本發(fā)屬于微生物發(fā)酵領(lǐng)域，尤其涉及一種紅豆杉固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基及其制備方法和紅豆杉固態(tài)發(fā)酵方法。
背景技術(shù)：
紫杉烷類化合物是提取于高等裸子植物紅豆杉的樹皮、根和葉等部位的一類化合物，主要含有紫杉醇、三尖杉寧堿、10-DABⅢ、7-木糖基紫杉醇等，有許多已被證明具有細胞毒性和抗腫瘤活性，而用來提取紫杉醇等的天然紅豆杉資源有限，因而天然紫杉醇原料藥的生產(chǎn)和供應受到限制，遠遠不能滿足紫杉醇臨床的應用。
固態(tài)發(fā)酵(Solid-state fermentation，簡稱SSF)是指利用自然底物做碳源及能源，或利用惰性底物做固體支持物，其體系無水或接近于無水的任何發(fā)酵過程，固體發(fā)酵技術(shù)發(fā)展已久，應用廣泛。在古代中國就已經(jīng)被應用在制曲釀酒、腌制食品、肥料堆積等方面。受科技發(fā)展的限制，在過去的很長一段時間內(nèi)固體發(fā)酵技術(shù)都停留在一個比較原始落后的狀態(tài)，甚至在現(xiàn)代的工業(yè)生產(chǎn)上仍然在沿用這樣的發(fā)酵技術(shù)。在最近二十年間，關(guān)于固體發(fā)酵技術(shù)的研究和應用得到了迅速發(fā)展，人們在固態(tài)發(fā)酵領(lǐng)域的研究及其在資源環(huán)境、蛋白質(zhì)飼料中的應用取得了進展，主要表現(xiàn)在生物飼料、生物燃料、生物農(nóng)藥、生物轉(zhuǎn)化、生物解毒及生物修復等方面的應用。目前還沒有專利利用微生物和紅豆杉采用固體發(fā)酵技術(shù)，增加紅豆杉紫杉醇的含量。
固態(tài)發(fā)酵本身具有如下優(yōu)點：培養(yǎng)基簡單且來源廣泛，多為便宜的天然基質(zhì)或工業(yè)生產(chǎn)的下腳料；投資少，能耗低，技術(shù)較簡單；產(chǎn)物的產(chǎn)率較高；基質(zhì)含水量低，可大大減少生物反應器的體積，不需要廢水處理，環(huán)境污染較少，后處理加工方便；發(fā)酵過程一般不需要嚴格的無菌操作；通氣一般可由氣體擴散或間歇通風完成，不需要連續(xù)通風，空氣一般也不需嚴格的無菌空氣。
所以為提高紫杉醇的產(chǎn)量及質(zhì)量、降低紫杉醇的生產(chǎn)成本，可以對其進行固態(tài)發(fā)酵進行研發(fā)以滿足臨床日益增長的需求。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的是為了提供一種提高紅豆杉紫杉醇產(chǎn)量、降低其生產(chǎn)成本的紅豆杉固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基及其制備方法和紅豆杉固態(tài)發(fā)酵方法。
為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：一種紅豆杉固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基包括A培養(yǎng)基和B培養(yǎng)基，其中A培養(yǎng)基包括如下重量份：紅豆杉枝葉粉末100份、麩皮40-50g份、豆粕4-5份、大米粉10份；
B培養(yǎng)基包括如下重量份：蛋白胨2份、酵母浸膏1-2份、氯化鈉5份、磷酸二氫鉀0.3份、硫酸鎂0.2份、葡萄糖8-10份、土豆汁，所述土豆汁體積與所述氯化鈉質(zhì)量的比為20mL：1g。
進一步優(yōu)選的，所述A培養(yǎng)基包括如下重量份：紅豆杉枝葉粉末100份、麩皮50g份、豆粕5份、大米粉10份；
所述B培養(yǎng)基包括如下重量份：：蛋白胨2份、酵母浸膏1份、氯化鈉5份、磷酸二氫鉀0.3份、硫酸鎂0.2份、葡萄糖10份、土豆汁，所述土豆汁體積與所述氯化鈉質(zhì)量的比為20mL：1g。
上述紅豆杉固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基的制備方法包括如下步驟：將紅豆杉粉末用甲醛熏蒸至少12h后與麩皮、豆粕、大米粉混合均勻即得A培養(yǎng)基；
將新鮮土豆去皮切塊，用5倍切塊土豆質(zhì)量的水煮沸至少30min，然后用紗布過濾，濾液自然冷卻至室溫后用蒸餾水定容至5倍切塊土豆質(zhì)量的水對應的體積得土豆汁；
將蛋白胨、酵母浸膏、氯化鈉、磷酸二氫鉀、硫酸鎂和葡萄糖用土豆汁溶解后，用氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH至7，即得B培養(yǎng)基。
進一步優(yōu)選的，所述的氫氧化鈉濃度為3mol/L。
一種利用上述紅豆杉固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基進行的紅豆杉固態(tài)發(fā)酵方法包括如下步驟：
A.培養(yǎng)基準備：將制備好的B培養(yǎng)基與A培養(yǎng)基中的麩皮、豆粕和大米粉混合均勻后滅菌，滅菌后的混合物與甲醛熏蒸后的紅豆杉粉末混合均勻即得培養(yǎng)基，將培養(yǎng)基裝于容器中，厚度為0.8-1.2cm；
B.菌種液的制備：將斜面菌種接種于裝有PDB培養(yǎng)基的已滅菌的容器中，在溫度為28℃、攪拌速度200rpm/min條件下恒溫培養(yǎng)60-80h，制得種子液；
C.接種及培養(yǎng)：將種子液按質(zhì)量分數(shù)1％-5％的量接入已制備好的培養(yǎng)基中，于26-32℃溫度下靜置培養(yǎng)6-10天；
所述菌種編號為CPCC 800037，保存于中國藥學微生物菌種保藏管理中心。
進一步的，所述步驟A中滅菌條件為：溫度為121℃、壓力為0.1MPa滅菌鍋內(nèi)滅菌20min。
進一步優(yōu)選的，所述步驟B中恒溫培養(yǎng)時間為72h。
進一步的，所述步驟B中種子液接入培養(yǎng)基后，在培養(yǎng)基上蓋上紗布并捆扎結(jié)實。
進一步優(yōu)選的，所述步驟A中培養(yǎng)基的厚度為1cm。
采用本發(fā)明提供的培養(yǎng)基對紅豆杉進行發(fā)酵能有效提高發(fā)酵培養(yǎng)產(chǎn)物中紫杉醇的含量，且該方法為首次嘗試對紅豆杉進行固體發(fā)酵，對紫杉醇生產(chǎn)行業(yè)具有重要意義。
具體實施方式
下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明做進一步說明。所述實施例僅為本發(fā)明的優(yōu)選實施例而已，并不用于限制本發(fā)明，對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說，本發(fā)明可以有各種更改和變化。凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進等，均應包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。
實施例中用于制備含紅豆杉粉末固體真菌發(fā)酵培養(yǎng)基的紅豆杉枝葉粉末為本公司種植的曼地亞紅豆杉枝葉經(jīng)過風干粉碎而得，其他各項成分可通過市購的方式獲得。
實施例一
培養(yǎng)基配置：將紅豆杉粉末100g用甲醛熏蒸12h備用。
制備B培養(yǎng)基：制備土豆汁：將200g新鮮土豆去皮切塊，用1L的水煮沸30min，然后用4層紗布過濾，過濾液自然冷卻至室溫后用蒸餾水定容至1L備用，pH為自然。
將蛋白胨2g，酵母浸膏1g，氯化鈉5g，磷酸二氫鉀0.3g，硫酸鎂0.2g，葡萄糖10g溶于100ml土豆汁中，用3mol/L的氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH至7，備用。
將制備好的B培養(yǎng)基與A培養(yǎng)基除紅豆杉粉末以外的其余成分混合均勻，121℃、0.1Mpa滅菌鍋20分鐘后冷卻，將熏蒸后的紅豆杉粉末100g與滅菌后的培養(yǎng)基混合均勻備用。
接種：將搖瓶培養(yǎng)的菌種液按質(zhì)量分數(shù)3％的量接入已制備好的培養(yǎng)基中，于30℃條件下培養(yǎng)7天，用甲醇提取，HPLC測定紫杉醇含量。
實施例二
培養(yǎng)基配置：將紅豆杉粉末100g用甲醛熏蒸12h備用。
制備B培養(yǎng)基：制備土豆汁：將200g新鮮土豆去皮切塊，用1L的水煮沸30min，然后用4層紗布過濾，過濾液自然冷卻至室溫后用蒸餾水定容至1L備用，pH為自然。
將蛋白胨2g，酵母浸膏1g，氯化鈉5g，磷酸二氫鉀0.3g，硫酸鎂0.2g，葡萄糖10g溶于100ml土豆汁中，用3mol/L的氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH至7，備用。
將制備好的B培養(yǎng)基與A培養(yǎng)基除紅豆杉粉末以外的其余成分混合均勻，121℃、0.1Mpa滅菌鍋20分鐘后冷卻，將熏蒸后的紅豆杉粉末100g與滅菌后的培養(yǎng)基混合均勻備用。
菌種液制備：將斜面菌種，接種于裝有PDB培養(yǎng)基的已滅菌的三角瓶中，28℃、200rpm/min，恒溫培養(yǎng)3天，制得種子液備用。
接種：將搖瓶培養(yǎng)的菌種液按質(zhì)量分數(shù)1％的量接入已制備好的培養(yǎng)基中，于32℃條件下培養(yǎng)10天，用甲醇提取，HPLC測定紫杉醇含量。
實施例三
培養(yǎng)基配置：將紅豆杉粉末100g用甲醛熏蒸12h備用。
制備B培養(yǎng)基：制備土豆汁：將200g新鮮土豆去皮切塊，用1L的水煮沸30min，然后用4層紗布過濾，過濾液自然冷卻至室溫后用蒸餾水定容至1L備用，pH為自然。
將蛋白胨2g，酵母浸膏1g，氯化鈉5g，磷酸二氫鉀0.3g，硫酸鎂0.2g，葡萄糖10g溶于100ml土豆汁中，用3mol/L的氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH至7，備用。
將制備好的B培養(yǎng)基與A培養(yǎng)基除紅豆杉粉末以外的其余成分混合均勻，121℃、0.1Mpa滅菌鍋20分鐘后冷卻，將熏蒸后的紅豆杉粉末100g與滅菌后的培養(yǎng)基混合均勻備用。
菌種液制備：將斜面菌種，接種于裝有PDB培養(yǎng)基的已滅菌的三角瓶中，28℃、200rpm/min，恒溫培養(yǎng)3天，制得種子液備用。
接種：將搖瓶培養(yǎng)的菌種液按質(zhì)量分數(shù)5％的量接入已制備好的培養(yǎng)基中，于28℃條件下培養(yǎng)6天，用甲醇提取，HPLC測定紫杉醇含量。
以同批未發(fā)酵紅豆杉枝葉，用甲醇提取，HPLC測定紫杉醇含量作為對照，各實施例的對照數(shù)據(jù)如表1所示。
表1紫杉醇含量對比結(jié)果