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      定量檢測荷花腐敗病菌的實時熒光等溫擴增引物組、反應(yīng)體系及檢測方法與流程

      文檔序號:12457540閱讀:來源:國知局

      技術(shù)特征:

      1.一種用于定量檢測荷花腐敗病菌的實時熒光等溫擴增引物組,其特征在于,所述實時熒光等溫擴增引物組包含一對外引物F3、B3和一對內(nèi)引物FIP、BIP,所述外引物F3、B3和所述內(nèi)引物FIP、BIP的序列分別為:

      F3:CCAGACGGTCAATATAGCTTAT;

      B3:TAGTTTGCTAGGCTAACCCTA;

      FIP:CATAGAGGGCTGCCTTCGCGGCAGTACTTGAGGAGGA;

      BIP:GGACGAAGGCACAGAGAACAAGTTATCTGACCTATGGCATTCA。

      2.一種用于定量檢測荷花腐敗病菌的實時熒光等溫擴增反應(yīng)體系,其特征在于,所述實時熒光等溫擴增反應(yīng)體系包括如權(quán)利要求1所述實時熒光等溫擴增引物組。

      3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的實時熒光等溫擴增反應(yīng)體系,其特征在于,所述實時熒光等溫擴增反應(yīng)體系還包括待檢DNA提取液、反應(yīng)液、Bst DNA聚合酶及熒光染料。

      4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的實時熒光等溫擴增反應(yīng)體系,其特征在于,所述熒光染料為10×SYBR Green I。

      5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的實時熒光等溫擴增反應(yīng)體系,其特征在于,所述反應(yīng)液包括dNTP、MgSO4及甜菜堿,所述dNTP、所述MgSO4及所述甜菜堿的體積比為:dNTP:MgSO4:甜菜堿=8:5:2。

      6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的實時熒光等溫擴增反應(yīng)體系,其特征在于,所述實時熒光等溫擴增反應(yīng)體系含有0.2μM所述外引物F3、0.2μM所述外引物B3、0.8μM所述內(nèi)引物FIP、0.8μM所述內(nèi)引物BIP、2μL所述待檢DNA提取液、12.5μL所述反應(yīng)液、0.32U/μL所述Bst DNA聚合酶及0.5μL所述熒光染料,去離子水補齊到25μL。

      7.利用權(quán)利要求1所述實時熒光等溫擴增引物組或權(quán)利要求2至6任一項所述的實時熒光等溫擴增反應(yīng)體系定量檢測荷花腐敗病菌的方法,其特征在于,包括以下步驟:

      S1.在反應(yīng)管中配置實時熒光等溫擴增反應(yīng)體系:向若干25μL的反應(yīng)管中均加入0.2μM外引物F3、0.2μM外引物B3、0.8μM內(nèi)引物FIP、0.8μM內(nèi)引物BIP、12.5μL反應(yīng)液、0.32U/μL Bst DNA聚合酶及0.5μL熒光染料,然后向所述反應(yīng)管中的其中之一加入陽性基因組DNA,剩余所述反應(yīng)管中分別加入2μL待檢DNA提取液,去離子水補齊到25μL;

      S2.實時熒光等溫擴增法檢測:將步驟S1中配置好的若干所述實時熒光等溫擴增反應(yīng)體系混勻后離心,然后放置于實時熒光分析儀上,所述實時熒光等溫擴增反應(yīng)體系在所述實時熒光分析儀上進行等溫擴增反應(yīng)及熔解曲線分析,同時所述熒光分析儀實時讀取等溫擴增反應(yīng)及熔解曲線分析產(chǎn)生的熒光信號;

      S3.所述實時熒光分析儀根據(jù)等溫擴增反應(yīng)及熔解曲線分析產(chǎn)生的熒光信號繪制等溫擴增曲線及熔解曲線,若等溫擴增曲線的值高于本底噪音信號值且熔解曲線的Tm吸收峰值與陽性基因組DNA的熔解曲線的Tm吸收峰值一致,則說明所述待檢DNA提取液含有荷花腐敗病菌的DNA。

      8.如權(quán)利要求7所述的定量檢測荷花腐敗病菌的方法,其特征在于,在所述實時熒光分析儀上設(shè)定等溫擴增反應(yīng)的程序為:63℃,60min;等溫擴增反應(yīng)結(jié)束后立即進行熔解曲線分析,在所述實時熒光分析儀上設(shè)定熔解曲線分析的程序為:95℃,15s,然后60℃,1min,從60℃開始每秒升高0.3℃至95℃,95℃保持15s。

      9.如權(quán)利要求7所述的定量檢測荷花腐敗病菌的方法,其特征在于,所述實時熒光分析儀為ESE-Quant Tube Scanner或熒光定量PCR儀。

      10.如權(quán)利要求7所述的定量檢測荷花腐敗病菌的方法,其特征在于,所述陽性基因組DNA包括若干已知濃度的荷花腐敗病菌樣品的DNA,并于步驟S3中可得到若干已知濃度的荷花腐敗病菌樣品的DNA對應(yīng)的Ct值,從而得出一個標(biāo)準(zhǔn)曲線,根據(jù)所述標(biāo)準(zhǔn)曲線的函數(shù)關(guān)系,得出所述待檢DNA提取液中荷花腐敗病菌的DNA含量。

      11.如權(quán)利要求7所述的定量檢測荷花腐敗病菌的方法,其特征在于,在步驟S1之前還包括提取待檢DNA提取液的步驟:如果檢測樣本為荷花腐敗病菌菌絲體,則利用改進的SDS法抽提荷花腐敗病菌菌絲體的DNA;如果檢測樣本為荷花植株組織,則利用CTAB法抽提荷花植株組織中的DNA;如果檢測樣本為土壤,則利用土壤基因組DNA快速提取試劑盒提取疑感染土壤的微生物的DNA。

      12.如權(quán)利要求11所述的定量檢測荷花腐敗病菌的方法,其特征在于,所述荷花植株組織為地下莖、蓮鞭、藕節(jié)或須根部位的組織。

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