一種葡聚糖微球凝膠的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種水凝膠微球的制備方法，具體涉及一種特定孔徑交聯(lián)葡聚糖微球 凝膠的制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 微柱凝膠技術(shù)是1986年由法國人Dr.YvesLappierre發(fā)明的可用于血型血清學 檢測的檢驗技術(shù)，1994年獲得美國FDA認證，目前在許多發(fā)達國家已經(jīng)作為常規(guī)技術(shù)應用 于臨床。屬于尺寸排除色譜法（sizeexclusionchromatography)，其主要原理是利用不同 生物大分子具有不同的流體動力學體積，通過具有一定孔徑的凝膠（凝膠空隙）來達到分 離的目的。以使用微柱凝膠法測定血型為例，在微柱管中，注入微球凝膠作為填充物，微球 與微球之間的縫隙形成特定均一的孔徑，形成凝膠分子篩，待檢紅細胞與相應的抗體在凝 膠上層結(jié)合，經(jīng)低速離心后，凝集的紅細胞塊由于體積大，無法通過凝膠分子篩而被阻隔于 凝膠中，呈陽性反應，而未與抗體結(jié)合的單個游離紅細胞則可以通過凝膠分子篩沉積到管 底，呈陰性反應，由此判斷待檢血液的血型。
[0003] 微柱凝膠法的最大優(yōu)點就是結(jié)果客觀，它規(guī)定了統(tǒng)一的離心力和離心時間，操作 可標準化，紅細胞在凝膠中穩(wěn)定存在，不會產(chǎn)生漂移現(xiàn)象，重復性好，幾乎沒有人為干擾，方 法簡單易行。檢測后標本（血型卡）圖像及實物可以較長時間保存，便于復查。另外，由于 所需樣本量少，該法特別適合于樣本不易抽取的患者（如大面積燒傷者及嬰幼兒等）。目 前，微柱凝膠技術(shù)在歐美等發(fā)達國家輸血領(lǐng)域已作為常規(guī)技術(shù)引入到血型定型中。由于正 常人紅細胞直徑為7. 0-7. 6ym，平均為7. 33ym，被相應的抗體結(jié)合后，會形成太小不一的 凝集塊，必須精確控制微柱凝膠間隙在14-20ym之間，以保證篩分出單個紅細胞與凝集紅 細胞塊，間隙的大小由微球的粒徑大小及均勻度決定，故精確控制微球凝膠的粒徑大小及 粒徑分布范圍是微柱凝膠檢測技術(shù)核心所在。
[0004] 國內(nèi)至今仍缺乏對微珠凝膠的合成工藝研究，目前臨床應用中主要依賴進口，進 口的不同型號微珠凝膠干膠價格高達2. 5-3. 5萬元/公斤，以微珠凝膠與保存液按7 :3比 例配制成的濕膠，高達2000-3000元/升，貨期一般長達6-8周，成本高、貨期長等因素嚴重 制約著微柱凝膠技術(shù)在國內(nèi)的普及應用，導致微柱凝膠技術(shù)在國內(nèi)的普及程序低。
[0005] 除直接應用進口微柱凝膠外，目前可檢索到的凝膠合成技術(shù)（楊振平，韓杰，榮瑤 君，交聯(lián)葡聚糖凝膠微珠的制備I.微珠表面形態(tài)的影響因素與控制）主要是：在標準六 葉渦輪攪拌釜中，以甲苯等有機溶劑作為連續(xù)相，聚乙酸乙烯酯（PVAc)為分散劑，葡聚糖 的水溶液為分散相，環(huán)氧氯丙烷（ECH)為交聯(lián)劑，通過反相懸浮聚合的方式得到交聯(lián)葡聚 糖的微球凝膠。以標準六葉渦輪攪拌釜儀器結(jié)構(gòu)復雜，難以標準化控制反應條件，不利于工 業(yè)化生產(chǎn)；此外，甲苯等有機溶劑大多具是有毒性，會對操作員工和自然環(huán)境造成重大的污 染，在目前提倡職業(yè)健康及環(huán)境保護的大趨勢下不可以大量使用。
[0006] 由于甲苯的粘度低，容易造成預分散好的葡聚糖小液滴不同程度的團聚，難以控 制微球的粒徑大小及分布范圍，所制得的微球直徑分布在5-300ym之間，而各種應用領(lǐng)域 對粒徑的要求不一致，粒徑分布范圍過廣導致各種領(lǐng)域應用效果均欠佳。這種方法制得的 微球凝膠粒徑大小分布范圍在5-300ym之間，大小不一，分布不均，不能很好的滿足應用 需求。
[0007] 此外，其交聯(lián)反應的原理為：葡聚糖在堿性條件下，以環(huán)氧氯丙烷為交聯(lián)劑可以得 到交聯(lián)葡聚糖，反應方程式為：
dextran
[0009] 從交聯(lián)反應機理中可以看出，堿是可以中和交聯(lián)過程中生成的鹽酸，從而使交聯(lián) 反應順利的進行。當堿性不夠強，就會使的交聯(lián)不完全，從而得到的微球容易造成粘連和機 械強度不夠，導致微球碎片產(chǎn)生，影響使用效果。而在堿性條件下PVAc會水解成PVA，水解 反應方程式為：
[0010]
[0011] 根據(jù)水解程度的不同，會使-Ac基的殘余量不同。當PVAc的水解程度過大時，生 成的PVA是水溶性的，就使其失去了作為分散相保護膜的作用，容易造成葡聚糖小液滴發(fā) 生團聚。因此，在堿性條件下，聚乙酸乙烯酯（PVAc)的分解和葡聚糖的交聯(lián)反應是個競爭 反應。必須要找到一個合適的堿性點，要既利于葡聚糖的交聯(lián)，又不能使PVAc發(fā)生過度的 水解，此過程要考慮的影響因素太多，工藝難控制，不利于工業(yè)化生產(chǎn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0012] 針對上述問題，本發(fā)明提出一種以國產(chǎn)原料為基礎(chǔ)，合成價格低廉，工藝可控，安 全環(huán)保，且粒徑大小分布范圍窄，機械強度高的交聯(lián)葡聚糖微珠凝膠的制備方法。
[0013] -種葡聚糖微球凝膠的制備方法，其步驟如下：分別配制分散相葡聚糖溶液和連 續(xù)相溶液；將分散相溶液勻速滴加至連續(xù)相溶液中，同時利用均質(zhì)乳化設(shè)備使混合物充分 乳化；加入交聯(lián)劑，機械攪拌使混合物充分交聯(lián)，制得葡聚糖微球凝膠。
[0014] 進一步地，所述分散相葡聚糖溶液為葡聚糖的氫氧化鈉溶液；所述連續(xù)相為加入 乳化劑的油；所述交聯(lián)劑為N，N' -亞甲基雙丙烯酰胺。
[0015] 進一步地，所述氫氧化鈉溶液為2. 5M氫氧化鈉溶液。
[0016] 進一步地，所述油為蓖麻油、礦物油、橄欖油或大豆油。
[0017] 進一步地，所述的方法具體包括以下步驟：
[0018] 1)配制分散相：稱取葡聚糖3. 0~6. 0±0. 3g，加入至2. 5M氫氧化鈉溶液里，置均 質(zhì)乳化設(shè)備下攪拌，攪拌參數(shù)為600±lOOrpm，至葡聚糖完全溶解成無色透明溶液，作為分 散相，備用；
[0019] 2)配制連續(xù)相：稱取司盤802. 5±0. 3g，加入至60±5g油中，置均質(zhì)乳化設(shè)備下攪 拌，攪拌參數(shù)為600 ±100rpm，至司盤80完全溶解至油內(nèi)；
[0020] 3)在相同的攪拌速度下，把上述步驟1)制得的分散相滴加至上述步驟2)制得的 連續(xù)相內(nèi)，以蠕動栗控制滴加速度為5. 0±0. 5ml/h;
[0021] 4)分散乳化反應：控制溫度在25±5°C滴加，滴加完成后，保持溫度在25±5°C，調(diào) 節(jié)均質(zhì)乳化設(shè)備參數(shù)為600~1200±100rpm，25-30min，以充分分散乳化；
[0022] 5)交聯(lián)反應：分散乳化完成后，加入交聯(lián)劑，控制室內(nèi)溫度在25±5°C，切換機械 攪拌設(shè)備，參數(shù)為600±50rpm，14±lh，以充分交聯(lián)。
[0023] 進一步地，所述步驟5)中，交聯(lián)劑為N，N' -亞甲基雙丙烯酰胺，質(zhì)量為2. 5±0. 3g。
[0024] 進一步地，所述步驟2)中，所述油為蓖麻油、礦物油、橄欖油或大豆油。
[0025] 進一步地，所述步驟4)和5)中，控制反應溫度在20~30°C
[0026] 進一步地，所述的方法還包括以下步驟：
[0027] 6)靜置：交聯(lián)反應完成后，靜置0. 5±0.lh，吸棄上清液，收集微球凝膠。
[0028] 7)洗滌：以30%乙醇溶液洗滌上述微球凝膠4-5次后，按3 :7的比例將乙醇溶液 與微球凝膠混合保存，得到所述葡聚糖微球凝膠。
[0029] 8)干燥：置真空冷凍干燥機內(nèi)，干燥24 ±lh形成干粉，收集微球凝膠干粉，得到葡 聚糖微球凝膠干粉。
[0030] 本發(fā)明的內(nèi)容還包括上述制備方法得到的葡聚糖微球凝膠。
[0031] 相對于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明具有以下優(yōu)點：
[0032] 1)采用國產(chǎn)原料為基礎(chǔ)，原料易得且成本低，供應周期短，可大幅降低微珠凝膠的 價格。
[0033] 2)采用均質(zhì)乳化設(shè)備作為分散的設(shè)備，可控范圍大（100-23000rpm)，精確