本發(fā)明涉及多重PCR檢測技術(shù)，具體地說，涉及一種快速高效檢測蛹蟲草不同菌種交配型的方法。

背景技術(shù)：

蛹蟲草(Cordyceps militaris)俗稱北蟲草、北冬蟲夏草，是一種珍貴的藥用真菌及中藥材，世界性分布天然資源數(shù)量很少。蛹蟲草作為一種“藥食同源”滋補(bǔ)佳品，在中西醫(yī)治療與保健方面得到廣泛認(rèn)可和應(yīng)用。蛹蟲草也作為一種營養(yǎng)價(jià)值較高的藥(食)用菌。但是野生蛹蟲草的產(chǎn)地生態(tài)環(huán)境條件特殊，極大地限制了蛹蟲草的生長區(qū)域范圍及產(chǎn)量，加之近年來野生資源過度開發(fā)導(dǎo)致其野生資源日趨枯竭。隨著對蛹蟲草生物學(xué)特性的認(rèn)識(shí)深入和技術(shù)探索提高，蛹蟲草實(shí)現(xiàn)了人工培養(yǎng)，其藥用及營養(yǎng)價(jià)值不遜于野生蛹蟲草，其藥用價(jià)值可與冬蟲夏草相媲美，部分營養(yǎng)價(jià)值甚至更高。作為替代名貴中藥冬蟲夏草作為藥(食)用菌已被廣泛接受。

目前，蛹蟲草生產(chǎn)中通常以傳統(tǒng)方法分離蛹蟲草菌株，作為生產(chǎn)使用的菌種。這類菌種由于生物學(xué)及遺傳背景等特征不清楚，導(dǎo)致栽培過程中出現(xiàn)菌種退化及變異嚴(yán)重，從而引起蛹蟲草栽培形成的子實(shí)體畸形、品質(zhì)下降甚至減產(chǎn)等嚴(yán)重問題，極大地制約了蛹蟲草的生產(chǎn)與開發(fā)規(guī)模。蛹蟲草的主要藥用組織—子實(shí)體為有性生殖的產(chǎn)物。真菌交配型是調(diào)控有性生殖的重要遺傳基礎(chǔ)之一，蛹蟲草作為一種典型的異宗配合子囊門真菌，其交配型具有二極性特點(diǎn)，即有性生殖的發(fā)生與子實(shí)體的形成需要兩個(gè)不同交配型(MAT1-1和MAT1-2)。利用分子生物學(xué)鏈?zhǔn)骄酆厦阜磻?yīng)(PCR)方法，可以有效針對蛹蟲草的單分生孢子和子囊孢子來源的菌種，進(jìn)而對蛹蟲草菌種的遺傳背景進(jìn)行有效鑒定，為后續(xù)不同交配型菌種的混合雜交以實(shí)現(xiàn)子實(shí)體的形成，以及相關(guān)的蛹蟲草生物學(xué)特性研究提供良好的理論基礎(chǔ)和技術(shù)支持。

目前為止，為明確不同來源菌種的交配型，避免部分遺傳背景不單一或混雜的菌種同時(shí)存在兩個(gè)交配型的現(xiàn)象，需要分別進(jìn)行兩次PCR反應(yīng)用以明確菌種的交配型類型，這種對不同菌種的交配型進(jìn)行鑒定的方法存在鑒定方案效率低，鑒定周期較長，試劑消耗量大等缺陷。因此，有必要研發(fā)一套快速高效的蛹蟲草交配型鑒別方法。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種基于雙重PCR技術(shù)的，快速高效檢測蛹蟲草不同菌種交配型的方法。

為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明提供用于雙重PCR檢測蛹蟲草不同菌種交配型的引物組合，所述引物組合包括，

用于鑒定交配型MAT1-1的特異性引物對(Seq ID No:1-2)：

Cm1F：5′-TCCAAGCCTCAATCGAC-3′

Cm1R：5′-AACAAGCATCTTGGTAC-3′；以及

用于鑒定交配型MAT1-2的特異性引物對(Seq ID No:3-4)：

Cm2F：5′-ACCGACATACGCTTGTC-3′

Cm2R：5′-ATGCCGTTCGAGGAGAG-3′。

本發(fā)明還提供含有所述引物組合的用于PCR檢測蛹蟲草不同菌種交配型的試劑盒。

所述試劑盒還包括dNTPs、Taq DNA聚合酶、Mg²⁺、PCR反應(yīng)緩沖液、標(biāo)準(zhǔn)陽性模板等中的至少一種。

本發(fā)明還提供所述引物組合、含有所述引物組合的試劑盒在PCR檢測蛹蟲草不同菌種交配型中的應(yīng)用。

本發(fā)明進(jìn)一步提供一種快速高效檢測蛹蟲草不同菌種交配型的方法，包括以下步驟：

1)提取樣品中的DNA；

2)以步驟1)中提取的DNA為模板，利用引物組合Cm1F/Cm1R和Cm2F/Cm2R進(jìn)行雙重PCR擴(kuò)增反應(yīng)；

3)分析PCR產(chǎn)物。

其中，PCR反應(yīng)體系以20μl計(jì)為：

PCR反應(yīng)條件為：95℃3分鐘；95℃30秒，45-53℃30-45秒，72℃30秒，25-40個(gè)循環(huán)；72℃5-15分鐘；4℃保存。

可采用0.8-1.2％瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物。如果擴(kuò)增出396bp和205bp兩條特征條帶，則表明樣品中含有MAT1-1和MAT1-2兩種交配型；如果僅擴(kuò)增出396bp一條特征條帶，則表明樣品中含有交配型MAT1-1；如果僅擴(kuò)增出205bp一條特征條帶，則表明樣品中含有交配型MAT1-2。

可按照如下方法提取樣品DNA：

挑取少量蛹蟲草菌絲，與650μL提取緩沖液(100mM Tris-HCl,pH 8.0；50mM EDTA，pH 8.0；1％SDS；10μg/mL RNase A)混合，震蕩10-60秒；加入100μL醋酸鉀(KAc，3.0M，pH 5.5，4℃保存)溶液，震蕩混勻,在8 000-12 000rpm離心2-5min；取上清液300-750μL到另一無菌離心管中；加入500-800μL氯仿，與上清液混合，在8000-12 000rpm離心2-5min；取上清液300-750μL到新的無菌離心管中，加入500-800μL冰凍預(yù)冷-20℃的異丙醇，混合均勻，-20℃靜置10-60min，然后在8 000-12 000rpm離心2-5min，去除上清液后；離心沉淀用500-1000μL 70％乙醇，清洗2-5次；無菌風(fēng)或真空離心濃縮儀干燥后，溶解于10-100μL無菌水或TE緩沖液中，通過超微量分光光度計(jì)檢測DNA的純度和濃度。

本發(fā)明結(jié)合現(xiàn)代真菌學(xué)研究技術(shù)手段，建立了一套高效和經(jīng)濟(jì)的蛹蟲草菌種交配型鑒定技術(shù)體系，首次提出“一步法”快速檢測鑒定方法，即在一個(gè)PCR反應(yīng)中加入兩對不同交配型基因引物，實(shí)現(xiàn)快速、準(zhǔn)確地鑒定不同菌種交配型目的，同時(shí)縮減了鑒定時(shí)間，節(jié)約了試劑用量，降低了鑒定成本，為開展高效經(jīng)濟(jì)型人工栽培蛹蟲草及天然蛹蟲草資源保護(hù)與利用提供理論基礎(chǔ)和技術(shù)支持。

附圖說明

圖1為本發(fā)明實(shí)施例2中蛹蟲草基因組DNA的瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果；其中，M為DNA Marker，1和2分別為2000ng和4000ng基因組DNA。

圖2為本發(fā)明實(shí)施例2中對蛹蟲草基因組DNA模板量的優(yōu)化結(jié)果；其中，M為DNA Marker，1-5分別為模板DNA用量500ng，200ng，100ng，10ng，1ng。

圖3為本發(fā)明實(shí)施例2中對PCR反應(yīng)退火溫度的優(yōu)化結(jié)果；其中，M為DNA Marker，1-6分別為退火溫度45℃，47℃，49℃，51℃，53℃，55℃。

圖4為本發(fā)明實(shí)施例2中“一步法”與常規(guī)“二步法”的PCR檢測結(jié)果比較；其中，M為DNA Marker，常規(guī)“二步法”PCR(分別使用交配型引物之一)：其中1-3和4-6為交配型MAT1-1引物擴(kuò)增單子囊孢子代表菌株S1-3(MAT1-1)和S4-6(MAT1-2)的模板DNA，7-9和10-12為交配型MAT1-2引物擴(kuò)增菌株S1-3和S4-6的模板DNA；13-22，快速“一步法”PCR(同時(shí)使用兩個(gè)交配型引物)：其中13-15和16-18為擴(kuò)增菌株S1-3和S4-6的模板DNA，19-21擴(kuò)增菌株S1和S4，S2和S5，S3和S6的混合模板DNA，22擴(kuò)增子實(shí)體模板DNA。

圖5為本發(fā)明實(shí)施例3中對不同來源的蛹蟲草菌種交配型進(jìn)行“一步法”PCR檢測；其中，M為DNA Marker，1-18為不同來源的單子囊孢子菌株。

具體實(shí)施方式

以下實(shí)施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。若未特別指明，實(shí)施例均按照常規(guī)實(shí)驗(yàn)條件，如Sambrook等分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊(Sambrook J&Russell DW,Molecular Cloning:a Laboratory Manual,2001)，或按照制造廠商說明書建議的條件。

以下實(shí)施例中所用蛹蟲草菌株S1-S6為子實(shí)體分離獲得的單子囊孢子菌株，保藏于沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)真菌生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室。

實(shí)施例1用于雙重PCR檢測蛹蟲草不同菌種交配型的特異性引物設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)蛹蟲草全基因組及交配型基因序列，利用Premier Primer 3軟件設(shè)計(jì)，并人工合成鑒定交配型MAT1-1(gi 573987612或XM_006671664.1)和MAT1-2(gi 38175274或AB124626.1)的特異性引物對Cm1F/Cm1R和Cm2F/Cm2R，引物序列見表1。另外，為了方便擴(kuò)增后期電泳檢測，不同交配型PCR擴(kuò)增產(chǎn)物大小通過設(shè)計(jì)分別為396和205bp，以便快速并直觀的區(qū)分不同菌株的交配型。

引物設(shè)計(jì)原則：①引物大小控制在20bp以內(nèi)，引物3’端以C或G結(jié)尾；②通過在線軟件(http://www.oligoevaluator.com/OligoCalcServlet)分析所設(shè)計(jì)的引物，避免出現(xiàn)引物二聚體(self-dimer和cross-dimer)或發(fā)卡結(jié)構(gòu)(hairpin)。

表1蛹蟲草交配型MAT1-1和MAT1-2快速檢測引物序列

實(shí)施例2基于雙重PCR快速高效檢測蛹蟲草不同菌種交配型的方法

1、蛹蟲草基因組DNA的快速提取

挑取少量蛹蟲草菌絲，與650μL提取緩沖液(100mM Tris-HCl,pH 8.0；50mM EDTA，pH 8.0；1％SDS；10μg/mL RNase A)混合，震蕩10-60秒；加入100μL醋酸鉀(KAc，3.0M，pH 5.5，4℃保存)溶液，震蕩混勻,在8 000-12 000rpm離心2-5min；取上清液300-750μL到另一無菌離心管中；加入500-800μL氯仿，與上清液混合，在8000-12 000rpm離心2-5min；取上清液300-750μL到新的無菌離心管中，加入500-800μL冰凍預(yù)冷-20℃的異丙醇，混合均勻，-20℃靜置10-60min，然后在8 000-12 000rpm離心2-5min，去除上清液后；離心沉淀用500-1000μL 70％乙醇，清洗2-5次；無菌風(fēng)或干燥濃縮儀干燥后，溶解于10-100μL無菌水或TE緩沖液中，通過超微量分光光度計(jì)檢測DNA的純度和濃度(表2)，并使用0.5-1.0％瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(圖1)。

表2蛹蟲草基因組DNA檢測

2、蛹蟲草交配型快速檢測PCR反應(yīng)體系

PCR反應(yīng)體系見表3。其中，對作為體系中模板DNA的用量進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果表明，反應(yīng)體系中模板DNA用量在10-200ng之間，其中推薦模板用量控制在100-200ng之間，可有效擴(kuò)增并鑒定交配型(圖2)。

表3蛹蟲草交配型PCR反應(yīng)體系

注：x為10-200ng，優(yōu)選100-200ng。

3、蛹蟲草交配型快速檢測PCR反應(yīng)條件

PCR反應(yīng)條件如下：95℃3分鐘；95℃30秒，45-53℃30-45秒，72℃30秒，25-40個(gè)循環(huán)；72℃8-20分鐘；4℃保存。通過0.8-1.2％瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果表明退火溫度在45-53℃之間，均可以有效檢測不同交配型基因(圖3)。

4、蛹蟲草交配型快速檢測“一步法”PCR

通過對已知交配型的蛹蟲草單子囊孢子菌株(交配型MAT1-1單子囊孢子代表菌株S1-3和交配型MAT1-2單子囊孢子代表菌株S4-6)進(jìn)行PCR檢測，比較快速檢測“一步法”與常規(guī)“二步法”的PCR方法，以獲得快速檢測PCR體系的穩(wěn)定性和靈敏度等信息。結(jié)果表明，利用交配型引物MAT1-1或MAT1-2對不同交配型但子囊孢子代表菌株進(jìn)行檢測，只能擴(kuò)增其對應(yīng)已知交配型片段(圖4)。另外，通過快速檢測PCR方法，當(dāng)只有一個(gè)交配型基因存在條件下，檢測體系只能擴(kuò)增其已知的片段，而當(dāng)不同交配型菌株混合時(shí)，可以同時(shí)擴(kuò)增兩個(gè)不同交配型。快速PCR方法可以達(dá)到與常規(guī)PCR方法同樣檢測的結(jié)果和靈敏度，而時(shí)間和試劑成本等，相應(yīng)減半(圖4)。

實(shí)施例3對不同來源的蛹蟲草菌種交配型進(jìn)行PCR檢測

利用優(yōu)化的蛹蟲草交配型PCR反應(yīng)條件及體系，對不同來源的單子囊孢子菌株進(jìn)行鑒定，以確定其交配型及“一步法”檢測體系的實(shí)用性。隨機(jī)選取通過單子囊孢子分離技術(shù)選取的不同單子囊孢子菌株，進(jìn)行PCR檢測。結(jié)果表明，設(shè)計(jì)的特異性混合引物可以快速準(zhǔn)確檢測不同來源菌株的交配型(圖5)。其中，在檢測的群體中，交配型MAT1-1占55.6％，交配型MAT1-2占44.4％，二者比例為10:8，符合理論上MAT1-1:MAT1-2＝1:1的比例。

雖然，上文中已經(jīng)用一般性說明及具體實(shí)施方案對本發(fā)明作了詳盡的描述，但在本發(fā)明基礎(chǔ)上，可以對之作一些修改或改進(jìn)，這對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進(jìn)，均屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。