本發(fā)明涉及腫瘤治療的細(xì)胞藥物領(lǐng)域，特別是涉及一種PD-1 CAR-T細(xì)胞及其制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

隨著腫瘤免疫治療研究的逐步進(jìn)展，程序性死亡生長(zhǎng)因子-1(PD -1／CD 279 ) 及 其配體 PD-L1／2 (B7-H1／CD274) 作為腫瘤微環(huán)境中的重要成員獲得眾多研究者的青睞。2014年9月4號(hào) ，美國(guó)食品及藥物管理局 (food and drug adm inistration ，F(xiàn)D A ) 批準(zhǔn)了Keytruda (pembrolizum ab ) 用于治療對(duì)其它藥物治療無(wú)效的晚期或無(wú)法切除的黑色素瘤患者，成為阻斷 PD-1 細(xì)胞通路的首款獲得FD A批準(zhǔn)的藥物. 1992 年P(guān)D -1 首次被發(fā)現(xiàn) ，其主要表達(dá)于T細(xì)胞、調(diào)節(jié)性 T 細(xì)胞 、“ 耗盡 ”的 T 細(xì)胞 、B細(xì)胞 、活化單核細(xì)胞 、樹突細(xì)胞 、 自然殺傷細(xì)胞 、 自然殺傷 T 細(xì)胞 … 。 PD-1 一般表達(dá)于活化的 T 細(xì)胞 ，其包括跨膜區(qū)、莖區(qū) 、1 個(gè) Ig 超家族區(qū)和 1 個(gè)包含 ITIM 、ITSM 的細(xì)胞內(nèi)區(qū)。 PD -1 屬于協(xié)同抑制受體 ，有 2 個(gè)配體 ，分別為 PD-L1、PD-L2。 PD-L1在不同的惡性腫瘤中異常表達(dá)，如肺、食管、頭頸部的鱗狀細(xì)胞癌以及其他類型的惡性腫瘤 ，如卵巢癌 、膀胱癌 、惡性黑色素瘤和膠質(zhì)瘤中表達(dá)從結(jié)構(gòu) 上看 ，PD -L2 與 PD -L1 類似 ，同屬 于 I 型跨 膜蛋白，其包括信號(hào)肽、IgV 樣 區(qū)、IgC 樣區(qū)、莖區(qū)、跨膜區(qū)和胞質(zhì)區(qū)。PD-1 與配體 PD-L1／2 結(jié)合使 ITIM 和 ITSM 內(nèi)的酪氨酸磷酸化，ITIM 、IT SM 與 SH P- 1 和SH P-2 結(jié)合 ，通過(guò) BC L· X L 的下調(diào)表達(dá)和 T 細(xì)胞的分化傳遞 T 細(xì)胞抑制性信號(hào)，間接導(dǎo)致細(xì)胞死亡 。 PD -1 PD - L 1／2 途徑也被認(rèn)為是介導(dǎo)免疫抑制的路徑，PD -1 作為一個(gè)負(fù)性調(diào)控點(diǎn)起作用。 PD -1 和PD-L1 途徑的抑制作用在體外能加強(qiáng) T 細(xì)胞應(yīng)答；在體內(nèi) PD-1 與特異性配體 (PD-L1、PD -L2 ) 結(jié)合起作用，下調(diào)抗原刺激的淋巴細(xì)胞增殖及細(xì)胞因子的產(chǎn)生 ，最終導(dǎo)致淋巴細(xì)胞“ 耗盡 ”以及誘導(dǎo)免疫耐受。實(shí)體腫瘤中的腫瘤細(xì)胞可上調(diào) PD- L1 的表達(dá) ，繼而提供下調(diào)激活 T 細(xì)胞的抑制信號(hào)，最終關(guān)閉免疫反應(yīng)并誘導(dǎo)免疫耐受性。PD-Ll 高表達(dá) 的患者生存率顯著下降，與大多數(shù)報(bào)道腫瘤細(xì)胞上 PD -L1 的高表達(dá)與不良預(yù)后相關(guān) 且具有一致性. 除在惡性黑色素瘤表達(dá)外，PD -L1 還可在其他不同的腫瘤中表達(dá)，包括膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、胰腺癌 、卵巢癌 、乳腺癌、腎細(xì)胞癌 、頭頸部及食管鱗狀細(xì)胞癌和非小細(xì)胞肺癌，且腫瘤細(xì)胞上 PD -Ll 的高表達(dá)與不 良預(yù)后相關(guān)。

嵌合抗原受體T淋巴細(xì)胞技術(shù)(CAR-T) 的原理在于：經(jīng)嵌合抗原受體修飾的T細(xì)胞，可以特異性地識(shí)別腫瘤相關(guān)抗原，使效應(yīng)T細(xì)胞的靶向性、殺傷活性和持久性均較常規(guī)應(yīng)用的免疫細(xì)胞高，并可克服腫瘤局部免疫抑制微環(huán)境并打破宿主免疫耐受狀態(tài)。正常情況下，機(jī)體的T淋巴細(xì)胞是通過(guò)其表面的T 細(xì)胞受體來(lái)識(shí)別靶細(xì)胞的，這一識(shí)別具有特異性，即某一個(gè)T淋巴細(xì)胞只識(shí)別具有特定抗原的靶細(xì)胞，而且這種特定的抗原是在細(xì)胞內(nèi)加工后，在特殊分子的作用下呈遞給T淋巴細(xì)胞的。這種起抗原呈遞作用的分子存在于抗原呈遞細(xì)胞表面或靶細(xì)胞表面，即T細(xì)胞的活化不但需要特異性的識(shí)別抗原還需要有協(xié)同刺激信號(hào)。在腫瘤中：（1）腫瘤細(xì)胞要有抗原遞呈，才會(huì)被 T 細(xì)胞受體識(shí)別（特異性信號(hào)）。（2）要有第二信號(hào)參與（CD28參與），CD28也必須被活化。第一、第二信號(hào)都活化后，T細(xì)胞才可以殺傷腫瘤。然而腫瘤主要是從兩個(gè)方面實(shí)現(xiàn)了免疫逃逸：（1）腫瘤細(xì)胞抗原遞呈的機(jī)制會(huì)被下調(diào)甚至丟失該能力（HLA 陰性），導(dǎo)致 T 細(xì)胞無(wú)法識(shí)別腫瘤細(xì)胞。（2）很多腫瘤細(xì)胞異常高表達(dá)PD-L1 分子，使 T 細(xì)胞表面 PD-1 分子被活化，會(huì)導(dǎo)致T細(xì)胞功能的耗竭、甚至T細(xì)胞的死亡?；谶@種情況，科學(xué)家提出了構(gòu)建嵌合T細(xì)胞受體（現(xiàn)在一般稱為嵌合抗原受體）的概念。嵌合抗原受體（Chimeric Antigen Receptor， CAR）主要由兩部分構(gòu)成，一端位于細(xì)胞外能夠特異性識(shí)別癌細(xì)胞表面某一抗原的抗體，另一端位于胞內(nèi)含有信號(hào)激活元件（如T細(xì)胞受體的Zeta鏈），起傳遞信號(hào)激活T細(xì)胞的作用。這樣表達(dá)CAR 的T淋巴細(xì)胞（CAR-T細(xì)胞）就能避免T細(xì)胞受體識(shí)別靶細(xì)胞的限制，從而起到靶向癌細(xì)胞的殺傷作用。

構(gòu)建CAR-T就可以使T細(xì)胞識(shí)別和殺傷癌細(xì)胞不再受到限制，充分發(fā)揮T細(xì)胞的固有免疫殺傷功能。目前研究者針對(duì)多種腫瘤相關(guān)抗原設(shè)計(jì)CAR-T細(xì)胞，如CD138、CD19、ErbB2、EGFRvIII 、cell-surface glycoprotein （CS1）、GD2、CD20等，不過(guò)這些CAR-T細(xì)胞還大多處于研究階段，臨床效果還需要進(jìn)一步證實(shí)。因此需要用創(chuàng)新性的想法，設(shè)計(jì)構(gòu)建CAR-T細(xì)胞，實(shí)現(xiàn)實(shí)體腫瘤中治療中的突破。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明主要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種PD-1 CAR-T細(xì)胞及其制備方法和應(yīng)用，得到的PD-1 CAR-T細(xì)胞可特異性識(shí)別和結(jié)合PDL-1蛋白高表達(dá)的腫瘤細(xì)胞，可以在制備預(yù)防和治療腫瘤疾病的藥物中進(jìn)行應(yīng)用。

為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明采用的一個(gè)技術(shù)方案是：提供一種PD-1 CAR-T細(xì)胞，所述PD-1 CAR-T細(xì)胞是在T細(xì)胞內(nèi)表達(dá)PD-1-CD8-4-1BB-CD3ζ融合蛋白。

在本發(fā)明一個(gè)較佳實(shí)施例中，所述PD-1 CAR-T細(xì)胞的制備方法包括步驟為：

（1）合成和擴(kuò)增PD-1-CD8-4-1BB-CD3ζ融合蛋白基因，將所述PD-1-CD8-4-1BB-CD3ζ融合蛋白基因克隆到慢病毒表達(dá)載體上；

（2）利用慢病毒包裝質(zhì)粒和步驟（1）得到的慢病毒表達(dá)載體質(zhì)粒感染293T細(xì)胞，包裝和制備慢病毒；

（3）分離人外周血T細(xì)胞，培養(yǎng)擴(kuò)增，利用步驟（2）得到的慢病毒感染T細(xì)胞，使所述T細(xì)胞表達(dá)PD-1-CD8-4-1BB-CD3ζ融合蛋白，得到PD-1 CAR-T細(xì)胞。

在本發(fā)明一個(gè)較佳實(shí)施例中，所述T細(xì)胞的表面表達(dá)所述PD-1分子，所述T細(xì)胞的胞內(nèi)由所述4-1BB-CD3ζ分子傳遞T細(xì)胞活化信號(hào)。

在本發(fā)明一個(gè)較佳實(shí)施例中，所述PD-1-CD8-4-1BB-CD3ζ融合蛋白中所述PD-1的氨基酸序列如SEQ ID NO：5所示；所述PD-1-CD8-4-1BB-CD3ζ融合蛋白中所述CD8SEQ ID NO：1所示。

在本發(fā)明一個(gè)較佳實(shí)施例中，所述PD-1-CD8-4-1BB-CD3ζ融合蛋白中所述4-1BB的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示；所述PD-1-CD8-4-1BB-CD3ζ融合蛋白中的所述4-1BB能替換為CD28，所述CD28的分子序列如SEQ ID NO：3所示。

在本發(fā)明一個(gè)較佳實(shí)施例中，所述PD-1-CD8-4-1BB-CD3ζ融合蛋白中所述CD3ζ的氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示；所述T細(xì)胞來(lái)源于人外周血T淋巴細(xì)胞中。

在本發(fā)明一個(gè)較佳實(shí)施例中，所述PD-1-CD8-4-1BB-CD3ζ融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：6所示。

在本發(fā)明一個(gè)較佳實(shí)施例中，所述PD-1 CAR-T細(xì)胞在制備治療腫瘤藥物中的應(yīng)用。

在本發(fā)明一個(gè)較佳實(shí)施例中，所述PD-1 CAR-T細(xì)胞在制備治療高表達(dá)PDL-1分子的腫瘤藥物中的應(yīng)用。

本發(fā)明的有益效果是：本發(fā)明的PD-1 CAR-T細(xì)胞及其制備方法和應(yīng)用，采用嵌合抗原受體修飾和改造T細(xì)胞，將PD-1-CD8-4-1BB-CD3ζ分子在T細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，使改造后的T細(xì)胞能夠特異性識(shí)別和殺傷腫瘤，得到的細(xì)胞具備更高效的腫瘤殺傷活性。

附圖說(shuō)明

為了更清楚地說(shuō)明本發(fā)明實(shí)施例中的技術(shù)方案，下面將對(duì)實(shí)施例描述中所需要使用的附圖作簡(jiǎn)單地介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖僅僅是本發(fā)明的一些實(shí)施例，對(duì)于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來(lái)講，在不付出創(chuàng)造性勞動(dòng)的前提下，還可以根據(jù)這些附圖獲得其它的附圖，其中：

圖1是慢病毒質(zhì)粒載體PRRLSIN-PD-1圖；

圖2是高表達(dá)PD-L1的工程細(xì)胞株MCF7-PDL1 流式檢測(cè)結(jié)果圖；

圖3是PBMC活化兩天后流式檢測(cè)T細(xì)胞比例圖

圖4是檢測(cè)PD-1-CART不同體積的病毒14天侵染的效果圖；

圖5 是CAR-PD1體外殺傷實(shí)驗(yàn)結(jié)果：不同比例的effect圖；

圖6是PD-1-CAR-T 細(xì)胞增殖效果檢測(cè)圖；

圖7是不同效靶比條件下PD-1-CAR-T細(xì)胞體外殺傷效果圖。

具體實(shí)施方式

下面將對(duì)本發(fā)明實(shí)施例中的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實(shí)施例僅是本發(fā)明的一部分實(shí)施例，而不是全部的實(shí)施例?；诒景l(fā)明中的實(shí)施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒有做出創(chuàng)造性勞動(dòng)前提下所獲得的所有其它實(shí)施例，都屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。

實(shí)施例一：

慢病毒表達(dá)載體制備

基因合成PD-1- CD8^TM-4-1BB-CD3ζ融合基因序列，通過(guò)酶切轉(zhuǎn)化連接到PRRSLIN載體中，基因上游為EP-1α啟動(dòng)子。載體轉(zhuǎn)化Stbl3大腸桿菌菌株，氨芐青霉素篩選，獲得陽(yáng)性克隆，提取質(zhì)粒，酶切鑒定克隆，獲得PRRSLIN-PD-1慢病毒轉(zhuǎn)染載體,載體構(gòu)建圖見圖1。

實(shí)施例二：

慢病毒制備

（1）轉(zhuǎn)染前24小時(shí)，以每皿約8×10⁶將293T細(xì)胞接種至15cm培養(yǎng)皿中。確保轉(zhuǎn)染時(shí)細(xì)胞在80%左右的匯合度且均勻分布于培養(yǎng)皿中。

（2）準(zhǔn)備溶液A和溶液B

溶液A：6.25 ml 2 ×HEPES buffer緩沖液（5個(gè)大皿一起包裝的量，效果最好）。

溶液B：分以加入以下質(zhì)粒的混合物：112.5 ug pRRLSIN-EF-PD1（target plasmid）；39.5 ug pMD2.G (VSV-G envelop)；73 ug pCMVR8.74 (gag, pol, tat, rev)；625 μl 2M鈣離子溶液。溶液A總體積：6.25ml。

充分混勻溶液B，輕輕渦旋溶液A的同時(shí)，逐滴加入溶液A，靜置5-15分鐘。輕輕渦旋上述A和B的混合溶液，逐滴加入含293T細(xì)胞的培養(yǎng)皿中，輕輕前后晃動(dòng)培養(yǎng)皿使DNA與鈣離子的混合物均勻分布。（不要旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)皿）放置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16-18小時(shí)。更換新鮮培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)，分別在48小時(shí)和72小時(shí)后收集含病毒的上清液。熒光顯微鏡觀察。95%以上的細(xì)胞都應(yīng)該顯示綠色熒光。500g，25℃離心10分鐘。PES膜（0.45μm）過(guò)濾。以70%乙醇消毒貝克曼庫(kù)爾特Ultra-clear SW28 centrifuge tubes，并置于紫外燈下消毒30分鐘。將已過(guò)濾的含慢病毒的上清液轉(zhuǎn)移至離心管中。在離心管底部小心鋪上一層20%蔗糖（每8ml上清液加1ml蔗糖）。以PBS平衡離心管，25000rpm （82, 700g），4℃離心2小時(shí)。小心取出離心管，倒掉上清液，倒置離心管去掉殘余液體。加入100μl PBS，密封離心管，在4℃放置2小時(shí)，每20分鐘輕輕渦旋一次，500g離心1分鐘（25℃），收集病毒上清。冰上冷卻后，置于-80℃保存。

實(shí)施例三：

PD-1 CAR-T細(xì)胞制備

取0.5ml血進(jìn)行快速的病原微生物檢測(cè)，排除HBV、HCV、HDV 和HEV、HIV-1/2、梅毒螺旋體及寄生蟲等微生物感染；無(wú)菌條件下，用肝素瓶采血50ml（肝素抗凝），立即（4℃，24小時(shí)內(nèi)）送至細(xì)胞制備實(shí)驗(yàn)室，保證此過(guò)程無(wú)病原微生物污染。得到患者血液后，在GMP制備室，用酒精棉球擦拭肝素瓶表面進(jìn)行消毒后放入生物安全柜。預(yù)先打開2個(gè)50ml離心管，將血液轉(zhuǎn)入兩個(gè)50ml離心管中，旋緊。將上述裝好血液的兩個(gè)50ml離心管放入離心機(jī)離心。400 g （2000rpm），10min，室溫離心后收集上層血漿，留下沉淀層。收集的自體血漿經(jīng)56℃、30分鐘滅活。4℃放置15分鐘后，900g，30min，4℃離心，取上清備用。將上述富集的血細(xì)胞用生理鹽水稀釋至30ml/管，打開2個(gè)新的50ml離心管，每個(gè)離心管分別加入15ml人淋巴細(xì)胞分離液。用移液管把稀釋后的血細(xì)胞液緩緩加入到盛有人淋巴分離液的離心管中，旋緊。注意血液要加到淋巴分離液的上層，勿打破人淋巴分離液的界面。將加好的血細(xì)胞液放入離心機(jī)，調(diào)至最小的升降速率，400 g（2000rpm），20min，常溫離心。收集兩管的中層白細(xì)胞層于一支15ml無(wú)菌離心管中，加入5ml生理鹽水，洗兩次（400g，10min離心），得外周血單核細(xì)胞（PBMC）。配置完全生長(zhǎng)培養(yǎng)基，V-VIVO15添加自體AB（FBS）濃度為5%，IL-2濃度為40ng/ml，將分離得到的PBMC用培養(yǎng)基稀釋成2×10⁶/ml，取50ul流式檢測(cè)PBMC中T細(xì)胞的純度。0天，配置buffer1，PBS添加1%的FBS，將beads振蕩30s或手動(dòng)上下?lián)u勻5min，根據(jù)beads與T細(xì)胞比例3比1的比例取出CD3/CD28 beads置于1.5ml EP管中，添加1mlBuffer1清洗beads，之后使用磁鐵從EP管外吸beads 1min，棄洗液，重復(fù)兩次，再使用培養(yǎng)基將beads重懸到原體積，將細(xì)胞和beads混合后按2×10⁶ PBMC/ML加到合適的培養(yǎng)瓶中。第二天將細(xì)胞密度調(diào)整至3-5×10⁶/ml，按virus vector：cell=1:5比例添加virus vector，同時(shí)添加polybrene 4ug/ml和40ng/ml IL^-2。4h之后，補(bǔ)加新鮮的完全培養(yǎng)基將細(xì)胞密度調(diào)整至1×10⁶/ml繼續(xù)培養(yǎng)。將所有的細(xì)胞離心，加入新鮮的培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)。每隔2-3天進(jìn)行半量換液，維持細(xì)胞密度在0.5-1×10⁶/ml。10-12天，細(xì)胞數(shù)量達(dá)到10⁹級(jí)別，400g，5min離心得免疫細(xì)胞，再用預(yù)冷的PBS洗滌兩遍（400g，5min）。用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞類群，CART細(xì)胞比例。每天觀察培養(yǎng)基的顏色變化、細(xì)胞密度、細(xì)胞形態(tài)并作相應(yīng)記錄。逐步擴(kuò)大培養(yǎng)過(guò)程中，加入總體積所需的白細(xì)胞介素2。

結(jié)果顯示: PBMC活化兩天后流式檢測(cè)T細(xì)胞比例達(dá)到80%以上(見圖3),病毒侵染T細(xì)胞后, 檢測(cè)PD-1-CART不同體積的病毒14天侵染的效果,結(jié)果顯示有35.8%的細(xì)胞被侵染成功（圖4），制備成PD-1-CART細(xì)胞。

實(shí)施例四：

工程細(xì)胞株的構(gòu)建及檢測(cè)

（1）慢病毒PD-L1的制備（具體制備方法見實(shí)施例二中的方法）；

（2）MCF細(xì)胞的侵染：侵染前一天，接種50萬(wàn)個(gè)MCF7細(xì)胞于6孔板中，待第二天細(xì)胞長(zhǎng)到80%時(shí)，加入包裝好的500ul的PD-L1病毒于6孔板中，同時(shí)設(shè)置對(duì)照細(xì)胞（不添加病毒），12-16小時(shí)后換液，侵染3天后，流式分選PD-L1的陽(yáng)性細(xì)胞；

（3）工程細(xì)胞株的檢測(cè)：取分選的PD-L1的陽(yáng)性細(xì)胞2萬(wàn)個(gè)，400g，5min，再用預(yù)冷的PBS洗滌兩遍，加入2.5ul的PD-L1的抗體（Biolegend）避光孵育20min，離心，再用預(yù)冷的PBS洗滌1遍，100ul PBS重懸細(xì)胞，上流式檢測(cè)PD-L1的表達(dá),見圖2,實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明工程細(xì)胞株構(gòu)建成功，可作為靶細(xì)胞用于后續(xù)殺傷實(shí)驗(yàn)。

實(shí)施例五:

PD-1 CAR-T細(xì)胞體外活性檢測(cè)

ELISA方法檢測(cè)LDH釋放實(shí)驗(yàn)，即檢測(cè)PD-1 CAR-T細(xì)胞對(duì)MCF7-PD-L1靶細(xì)胞的殺傷效應(yīng)。

（1）用含5％小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液將靶細(xì)胞調(diào)整到5×10⁴/ml。

（2）在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中加入靶細(xì)胞，每孔加100μl。3個(gè)效應(yīng)細(xì)胞自然釋放對(duì)照孔不加靶細(xì)胞，只加100μl培養(yǎng)液。

（3）向各孔加100μl效應(yīng)細(xì)胞，效應(yīng)細(xì)胞與靶細(xì)胞的比例50:1; 25:1; 10:1; 5:1; 1:1。自然釋放孔不加效應(yīng)細(xì)胞只加100μl培養(yǎng)液，效應(yīng)細(xì)胞與靶細(xì)胞共孵育6小時(shí)，每個(gè)實(shí)驗(yàn)置三個(gè)復(fù)孔。

（4）最大釋放孔中（陽(yáng)性對(duì)照）加10μl Lysis Solution (10×)，孵育45min-60min，每個(gè)實(shí)驗(yàn)置三個(gè)復(fù)孔。

（5）取上述3和4中待測(cè)樣品和對(duì)照樣品各50 ul，加入新鮮的96孔酶標(biāo)板中，再加入assay buffer和substrate mix，避光30min。

（6）加入50 ul stop solution。

（7）490nm或492nm處測(cè)吸光度值，在1小時(shí)內(nèi)測(cè)完。

（8）殺傷率=實(shí)驗(yàn)組LDH(OD)/Max LDH 釋放組（OD）。

（9）計(jì)算公式：殺傷效率=（experimental - effector spontaneous - target spontaneous）/ (target maximum - target spontaneous)×100％

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，制備的PD-1 CAR-T細(xì)胞能夠顯著殺傷高表達(dá)PDL1的靶細(xì)胞株, 不同比例的PD-1 CAR-T與target cells(MCF7-PDL1) 共孵育4小時(shí)后，ELISA實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，隨著E:T比例的增加，細(xì)胞殺傷效率也逐漸增加(見圖5)，顯微成像顯示腫瘤細(xì)胞發(fā)生明顯死亡（圖7）。同時(shí)在靶細(xì)胞株的抗原刺激下，不同比例的CAR-T細(xì)胞與target cells(MCF7-PDL1) 共孵育16小時(shí)后，MTT計(jì)數(shù)T細(xì)胞數(shù)目，結(jié)果顯示，隨著E:T比例的增加，其中CAR-PD1細(xì)胞增殖顯著。

序列表：

CD8SEQ ID NO：1為：

IYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYC。

4-1BB的序列SEQ ID NO：2為：

KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL。

CD28的序列SEQ ID NO：3為：

RSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS。

CD3ζ的分子序列SEQ ID NO：4為：

RVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR。

PD-1的序列SEQ ID NO：5為：

MQIPQAPWPVVWAVLQLGWRPGWFLDSPDRPWNPPTFSPALLVVTEGDNA

TFTCSFSNTSESFVLNWYRMSPSNQTDKLAAFPEDRSQPGQDCRFRVTQLPN

GRDFHMSVVRARRNDSGTYLCGAISLAPKAQIKESLRAELRVTERRAEVPTAHPSPSPRPAGQFQTLV。

PD-1-CD8-4-1BB-CD3ζ融合蛋白氨基酸的序列SEQ ID NO：6為：

MQIPQAPWPVVWAVLQLGWRPGWFLDSPDRPWNPPTFSPALLVVTEGDNA

TFTCSFSNTSESFVLNWYRMSPSNQTDKLAAFPEDRSQPGQDCRFRVTQLPN

GRDFHMSVVRARRNDSGTYLCGAISLAPKAQIKESLRAELRVTERRAEVPTAHPSPSPRPAGQFQTLVIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR。