本發(fā)明屬于微生物發(fā)酵領域，具體涉及一種高產(chǎn)茶褐素的黑曲霉菌株及應用。
背景技術：
：黑曲霉是一種廣泛存在于自然界的腐生真菌，其分生孢子頭呈褐黑色放射狀，分生孢子梗長短不一，頂囊球形，雙層小梗，多見于糧食、植物性產(chǎn)品和土壤中。黑曲霉又是重要的工業(yè)發(fā)酵微生物，在工業(yè)酶制劑、有機酸發(fā)酵方面應用廣泛?？缮a(chǎn)淀粉酶、酸性蛋白酶、纖維素酶、果膠酶、葡萄糖氧化酶等超過30種酶制劑。因為黑曲霉出色的蛋白質(zhì)分泌能力，黑曲霉也被開發(fā)為通用的異源蛋白表達載體。黑曲霉是檸檬酸、葡糖酸和沒食子酸等的主要生產(chǎn)菌。黑曲霉具有強大的聚合物降解酶系，賦予其在各種廉價的培養(yǎng)基上快速生長和發(fā)酵的能力，能夠在極低的pH下保持旺盛的代謝活性因而不易染菌，能夠適應工業(yè)發(fā)酵中粗放的物料和理化環(huán)境，這些品質(zhì)使黑曲霉成為一種不可多得的工業(yè)生產(chǎn)宿主菌，即細胞工廠。茶葉中的多酚類物質(zhì)是茶葉中的重要活性物質(zhì)，是茶葉中多種酚類化合物的總稱，是茶樹鮮葉的主要組成成分，其中以兒茶素為其主體成分，占多酚類物質(zhì)總量的60％～80％，與茶的湯色、滋味和香氣都有著密切的關系。多酚類物質(zhì)的水溶性產(chǎn)物主要是茶黃素、茶紅素和茶褐素。茶褐素是兒茶素氧化聚合形成的一類結構十分復雜的產(chǎn)物的總稱，在普洱茶的加工過程中80％的茶黃素和茶紅素氧化、聚合，形成茶褐素，并使其含量成倍增加，從而使茶湯的收斂性和苦澀味降低。研究表明茶褐素是黑茶中主要功能和特征性成分，其含量對黑茶品質(zhì)至關重要。研究表明，茶褐素能夠降低小鼠血清中血糖，膽固醇，甘油三酯含量，具有較強的清除自由基能力，具有抗氧化作用。對減肥降脂，預防高血脂癥具有顯著的作用。毒理學實驗證明，茶褐素無毒安全。這些結果表明，茶褐素具有較好的應用前景。技術實現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的提供一種黑曲霉菌株，該菌株具有高產(chǎn)茶褐素的特點，可用于制備茶褐素提取物，該菌株已于2015年8月26日保藏于黑曲霉菌種保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(ChinaGeneralMicrobiologicalCultureCollectionCenter,CGMCC)，該黑曲霉菌株的保藏號為：CGMCCNo.11276，拉丁名：Aspergillusniger，地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號。本發(fā)明還提供了一種黑曲霉菌株在綠茶濃縮液液態(tài)發(fā)酵中的應用，不僅能提高綠茶濃縮液液態(tài)發(fā)酵茶褐素的產(chǎn)量。本發(fā)明的黑曲霉菌株來源于室溫放置1年的速溶綠茶粉中，具體分離方法為：在超凈工作臺中，取適量貯藏1年速溶綠茶粉溶于100mL無菌水中，置于溫度37℃，轉數(shù)150r/min的搖床中培養(yǎng)4天后，挑取培養(yǎng)液中的菌絲接種于PDA平板；將接種菌絲的PDA平板置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4天，然后挑取單一的黑色孢子于查氏選擇培養(yǎng)基中重復劃線培養(yǎng)2-3次，進一步分離純化，直至查氏選擇培養(yǎng)基平板上只有單一霉菌為止。挑取該純種的霉菌，接種至PDA平板上并置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4天，得到本發(fā)明保藏的黑曲霉菌株。將菌種放置于4℃保存，備用。菌落形態(tài)特征：菌落在20～30mm之間，菌落較大，地毯式蔓延生長，呈同心輪紋狀，菌落正面黑色，邊緣產(chǎn)生白色次生菌絲，反面灰黑色；在在顯微鏡下觀察，菌絲有隔，在菌絲的壁厚而膨大成“足細胞”，產(chǎn)生分生孢子梗，無隔，梗頂端膨大成球狀泡囊，即為分生孢子頭。同時，本發(fā)明還提供了一種高茶褐素速溶黑茶的制備方法，所述高茶褐素速溶黑茶的制備方法包括以下步驟：采用綠茶為原料，用水提取綠茶，并濃縮得到綠茶濃縮液；取保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心的黑曲霉菌株，保藏號為：CGMCCNo.11276，活化培養(yǎng)，調(diào)整黑曲霉孢子液濃度；混合綠茶濃縮液與黑曲霉孢子液，逐級擴大培養(yǎng)，得到2級或3級種子液并接種到綠茶濃縮液中；在溫度26～37℃的條件下，有氧液態(tài)發(fā)酵6～12天，得到黑曲霉發(fā)酵液；膜過濾，干燥得到粉末狀固體，即為高茶褐素速溶黑茶。其中，所述用水提取綠茶具體條件為：溫度60～95℃；料液比為1:8～1:25；提取時間20～60min。所述綠茶濃縮液的可溶性固形物含量為2～15％。所述活化培養(yǎng)的條件是：置于PDA平板培養(yǎng)基培養(yǎng)72-120h。所述黑曲霉孢子液濃度調(diào)整為1.0～5.0×106個/mL。所述2級或3級種子液接種到綠茶濃縮液中的接種量為2.0～12.0(v/v)％。所述干燥得到粉末狀固體優(yōu)選冷凍干燥或減壓干燥。有益效果其一，本發(fā)明解決了傳統(tǒng)黑茶發(fā)酵過程中茶褐素含量不高，陳香味不被接受的問題。本發(fā)明制備的發(fā)酵液及速溶茶產(chǎn)品的茶褐素含量高，具有消除炎癥，調(diào)整腸道細菌，調(diào)解血脂代謝，預防心腦血管疾病、抗癌、抗病毒等功效。具有良好的營養(yǎng)價值和養(yǎng)生保健作用。其二，本發(fā)明從存放1年的速溶綠茶粉中分離出一種黑曲霉，并將此黑曲霉保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為：CGMCCNo.11276，此黑曲霉具有如下優(yōu)勢：第一：利用本保藏的黑曲霉菌種在綠茶發(fā)酵液中生長旺盛，適應液態(tài)發(fā)酵環(huán)境能力強，短時間內(nèi)可以產(chǎn)生大量的茶褐素；第二，本發(fā)明保藏的黑曲霉發(fā)酵速度快，可快速達到發(fā)酵終點；第三，本發(fā)明分離的黑曲霉發(fā)酵綠茶提取液產(chǎn)色素能力明顯高于其它黑曲霉，產(chǎn)品色澤紅亮且品質(zhì)明顯好于其它黑曲霉發(fā)酵的產(chǎn)品；第四，綠茶濃縮液的發(fā)酵液中，茶褐素的總量較高。其三，本發(fā)明保藏的黑曲霉可以應用于低檔綠茶、粗老的茶葉及碎茶液態(tài)發(fā)酵，以制備茶褐素或直接制備高茶褐素含量的速溶黑茶，提高低檔綠茶、粗老的茶葉及碎茶的經(jīng)濟價值；本發(fā)明的黑曲霉適應在發(fā)酵罐中進行的純菌發(fā)酵，應用于綠茶提取液液態(tài)發(fā)酵，液態(tài)發(fā)酵可提高產(chǎn)品的安全性，生產(chǎn)工藝簡單，發(fā)酵成本低，適合于工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)。附圖說明：圖1為一種黑曲霉菌株菌落形態(tài)圖。具體實施方式下面結合具體實施例子進一步闡明本發(fā)明，應理解這些實施例僅用于說明本發(fā)明，而不用于限制本發(fā)明的范圍，在閱讀了本發(fā)明之后，本領域的技術人員對本發(fā)明各種等價形式的修改均落于本申請所附權利要求所規(guī)定的范圍。實施例1一種黑曲霉菌株，保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心的菌株，保藏號為：CGMCCNo.11276。其中，本發(fā)明實施例所用的試劑均為分析純，速溶綠茶粉由大閩食品(漳州)有限公司提供。本發(fā)明的黑曲霉菌株來源于室溫放置1年的速溶綠茶粉中，具體分離方法為：在超凈工作臺中，取適量貯藏1年速溶綠茶粉溶于100mL無菌水中，置于溫度37℃，轉數(shù)150r/min的搖床中培養(yǎng)4天后，挑取培養(yǎng)液中的菌絲接種于PDA平板；將接種菌絲的PDA平板置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4天，然后挑取單一的黑色孢子于查氏選擇培養(yǎng)基中重復劃線培養(yǎng)2-3次，進一步分離純化，直至查氏選擇培養(yǎng)基平板上只有單一霉菌為止。挑取該純種的霉菌，接種至PDA平板上并置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4天，得到本發(fā)明保藏的黑曲霉菌株。將菌種放置于4℃保存，備用?；罨囵B(yǎng)基制備：稱取去皮馬鈴薯200g，切塊，加1L水煮爛，用紗布過濾，然后在加熱的條件下加入20g瓊脂粉，繼續(xù)加熱并攪拌，待瓊脂粉溶解完后，加入20g葡糖糖，攪拌均勻，冷卻后再補足水分至1000mL，包扎，121℃滅菌20min，冷卻后，倒入平板。菌種活化：將保藏號為CGMCCNo.11276的黑曲霉菌株，在無菌條件下，于上述培養(yǎng)基制備的平板上劃線，劃線結束后將平板倒置于37℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4天。菌落形態(tài)：菌落在20～30mm之間,菌落較大,地毯式蔓延生長,呈同心輪紋狀,菌落正面黑色,邊緣產(chǎn)生白色次生菌絲,反面灰黑色；在在顯微鏡下觀察,菌絲有隔,在菌絲的壁厚而膨大成“足細胞”,產(chǎn)生分生孢子梗,無隔,梗頂端膨大成球狀泡囊,即為分生孢子頭,菌落和孢子形態(tài)。菌落形態(tài)圖見圖1，其中，自左至右分別為菌落正面圖、菌落背面圖和菌落放大圖。實施例2制備綠茶提取液：采用60～95℃水提取綠茶，其中，料液比為1:8～1:25；提取時間20～60min，過濾取濾液，得到綠茶提取液；制備綠茶濃縮液：將綠茶提取液濃縮至可溶性固形物為2～15％，制得綠茶濃縮液。將保藏號為CGMCCNo.11276的黑曲霉菌株，經(jīng)過活化后，無菌條件下，置于綠茶濃縮液中液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)。實施例3一種用黑曲霉液態(tài)發(fā)酵制備含茶褐素茶湯發(fā)酵液的應用。本實施例利用黑曲霉液態(tài)發(fā)酵方法得到茶褐素，具體方法如下：1.制備綠茶提取液：采用60～95℃水提取綠茶，其中，料液比為1:8～1:25；提取時間20～60min，過濾取濾液，得到綠茶提取液；2.濃縮綠茶提取液：將綠茶提取液濃縮至可溶性固形物為2～15％，制得綠茶濃縮液。3.黑曲霉孢子液制備：取保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心的菌株，保藏號為：CGMCCNo.11276。置于PDA平板培養(yǎng)基培養(yǎng)72-120h，培養(yǎng)結束后取PDA平板培養(yǎng)基上的黑曲霉孢子，溶解于水中并調(diào)整黑曲霉孢子濃度至1.0～5.0×106個/mL，得到黑曲霉孢子液。4.種子液制備：混合綠茶濃縮液與黑曲霉孢子液，綠茶濃縮液：黑曲霉孢子液(v/v)＝10:1～50:1。于溫度37℃，轉數(shù)150r/min恒溫搖床中培養(yǎng)48小時，獲得1級種子液，用1級種子液和綠茶濃縮液混合，同樣的條件培養(yǎng)，得到2級種子液，同理得到3級種子液。5.接種：將2級或3級黑曲霉種子液接種到綠茶提取液中，接種量為2.0～12.0(v/v)％。6.有氧液態(tài)發(fā)酵：控制發(fā)酵罐中綠茶發(fā)酵液溫度26～37℃并通入無菌空氣，發(fā)酵6～12天后停止發(fā)酵，得到黑曲霉茶湯發(fā)酵液。發(fā)明人為測定本實施例得到的黑曲霉發(fā)茶湯酵液中的茶褐素含量，將黑曲霉發(fā)酵得到的發(fā)酵茶湯液干燥，得到黑曲霉發(fā)酵液干粉。同時，從菌種保藏中心購買了兩株普通黑曲霉做對照，分別為普通黑曲霉1號和普通黑曲霉2號，發(fā)酵原料和發(fā)酵方法同本實施例，檢測方法如下：茶褐素的測定方法取1g黑曲霉發(fā)酵液干粉，用純凈水定容至100mL的容量瓶中，用移液管分別吸取25mL黑曲霉發(fā)酵溶液和25mL正丁醇放入125mL分液漏斗中，充分搖震3min，帶分層后將水層(下層)放于50mL三角瓶中，取水層液2mL于25mL容量瓶中，分別加2mL飽和草酸溶液和6mL蒸餾水，再用95％乙醇定容至刻度，得溶液?？瞻讓φ盏姆磻旌弦褐械乃畬右河谜麴s水代替，其他條件相同。用10mm比色皿在波長380nm處測吸光度。茶褐素(TB)濃度(gTB/100g茶粉)按下式計算：m—1g茶粉中水分質(zhì)量(g)；0.72—發(fā)酵前與發(fā)酵后，茶粉與水的比例變化的校正系數(shù)；7.06—為同等操作條件下的換算系數(shù)。測試結果如下：表1不同菌種發(fā)酵不同時間茶湯茶褐素的變化由上述數(shù)據(jù)可知，本發(fā)明保藏的菌株發(fā)酵綠茶濃縮液，可以快速發(fā)酵產(chǎn)生茶褐素，增加發(fā)酵液的活性成分。實施例4一種用黑曲霉液態(tài)發(fā)酵茶濃縮液制備茶褐素的應用本實施例利用黑曲霉液態(tài)發(fā)酵方法得到茶褐素，具體方法如下：1.制備綠茶提取液：采用60～95℃水提取綠茶，其中，料液比為1:8～1:25；提取時間20～60min，過濾取濾液，得到綠茶提取液；2.濃縮綠茶提取液：將綠茶提取液濃縮至可溶性固形物為2～15％，制得綠茶濃縮液。3.黑曲霉孢子液制備：取保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心的菌株，保藏號為：CGMCCNo.11276。置于PDA平板培養(yǎng)基培養(yǎng)72-120h，培養(yǎng)結束后取PDA平板培養(yǎng)基上的黑曲霉孢子，溶解于水中并調(diào)整黑曲霉孢子濃度至1.0～5.0×106個/mL，得到黑曲霉孢子液。4.種子液制備：混合綠茶濃縮液與黑曲霉孢子液，綠茶濃縮液：黑曲霉孢子液(v/v)＝10:1～50:1。于溫度37℃，轉數(shù)150r/min恒溫搖床中培養(yǎng)48小時，獲得1級種子液，用1級種子液和綠茶濃縮液混合，同樣的條件培養(yǎng)，得到2級種子液，同理得到3級種子液。5.接種：將2級或3級黑曲霉種子液接種到綠茶提取液中，接種量為2.0～12.0(v/v)％。6.有氧液態(tài)發(fā)酵：控制發(fā)酵罐中綠茶發(fā)酵液溫度26～37℃并通入無菌空氣，發(fā)酵6～12天后停止發(fā)酵，得到黑曲霉發(fā)酵液。7.茶褐素的制備：將發(fā)酵后的液體過濾網(wǎng)去除渾濁物，離心，得濾液Ⅰ和濾渣Ⅰ，取濾液Ⅰ，加入4倍95％食用乙醇溶液攪拌后靜置3小時，離心過濾，得到濾渣Ⅱ和濾液Ⅱ，其中濾渣Ⅱ為茶褐素粗提物；再用20％(v/v)酒精水溶液溶解茶褐素粗提物，得到的溶液經(jīng)濃縮和干燥工藝提純后即得茶褐素。實施例5本發(fā)明的實施例均使用保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心的黑曲霉菌株，其保藏號為：CGMCCNo.11276。實施例中所用的試劑均為分析純，綠茶和速溶綠茶粉均由大閩食品(漳州)有限公司提供。一種高茶褐素速溶黑茶及其制備方法，具體方法如下：1.制備綠茶提取液：采用80℃水提取綠茶，其中，料液比為1:15；提取時間40min，過濾取濾液，得到綠茶提取液；2.濃縮綠茶提取液：將綠茶提取液濃縮至可溶性固形物為8％，制得綠茶濃縮液。3.黑曲霉孢子液制備：取保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心的菌株，保藏號為：CGMCCNo.11276。置于PDA平板培養(yǎng)基培養(yǎng)100h，培養(yǎng)結束后取PDA平板培養(yǎng)基上的黑曲霉孢子，溶解于水中并調(diào)整黑曲霉孢子濃度至3.0×106個/mL，得到黑曲霉孢子液。4.種子液制備：混合綠茶濃縮液與黑曲霉孢子液，綠茶濃縮液：黑曲霉孢子液(v/v)＝30:1。于溫度37℃，轉數(shù)150r/min恒溫搖床中培養(yǎng)48小時，獲得1級種子液，用1級種子液和綠茶濃縮液混合，同樣的條件培養(yǎng)，得到2級種子液，同理得到3級種子液。5.接種：將2級或3級黑曲霉種子液接種到綠茶提取液中，接種量為8.0(v/v)％。6.有氧液態(tài)發(fā)酵：控制發(fā)酵罐中綠茶發(fā)酵液溫度37℃并通入無菌空氣，發(fā)酵10天后停止發(fā)酵，得到黑曲霉發(fā)酵液。7.膜過濾：采用過濾網(wǎng)先去除菌絲等渾濁物，再用0.22微米除菌膜過濾，獲得澄清無菌的黑曲霉發(fā)酵液。8.干燥：將膜過濾后的黑曲霉發(fā)酵液進行干燥處理，得到粉末狀固體，即為高茶褐素速溶黑茶。測定本實施例得到的高茶褐素速溶黑茶茶褐素含量的檢測方法同上：表2不同菌種發(fā)酵不同時間茶湯茶褐素的變化表3本實施例高茶褐素速溶黑茶含量表茶褐素％游離氨基酸含量mg/g碳水化合物含量mg/g紅度25.31120.38116.5743.6本發(fā)明的高茶褐素速溶黑茶的茶褐素含量高，具有消除炎癥，調(diào)整腸道細菌，調(diào)解血脂代謝，預防心腦血管疾病、抗癌、抗病毒等功效。速溶茶中具有很好的養(yǎng)生保健作用。實施例6一種高茶褐素速溶黑茶及其制備方法，具體方法如下：1.制備綠茶提取液：采用60℃水提取綠茶，其中，料液比為1:8；提取時間20min，過濾取濾液，得到綠茶提取液；2.濃縮綠茶提取液：將綠茶提取液濃縮至可溶性固形物為15％，制得綠茶濃縮液。3.黑曲霉孢子液制備：取保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心的菌株，保藏號為：CGMCCNo.11276。置于PDA平板培養(yǎng)基培養(yǎng)72h，培養(yǎng)結束后取PDA平板培養(yǎng)基上的黑曲霉孢子，溶解于水中并調(diào)整黑曲霉孢子濃度至1.0×106個/mL，得到黑曲霉孢子液。4.種子液制備：混合綠茶濃縮液與黑曲霉孢子液，綠茶濃縮液：黑曲霉孢子液(v/v)＝10:1。于溫度37℃，轉數(shù)150r/min恒溫搖床中培養(yǎng)48小時，獲得1級種子液，用1級種子液和綠茶濃縮液混合，同樣的條件培養(yǎng)，得到2級種子液，同理得到3級種子液。5.接種：將2級或3級黑曲霉種子液接種到綠茶提取液中，接種量為2.0(v/v)％。6.有氧液態(tài)發(fā)酵：控制發(fā)酵罐中綠茶發(fā)酵液溫度26℃并通入無菌空氣，發(fā)酵6天后停止發(fā)酵，得到黑曲霉發(fā)酵液。7.膜過濾：采用過濾網(wǎng)先去除菌絲等渾濁物，再用0.22微米除菌膜過濾，獲得澄清無菌的黑曲霉發(fā)酵液。8.冷凍干燥：將膜過濾后的黑曲霉發(fā)酵液進行冷凍干燥處理，得到粉末狀固體，即為高茶褐素速溶黑茶。經(jīng)檢測：本實施例得到的高茶褐素速溶黑茶的茶褐素含量為17.3％。實施例7一種高茶褐素速溶黑茶及其制備方法，具體方法如下：1.制備綠茶提取液：采用95℃水提取綠茶，其中，料液比為1:25；提取時間60min，過濾取濾液，得到綠茶提取液；2.濃縮綠茶提取液：將綠茶提取液濃縮至可溶性固形物為2％，制得綠茶濃縮液。3.黑曲霉孢子液制備：取保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心的菌株，保藏號為：CGMCCNo.11276。置于PDA平板培養(yǎng)基培養(yǎng)120h，培養(yǎng)結束后取PDA平板培養(yǎng)基上的黑曲霉孢子，溶解于水中并調(diào)整黑曲霉孢子濃度至5.0×106個/mL，得到黑曲霉孢子液。4.種子液制備：混合綠茶濃縮液與黑曲霉孢子液，綠茶濃縮液：黑曲霉孢子液(v/v)＝50:1。于溫度37℃，轉數(shù)150r/min恒溫搖床中培養(yǎng)48小時，獲得1級種子液，用1級種子液和綠茶濃縮液混合，同樣的條件培養(yǎng)，得到2級種子液，同理得到3級種子液。5.接種：將2級或3級黑曲霉種子液接種到綠茶提取液中，接種量為12.0(v/v)％。6.有氧液態(tài)發(fā)酵：控制發(fā)酵罐中綠茶發(fā)酵液溫度37℃并通入無菌空氣，發(fā)酵12天后停止發(fā)酵，得到黑曲霉發(fā)酵液。7.膜過濾：采用過濾網(wǎng)先去除菌絲等渾濁物，再用0.22微米除菌膜過濾，獲得澄清無菌的黑曲霉發(fā)酵液。8.減壓干燥：將膜過濾后的黑曲霉發(fā)酵液在20～50kpa的氣壓下進行減壓干燥處理，得到粉末狀固體，即為高茶褐素速溶黑茶。經(jīng)檢測：本實施例得到的高茶褐素速溶黑茶的茶褐素含量為25.4％。當前第1頁1 2 3