本發(fā)明涉及一株植物內(nèi)生菌根真菌；特別涉及一株從越橘屬植物藍(lán)莓根系分離獲得的一種促進(jìn)藍(lán)莓營(yíng)養(yǎng)吸收的菌根真菌及其制備方法與應(yīng)用。

背景技術(shù)：

植物菌根是指植物根系與真菌所形成的互惠共生體即“菌根”(mycorrhizas)，是一種極為普遍的生命活動(dòng)和生態(tài)現(xiàn)象。Frank 1885年首次擬創(chuàng)了“菌根”這個(gè)術(shù)語，之后若干年一直處于平穩(wěn)發(fā)展期，直到20世紀(jì)50年代，菌根學(xué)在現(xiàn)代分子生物學(xué)和生化技術(shù)的輔助下進(jìn)入迅猛共發(fā)展期，尤其是近30年，隨著新方法、新技術(shù)的不斷建立，研究?jī)?nèi)容更加廣泛，菌根學(xué)研究已成為一項(xiàng)包括多種學(xué)科相互滲透的一門邊緣生物科學(xué)。

菌根真菌的侵染能誘導(dǎo)植物根系形態(tài)發(fā)生明顯變化，影響菌根周圍各成員的相互作用。Duckett和Read(1995)研究發(fā)現(xiàn)Hymenoscyphus ericae分離物能促使假根根尖膨大，并在其細(xì)胞內(nèi)形成菌絲團(tuán)。菌根真菌還可通過分泌H⁺和一些酸性化合物，直接影響到土壤化學(xué)特性。大量研究表明，菌根真菌能顯著促進(jìn)植物對(duì)土壤中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收、提高植物抗病蟲害的作用。接種菌根真菌還可促進(jìn)各類植物生長(zhǎng)、提高產(chǎn)量和品質(zhì)，并促進(jìn)組培苗的生長(zhǎng)，提高移栽成活率。

藍(lán)莓(blueberry)又名越橘，是杜鵑花科(Ericaceae)越橘屬(Vaccinium spp.)植物，為多年生落葉或常綠灌木，果實(shí)為漿果。在我國(guó)原產(chǎn)于高海拔的野生灌木，在吉林長(zhǎng)白山分布于海拔1500-2400米的地區(qū)。其須根部缺少大部分植物所具有的根毛，需借助合適的菌根菌幫助其吸收水分、礦物質(zhì)營(yíng)養(yǎng)等。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明針對(duì)上述現(xiàn)有技術(shù)中存在的問題，提供一種從野生越橘根系中獲得菌根真菌，目的是促進(jìn)藍(lán)莓根系生長(zhǎng)發(fā)育、提高N、P、K吸收作用及提高藍(lán)莓產(chǎn)量。

本發(fā)明的另一目的在于提供一種菌根真菌的制備方法。

本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)的。

一種菌根真菌MF001，該菌根真菌分類名稱為：白囊耙齒菌(Irpex lacteus)，其保藏編號(hào)為CGMCC No.4108，保藏日期為2010年8月18日，保藏單位名稱：中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通生物中心(簡(jiǎn)稱CGMCC)，保藏單位地址為：中國(guó)北京市海淀區(qū)中關(guān)村北一條13號(hào)。

所述的白囊耙齒菌引物擴(kuò)增DNA序列如下：

本發(fā)明一種菌根真菌的制備方法包括如下步驟：

取新鮮完整的健康野生越橘的根，用自來水沖洗一小時(shí)，然后用無菌水沖洗3次，放入70℃的乙醇中滅菌30秒，再轉(zhuǎn)入0.1％的升汞溶液中表面消毒2分鐘，然后立即轉(zhuǎn)入1％的無菌硫化鈉水溶液中清洗，浸泡2分鐘，然后切成0.5厘米長(zhǎng)的根段置于PDA培養(yǎng)基平板上，25℃下恒溫培養(yǎng)，待長(zhǎng)出菌落后，將菌落邊緣純凈的菌絲挑入新的PDA培養(yǎng)平板上培養(yǎng)，生長(zhǎng)兩天確認(rèn)無污染后轉(zhuǎn)入PDA試管中保存，所得真菌為白囊耙齒菌(Irpex lacteus)MF001 CGMCC No.4108。

所述白囊耙齒菌(Irpex lacteus)MF001 CGMCC No.4108的基本培養(yǎng)形態(tài)特征為：在PDA板上，28℃培養(yǎng)5天后菌落直徑為8.6cm；菌絲粗壯，無分枝，無隔膜，表面白色有細(xì)長(zhǎng)毛，無分生孢子。

所述的白囊耙齒菌(Irpex lacteus)MF001 CGMCC No.4108在藍(lán)莓組培階段、瓶外生根階段和大田栽培階段的應(yīng)用。

本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)效果如下：

本發(fā)明對(duì)從健康的野生越橘根系中分離得到的對(duì)藍(lán)莓具有促進(jìn)根系發(fā)育，提高N、P、K吸收率，增加藍(lán)莓產(chǎn)量的菌根菌，并對(duì)其進(jìn)行了種屬鑒定和回接試驗(yàn)研究，旨在為藍(lán)莓栽培產(chǎn)業(yè)開發(fā)提供優(yōu)良的菌根菌株。接種菌根菌白囊耙齒菌對(duì)藍(lán)莓的生長(zhǎng)起到明顯的促進(jìn)作用。因此該菌株具有較好的應(yīng)用前景，可以作為藍(lán)莓生產(chǎn)儲(chǔ)備菌株。

附圖說明

圖1為本發(fā)明的菌根真菌顯微鏡下菌絲體形態(tài)圖。

圖2為本發(fā)明的菌根真菌分子鑒定進(jìn)化樹圖。

圖3接種菌根真菌MF001對(duì)藍(lán)莓組培苗的生長(zhǎng)。

圖4接種MF001對(duì)馴化階段的藍(lán)莓組培苗的影響。

圖5接種MF001對(duì)2年生盆栽藍(lán)莓的影響。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的說明。

表1為盆栽藍(lán)莓葉片中全N、全P、全K的含量及差異顯著性分析。

實(shí)施例1

藍(lán)莓菌根真菌菌株白囊耙齒菌(Irpex lacteus)MF001 CGMCC No.4108菌的篩選及其鑒定

(1)本發(fā)明中的真菌分離自長(zhǎng)白山南的野生越橘的根系中

具體方法為：取新鮮完整的健康野生越桔根，用自來水沖洗1小時(shí)，然后用無菌水沖洗3次，放入70℃的乙醇中滅菌30秒，再轉(zhuǎn)入0.1％的升汞溶液中表面消毒2分鐘，然后立即轉(zhuǎn)入1％的無菌硫化鈉水溶液中清洗，浸泡2分鐘，然后切成0.5厘米長(zhǎng)的根段置于PDA培養(yǎng)基平板上，25℃下恒溫培養(yǎng)，待長(zhǎng)出菌落后，將菌落邊緣純凈的菌絲挑入新的PDA培養(yǎng)平板上培養(yǎng)，生長(zhǎng)兩天確認(rèn)無污染后轉(zhuǎn)入PDA試管中保存。將獲得的真菌繼續(xù)接種到瓶外生根的藍(lán)莓苗，觀察藍(lán)莓接菌后的生長(zhǎng)情況，把對(duì)藍(lán)莓苗明顯促進(jìn)作用的菌株篩選出來。上述方法從幾株真菌中篩選到一株對(duì)藍(lán)莓苗有促進(jìn)作用的菌株，將其命名為MF001。

(2)白囊耙齒菌(Irpex lacteus)的鑒定

在PDA板上，28℃培養(yǎng)5天后菌落直徑為8.6cm。菌絲粗壯，無分枝，無隔，菌絲寬50-100μm，無分生孢子。如圖1所示。

對(duì)該菌株的rDNA-ITS序列即18S，ITS1,5.8S,ITS2和28S區(qū)域部分序列進(jìn)行擴(kuò)增鑒定：提取菌株的基因組DNA作為模板，采用兩條通用引物ITS1(5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGCGG-3’)和ITS4(5’-TCCTCCGCTTAGATATGC-3’)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得大小約0.6Kb的擴(kuò)增產(chǎn)物。擴(kuò)增片段克隆后送由上海生工進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序獲得655個(gè)堿基的ITS序列，序列如圖2所示。

將該菌株的上述rDNA-ITS序列在Genbank數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行BLAST比對(duì)，結(jié)果顯示，其序列與Irpex lacteus的rDNA-ITS區(qū)序列同源性達(dá)到99％。

通過上述表性特征和分子特征將其鑒定為Irpex lacteus屬真菌，即白囊耙齒菌(Irpex lacteus)，該菌根真菌分類名稱為：白囊耙齒菌(Irpex lacteus)，其保藏編號(hào)為CGMCC No.4108，保藏日期為2010年8月18日，保藏單位名稱：中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通生物中心(簡(jiǎn)稱CGMCC)，保藏單位地址為：中國(guó)北京市海淀區(qū)中關(guān)村北一條13號(hào)。

所述的白囊耙齒菌引物擴(kuò)增DNA序列如下：

實(shí)施例2

菌根真菌MF001的使用方法及其對(duì)藍(lán)莓生長(zhǎng)情況的研究結(jié)果

1、接種本發(fā)明的菌根真菌(MF001)對(duì)生根的藍(lán)莓組培苗的影響

將已生根的藍(lán)莓組培苗放在共生培養(yǎng)基中，每瓶一株。用7mm打孔器在菌絲邊緣打孔，得到新鮮菌塊。將菌塊倒置于瓶?jī)?nèi)組培苗根系附近，每瓶接一個(gè)菌塊。另設(shè)置不接菌對(duì)照處理，每種處理5個(gè)重復(fù)。將組培苗于恒溫培養(yǎng)箱放置6個(gè)月，溫度25℃，光強(qiáng)1500-2000lx，光照12h/d。

實(shí)驗(yàn)表明(圖3)，接種菌根真菌MF001對(duì)藍(lán)莓組培苗的生長(zhǎng)促進(jìn)作用較為明顯，接菌處理的生長(zhǎng)量比對(duì)照高出30％。

2、接種MF001對(duì)馴化階段的藍(lán)莓組培苗的影響

待2個(gè)月后形成菌根，用無菌鑷子把培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)的瓊脂輕輕搗碎，將已形成菌根的藍(lán)莓組培苗從培養(yǎng)基中拔出，然后放入25℃溫水中輕輕洗去瓊脂培養(yǎng)基。洗去瓊脂后將其移植到0.1MPa壓力下滅菌2.5小時(shí)的營(yíng)養(yǎng)土上。移植時(shí)先用塑料育苗缽盛裝己滅菌的培養(yǎng)基質(zhì)達(dá)2/3容器高時(shí)，挖定植坑，接入1ml菌種，再栽上組培苗，在根部覆蓋2-3cm厚的珍珠巖并澆水透濕。然后，放置在光照培養(yǎng)箱中，溫度25℃，光照12h/d，每周澆WPM營(yíng)養(yǎng)液一次，并進(jìn)行常規(guī)管理。3個(gè)月后記錄植株生長(zhǎng)量。

實(shí)驗(yàn)表明(圖4)接菌MF001對(duì)藍(lán)莓組培苗馴化階段植株的生長(zhǎng)勢(shì)也表現(xiàn)出明顯促進(jìn)作用，接菌處理的植株生長(zhǎng)量高出對(duì)照56.1％。

3、接種MF001對(duì)盆栽藍(lán)莓的影響

將擴(kuò)大繁殖的菌根真菌MF001接種在盆栽藍(lán)莓根際周圍，20盆重復(fù)，2年生每株接種5ml菌液，5年生接種10ml,接種后覆土遮蓋植株根系。接種需重復(fù)一次，間隔時(shí)間為一個(gè)月。按照常規(guī)方法進(jìn)行水肥管理。2個(gè)月后記錄植株生長(zhǎng)量及莖粗。

實(shí)驗(yàn)表明(圖5)，2年生接菌2個(gè)月的藍(lán)莓苗盆栽階段對(duì)植株生長(zhǎng)的促進(jìn)作用較明顯，生長(zhǎng)量高于對(duì)照34.54％。5年生接種6個(gè)月效果較明顯,生長(zhǎng)量高出對(duì)照28.2％。

即，接種MF001菌后，藍(lán)莓組培苗、馴化苗和株高分別比對(duì)照高出30.0％、56.1％，2年生接菌2個(gè)月的藍(lán)莓苗盆栽階段對(duì)植株生長(zhǎng)的促進(jìn)作用較明顯，生長(zhǎng)量高于對(duì)照34.54％。5年生接種6個(gè)月效果較明顯,生長(zhǎng)量高出對(duì)照28.2％。藍(lán)莓N、P、K吸收率顯著提高，分別比對(duì)照增加8.76％、11.7％、31.8％。接種菌根菌白囊耙齒菌對(duì)藍(lán)莓的生長(zhǎng)起到明顯的促進(jìn)作用。因此該菌株具有較好的應(yīng)用前景，可以作為藍(lán)莓生產(chǎn)儲(chǔ)備菌株。

實(shí)施例3

藍(lán)莓菌根菌對(duì)藍(lán)莓生長(zhǎng)過程中N、P、K的吸收的影響

將二年生藍(lán)莓盆栽苗根部在菌劑中迅速浸潤(rùn)，然后定植在花盆里，定植后澆透水。一個(gè)月后，在藍(lán)莓根部再次補(bǔ)澆菌劑，每盆5m l。試驗(yàn)設(shè)置不接菌的對(duì)照處理，每種處理20個(gè)重復(fù)。采集藍(lán)莓葉片，測(cè)定其N、P、K含量。其中采用凱氏定氮法測(cè)定全N，鉬銻抗比色法測(cè)定全、P，原子吸收法測(cè)定全K含量。每處理隨機(jī)采集5份。

結(jié)果表明：

1、全N測(cè)定中，MF001處理的全N含量為0.993％，與對(duì)照相比均達(dá)到了顯著水平(α＝0.05)，比對(duì)照增加了8.76％，說明接菌處理能夠增加藍(lán)莓體內(nèi)N元素的含量。

2、全P測(cè)定中，MF001處理的全P含量為0.114％，兩種處理存在顯著差異，比對(duì)照增加了11.7％，說明接菌處理能夠增加藍(lán)莓體內(nèi)P元素的含量。

3、全K測(cè)定中，MF001處理的全K含量為0.605％,比對(duì)照增加了31.8％,說明接菌處理能夠增加藍(lán)莓體內(nèi)K元素的含量。

表1 盆栽藍(lán)莓葉片中全N、全P、全K的含量及差異顯著性分析

Table 5-1 Contents and significance of differences of N,P and K in blueberries