本發(fā)明屬于細(xì)胞系構(gòu)建方法技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種含人APP啟動(dòng)子-luci細(xì)胞系，本發(fā)明還涉及上述含人APP啟動(dòng)子-luci細(xì)胞系的構(gòu)建方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

阿爾茨海默病(Alzheimer’s Disease，AD)，俗稱老年癡呆癥；是以進(jìn)行性癡呆為其主要臨床特征的神經(jīng)系統(tǒng)退行性病變。阿爾茨海默病患者認(rèn)知和記憶能力不斷下降，并伴有各種神經(jīng)精神癥狀和行為障礙。就現(xiàn)有技術(shù)而言，阿爾茨海默病在臨床上尚無(wú)有效的治療方法。

近年來(lái)國(guó)、內(nèi)外研究表明：在阿爾茨海默病病情進(jìn)展中，Aβ聚集并形成淀粉樣原纖維是老年斑形成的關(guān)鍵步驟，也是導(dǎo)致神經(jīng)元損傷的重要因素。神經(jīng)元細(xì)胞中APP表達(dá)異常增高是加速Aβ產(chǎn)生和聚集的重要因素之一。多年來(lái)，研究人員致力于研發(fā)一種能夠抑制APP表達(dá)且無(wú)明顯細(xì)胞毒性作用的藥物。但目前在技術(shù)領(lǐng)域仍然缺乏高效篩選抑制APP啟動(dòng)子區(qū)活性藥物的平臺(tái)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種含人APP啟動(dòng)子-luci細(xì)胞系，能用于篩選抑制人APP表達(dá)的新型抗老年癡呆化合物及治療性藥物。

本發(fā)明的另一目的是提供上述含人APP啟動(dòng)子-luci細(xì)胞系的構(gòu)建方法。

本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供上述含人APP啟動(dòng)子-luci細(xì)胞系在篩選抑制人APP表達(dá)的新型抗老年癡呆化合物及治療性藥物中的應(yīng)用。

本發(fā)明所采用的第一種技術(shù)方案是，含人APP啟動(dòng)子-luci細(xì)胞系，其具有SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列。

本發(fā)明所采用的第二種技術(shù)方案是，含人APP啟動(dòng)子-luci細(xì)胞系的構(gòu)建方法，具體按照以下步驟實(shí)施：

步驟1、構(gòu)建含人APP啟動(dòng)子區(qū)-熒光素酶嵌合基因的表達(dá)載體，該表達(dá)載體為：pGL3-APPP_luc-puro質(zhì)粒；

步驟2、將步驟1中構(gòu)建的pGL3-APPP_luc-puro質(zhì)粒與pRL-SV40質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染人胚腎細(xì)胞系HEK-293T細(xì)胞系；

步驟3、將步驟2中被轉(zhuǎn)染的HEK-293T細(xì)胞經(jīng)胰酶消化后鋪種于10cm培養(yǎng)皿中，并采用嘌呤霉素加壓篩選獲得基因組中有可能穩(wěn)定整合人APP啟動(dòng)子區(qū)-熒光素酶嵌合基因的細(xì)胞系，共五株，分別為：1A3、2A3、2A6、1B3和2B3；通過(guò)對(duì)篩選得到的五株細(xì)胞系中螢火蟲熒光素酶及海腎熒光素酶的活性檢測(cè)，得到含人APP啟動(dòng)子-luci細(xì)胞系，即為1A3細(xì)胞系。

本發(fā)明第二種技術(shù)方案的特點(diǎn)還在于：

步驟1具體按照以下步驟實(shí)施：

步驟1.1、以pRL-SV40載體為模板，并采用引物1和引物2，經(jīng)PCR擴(kuò)增獲得SV40增強(qiáng)子/啟動(dòng)子區(qū)序列片段；

引物1為：

TGGTAAAATCGATAAGAGTCCGCGCAGCACCATGGCCTGAA；

引物2為：

GTGGGCTTGTACTCGGTCATGGATCCTTGCAAAAGCCTAGG；

以pBrit-HA/Flag載體為模板，并采用引物3和引物4，經(jīng)PCR擴(kuò)增獲得嘌呤霉素抗性基因序列片段；

引物3為：

CCTAGGCTTTTGCAAGGATCCATGACCGAGTACAAGCCCAC；

引物4為：

CTCTCAAGGGCATCGGTCGACTCAGGCACCGGGCTTGCGGG；

步驟1.2、待步驟1.1完成，運(yùn)用二次PCR方法，再利用引物1和引物4，以凝膠純化后的SV40增強(qiáng)子/啟動(dòng)子區(qū)序列片段和嘌呤霉素抗性基因序列片段為模板，經(jīng)PCR擴(kuò)增獲得SV40增強(qiáng)子/啟動(dòng)子及嘌呤霉素抗性基因融合片段；

步驟1.3、經(jīng)步驟1.2后，先將pGL3-basic表達(dá)載體用限制性酶切酶BamH I-HF和Sal I-HF進(jìn)行雙酶切，接著采用熱敏堿性磷酸酶對(duì)酶切產(chǎn)物進(jìn)行去磷酸化處理，最后采用凝膠純化方法回收載體片段；

步驟1.4、采用Infusion-HD連接酶連接經(jīng)步驟1.3雙酶切后得到的載體pGL3-basic和目的基因片段SV40增強(qiáng)子/啟動(dòng)子及嘌呤霉素抗性基因融合片段，得到連接產(chǎn)物A；

步驟1.5、將經(jīng)步驟1.4得到的連接產(chǎn)物A轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，并于次日挑取陽(yáng)性克隆，提取質(zhì)粒并送測(cè)序，獲得的載體命名為pGL3-puro1，獲得的該載體還保留了pGL3-basic載體的原有氨芐抗性基因及螢火蟲熒光素酶基因序列片段；

步驟1.6、提取人膠質(zhì)細(xì)胞系A(chǔ)172細(xì)胞的基因組DNA，具體按照以下方法實(shí)施：

采用引物5和引物6，經(jīng)PCR法擴(kuò)增人APP，即淀粉樣蛋白前體蛋白基因，啟動(dòng)子區(qū)基因片段；

所述引物5為：

CTATCGATAGGTACCGAGCTCTGCATTTTTAGTAGAGATGGGGG；

所述引物6為：

ACTTAGATCGCAGATCTCGAGGGGTTAAGGTCTTGGGGGGTAT；

步驟1.7、先將經(jīng)步驟1.5獲得的pGL3-puro1表達(dá)載體用限制性酶切酶Sac I-HF和Xho I-HF進(jìn)行雙酶切，然后采用熱敏堿性磷酸酶對(duì)酶切產(chǎn)物進(jìn)行去磷酸化處理，最后采用凝膠純化方法回收載體片段；

步驟1.8、采用Infusion-HD連接酶連接經(jīng)步驟1.7雙酶切后的載體pGL3-puro1和目的基因片段APPP，得到連接產(chǎn)物B；

步驟1.9、將經(jīng)步驟1.8得到的連接產(chǎn)物B轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，次日挑取陽(yáng)性克隆，提取質(zhì)粒并送測(cè)序，獲得的載體命名為pGL3-APPP_luc-puro，所述pGL3-APPP_luc-puro載體中保留了pGL3-puro1載體原有氨芐抗性基因、嘌呤霉素抗性基因序列及SV40啟動(dòng)子/增強(qiáng)子基因序列片段。

步驟1.3中雙酶切的條件為：先于37℃條件下反應(yīng)3.5h～4.5h，再于65℃條件下滅活20min～30min；

步驟1.3中去磷酸化處理的反應(yīng)條件為：先于37℃條件下反應(yīng)30min～60min，在于65℃條件下滅活10min～12min。

步驟1.4中的反應(yīng)條件為：先于50℃條件下反應(yīng)13min～17min；再于4℃條件下冷卻1min～3min。

步驟1.7中的反應(yīng)條件具體如下：

雙酶切條件為：先于37℃條件下反應(yīng)3h～5h，再于65℃條件下滅活20min～30min；

去磷酸化處理的反應(yīng)條件為：先于37℃條件下反應(yīng)50min～70min，再于65℃條件下65℃滅活10min～12min。

步驟1.8中的反應(yīng)條件具體如下：先于50℃條件下反應(yīng)15min，再于4℃條件下冷卻2min～4min。

步驟2具體按照以下步驟實(shí)施：

步驟2.1、將1×10⁵個(gè)HEK-293T細(xì)胞鋪種于24孔板中；

步驟2.2、待24h之后，采用脂質(zhì)體2000將0.8微克的pGL3-APPP_luc-puro質(zhì)粒和0.2微克的pRL-SV40質(zhì)粒轉(zhuǎn)染人胚腎細(xì)胞系HEK-293T細(xì)胞系。

步驟3具體按照以下步驟實(shí)施i:

步驟3.1、采用胰酶消化經(jīng)步驟2得到的被轉(zhuǎn)染細(xì)胞；

步驟3.2、經(jīng)步驟3.1后，將被轉(zhuǎn)染細(xì)胞分別鋪種于兩個(gè)直徑為10cm細(xì)胞培養(yǎng)皿中，每個(gè)培養(yǎng)皿中都預(yù)先加入10mL含10％胎牛血清和1μg/mL嘌呤霉素的DMEM培養(yǎng)基；

于1μg/mL嘌呤霉素加壓條件下，篩選細(xì)胞2周，能夠觀察到培養(yǎng)皿中形成多個(gè)陽(yáng)性細(xì)胞克隆團(tuán)；

步驟3.3、待步驟3.2完成，先將經(jīng)細(xì)胞消化液潤(rùn)濕后的無(wú)菌濾紙覆蓋于單一陽(yáng)性細(xì)胞克隆團(tuán)上，待全部陽(yáng)性細(xì)胞克隆團(tuán)被濾紙覆蓋后，再將培養(yǎng)皿置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育3min～6min后取出培養(yǎng)皿；

然后采用無(wú)菌鑷子將沾有陽(yáng)性細(xì)胞克隆團(tuán)的濾紙轉(zhuǎn)移至24孔板；

最后采用含有1μg/mL嘌呤霉素和10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞；

步驟3.4、篩選經(jīng)步驟3.3得到的細(xì)胞系，初步獲得五株能穩(wěn)定整合人APP啟動(dòng)子區(qū)-螢火蟲熒光素酶和海腎熒光素酶基因的細(xì)胞系，簡(jiǎn)稱為含人APP啟動(dòng)子-luci細(xì)胞系，并將這五株細(xì)胞系分別命名為：1A3、2A3、2A6、1B3和2B3；

步驟3.5、將步驟3.4中的五株細(xì)胞系培養(yǎng)于1μg/mL嘌呤霉素含10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中；

步驟3.6、經(jīng)步驟3.5后，采用雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)試劑盒對(duì)步驟3.4中篩選到的五株APPP-luci細(xì)胞系：1A3、2A3、2A6、1B3和2B3進(jìn)行螢火蟲熒光素酶及海腎熒光素酶表達(dá)檢測(cè)，以確定APP啟動(dòng)子區(qū)序列能否正常啟動(dòng)螢火蟲熒光素酶表達(dá)，最終得到一株基因組中確定能穩(wěn)定整合人APP啟動(dòng)子區(qū)-熒光素酶嵌合基因且高效表達(dá)螢火蟲熒光素酶和海腎熒光素酶的細(xì)胞系，即為含人APP啟動(dòng)子區(qū)-熒光素酶嵌合基因的細(xì)胞系；

對(duì)篩選到的五株APPP-luci細(xì)胞系：1A3、2A3、2A6、1B3和2B3進(jìn)行表達(dá)檢測(cè)，其具體的方法如下：

步驟a、分別將五株APPP-luci細(xì)胞系：1A3、2A3、2A6、1B3和2B3鋪種于24孔培養(yǎng)板中，每孔1×10⁵個(gè)細(xì)胞，培養(yǎng)24h，

步驟b、經(jīng)步驟a后，去除細(xì)胞培養(yǎng)液，每孔加入50μL細(xì)胞裂解液1×Passive lysis buffer，于室溫條件下反應(yīng)15min～20min；

步驟c、取5μL步驟b中細(xì)胞裂解液，加入白色不透明96孔板中，并在每孔中加入50μL螢火蟲熒光素酶底物液，讀取熒光強(qiáng)度，然后加入50μL海腎熒光素酶底物液，讀取熒光強(qiáng)度；

步驟d、通過(guò)比較5株細(xì)胞系中螢火蟲熒光素酶活性相對(duì)強(qiáng)弱RLA來(lái)確定插入螢火蟲熒光素酶基因上游的人源APP啟動(dòng)子區(qū)基因序列是否能驅(qū)動(dòng)螢火蟲熒光素酶表達(dá)，螢火蟲熒光素酶活性相對(duì)強(qiáng)弱按照如下算法獲得：

RLA＝螢火蟲熒光素酶活性(LA_F)/海腎熒光素酶活性(LA_R)；

經(jīng)計(jì)算后得到：篩選到的五株穩(wěn)定細(xì)胞系中1A3、1B3和2B3既表達(dá)螢火蟲熒光素酶，又表達(dá)海腎熒光素酶，其中1A3細(xì)胞株中兩種熒光素酶表達(dá)效率較高，＝該細(xì)胞系可用于篩選具有調(diào)控人APP啟動(dòng)子區(qū)活性作用的化合物。

本發(fā)明所采用的第三種技術(shù)方案是，上述含人APP啟動(dòng)子-luci細(xì)胞系在篩選抑制人APP表達(dá)的新型抗老年癡呆化合物及治療性藥物中的應(yīng)用。

本發(fā)明的有益效果在于：

(1)在構(gòu)建本發(fā)明含人APP啟動(dòng)子-luci細(xì)胞系的方法中，在pGL3-basic載體中插入了SV40啟動(dòng)子/增強(qiáng)子和嘌呤霉素抗性基因融合片段，所構(gòu)建出的pGL3-puro1載體具有嘌呤霉素抗性，經(jīng)轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，可以采用嘌呤霉素進(jìn)行篩選細(xì)胞，具有低成本和高效性的優(yōu)點(diǎn)。

(2)在本發(fā)明含人APP啟動(dòng)子-luci細(xì)胞系的構(gòu)建方法中，人源APP啟動(dòng)子區(qū)序列片段來(lái)源于人膠質(zhì)細(xì)胞基因組，將該片段插入pGL3-puro1載體中的螢火蟲熒光素酶基因上游，構(gòu)建出的pGL3-APPP_luc-puro載體，經(jīng)轉(zhuǎn)染人胚腎HEK-293T細(xì)胞并采用嘌呤霉素篩選后獲得了穩(wěn)定細(xì)胞系，其中1A3細(xì)胞中螢火蟲熒光素酶和海腎熒光素酶表達(dá)較高，可如說(shuō)明書中的圖7所示，能用于大規(guī)模篩選抑制人APP表達(dá)的新型抗老年癡呆化合物及治療性藥物。

附圖說(shuō)明

圖1是SV40增強(qiáng)子/啟動(dòng)子區(qū)基因片段瓊脂糖凝膠電泳圖；

圖2是嘌呤霉素抗性基因片段瓊脂糖凝膠電泳圖；

圖3是凝膠純化回收APPP片段、SV40增強(qiáng)子/啟動(dòng)子區(qū)基因片段和BamH I-HF/Sal I-HF雙酶切后的pGL3-basic載體片段經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后的圖；

圖4是pGL3-puro1載體的結(jié)構(gòu)示意圖；

圖5是APPP基因片段瓊脂糖凝膠電泳圖；

圖6是pGL3-APPP_luc-puro載體的結(jié)構(gòu)示意圖；

圖7是1A3、2A3、2A6、1B3和2B3穩(wěn)定細(xì)胞系中螢火蟲熒光素酶及海腎熒光素酶表達(dá)檢測(cè)結(jié)果。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施方式對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明。

本發(fā)明含人APP啟動(dòng)子-luci細(xì)胞系，其具有SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列。

本發(fā)明含人APP啟動(dòng)子-luci細(xì)胞系的構(gòu)建方法，具體按照以下步驟實(shí)施：

步驟1、構(gòu)建含人APP啟動(dòng)子區(qū)-熒光素酶嵌合基因的表達(dá)載體，該表達(dá)載體為：pGL3-APPP_luc-puro質(zhì)粒，具體按照以下步驟構(gòu)建：

步驟1.1、以pRL-SV40載體為模板，并采用引物1和引物2，經(jīng)PCR擴(kuò)增獲得SV40增強(qiáng)子/啟動(dòng)子區(qū)序列片段；

SV40增強(qiáng)子/啟動(dòng)子區(qū)序列片段可如圖1所示：瓊脂糖凝膠電泳分析PCR產(chǎn)物；圖1種的第7和第8泳道為經(jīng)過(guò)PCR獲得的SV40增強(qiáng)子/啟動(dòng)子區(qū)序列片段，其大小約為450bp，且條帶單一、產(chǎn)物量大，可用于凝膠純化及后續(xù)的二次PCR反應(yīng)；

另外，引物1和引物2分別如下：

引物1為：

TGGTAAAATCGATAAGAGTCCGCGCAGCACCATGGCCTGAA；

引物2為：

GTGGGCTTGTACTCGGTCATGGATCCTTGCAAAAGCCTAGG；

以pBrit-HA/Flag載體為模板，并采用引物3和引物4，經(jīng)PCR擴(kuò)增獲得嘌呤霉素抗性基因序列片段；

嘌呤霉素抗性基因序列片段可如圖2所示：瓊脂糖凝膠電泳分析PCR產(chǎn)物，圖2中的第2泳道為經(jīng)過(guò)PCR獲得的嘌呤霉素抗性基因序列片段，其大小約為650bp，且條帶單一、產(chǎn)物濃度較低，但仍可作可用于凝膠純化及后續(xù)的二次PCR反應(yīng)；

另外，引物3和引物4分別如下：

引物3為：

CCTAGGCTTTTGCAAGGATCCATGACCGAGTACAAGCCCAC；

引物4為：

CTCTCAAGGGCATCGGTCGACTCAGGCACCGGGCTTGCGGG；

步驟1.2、待步驟1.1完成，運(yùn)用二次PCR方法，再利用引物1和引物4，以凝膠純化后的SV40增強(qiáng)子/啟動(dòng)子區(qū)序列片段和嘌呤霉素抗性基因序列片段為模板，經(jīng)PCR擴(kuò)增獲得SV40增強(qiáng)子/啟動(dòng)子及嘌呤霉素抗性基因融合片段；

步驟1.3、經(jīng)步驟1.2后，先將pGL3-basic表達(dá)載體用限制性酶切酶BamH I-HF和Sal I-HF進(jìn)行雙酶切；接著采用熱敏堿性磷酸酶對(duì)酶切產(chǎn)物進(jìn)行去磷酸化處理，最后采用凝膠純化方法回收載體片段；

回收的pGL3-basic載體片段可如圖3中的第4泳道所示：條帶單一且濃度較高，可用于后續(xù)的連接反應(yīng)。

在步驟1.3中：

雙酶切的條件為：先于37℃條件下反應(yīng)3.5h～4.5h，再于65℃條件下滅活20min～30min；

去磷酸化處理的反應(yīng)條件為：先于37℃條件下反應(yīng)30min～60min，在于65℃條件下滅活10min～12min。

步驟1.4、采用Infusion-HD連接酶連接經(jīng)步驟1.3雙酶切后得到的載體pGL3-basic和目的基因片段SV40增強(qiáng)子/啟動(dòng)子及嘌呤霉素抗性基因融合片段，得到連接產(chǎn)物A；

步驟1.4中的反應(yīng)條件具體如下：

先于50℃條件下反應(yīng)13min～17min；

再于4℃條件下冷卻1min～3min。

步驟1.5、將經(jīng)步驟1.4得到的連接產(chǎn)物A轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，并于次日挑取陽(yáng)性克隆，提取質(zhì)粒并送測(cè)序，其測(cè)序結(jié)果如圖4所示，獲得的載體命名為pGL3-puro1；

如圖4所示：在pGL3-puro1載體中，SV40啟動(dòng)子/增強(qiáng)子基因序列片段位于嘌呤霉素抗性基因序列片段上游，啟動(dòng)嘌呤霉素抗性基因表達(dá)；

獲得的該載體還保留了pGL3-basic載體的原有氨芐抗性基因及螢火蟲熒光素酶基因序列片段。

步驟1.6、提取人膠質(zhì)細(xì)胞系A(chǔ)172細(xì)胞的基因組DNA，具體方法如下：

采用引物5和引物6，經(jīng)PCR法擴(kuò)增人APP(淀粉樣蛋白前體蛋白)基因啟動(dòng)子區(qū)基因片段，如圖5中的泳道2所示，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后，APP啟動(dòng)子區(qū)基因片段大小約為2250bp，條帶單一；

經(jīng)凝膠純化回收，如圖3中的第2泳道所示，純化后的APP啟動(dòng)子區(qū)基因片段純度高，瓊脂糖凝膠電泳條帶單一，可用于后續(xù)了連接反應(yīng)。

APP啟動(dòng)子區(qū)基因片段片段簡(jiǎn)寫為：APPP，該段基因序列位于APP基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游1823bp至下游329bp(-1823bp/+329bp)處；

另外，引物5和引物6分別為：

引物5為：

CTATCGATAGGTACCGAGCTCTGCATTTTTAGTAGAGATGGGGG；

引物6為：

ACTTAGATCGCAGATCTCGAGGGGTTAAGGTCTTGGGGGGTAT。

步驟1.7、先將經(jīng)步驟1.5獲得的pGL3-puro1表達(dá)載體用限制性酶切酶Sac I-HF和Xho I-HF進(jìn)行雙酶切，然后采用熱敏堿性磷酸酶對(duì)酶切產(chǎn)物進(jìn)行去磷酸化處理，最后采用凝膠純化方法回收載體片段；

在步驟1.7中：

雙酶切條件為：先于37℃條件下反應(yīng)3h～5h，再于65℃條件下滅活20min～30min；

去磷酸化處理的反應(yīng)條件為：先于37℃條件下反應(yīng)50min～70min，再于65℃條件下65℃滅活10min～12min；

步驟1.8、采用Infusion-HD連接酶連接經(jīng)步驟1.7雙酶切后的載體pGL3-puro1和目的基因片段APPP，得到連接產(chǎn)物B；

步驟1.8中的反應(yīng)條件具體如下：

先于50℃條件下反應(yīng)15min；

再于4℃條件下冷卻2min～4min。

步驟1.9、將經(jīng)步驟1.8得到的連接產(chǎn)物B轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，次日挑取陽(yáng)性克隆，提取質(zhì)粒并送測(cè)序，獲得的載體命名為pGL3-APPP_luc-puro；

pGL3-APPP_luc-puro載體的結(jié)構(gòu)示意圖如圖6所示，在pGL3-APPP_luc-puro載體中，APPP位于螢火蟲熒光素酶基因序列上游，啟動(dòng)螢火蟲熒光素酶表達(dá)；pGL3-APPP_luc-puro載體中保留了pGL3-puro1載體原有氨芐抗性基因、嘌呤霉素抗性基因序列及SV40啟動(dòng)子/增強(qiáng)子基因序列片段。

步驟2、將步驟1中構(gòu)建的pGL3-APPP_luc-puro質(zhì)粒與pRL-SV40質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染人胚腎細(xì)胞系HEK-293T細(xì)胞系，具體按照以下方法實(shí)施：

步驟2.1、將1×10⁵個(gè)HEK-293T細(xì)胞鋪種于24孔板中；

步驟2.2、待24h之后，采用脂質(zhì)體2000將0.8微克的pGL3-APPP_luc-puro質(zhì)粒和0.2微克的pRL-SV40質(zhì)粒轉(zhuǎn)染人胚腎細(xì)胞系HEK-293T細(xì)胞系。

步驟3、將步驟2中被轉(zhuǎn)染的HEK-293T細(xì)胞經(jīng)胰酶消化后鋪種于10cm培養(yǎng)皿中，并采用嘌呤霉素加壓篩選獲得基因組中有可能穩(wěn)定整合人APP啟動(dòng)子區(qū)-熒光素酶嵌合基因的細(xì)胞系，共五株，分別為：1A3、2A3、2A6、1B3和2B3；通過(guò)對(duì)篩選得到的五株細(xì)胞系中螢火蟲熒光素酶及海腎熒光素酶的活性檢測(cè)，得到含人APP啟動(dòng)子-luci細(xì)胞系，即為1A3細(xì)胞系，具體按照以下步驟實(shí)施：

步驟3.1、采用胰酶消化經(jīng)步驟2得到的被轉(zhuǎn)染細(xì)胞；

步驟3.2、經(jīng)步驟3.1后，將被轉(zhuǎn)染細(xì)胞分別鋪種于兩個(gè)直徑為10cm細(xì)胞培養(yǎng)皿中；

每個(gè)培養(yǎng)皿中都預(yù)先加入10mL含10％胎牛血清和1μg/mL嘌呤霉素的DMEM培養(yǎng)基；于1μg/mL嘌呤霉素加壓條件下，篩選細(xì)胞2周，能夠觀察到培養(yǎng)皿中形成多個(gè)陽(yáng)性細(xì)胞克隆團(tuán)；

步驟3.3、待步驟3.2完成，先將經(jīng)細(xì)胞消化液潤(rùn)濕后的無(wú)菌濾紙覆蓋于單一陽(yáng)性細(xì)胞克隆團(tuán)上，待全部陽(yáng)性細(xì)胞克隆團(tuán)被濾紙覆蓋后，再將培養(yǎng)皿置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育3min～6min后取出培養(yǎng)皿；然后采用無(wú)菌鑷子將沾有陽(yáng)性細(xì)胞克隆團(tuán)的濾紙轉(zhuǎn)移至24孔板；最后采用含有1μg/mL嘌呤霉素和10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞；

步驟3.4、篩選經(jīng)步驟3.3得到的細(xì)胞，初步獲得五株能穩(wěn)定整合人APP啟動(dòng)子區(qū)-螢火蟲熒光素酶和海腎熒光素酶基因的細(xì)胞系，簡(jiǎn)稱為APPP-luci細(xì)胞系，并將這五株細(xì)胞系分別命名為：1A3、2A3、2A6、1B3和2B3；

步驟3.5、將步驟3.4中的五株細(xì)胞系培養(yǎng)于1μg/mL嘌呤霉素含10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中；

步驟3.6、經(jīng)步驟3.5后，采用雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)試劑盒對(duì)步驟3.4中篩選到的五株APPP-luci細(xì)胞系：1A3、2A3、2A6、1B3和2B3進(jìn)行螢火蟲熒光素酶及海腎熒光素酶表達(dá)檢測(cè)，以確定APP啟動(dòng)子區(qū)序列能否正常啟動(dòng)螢火蟲熒光素酶表達(dá)，最終得到一株基因組中確定能穩(wěn)定整合人APP啟動(dòng)子區(qū)-熒光素酶嵌合基因且高效表達(dá)螢火蟲熒光素酶和海腎熒光素酶的細(xì)胞系，即為含人APP啟動(dòng)子區(qū)-熒光素酶嵌合基因的細(xì)胞系；

其中，對(duì)篩選到的五株APPP-luci細(xì)胞系：1A3、2A3、2A6、1B3和2B3分別進(jìn)行檢測(cè)，其具體的方法如下：

步驟a、分別將五株APPP-luci細(xì)胞系：1A3、2A3、2A6、1B3和2B3鋪種于24孔培養(yǎng)板中，每孔1×10⁵個(gè)細(xì)胞，培養(yǎng)24h，

步驟b、經(jīng)步驟a后，去除細(xì)胞培養(yǎng)液，每孔加入50μL細(xì)胞裂解液(1×Passive lysis buffer)，于室溫條件下反應(yīng)15min～20min；

步驟c、取5μL步驟b中細(xì)胞裂解液，加入白色不透明96孔板中，并在每孔中加入50μL螢火蟲熒光素酶底物液，讀取熒光強(qiáng)度，然后加入50μL海腎熒光素酶底物液，讀取熒光強(qiáng)度；

步驟d、通過(guò)比較5株細(xì)胞系中螢火蟲熒光素酶活性相對(duì)強(qiáng)弱(RLA)來(lái)確定插入螢火蟲熒光素酶基因上游的人源APP啟動(dòng)子區(qū)基因序列是否能驅(qū)動(dòng)螢火蟲熒光素酶表達(dá)，螢火蟲熒光素酶活性相對(duì)強(qiáng)弱按照如下算法獲得：

RLA＝螢火蟲熒光素酶活性(LA_F)/海腎熒光素酶活性(LA_R)；

具體結(jié)果可如圖7所示，篩選到的五株穩(wěn)定細(xì)胞系中1A3、1B3和2B3既表達(dá)螢火蟲熒光素酶，又表達(dá)海腎熒光素酶，其中1A3細(xì)胞株中兩種熒光素酶表達(dá)效率較高，因此該細(xì)胞系可用于篩選具有調(diào)控人APP啟動(dòng)子區(qū)活性作用的化合物。

最終得到的1A3細(xì)胞建立后即可應(yīng)用于高通量篩選抑制人APP基因表達(dá)的抗老年癡呆藥物，具體檢查方法為：

采用不同濃度的待測(cè)化合物處理1A3細(xì)胞，24h后檢測(cè)螢火蟲熒光素酶和海腎熒光素酶表達(dá)，具體方法如下：

細(xì)胞經(jīng)1×Passive lysis buffer裂解后，加入螢火蟲熒光素酶底物和海腎熒光素酶底物，分別讀取熒光強(qiáng)度；通過(guò)比較待測(cè)化合物處理前后，APP啟動(dòng)子區(qū)活性強(qiáng)弱，即螢火蟲熒光素酶活性相對(duì)強(qiáng)弱(RLA)來(lái)確定待測(cè)化合物對(duì)APP啟動(dòng)子區(qū)的影響；

RLA＝螢火蟲熒光素酶活性(LAF)/海腎熒光素酶活性(LAR)。

待測(cè)化合物對(duì)APP啟動(dòng)子區(qū)抑制效率的計(jì)算公式具體如下：

在上式中：

LAF_c代表對(duì)照組(即溶劑組)螢火蟲熒光素酶活性值；

LAR_c代表對(duì)照組(即溶劑組)海腎熒光素酶活性值；

LAF_c代表實(shí)驗(yàn)組(即待測(cè)化合物組)螢火蟲熒光素酶活性值；

LAR_c代表實(shí)驗(yàn)組(即待測(cè)化合物組)海腎熒光素酶活性值；

B^LAFc，B^LARc、B^LAFt和B^LARt分別代表相應(yīng)96孔板的背景吸光值；

S.e.代表抑制效率。

判斷標(biāo)準(zhǔn)：

如果S.e.值接近0，說(shuō)明該化合物對(duì)APP啟動(dòng)子區(qū)活性無(wú)明顯影響；

如果S.e.值接近1，說(shuō)明該化合物能顯著抑制APP啟動(dòng)子區(qū)活性。