本發(fā)明涉及材料工程技術(shù)領(lǐng)域，具體地說(shuō)，涉及一種交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉凝膠及其制備方法。
背景技術(shù)：
透明質(zhì)酸(Hyaluronic acid，HA)又名玻尿酸，是粘多糖中最具有代表性的一種，廣泛分布于人體各部位，以其獨(dú)特的分子結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)在機(jī)體內(nèi)顯示出多種重要的生理功能，如潤(rùn)滑關(guān)節(jié)，調(diào)節(jié)血管壁的通透性，調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)，水電解質(zhì)擴(kuò)散及運(yùn)轉(zhuǎn)，促進(jìn)創(chuàng)傷愈合等。此外，透明質(zhì)酸具有特殊的鎖水作用，是目前發(fā)現(xiàn)的自然界中保濕性最好的物質(zhì)，被稱(chēng)為理想的天然保濕因子(Natural moisturizing factor，NMF)，例如2％的純透明質(zhì)酸水溶液能牢固地保持98％水分。
人類(lèi)皮膚中含有大量的透明質(zhì)酸，用于改善皮膚營(yíng)養(yǎng)代謝，使皮膚柔嫩、光滑、富有彈性。但隨著年齡的增長(zhǎng)，皮膚中的透明質(zhì)酸含量會(huì)逐漸降低，導(dǎo)致皮膚褶皺，萎縮，此時(shí)需注射透明質(zhì)酸以起到填充美容的作用。但由于天然中提取的透明質(zhì)酸注射于人體內(nèi)時(shí)，降解非常迅速，約24小時(shí)之內(nèi)完成降解，一般將透明質(zhì)酸鈉交聯(lián)后注射于皮下，以延長(zhǎng)降解時(shí)間，降解時(shí)間與交聯(lián)度密切相關(guān)，因此，對(duì)透明質(zhì)酸進(jìn)行交聯(lián)改性以延長(zhǎng)其在體內(nèi)的降解時(shí)間具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。
目前常用的交聯(lián)方法是將透明質(zhì)酸鈉和交聯(lián)劑，如1,4-丁二醇二縮水甘油醚(1,4-butanediol diglycidyl ether,BDDE)、1,2,7,8-二環(huán)氧辛烷(1,2,7,8-diepoxyoctane,DEO)、二乙烯基砜(divinyl sulfone,DVS)等，在堿性條件交聯(lián)而得，區(qū)別主要集中于透明質(zhì)酸鈉與交聯(lián)劑的比例以及交聯(lián)反應(yīng)的溫度，通過(guò)這些條件一定程度上控制了交聯(lián)度，從而控制降解時(shí)間。
由于1,4-丁二醇二縮水甘油醚(BDDE)毒性相對(duì)較小，且分子中含有烷氧基鍵，聚合后烷氧基鍵聚合后可自由旋轉(zhuǎn)而使材料柔軟，特別適用于軟組織的填充，所以目前市面上絕大多數(shù)產(chǎn)品都采用1,4-丁二醇二縮水甘油醚(BDDE)作為交聯(lián)劑交聯(lián)而得。
透明質(zhì)酸交聯(lián)度的表征主要有總交聯(lián)度，包括懸掛修飾度和交聯(lián)修飾度，懸掛修飾度主要影響組織毒性的大小，而交聯(lián)修飾的透明質(zhì)酸基本無(wú)組織毒性，主要影響體內(nèi)降解時(shí)間。故理想的交聯(lián)透明質(zhì)酸是交聯(lián)修飾度占比越大而懸掛修飾度占比越小越好，因此提高交聯(lián)修飾度降低懸掛修飾度對(duì)于是交聯(lián)透明質(zhì)酸具有非常重要的意義，然而現(xiàn)有的交聯(lián)劑技術(shù)無(wú)法控制懸掛修飾度和交聯(lián)修飾度的比例，目前常見(jiàn)的交聯(lián)劑術(shù)只能通過(guò)控制總修飾度來(lái)平衡組織毒性和降解時(shí)間。
例如，傳統(tǒng)交聯(lián)技術(shù)中，懸掛修飾度與交聯(lián)修飾度基本維持在9:1的比例，由于懸掛修飾所占比例大，因此會(huì)出現(xiàn)明顯的組織毒性，此條件下降解時(shí)間一般維持在6～8個(gè)月左右，若能提高交聯(lián)修飾度的比例而降低懸掛修飾度的比例，可在保證無(wú)組織毒性的情況下有效延長(zhǎng)材料的降解時(shí)間。
目前的透明質(zhì)酸鈉交聯(lián)相關(guān)技術(shù)中，僅限于總交聯(lián)度的控制，暫未涉及到提高交聯(lián)修飾度而抑制懸掛修飾度這種方式，如CN101036808B公開(kāi)了一種交聯(lián)HA凝膠制劑的制備工藝，將二乙烯基砜與HA分子的羥基發(fā)生反應(yīng)，形成醚鍵，其步驟為：HA原料加入堿試劑中，攪拌，使其徹底溶解，將堿性的HA溶液與二乙烯基砜混合，形成交聯(lián)HA凝塊；反應(yīng)液中加入富含羥基的物質(zhì)，將交聯(lián)HA凝膠塊取出并放入電動(dòng)攪拌機(jī)中攪拌，交聯(lián)HA塊狀凝膠變成微粒狀凝膠。CN101056891B公開(kāi)了可以簡(jiǎn)便地制備交聯(lián)劑含量少且黏彈性好的交聯(lián)HA凝膠的方法。其是在酸性或堿性條件下將含有透明質(zhì)酸10W/V％以上、交聯(lián)劑和水的混合物攪拌混合。該方法主要靠增加HA的濃度的方式，減少交聯(lián)劑用量，未綜合考慮其他反應(yīng)物質(zhì)的影響。CN101878230B公開(kāi)了一種乳液中的交聯(lián)透明質(zhì)酸的方法，其步驟為：(a)提供包含透明質(zhì)酸或其鹽的堿性水溶液；(b)在有機(jī)相或油相中，從步驟(a)的混合溶液中形成具有所期望尺寸的微滴，以形成有機(jī)物包水或油包水(W/O)的乳液；向乳液中加入包含交聯(lián)劑的溶液，由此透明質(zhì)酸與所述交聯(lián)劑發(fā)生反應(yīng)以提供交聯(lián)的透明質(zhì)酸微珠；并且(d)任選地加工步驟(c)中所得的交聯(lián)的透明質(zhì)酸微珠的分散體。此方法反應(yīng)體系中需要添加有機(jī)試劑，可能會(huì)帶來(lái)有機(jī)試劑殘留等風(fēng)險(xiǎn)。WO97/04012提供了一種多糖(包括透明質(zhì)酸)凝膠組合物的制備方法，包括：形成水溶性可交聯(lián)的多糖水溶液；在多官能交聯(lián)劑的存在下開(kāi)始交聯(lián)；在凝膠反應(yīng)發(fā)生前，立體阻礙交聯(lián)反應(yīng)防止其終止(例如通過(guò)稀釋溶液)；向所述活化的多糖中再引入未立體阻礙的條件(例如通過(guò)蒸發(fā)溶液)，繼續(xù)交聯(lián)反應(yīng)，形成黏彈凝膠。WO2006/0194758A1公開(kāi)了將高、低分子量的透明質(zhì)酸混合反應(yīng)，產(chǎn)生一種單相的具良好機(jī)械性質(zhì)的膠體，改良了可注射性，但此方法在50℃交聯(lián)反應(yīng)結(jié)束后，未經(jīng)透析純化前殘留大量未反應(yīng)的交聯(lián)劑，其濃度超過(guò)300ppm以上，之后通過(guò)透析法以純化試圖去除交聯(lián)劑，但其效果不佳，難以有效去除未反應(yīng)的交聯(lián)劑。CN101925348A提出了一種可生物降解的粘性水凝膠，制備方法是將X種具有相同或不同交聯(lián)度的聚合物均質(zhì)混合。此方法僅是將X種聚合物進(jìn)行物理混合，聚合物之間沒(méi)有交聯(lián)鍵，不能形成致密的交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。CN100582146C提到一種的生物相容性交聯(lián)凝膠，通過(guò)添加一定量的交聯(lián)劑，將預(yù)訂量的至少一種聚合物在溶液中交聯(lián)，然后加入另外量的分子量大于500kDa的液態(tài)聚合物，使液態(tài)聚合物的總濃度降低，并交聯(lián)。
以上方法通過(guò)控制總修飾度來(lái)調(diào)節(jié)組織毒性和降解時(shí)間，均屬于傳統(tǒng)交聯(lián)技術(shù)范疇，無(wú)法有效提高交聯(lián)修飾度在總交聯(lián)度中的占比。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的是提供一種交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉凝膠及其制備方法。
本發(fā)明基于以下構(gòu)思：在透明質(zhì)酸鈉交聯(lián)技術(shù)中，總交聯(lián)度等于懸掛修飾度和交聯(lián)修飾度的總和，其中，交聯(lián)修飾度的大小直接影響著材料在體內(nèi)的降解時(shí)間，交聯(lián)修飾度越大，其在體內(nèi)的停留時(shí)間越長(zhǎng)；懸掛修飾度的大小直接影響著材料的組織毒性，懸掛修飾度越大，安全性越差。因此理想的交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉為懸掛修飾度越小，交聯(lián)修飾度越大越好。傳統(tǒng)的交聯(lián)技術(shù)中，總修飾度可以通過(guò)控制實(shí)驗(yàn)條件有所提高，但交聯(lián)修飾度所占總交聯(lián)度的比例無(wú)法得到有效提高，僅約10％。本發(fā)明引入超聲交聯(lián)技術(shù)，有效提高交聯(lián)透明質(zhì)酸中的交聯(lián)修飾度比例，降低懸掛修飾度比例，延長(zhǎng)材料的體內(nèi)降解時(shí)間。
超聲波在介質(zhì)中傳播時(shí)，與介質(zhì)相互作用時(shí)，使介質(zhì)發(fā)生物理的和化學(xué)的變化，從而產(chǎn)生一系列特殊效應(yīng)，主要是因?yàn)槌暡ㄔ诮橘|(zhì)中的空化作用，即存在于液體中微小氣泡在超聲場(chǎng)中被激活，表現(xiàn)為泡核的形成，震蕩，生長(zhǎng)，收縮乃至崩潰等一系列動(dòng)力學(xué)過(guò)程，及其引發(fā)的物理和化學(xué)效應(yīng)。氣泡在幾微秒之內(nèi)突然崩潰，氣泡破裂類(lèi)似于一個(gè)小小的爆炸過(guò)程，產(chǎn)生極其短暫的高能環(huán)境，由此產(chǎn)生局部的高溫高壓。同時(shí)這種局部的高溫高壓存在時(shí)間非常短，僅幾微秒，所以溫度的變化率非常大，這就為一般條件下難以實(shí)現(xiàn)或者不可能實(shí)現(xiàn)的化學(xué)反應(yīng)提供了一種非常特殊的環(huán)境。高溫條件有利于反應(yīng)物的裂解和自由基的形成，提高了化學(xué)反應(yīng)速率。高壓有利于氣相中的反應(yīng)；另一方面，當(dāng)氣泡破裂產(chǎn)生高壓的同時(shí)，還伴隨著強(qiáng)烈的沖擊波，其速度可達(dá)100m/s的微射流，對(duì)于固體參加的非均相體系起到很好的沖擊作用，導(dǎo)致分子間強(qiáng)烈的相互碰撞和聚集，對(duì)固體表面的形態(tài)、表面組成產(chǎn)生極為重要的作用。因此空化作用可以看做聚集聲能的一種形式，能夠在微觀尺度模擬反應(yīng)器內(nèi)的高溫高壓，促進(jìn)反應(yīng)的進(jìn)行。
高分子量的透明質(zhì)酸鈉分子鏈較長(zhǎng)，普通機(jī)械攪拌使分子的運(yùn)動(dòng)受到局限，并使其沿一個(gè)方向單一運(yùn)動(dòng)，導(dǎo)致其與交聯(lián)劑的碰撞機(jī)會(huì)減少，交聯(lián)劑一端連接于透明質(zhì)酸鈉分子鏈上后，另一端由于位阻作用，在分子碰撞機(jī)會(huì)減少的情況下，很難連接到另一分子鏈上而在堿液中分解，使其較大概率的成為懸掛修飾。
由于超聲的空化作用不斷產(chǎn)生微小氣泡，氣泡在不斷的形成和破裂過(guò)程中產(chǎn)生瞬間的高能高壓，并對(duì)分子運(yùn)動(dòng)起到?jīng)_擊，改變分子運(yùn)動(dòng)軌跡，從而增加透明質(zhì)酸鈉分子的運(yùn)動(dòng)程度，增加了分子間的碰撞機(jī)會(huì)，使的交聯(lián)修飾度有所增加，另一方面，反應(yīng)位點(diǎn)瞬間產(chǎn)生的高能高壓能克服位阻效應(yīng)，而使交聯(lián)劑和大分子的反應(yīng)點(diǎn)瞬間完成反應(yīng)。故超聲應(yīng)用于大分子量透明質(zhì)酸鈉的交聯(lián)，可提高其交聯(lián)修飾度，并通過(guò)控制超聲頻率的大小來(lái)調(diào)節(jié)交聯(lián)修飾度的大小。
為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明提供的一種制備交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉凝膠的方法，在(室溫)超聲條件下，向透明質(zhì)酸鈉的堿性水溶液中滴加交聯(lián)劑進(jìn)行交聯(lián)反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后，用酸調(diào)節(jié)體系pH值7.1-7.5，平衡攪拌1-2h，然后用有機(jī)溶劑沉淀，即得交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉凝膠。
本發(fā)明采用的超聲條件為：溫度15～30℃，超聲頻率25-45KHz，超聲時(shí)間10-50min。
所述透明質(zhì)酸鈉的堿性水溶液制備如下：將1.0克透明質(zhì)酸鈉溶于1％的堿性水溶液中，即得；其中，所述堿性水溶液包括氫氧化鈉、氫氧化鉀、季銨堿水溶液中的至少一種。
所述交聯(lián)劑包括1,4-丁二醇二縮水甘油醚、1,2,7,8-二環(huán)氧辛烷、二乙烯基砜等中的至少一種；使用時(shí)將交聯(lián)劑用水稀釋150～1000倍。稀釋后的交聯(lián)劑在10min內(nèi)滴加完畢。
前述的方法，透明質(zhì)酸鈉與交聯(lián)劑的質(zhì)量比為5-50:1。
前述方法中所用酸包括有機(jī)酸或無(wú)機(jī)酸，優(yōu)選稀鹽酸，更優(yōu)選0.005M的鹽酸溶液。
前述方法中所用有機(jī)溶劑包括乙醇、甲醇、異丙醇、乙醚或丙酮等中的至少一種；優(yōu)選無(wú)水乙醇。
前述的方法，按1.0克透明質(zhì)酸鈉加入100mL有機(jī)溶劑的用量，進(jìn)行沉淀。
在本發(fā)明的一個(gè)有效實(shí)施方式中，交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉凝膠的制備方法如下：
(1)取一定量的透明質(zhì)酸鈉溶于堿性溶液中(氫氧化鈉、氫氧化鉀、季銨堿等溶液)室溫下攪拌至完全溶解。
(2)取一定量的交聯(lián)劑(如BDDE、DEO、DVS等)按一定比例稀釋后保存?zhèn)溆谩?/p>
(3)將反應(yīng)體系置于一定功率的超聲環(huán)境中進(jìn)行反應(yīng)，緩慢將稀釋后的交聯(lián)劑滴加到透明質(zhì)酸的氫氧化鈉溶液中反應(yīng)一段時(shí)間。
(4)將反應(yīng)后體系用稀鹽酸溶液調(diào)節(jié)pH至7.1～7.5之間，平衡1～2小時(shí)，然后用95％的乙醇進(jìn)行沉淀得塊狀固體，經(jīng)后處理加工(冷凍干燥工藝，在-50℃壓力100Pa條件下冷凍干燥12小時(shí))，即得到交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉凝膠成品。
本發(fā)明進(jìn)一步提供由上述方法制備的交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉凝膠。
所述交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉凝膠的總修飾度為2％～50％，優(yōu)選2％～20％，其中交聯(lián)修飾度占總修飾度的50％-70％。
本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)：
(一)有效解決了傳統(tǒng)交聯(lián)技術(shù)中交聯(lián)修飾度占比低(約10％)的不足，將其提高至60％左右，且占比大小可控。
(二)解決了傳統(tǒng)交聯(lián)技中無(wú)法解決的交聯(lián)度和安全性之間的矛盾；
(三)提高交聯(lián)修飾度，降低懸掛修飾度，不僅可以延長(zhǎng)材料在體內(nèi)的降解時(shí)間，有效降低組織毒性，而且安全性有很大程度的提高。
(四)采用超聲工藝交聯(lián)，反應(yīng)時(shí)間短，成本低，效率高。
具體實(shí)施方式
以下實(shí)施例用于說(shuō)明本發(fā)明，但不用來(lái)限制本發(fā)明的范圍。若未特別指明，實(shí)施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段，所用原料均為市售商品。1,4-丁二醇二縮水甘油醚(BDDE，純度95％)購(gòu)自百靈威科技有限公司，透明質(zhì)酸鈉購(gòu)自山東華熙福瑞達(dá)生物科技有限公司?？纱帕嚢杵鳎?gòu)自上海越眾儀器有限公司，型號(hào)ZNCL-500。
本發(fā)明中涉及到的百分號(hào)“％”，若未特別說(shuō)明，是指質(zhì)量百分比；但溶液的百分比，除另有規(guī)定外，是指100mL溶液中含有溶質(zhì)的克數(shù)。
以下實(shí)施例中修飾度的測(cè)試方法如下：取樣品各0.1g，加入到5mL300U/mL的HAase-B酶(購(gòu)自上海第一生化藥業(yè)有限公司)解液中，晃勻，于42℃水浴中孵化24小時(shí)。然后將酶解液煮沸5分鐘，25000r/min轉(zhuǎn)速下離心除酶，0.22μm濾膜過(guò)濾后稀釋至10mL進(jìn)行SEC-MS測(cè)試。
色譜條件：色譜柱：Superdex Peptide 10/300GL；流動(dòng)相：0.05％醋酸銨：乙腈＝4:1；流速：0.3mL/min；進(jìn)樣量：25μL；柱溫度：25℃；檢測(cè)器：質(zhì)譜檢測(cè)器；
質(zhì)譜條件：負(fù)離子模式；DP-50，EP-10，TEM 500℃；IS-4000；MW范圍：300～3000Da；
數(shù)據(jù)處理：采用面積歸一法分析各修飾度的大小。
以下實(shí)施例中采用的冷凍干燥工藝的具體條件參數(shù)如下：冷凍溫度-50℃，冷凍壓力100Pa，冷凍時(shí)間12小時(shí)。
實(shí)施例1傳統(tǒng)交聯(lián)工藝中時(shí)間對(duì)交聯(lián)度的影響
1、將分子量為200萬(wàn)道爾頓的透明質(zhì)酸鈉1.0g加入150mL 1％(w/w)的NaOH溶液中，室溫下攪拌4小時(shí)至完全溶解。
2、取0.2mL 1,4-丁二醇二縮水甘油醚，用50mL蒸餾水稀釋后保留備用。
3、將透明質(zhì)酸鈉的NaOH溶液置于可磁力攪拌器中，室溫?cái)嚢柘聦⑾♂尯蟮腂DDE溶液滴加到體系中，10分鐘滴完，滴完后繼續(xù)反應(yīng)一定時(shí)間，反應(yīng)時(shí)間見(jiàn)表1。
4、加入0.005mol/L鹽酸溶液調(diào)節(jié)至pH＝7.2，攪拌下平衡2小時(shí)，然后加入500mL無(wú)水乙醇，沉淀2小時(shí)，取出塊狀固體。
將所得固體冷凍干燥后進(jìn)行交聯(lián)度測(cè)試，結(jié)果見(jiàn)表1。
表1傳統(tǒng)交聯(lián)工藝中反應(yīng)時(shí)間對(duì)交聯(lián)度的影響
實(shí)施例2傳統(tǒng)交聯(lián)工藝中交聯(lián)溫度對(duì)交聯(lián)度的影響
1、將分子量為200萬(wàn)道爾頓的透明質(zhì)酸鈉1.0g加入150mL 1％(w/w)的NaOH溶液中，室溫下攪拌4小時(shí)至完全溶解。
2、取0.2mL 1,4-丁二醇二縮水甘油醚，用50mL蒸餾水稀釋后保留備用。
3、將透明質(zhì)酸鈉的NaOH溶液置于可磁力攪拌器中，在25～45℃溫度范圍內(nèi)，攪拌下將BDDE溶液滴加到體系中，10分鐘滴完，滴完后繼續(xù)反應(yīng)36小時(shí)。
4、加入0.005mol/L鹽酸溶液調(diào)節(jié)至pH＝7.2，攪拌下平衡2小時(shí)，然后加入500mL無(wú)水乙醇，沉淀2小時(shí)，取出塊狀固體。
將所得固體冷凍干燥后進(jìn)行交聯(lián)度的測(cè)試，結(jié)果見(jiàn)表2。
表2傳統(tǒng)交聯(lián)工藝中反應(yīng)溫度對(duì)交聯(lián)度的影響
實(shí)施例3超聲交聯(lián)工藝中反應(yīng)時(shí)間對(duì)交聯(lián)度的影響
1、將分子量為200萬(wàn)道爾頓的透明質(zhì)酸鈉1.0g加入150mL 1％(w/w)的NaOH溶液中，室溫下攪拌4小時(shí)至完全溶解。
2、取0.2mL 1,4-丁二醇二縮水甘油醚，用50mL蒸餾水稀釋后保留備用。
3、將透明質(zhì)酸鈉的NaOH溶液置于頻率可調(diào)的超聲反應(yīng)儀中，調(diào)節(jié)超聲頻率25KHz，室溫下超聲，并將BDDE溶液滴加到體系中，10分鐘滴完，滴完后繼續(xù)超聲反應(yīng)0～40min，觀察反應(yīng)時(shí)間對(duì)交聯(lián)度的影響(表3)。
4、加入0.005mol/L鹽酸溶液調(diào)節(jié)至pH＝7.2，攪拌下平衡2小時(shí)，然后加入500mL無(wú)水乙醇，沉淀2小時(shí)，取出塊狀固體。
將所得固體冷凍干燥后進(jìn)行交聯(lián)度測(cè)試，結(jié)果見(jiàn)表3。
表3超聲交聯(lián)工藝中反應(yīng)時(shí)間對(duì)交聯(lián)度的影響
實(shí)施例4超聲交聯(lián)工藝中超聲頻率對(duì)交聯(lián)度的影響
1、將分子量為200萬(wàn)道爾頓的透明質(zhì)酸鈉1.0g加入150mL 1％(w/w)的NaOH溶液中，室溫下攪拌4小時(shí)至完全溶解。
2、取0.2mL 1,4-丁二醇二縮水甘油醚，用50mL蒸餾水稀釋后保留備用。
3、將透明質(zhì)酸鈉的NaOH溶液置于頻率可調(diào)的超聲反應(yīng)儀中，調(diào)節(jié)超聲頻率25～45KHz，室溫下超聲，并將BDDE溶液滴加到體系中，10分鐘滴完，觀察反應(yīng)時(shí)間對(duì)交聯(lián)度的影響(表4)。
4、加入0.005mol/L鹽酸溶液調(diào)節(jié)至pH＝7.2，攪拌下平衡2小時(shí)，然后加入500mL無(wú)水乙醇，沉淀2小時(shí)，取出塊狀固體。
將所得固體冷凍干燥后進(jìn)行交聯(lián)度測(cè)試，結(jié)果見(jiàn)表4。
表4超聲交聯(lián)工藝中超聲頻率對(duì)交聯(lián)度的影響
實(shí)施例5超聲交聯(lián)工藝中交聯(lián)劑用量對(duì)交聯(lián)度的影響
1、將分子量為200萬(wàn)道爾頓的透明質(zhì)酸鈉1.0g加入150mL 1％(w/w)的NaOH溶液中，室溫下攪拌4小時(shí)至完全溶解。
2、取一定量(具體用量見(jiàn)表5)的1,4-丁二醇二縮水甘油醚，用50mL蒸餾水稀釋后保留備用。
3、將透明質(zhì)酸鈉的NaOH溶液置于頻率可調(diào)的超聲反應(yīng)儀中，調(diào)節(jié)超聲頻率25～45KHz，室溫下超聲，并將BDDE溶液滴加到體系中，10分鐘滴完，滴完后繼續(xù)超聲反應(yīng)5分鐘。
4、加入0.005mol/L鹽酸溶液調(diào)節(jié)至pH＝7.2，攪拌下平衡2小時(shí)，然后加入500mL無(wú)水乙醇，沉淀2小時(shí)，取出塊狀固體。
將所得固體冷凍干燥后進(jìn)行交聯(lián)度測(cè)試，結(jié)果見(jiàn)表5。
表5超聲工藝中交聯(lián)劑用量對(duì)交聯(lián)度的影響
雖然，上文中已經(jīng)用一般性說(shuō)明及具體實(shí)施方案對(duì)本發(fā)明作了詳盡的描述，但在本發(fā)明基礎(chǔ)上，可以對(duì)之作一些修改或改進(jìn)，這對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見(jiàn)的。因此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進(jìn)，均屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。