(duì)攜帶Avr葉霉菌抗性反應(yīng)的必需基因(Dixon et al.，2000；Rooney et al.，2005)。Rar1和Rar2被發(fā)現(xiàn)是大麥白粉病(Bgh)抗病基因Mla、Mih和Mlk介導(dǎo)抗性反應(yīng)的必需基因；Ror1和Ror2是mlo介導(dǎo)抗性反應(yīng)必需基因(Freialdenhoven et al，1994and 1996)(圖1，引自Li，2005)。雖然這類必需基因最初往往在特定的植病體系被發(fā)現(xiàn)，但是越來越多研究表明這些必需基因參與了不同R基因介導(dǎo)的抗性反應(yīng)，例如RAR、SGT1和HSP90是參與不同R基因介導(dǎo)的抗性反應(yīng)的必需基因(Azevedo et al.，2002；Takahashi et al.，2003；Austin et al.，2002)。因此，研究必需基因可以為持久和廣譜抗性機(jī)理提供依據(jù)。

病毒誘導(dǎo)的基因沉默(virus induced gene silencing，VIGS)是一種快速高效的功能基因組學(xué)研究方法(van Kammen，1997；Senthil-Kumar and Mysore，2014)，克服了傳統(tǒng)功能基因組學(xué)研究技術(shù)的局限性，具有快速、不需要植物轉(zhuǎn)化和可以對(duì)基因家族進(jìn)行基因沉默的優(yōu)點(diǎn)。除此之外，VIGS還可以在物種間和物種內(nèi)不同遺傳背景的植物間進(jìn)行基因功能的比較(Burch-Simith et al.，2004)。VIGS已經(jīng)被成功地用來理解多種植物抗病反應(yīng)，例如，煙草NPR1基因介導(dǎo)的煙草花葉病毒抗性反應(yīng)必需基因的鑒定和功能分析(Liu et al.，2002a&b)；NPR1和TGA轉(zhuǎn)錄因子在Pto介導(dǎo)的番茄細(xì)菌性斑點(diǎn)病抗性反應(yīng)中的功能鑒定(Ekengren et al.，2003)；葉霉病誘導(dǎo)番茄快速表達(dá)基因的功能分析(Rowland et al.，2005)。TRV病毒載體介導(dǎo)的VIGS具有其他病毒載體不具有的快速、易操作等優(yōu)點(diǎn)(Senthil-Kumar and Mysore，2014)，另外，TRV介導(dǎo)的VIGS能夠在生長點(diǎn)分生組織中起作用和能夠達(dá)到持久基因沉默的效果(Ratcliffet al.，2001)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種植物抗病必需基因，名稱為ShORR-1，來源于番茄屬番茄(Solanum lycopersicum)，其特征在于其核苷酸序列如以下1)或2)所示：

1)其核苷酸序列為SEQ ID NO.1所示核苷酸序列；

2)在1)限定的核苷酸序列基礎(chǔ)上經(jīng)堿基的缺失、取代、插入或突變而成且具有植物抗病活性的核苷酸序列。

所述基因編碼的蛋白質(zhì)，其氨基酸序列為SEQ ID NO.2。

所述核苷酸序列的重組載體。

所述載體為用于克隆的pMD18-T載體、用于表達(dá)的pSAT6-GFP-N1、pCAMBIA1300、pCAMBIA2300載體和用于VIGS的pYY13載體。

所述核苷酸序列的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌。

所述核苷酸序列在植物組織表達(dá)中的應(yīng)用。

所述植物組織為根、莖、葉、花或種子。

所述植物為單子葉植物或雙子葉植物。

所述單子葉植物為水稻、小麥、高粱及玉米，所述雙子葉植物為番茄、煙草、大豆及土豆。

所述基因或權(quán)利要求2所述蛋白在培育抗病植物中的應(yīng)用，所述抗病為白粉病、晚疫病及黃萎病。

本發(fā)明的技術(shù)效果：首先將ShORR1基因構(gòu)建到TRV介導(dǎo)VIGS的載體pYY13中，獲得重組載體pYY13-ShORR1，將重組載體和空載轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌用于進(jìn)一步的轉(zhuǎn)化，利用農(nóng)桿菌浸潤法對(duì)抗白粉病野生番茄(S.habrochiates G1.1560)葉片進(jìn)行轉(zhuǎn)化；然后對(duì)ShORR1基因沉默和空載對(duì)照植株的葉片接種白粉菌進(jìn)行了感病性和顯微分析。感病性和顯微分析顯示，接種白粉菌7d后，未進(jìn)行ShORR1基因沉默的對(duì)照抗病植株G1.1560表現(xiàn)為抗病，其葉片上接種的白粉菌分生孢子大部分沒有萌芽，而萌發(fā)孢子形成的吸器則引起其侵染葉片表皮細(xì)胞的過敏反應(yīng)(細(xì)胞壞死)，無法從葉片細(xì)胞獲取充足的營養(yǎng)，進(jìn)而菌絲生長受到抑制，無法形成新的分生孢子和完成整個(gè)無性繁殖周期(圖1)。ShORR1基因沉默的抗病植株G1.1560葉片表現(xiàn)為感病，其葉片上接種的白粉菌分生孢子能夠正常萌芽，形成的吸器沒有引起侵染葉片細(xì)胞的過敏反應(yīng)，菌絲正常生長并形成了分生孢子梗和新的分生孢子，能夠完成整個(gè)無性繁殖周期(圖1)，進(jìn)行新一輪的侵染。結(jié)果表明，ShORR1基因是番茄白粉病抗性反應(yīng)的關(guān)鍵基因。

利用TRV介導(dǎo)的VIGS分析ShORR1在番茄黃萎病抗性反應(yīng)中的作用顯示，接種黃萎病致病菌大麗輪枝菌的高抗枯、黃萎病的番茄(S.lycopersicum LA1221)一周后，攜帶pYY13空載農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化和清水接種對(duì)照植株離體葉片未表現(xiàn)出感病癥狀(圖2)；攜帶pYY13-ShORR1重組載體農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化的ShORR1基因沉默植株離體葉片表現(xiàn)出明顯感病癥狀(圖2)。結(jié)果表明，ShORR1基因是番茄黃萎病抗性反應(yīng)的關(guān)鍵基因。

將攜帶ShORR1基因重組載體pYY13-ShORR1、空載以及番茄八氫番茄紅素脫氫酶(PDS)重組TRV-VIGS載體(pYL252)分別轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌，通過農(nóng)桿菌浸潤法將攜帶pYY13-ShORR1農(nóng)桿菌和攜帶pYL252農(nóng)桿菌共同浸潤八周齡本生煙草(Nicotiana benthamiana)葉片中，同時(shí)以清水和攜帶pYL252農(nóng)桿菌浸潤本生煙草葉片作為對(duì)照。接種10～15d后觀察表型變化，待煙草葉片白化后，分別在處理和對(duì)照植株的葉片上接種晚疫病菌致病菌(注：本研究發(fā)現(xiàn)，本生煙對(duì)致病疫霉菌表現(xiàn)極強(qiáng)抗病性)。經(jīng)DAB和臺(tái)盼藍(lán)染色，在顯微鏡下對(duì)接種葉片進(jìn)行觀察，實(shí)驗(yàn)表明，ShORR1基因沉默本生煙草葉片對(duì)致病疫霉菌表現(xiàn)為感病(圖3A-B，箭頭所指為致病疫霉菌絲)，產(chǎn)生了游走孢子與菌絲，而對(duì)照植株葉片表現(xiàn)出過敏反應(yīng)(細(xì)胞壞死)，無游走孢子和菌絲和菌絲產(chǎn)生。結(jié)果表明，ShORR1基因是本生煙晚疫病抗性反應(yīng)的關(guān)鍵基因。

附圖說明

圖1表示VIGS沉默ShORR-1基因的白粉病抗性番茄S.lycopersicum G1.1560接種白粉菌的表型和顯微觀察；A示ShORR-1基因沉默葉片接種白粉菌后表現(xiàn)為感病，紅色箭頭示白粉菌菌落；B示ShORR-1基因沉默后葉片接種白粉菌后形成的新生分子孢子梗；C示對(duì)照植株接種白粉菌表現(xiàn)為抗病；D對(duì)照植株葉片接種白粉菌后引起被侵染葉片的過敏反應(yīng)(細(xì)胞壞死)。

圖2表示VIGS沉默ShORR-1基因的黃萎病抗性番茄(S.lycopersicum LA1221)接種大麗輪枝菌孢子懸液的表型觀察；A示ShORR-1基因沉默植株在大麗輪枝菌孢子懸液中表現(xiàn)為感病，對(duì)照植株表現(xiàn)為抗病，B示ShORR-1基因沉默植株和對(duì)照植株在清水中均表現(xiàn)為抗病，紅色箭頭所指為沉默植株葉片，黑色箭頭所指為對(duì)照植株葉片。

圖3表示VIGS沉默ShORR-1基因的本生煙草接種致病疫霉菌的表型和顯微觀察；A示ShORR-1基因沉默植株葉片接種致病疫霉菌后，表現(xiàn)為感病表型，紅色箭頭示新生菌絲；B示ShORR-1基因沉默植株葉片接種致病疫霉菌后，葉片氣孔中穿出的新生菌絲；C示對(duì)照植株葉片接種致病疫霉菌表現(xiàn)為抗病表型；D示對(duì)照植株葉片接種致病疫霉菌后，表現(xiàn)出過敏反應(yīng)(壞死細(xì)胞)。

圖4表示番茄ShORR-1和PDS基因沉默的半定量RT-PCR結(jié)果；左：對(duì)照番茄植株；右：沉默番茄植株；20、25、30、35表示不同的PCR循環(huán)數(shù)；Actin轉(zhuǎn)錄本為內(nèi)參對(duì)照。

圖5表示ShORR-1在番茄不同組織中的表達(dá)量。

圖6表示ShORR-1在番茄白粉菌侵染番茄不同時(shí)期的表達(dá)量變化。

圖7表示ShORR-1在致病疫霉菌侵染番茄不同時(shí)期的表達(dá)量變化。

圖8表示ShORR-1在大麗輪枝菌侵染番茄不同時(shí)期的表達(dá)量變化。

具體實(shí)施方式

下面通過實(shí)例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步闡述，其目的在于更好理解本發(fā)明內(nèi)容而非限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。

本發(fā)明擬進(jìn)一步對(duì)ShORR-1基因互作的基因及其參與的相關(guān)信號(hào)通路進(jìn)行分析，并分析ShORR-1基因是否具有更廣譜的抗性作用。通過分析該基因在不同病原微生物誘導(dǎo)的番茄效應(yīng)蛋白激活的免疫反應(yīng)(ETI)及病原相關(guān)分子模式激活的免疫反應(yīng)(PTI)中的作用，以期豐富植物與病原微生物互作理論，并為番茄廣譜抗病品種培育提供依據(jù)和基因來源。

實(shí)施例

實(shí)施例一 VIGS實(shí)驗(yàn)

1材料與方法

1.1 植物材料、病原菌及其培養(yǎng)方法

供試的番茄品種包括番茄栽培種(S.lycopersicum)：Moneymaker(MM)、Microtom(MT)、LA1221；番茄野生種：S.habrochaites G1.1560；本生煙草：N.benthamiana。白粉菌來自河南省周口師范學(xué)院保存的感病番茄植株MM葉片，保存于氣候箱的MM植株上，溫度：20±2℃，相對(duì)濕度(RH)：75％，光/暗周期：16h/8h。致病疫霉菌T124生理小種由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所李君明研究員饋贈(zèng)，在黑麥培養(yǎng)基上擴(kuò)繁生長，溫度：20±2℃。大麗輪枝菌由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所植物保護(hù)研究室朱荷琴研究員惠贈(zèng)，在察氏培養(yǎng)基上擴(kuò)繁生長，溫度：25±2℃。所有的植株生長在條件適宜的氣候室中，溫度：20±2℃，光/暗周期：16h/8h，光強(qiáng)度：150μmol/m²·s。

1.2 所用載體

VIGS實(shí)驗(yàn)所用沉默載體為煙草脆裂病毒(TRV)的RNA1和RNA2cDNA的雙元表達(dá)載體，分別為TRV1(pYL192)和TRV2(pYY13)。TRV1載體包括編碼RNA依賴的RNA聚合酶、運(yùn)動(dòng)蛋白和16K蛋白的基因，是VIGS體系的輔助病毒載體。TRV2-LIC載體包括衣殼蛋白(Cp)基因、多克隆位點(diǎn)(MCS)等，用于目的基因的構(gòu)建。pYY13衍生于載體pYL170(Burch-Smith et al.，2006)。為了高通量地克隆目的片段于TRV2-VIGS載體中，采用了一個(gè)改良的不依賴連接的克隆(ligation independent cloning，LIC)方法，將兩個(gè)LIC接頭加到pYL170上，形成載體pYY12，接頭包含15bp的序列和中間的Pst I限制性酶切位點(diǎn)。接著通過Pst I酶切，在兩個(gè)LIC位點(diǎn)間插入了一個(gè)ccdB基因，形成載體pYY13(圖1)。ccdB是一個(gè)致死基因，可以快速、準(zhǔn)確地篩選出重組載體。

1.3 RNA的提取、cDNA合成和RT-PCR擴(kuò)增目的基因

番茄總RNA的提取方法按照總RNA提取試劑盒操作說明書進(jìn)行(TaKaRa)。以1μg的RNA做模板，按照cDNA合成試劑盒(TaKaRa)操作說明合成第一鏈cDNA。八氫番茄紅素脫氫酶基因(Phytoene desaturase，PDS)是檢驗(yàn)VIGS載體系統(tǒng)是否有效的報(bào)告基因。根據(jù)番茄PDS基因序列(Gene Bank登錄號(hào)M88683)，選取位于PDS基因中部的序列為目標(biāo)片段設(shè)計(jì)上游和下游引物。采用電子克隆的方法，對(duì)番茄白粉菌抗病基因候選序列進(jìn)行cDNA步移，根據(jù)步移后的序列，設(shè)計(jì)帶有TRV2-LIC載體接頭的引物。上游引物：5’-CGACGACAAGACCCT-基因特異序列-3’，下游引物：5’-GAGGAGAAGAGCCCT-基因特異序列-3’，下劃線為LIC接頭序列，基因特異性引物序列見表1-1。RT-PCR反應(yīng)體系(20μL)：10×PCR反應(yīng)緩沖液2μL，dNTP混合物(各2.5mmol/L)1.6μL，Mg²⁺(25mmol/L)1.6μL，引物(10pm/μL)各1μL，Taq聚合酶(5U/μL)0.2μL，模板cDNA 2μL，ddH₂O10.6μL。PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5min；94℃變性30s，58℃退火45s，72℃延伸1min，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min，4℃保存。

表1 RT-PCR擴(kuò)增目的基因的引物序列

Table1 The sequences of primers used in RT-PCR of objective genes

1.4 TRV2-LIC重組載體的構(gòu)建

目的基因的PCR產(chǎn)物，按照寶生物(Takara)Agarose Gel DNA Purification Kit試劑盒操作進(jìn)行純化。限制性內(nèi)切酶Pst I單酶切TRV2-LIC質(zhì)粒后，再用T₄ DNA聚合酶酶切目的基因和TRV-LIC載體。T₄ DNA聚合酶酶切目的基因反應(yīng)體系：目的基因6μL，T₄ DNA聚合酶(5U/μL)0.5μL，dATP(2.5mmol/L)0.5μL，BSA(0.1％)1μL，10×buffer 1μL，ddH₂O 1μL。T₄DNA聚合酶酶切TRV2-LIC載體反應(yīng)體系：質(zhì)粒單酶切產(chǎn)物6μL，T₄ DNA聚合酶(5U/μL)0.5μL，dTTP(2.5mmol/L)0.5μL，BSA(0.1％)1μL，10×buffer 1μL，ddH₂O 1μL。最后將酶切后的質(zhì)粒和目的基因進(jìn)行LIC連接，反應(yīng)體系：質(zhì)粒1μL，目的基因6μL；反應(yīng)條件：65℃，2min，然后22℃，10min。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)E.coli DH5α，涂布LB平板(50mg/L Kana)培養(yǎng)，37℃過夜倒置培養(yǎng)形成單菌落。

1.5 TRV2-LIC重組載體的鑒定

TRV2-LIC空質(zhì)粒攜帶一個(gè)ccdB基因，可編碼一種干擾大腸桿菌DNA促旋酶的蛋白質(zhì)，對(duì)大腸桿菌有致死效應(yīng)，如果載體發(fā)生自連，轉(zhuǎn)化這些載體的大腸桿菌宿主細(xì)胞就會(huì)死亡，只有當(dāng)外源DNA片段與載體連接后，ccdB基因的表達(dá)受到阻斷，重組質(zhì)粒才能在大腸桿菌中存活，因此有利于高效獲得陽性克隆。挑取TRV2-LIC重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化E.coli DH5α后形成的單克隆，提取質(zhì)粒進(jìn)行PCR鑒定。陽性質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至感受態(tài)農(nóng)桿菌GV3101，涂布LB平板(50mg/L Kana、50mg/L Rif)培養(yǎng)，28℃倒置培養(yǎng)2d，挑選陽性克隆轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101。

1.6 農(nóng)桿菌侵染和植株生長

以四葉期番茄G1.1560、LA1221和六葉期N.benthamiana為實(shí)驗(yàn)材料。TRV1、TRV2-LIC(空載)、TRV2-LIC(重組質(zhì)粒)通過凍融法轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101。分別挑取農(nóng)桿菌(TRV1和TRV2-LIC)單克隆于28℃培養(yǎng)過夜，各取10mL培養(yǎng)液，3000rpm，20min，離心收集菌體沉淀，分別重懸于緩沖液(10μmol/L MES，10μmol/L MgCl₂，200μmol/L乙酰丁香酮)內(nèi)，OD₆₀₀＝1.0，將含有TRV1的農(nóng)桿菌GV3101與含有TRV2-LIC(重組質(zhì)粒)農(nóng)桿菌GV3101 1∶1比例混勻，室溫100rpm低速振蕩2h。用去掉針頭的一次性2mL注射器吸取活化的菌液，采用壓迫法注射接種于番茄真葉背面(Mandar et al.，2008)。以TRV2-LIC(空載)為陰性對(duì)照。侵染番茄于20℃黑暗條件下培養(yǎng)過夜，之后在溫度為20±2℃，光/暗周期為16h/8h的氣候室中培養(yǎng)。農(nóng)桿菌菌液注射G1.1560 10d后，將新鮮白粉菌的分生孢子從嚴(yán)重感染的葉片上沖洗下來，用水稀釋為2×10⁴孢子/mL的濃度后用于接種。一周后觀察番茄G1.1560的抗病表型的變化。每種沉默載體接種10株番茄幼苗，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

農(nóng)桿菌感染N.benthamiana 10d后，在超凈工作臺(tái)中用無菌竹簽挑取生長狀態(tài)良好的致病疫霉菌菌絲分別涂在葉主脈、葉尖和葉邊緣等處，挑取菌絲量保持一致，一周后觀察N.benthamiana的抗病表型的變化。每種沉默載體接種10株N.benthamiana幼苗，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

農(nóng)桿菌感染番茄LA1221 10d后，將新長出的LA1221新枝條分別侵潤在10⁵孢子/mL大麗輪枝菌的孢子懸液和清水中，一周后觀察番茄G1.1560的抗病表型的變化。每種沉默載體接種10株番茄LA1221幼苗，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.7 組織顯微形態(tài)學(xué)分析

葉片組織H₂O₂的檢測(cè)采用聯(lián)苯胺(3，3′-diaminobenzidine tetrahydrochloride，DAB)染色檢測(cè)法，白粉菌采用臺(tái)盼蘭染色法(Huang et al.，1998)。具體步驟如下：

(1)DAB染色：取帶柄的新鮮葉片，將其葉柄剪成斜面，插入1mg/mL的DAB(pH 3.8)溶液中，溶液浸過葉柄的斜面即可。置于光照下靜置8h，肉眼可觀察到棕紅色的DAB溶液順著葉脈到達(dá)葉片的頂端。反應(yīng)時(shí)間可根據(jù)葉片的大小及具體條件來調(diào)整。

(2)固定：將DAB染色后葉片沿著中間的主葉脈剪切后，再切成1.5cm×1.5cm的小塊，直接浸沒于固定液中(無水乙醇∶冰醋酸＝3∶1)，至脫去顏色為止，通常過夜處理。

(3)臺(tái)盼蘭染色：葉片組織轉(zhuǎn)入含有0.3％的臺(tái)盼蘭溶液中，將試管蓋子輕輕旋開，置于加熱的水浴鍋中(70℃-80℃)，使染液沸騰1min。葉片組織于染液中過夜。

(4)脫色：用2.5g/mL的水合三氯乙醛沖洗被染色的葉片組織3次，樣品可以于水合三氯乙醛中放置數(shù)月。

1.8 半定量RT-PCR分析

提取對(duì)照植株和沉默植株的總RNA。以1μg的RNA做模板，按照cDNA合成試劑盒(TaKaRa)操作說明合成第一鏈cDNA。采用半定量RT-PCR方法檢測(cè)沉默植株中基因轉(zhuǎn)錄本的沉默效果。番茄Actin基因(GenBank登錄號(hào)U60480)為內(nèi)參基因，半定量RT-PCR引物序列見表4-2。PCR反應(yīng)體系(20μL)：10×PCR反應(yīng)緩沖液2μL，dNTP混合物(各2.5mmol/L)1.6μL，Mg²⁺(25mmol/L)1.6μL，引物(10pm/μL)各1μL，Taq聚合酶(5U/μL)0.2μL，模板cDNA 2μL，ddH₂O 10.6μL。PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5min；94℃變性30s，58℃退火45s，72℃延伸1min，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min。為了避免PCR產(chǎn)物量到達(dá)平臺(tái)期對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響，進(jìn)行了20、25、30和35不同循環(huán)數(shù)的擴(kuò)增，1％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。

表2 半定量RT-PCR的引物序列

Table2 The sequences of primers used in semi-quantitative RT-PCR

1.9 基因全長擴(kuò)增

依據(jù)番茄全基因組序列進(jìn)行基因步移，設(shè)計(jì)包含完整讀碼框的引物，RT-PCR擴(kuò)增G1.1560的ShORR-1序列的基因全長并測(cè)序。擴(kuò)增ShORR-1對(duì)應(yīng)基因上游引物5’-ATTACTCTCTTCATAAACTCATTTCCA-3’，下游引物5’-TCTGCTGCTATTTCTGCCACT-3’。PCR反應(yīng)體系(20μL)：10×PCR反應(yīng)緩沖液2μL，dNTP混合物(各2.5mmol/L)1.6μL，Mg²⁺(25mmol/L)1.6μL，引物(10pm/μL)各1μL，pfu高保真酶(5U/μL)0.2μL，模板cDNA 2μL，ddH₂O 10.6μL。PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5min；94℃變性30s，58℃退火45s，72℃延伸1min，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物純化后克隆至pMD18-T載體上，轉(zhuǎn)化至E.coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，質(zhì)粒PCR鑒定陽性菌落后，交由南京金斯瑞生物科技有限公司測(cè)序。

1.10 ShORR-1基因空間表達(dá)及接種不同病原物表達(dá)量分析

為了分析ShORR-1基因在不同組織中表達(dá)量及病原菌侵染后表達(dá)量的變化，取MT番茄的根、莖、葉、花、綠色果實(shí)和紅色果實(shí)，提取RNA，反轉(zhuǎn)錄后分析ShORR-1的表達(dá)量。同時(shí)取約4w齡MT番茄植株，分別采用對(duì)接法接種番茄白粉菌和致病疫霉菌于番茄葉片，灌根法接種大麗輪枝菌于MT番茄的根部，在不同的時(shí)間點(diǎn)取樣分析ShORR-1基因的表達(dá)量變化。實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)體系：10μL 2×SYBR Premix Ex Taq，0.4μL PCR Forward Primer，0.4μL PCR Reverse Primer，2.0μL DNA模板，7.2μL ddH₂O；反應(yīng)條件為：預(yù)變性95℃，10sec；95℃，5sec；58℃，30sec，該反應(yīng)體系共40個(gè)循環(huán)，在BIO-RAD CFX96^TM Real-time System中分析基因的表達(dá)量，用相對(duì)定量2^-ΔΔCt法對(duì)表達(dá)量進(jìn)行相對(duì)定量分析，以番茄Actin為內(nèi)參基因。

表3 實(shí)時(shí)定量qRT-PCR的引物序列

Table3 The sequences of primers used in real-time RT-PCR

實(shí)施例二 ShORR-1基因VIGS表型觀察

2.1 ShORR-1基因的克隆

以野生抗病番茄G1.1560的cDNA為模板克隆了510bp的番茄抗白粉病候選ShORR-1基因序列，由于來源于測(cè)序的DE-TDF的序列較短，采用生物信息學(xué)的方法，根據(jù)番茄全基因組序列進(jìn)行基因步移后，得到與其同源的序列，Primer5軟件設(shè)計(jì)引物。

2.2 TRV2-LIC重組載體的構(gòu)建與鑒定

RT-PCR擴(kuò)增得到的番茄白粉病抗性反應(yīng)候選基因采用本章方法1.4與TRV2-LIC載體連接，轉(zhuǎn)化E.coli DH5α獲得陽性克隆，陽性質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至農(nóng)桿菌GV3101，通過質(zhì)粒PCR、測(cè)序成功篩選出含有TRV2-LIC重組載體的農(nóng)桿菌菌株。

2.3 ShORR-1基因VIGS表型觀察

2.3.1 白粉菌抗性分析

為了分析ShORR-1基因沉默是如何影響G1.1560植株對(duì)O.neolycopersici的抗病性，對(duì)ShORR-1基因沉默植株和對(duì)照植株進(jìn)行組織顯微分析，病菌染色采用臺(tái)盼蘭染色法。感病性和顯微分析顯示，接種白粉菌7d后，未進(jìn)行ShORR-1基因沉默的對(duì)照抗病植株G1.1560表現(xiàn)為抗病，其葉片上接種的白粉菌分生孢子大部分沒有萌芽，而萌發(fā)孢子形成的吸器則引起其侵染葉片表皮細(xì)胞的過敏反應(yīng)(細(xì)胞壞死)，無法從葉片細(xì)胞獲取充足的營養(yǎng)，進(jìn)而菌絲生長受到抑制，無法形成新的分生孢子和完成整個(gè)無性繁殖周期(圖1C，D)。ShORR1基因沉默的抗病植株G1.1560葉片表現(xiàn)為感病，其葉片上接種的白粉菌分生孢子能夠正常萌芽，形成的吸器沒有引起侵染葉片細(xì)胞的過敏反應(yīng)，菌絲正常生長并形成了分生孢子梗和新的分生孢子，能夠完成整個(gè)無性繁殖周期(圖1A，B)，進(jìn)行新一輪的侵染。結(jié)果表明，ShORR1基因是番茄白粉病抗性反應(yīng)的關(guān)鍵基因。

2.3.2 大麗輪枝菌抗性分析

利用TRV介導(dǎo)的VIGS分析ShORR1在番茄黃萎病抗性反應(yīng)中的作用顯示，接種黃萎病致病菌大麗輪枝菌的高抗枯、黃萎病的番茄(S.lycopersicum LA1221)一周后，攜帶pYY13空載農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化和清水接種對(duì)照植株離體葉片未表現(xiàn)出感病癥狀(圖2)；攜帶pYY13-ShORR1重組載體農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化的ShORR1基因沉默植株離體葉片表現(xiàn)出明顯感病癥狀(圖2)。結(jié)果表明，ShORR1基因是番茄黃萎病抗性反應(yīng)的關(guān)鍵基因。

2.3.3 致病疫霉菌抗性分析

對(duì)ShORR-1基因沉默植株和對(duì)照植株進(jìn)行感病性和顯微觀察分析，實(shí)驗(yàn)表明，ShORR1基因沉默的本生煙草葉片對(duì)致病疫霉菌表現(xiàn)為感病(圖3A-B，箭頭所指為致病疫霉菌絲)，產(chǎn)生了游走孢子與菌絲，而對(duì)照植株葉片表現(xiàn)出過敏反應(yīng)(細(xì)胞壞死)，無游走孢子和菌絲和菌絲產(chǎn)生。結(jié)果表明，ShORR1基因是本生煙晚疫病抗性反應(yīng)的關(guān)鍵基因。2.4 VIGS沉默后RT-PCR檢測(cè)

采用半定量RT-PCR的方法在分子水平檢測(cè)了TRV2-LIC-PDS、TRV2-LIC-ShORR1的沉默后的轉(zhuǎn)錄本水平，以合成的cDNA為模板對(duì)目的基因片段和Actin內(nèi)參基因分別進(jìn)行20、25、30和35個(gè)循環(huán)擴(kuò)增。電泳檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，PDS、ShORR1基因沉默植株葉片中表達(dá)水平明顯低于對(duì)照，約低于對(duì)照的60％(圖4)。

2.4 ShORR-1序列對(duì)應(yīng)基因的全長

T載體測(cè)序法測(cè)得ShORR-1序列對(duì)應(yīng)基因的全長序列為974bp，其中包含完整讀碼框序列長度為807bp，序列如下SEQ ID NO.1；

采用NCBI ORF-finder預(yù)測(cè)其編碼蛋白質(zhì)為268個(gè)氨基酸，序列如下SEQ ID NO.2

2.5 ShORR-1基因的空間表達(dá)分析及接種不同病原物分析

取MT番茄的根、莖、葉、花、綠色果實(shí)和紅色果實(shí)，對(duì)ShORR-1的表達(dá)量分析發(fā)現(xiàn)，其在葉中的表達(dá)量明顯高于其它組織(圖5)，推測(cè)ShORR-1主要的葉中表達(dá)。接種三種不同類型的真菌病原菌，在不同的時(shí)間點(diǎn)取樣分析，結(jié)果表明ShORR-1表達(dá)量在白粉菌侵染12h后達(dá)到一個(gè)高峰，在72h后達(dá)到最高峰(圖6)；與白粉菌表達(dá)模式類似，ShORR-1在致病疫霉菌侵染3d后出現(xiàn)第一個(gè)表達(dá)高峰，在侵染14d后表達(dá)量達(dá)到最高(圖7)；而ShORR-1在大麗輪枝菌接種60h之后表達(dá)量達(dá)到最高，之后下降(圖8)。由此推測(cè)，ShORR-1在不同病原菌與番茄的互作中均起著重要的作用。

根據(jù)序列分析，ShORR-1為一個(gè)功能未知的新基因，尚沒有與其同源的任何功能已知的基因被發(fā)現(xiàn)。

以上實(shí)施例僅用以說明，而非限制本發(fā)明的技術(shù)方案，盡管參照上述實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)說明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解：依然可以對(duì)本發(fā)明進(jìn)行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明的精神和范圍的任何修改或局部替換，其均應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的權(quán)利要求范圍當(dāng)中。