本發(fā)明屬于基因多態(tài)性檢測技術(shù)領(lǐng)域,尤其涉及一種利用TaqI鑒定食管癌易感基因KRAS多態(tài)性的方法。
背景技術(shù):
近年來,食管癌是世界第六大常見惡性腫瘤死因,在特殊地區(qū)的發(fā)病率呈上升趨勢。我國的食管癌發(fā)病率居世界首位,食管癌死因在全國惡性腫瘤死因中位居第四,死亡人數(shù)占全國惡性腫瘤死亡人數(shù)的1/5。近年的研究表明,食管癌的發(fā)生和發(fā)展是多因素共同作用的結(jié)果,其發(fā)生和發(fā)展除與長期吸煙、飲酒、亞硝胺類及霉菌的攝人、膳食中缺乏維生素及微量元素(如鉬)、熱損傷(喜食燙食)等環(huán)境因素有關(guān)外,與個體遺傳易感性也有密切關(guān)系。KRAS(KRAS proto-oncogene)基因位于12號染色體上,是表皮生長因子受體(EGFR)功能信號的下游分子,在膜受體到腺苷環(huán)化酶信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中起重要作用。KRAS基因通過激活RAF/MEK/MAPK通路促進癌癥的發(fā)生。KRAS基因的突變與多種癌癥的發(fā)生相關(guān),在癌癥的發(fā)生、轉(zhuǎn)移和進展中發(fā)揮著重要作用。這些突變位點,一個氨基酸的替換可以導(dǎo)致一個激活突變或者使KRAS的表達增加。研究發(fā)現(xiàn)miRNA let-7與KRAS 3’端非翻譯區(qū)的結(jié)合位點的多態(tài)性位點rs712與結(jié)直腸癌、乳腺癌、卵巢癌和口腔癌等多種癌癥相關(guān)。單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism,SNP)是人類長期進化過程中環(huán)境選擇的結(jié)果,已成為第3代分子遺傳的標(biāo)記,具有標(biāo)記密度高、穩(wěn)定、易于分型檢測的優(yōu)勢,是人種之間、個體之間差異的遺傳基礎(chǔ)之一,已確定為多種遺傳學(xué)相關(guān)疾病的易感基礎(chǔ),成為患病危險程度的評價指標(biāo)。目前進行SNP基因型檢測的方法有多種,金標(biāo)準(zhǔn)為基因測序法,這是目前最準(zhǔn)確的檢測方法,但該方法需要昂貴的儀器設(shè)備和專業(yè)人員進行操作,費時費力,很難推廣。芯片法具有快速高通量的優(yōu)點,但是操作上復(fù)雜,步驟多,成本高也不易普及。
序列特異性引物PCR也稱等位基因特異性PCR(AS-PCR),它的原理是基于Taq DNA多聚酶不能修復(fù)DNA引物在3′末端的單個堿基錯配。所以,當(dāng)引物的3′端核苷酸與等位基因變異部位序列互補,則模板被擴增。但是,當(dāng)引物3′端核苷酸與模板錯配,則模板不會被擴增或擴增效率極低。每個等位基因的檢測,需設(shè)計兩套引物,一套為等位基因特異性引物,一套為普通引物。PCR產(chǎn)物凝膠電泳以后,通過紫外線透射來檢測DNA的存在與否,DNA條帶的存在或缺失即可確定基因型。在同一反應(yīng)中的另一對引物(通常擴增人生長激素基因的一段)總會產(chǎn)生一個DNA片斷,與SNP基因型無關(guān),作為PCR有效性的控制?;蛱禺愋訮CR(AS-PCR)的缺點是擴增效率較低,擴增特異性差,因此PCR產(chǎn)物的特異性與穩(wěn)定性無法保障,同時,分型結(jié)果也較容易誤判,穩(wěn)定性較差。TaqMan探針法是指PCR擴增時,在加入一對引物的同時另外加入一個特異性的熒光探針,該探針只與模板特異性地結(jié)合,其結(jié)合位點在兩條引物之間。探針的5′端標(biāo)記有熒光報告基團(Reporter,R),如FAM、VIC等,3′端標(biāo)記有熒光淬滅基團(Quencher,Q),如TAMRA等。當(dāng)探針完整的時候,5′端報告基團經(jīng)儀器光源激發(fā)的熒光正好被近距離的3′端熒光基團淬滅,儀器檢測不到5′端報告基團所激發(fā)的熒光信號(就是說5’熒光基團的發(fā)射波長正好是3’熒光基團的吸收波長,因而能量被吸收傳遞到3’熒光基團而發(fā)出其它熒光)。隨著PCR的進行,Taq酶在鏈延伸過程中遇到與模板結(jié)合的探針,其5′-3′外切酶活性(此活性是雙鏈特異性的,游離的單鏈探針不受影響)就會將切割探針,釋放5′端報告基團游離于反應(yīng)體系中,遠離3′端熒光淬滅基團的屏蔽,5′端報告基團受激發(fā)所發(fā)射的熒光信號就可以被探頭檢測到。也就是說每擴增一條DNA鏈,就有一個熒光分子形成,實現(xiàn)了熒光信號的累積與PCR產(chǎn)物形成完全同步。報告信號的強度就代表了模板DNA的拷貝數(shù)。Taqman熒光探針法需要昂貴的儀器和較長的步驟,成本較高,難以在實驗室中普及使用。SNaPshot也被稱為minisequencing。該方法針對不同突變位點設(shè)計不同長度的引物SNaPshot反應(yīng)后,產(chǎn)物通過電泳分離、五色熒光檢測、Gene mapper分析,可在一次電泳膠內(nèi)檢測多個SNP位點。應(yīng)用SNaPshot進行定點的序列分析,其基本原理遵循了DNA直接測序中的雙脫氧終止法,所不同的是PCR反應(yīng)中只有不同熒光標(biāo)記的ddNTP。由于每個SNP位點的引物3′端都緊靠SNP點,因此每一種引物在聚合酶作用下,根據(jù)模板的;序列,只延伸一個核苷酸。然后用先進的熒光檢測系統(tǒng),檢測延伸的那個核苷酸的種類。SNaPshot基因型分析方法的缺點在于所需試劑必須從國外進口,而且成本較高,不適合實驗室應(yīng)用。
技術(shù)實現(xiàn)要素:
本發(fā)明的目的在于提供一種用TaqI檢測食管癌易感性基因KRAS多態(tài)性位點rs712的方法,旨在解決現(xiàn)有的食管癌易感基因多態(tài)性檢測方法,克服操作復(fù)雜、需昂貴的儀器和繁瑣的步驟、檢測成本較高、適用范圍小、難以在實驗室中普及使用的問題。
本發(fā)明是這樣實現(xiàn)的,一種引物,所述引物的序列為:SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2。
本發(fā)明的另一目的在于提供一種應(yīng)用所述引物的利用TaqI鑒定食管癌易感基因KRAS多態(tài)性的方法,所述利用TaqI鑒定食管癌易感基因KRAS多態(tài)性的方法包括以下步驟:
步驟一,抽提樣品的基因組DNA;
步驟二,提供擴增人KRAS基因多態(tài)性rs712位點附近序列的正向引物和反向引物,上游引物:5’-GCAG ACTGTTAGCT TTTACC-3’,下游引物:5’-CTATAGGACATGATGCCTAGAAG-3’,以提取的待測人基因組DNA為模板,進行PCR擴增,獲取擴增產(chǎn)物;
步驟三,使用限制性內(nèi)切酶TaqI進行酶切,獲取相應(yīng)的酶切產(chǎn)物;
步驟四,將酶切產(chǎn)物采用3%的瓊脂糖凝膠進行電泳,以判定KRAS基因多態(tài)性rs712的各基因型。其中,經(jīng)電泳后有一條條帶者為野生型TT基因型,兩條條帶者為純合突變GG基因型,三條條帶者為雜合基因型TG基因型。
進一步,所述PCR擴增的體系反應(yīng)條件:
在標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)中采用三溫度點法,雙鏈DNA在94℃變性,再迅速冷卻至57℃,引物退火并結(jié)合到靶序列上,然后升溫至72℃,在TaqDNA聚合酶的作用下,使引物鏈沿模板延伸。
進一步,所述利用TaqI鑒定食管癌易感基因KRAS多態(tài)性的方法包括以下步驟:
(l)獲取手術(shù)切取的食管癌組織,采用酚-氯仿法提取食管癌組織的基因組DNA作為待測DNA,提取步驟如下:
1)將食管癌組織塊解凍,用生理鹽水洗去血污,剪取0.1g的組織進行碾磨,加入1ml的滅菌水,顛倒混勻,10000rpm離心10min,棄上清,以上步驟重復(fù)兩次;
2)加入200μl的DNA裂解液,5μl的蛋白酶K混勻,55℃水浴消化過夜;
3)消化完成后加入等體積的酚氯仿混合液1:1,劇烈震蕩,使其變成奶咖色,12000rpm離心10min;
4)取上清時避免觸及中間介質(zhì)以及下層液體,加入等體積的氯仿后顛倒混勻,12000rm離心10min;
5)取上清,加入1/10的醋酸鈉以及2.5倍的無水乙醇,顛倒混勻,12000rpm離心10min,棄上清;
6)加入1ml 70%乙醇,使其白色沉淀懸浮,顛倒混勻數(shù)次,12000rpm離心10min,棄上清,室溫靜置5-10min使乙醇揮發(fā)干凈;
7)加入50μl滅菌水溶解DNA,即得食管癌組織基因組DNA;
(2)堿基序列信息從NCBI的dbSNP數(shù)據(jù)庫獲取,在CHIP網(wǎng)站上進行核對,明確準(zhǔn)確無誤后采用Primer Premier 6.0設(shè)計各位點引物,結(jié)合退火溫度、GC含量以及Pubmed中的Blast序列比對結(jié)果信息篩選出最優(yōu)引物為正向引物序列:5’-GCAG ACTGTTAGCT TTTACC-3’,下游引物:5’-CTATAGGACATGATGCCTAGAAG-3’,進行PCR引物擴增,制備PCR擴增體系:2×TaqPCRMix7.5μl,雙蒸水5.9μl,上游引物0.3μl,下游引物0.3μl以及模板DNA 1.0μl,充分混勻后即得15.0μl PCR擴增反應(yīng)體系;按照第一階段:94℃變性5min,第二階段共包括30個循環(huán)三個步驟,首先94℃變性30s,57℃退火45s,最后72℃延伸45s,第三階段:72℃延伸5min,最終4℃儲存以備用,即得長為384bp的PCR擴增產(chǎn)物;
(3)擴增后的SNP片段用限制性核酸內(nèi)切酶TaqI 5U水浴鍋中酶切6-14h,PCR反應(yīng)產(chǎn)物5μl,限制性內(nèi)切酶0.5μl,Buffer1.0μl以及無核酸酶純水8.5μl共計15μl酶切體系,于水浴鍋中37℃酶切6-14h,即得酶切產(chǎn)物。
(4)酶切產(chǎn)物采用3%的瓊脂糖進行瓊脂糖凝膠電泳,在紫外燈照射下根據(jù)不同的條帶判斷野生純合基因型,雜合基因型以及突變純合基因型。
進一步,所述利用TaqI鑒定食管癌易感基因KRAS多態(tài)性的方法包括以下步驟:
(l)獲取外周血細胞,采用酚-氯仿法提取血細胞的基因組DNA作為待測DNA,提取步驟如下:
l)在1.5ml離心管中加入300μl血細胞后,再加入900μl細胞裂解液混和均勻,在冰上放置10min后,在離心機中12000rpm離心1min,棄上清,再次加入900μl細胞裂解液,用槍吹起沉淀并混勻后,重復(fù)上述步驟;
2)向沉淀物中加入600μl solution B溶液,用移液槍輕輕吹起沉淀后,加入10μl蛋白酶K混勻,在70℃水浴鍋中放置10min后,12000rpm離心5min;
3)將離心管中的上清轉(zhuǎn)入編過號的新的離心管中,再向新的離心管中加入500μl無水乙醇,期間可能會出現(xiàn)絮狀沉淀物,該絮狀物即為DNA;
4)將混勻的液體轉(zhuǎn)入離心柱中(若一次轉(zhuǎn)不完,可分次轉(zhuǎn)入),室溫靜置2min,再12000rpm離心1min,棄廢液;
5)加入700μl已加入相應(yīng)體積無水乙醇的solution C漂洗液,室溫靜置2min,12000rpm離心1min,棄廢液;
6)加入700μl已加入相應(yīng)體積無水乙醇的solution D漂洗液,室溫靜置2min,12000rpm離心1min,棄廢液;
7)加入500μl solution D漂洗液,12000rpm離心1min,棄廢液;
8)再次離心2min,將離心柱置于新的編過號的離心管中,敞口放入37℃恒溫箱內(nèi)10min直至無明顯乙醇味;
9)在硅基質(zhì)膜中央加入已經(jīng)預(yù)熱到65℃的solution E 100μl,室溫放置5min,12000rpm離心1min,重復(fù)上述步驟一次,終離心后的液體即為提取出的基因組DNA;
(2)堿基序列信息從NCBI的dbSNP數(shù)據(jù)庫獲取,在CHIP網(wǎng)站上進行核對,明確準(zhǔn)確無誤后采用Primer Premier 6.0設(shè)計各位點引物,結(jié)合退火溫度、GC含量以及Pubmed中的Blast序列比對結(jié)果信息篩選出最優(yōu)引物為正向引物序列:5’-GCAG ACTGTTAGCT TTTACC-3’,下游引物:5’-CTATAGGACATGATGCCTAGAAG-3’,進行PCR引物擴增,制備PCR擴增體系:2×TaqPCRMix7.5μl,雙蒸水5.9μl,上游引物0.3μl,下游引物0.3μl以及模板DNA 1.0μl,充分混勻后即得15.0μl PCR擴增反應(yīng)體系;按照第一階段:94℃變性5min,第二階段共包括30個循環(huán)三個步驟,首先94℃變性30s,57℃退火45s,最后72℃延伸45s,第三階段:72℃延伸5min,最終4℃儲存以備用,即得長為384bp的PCR擴增產(chǎn)物;
(3)擴增后的SNP片段用限制性核酸內(nèi)切酶TaqI 5U水浴鍋中酶切6-14h,PCR反應(yīng)產(chǎn)物5μl,限制性內(nèi)切酶0.5μl,Buffer1.0μl以及無核酸酶純水8.5μl共計15μl酶切體系,于水浴鍋中37℃酶切6-14h,即得酶切產(chǎn)物;
(4)酶切產(chǎn)物采用3%的瓊脂糖進行瓊脂糖凝膠電泳,在紫外燈照射下根據(jù)不同的條帶判斷野生純合基因型,雜合基因型以及突變純合基因型。
本發(fā)明的另一目的在于提供一種包含所述引物的利用TaqI鑒定食管癌易感基因KRAS多態(tài)性的試劑盒。
本發(fā)明提供的利用TaqI鑒定食管癌易感基因KRAS多態(tài)性的方法,首先提取待測人基因組DNA模板,人基因組DNA模板為人體任何部分取得的人基因組模板;然后PCR擴增基因組DNA,對提取的模板基因組DNA進行PCR擴增,獲得含多態(tài)附近序列的PCR產(chǎn)物;對PCR擴增產(chǎn)物用限制性核酸內(nèi)切酶TaqI進行酶切反應(yīng),得到酶切產(chǎn)物;酶切產(chǎn)物進行瓊脂糖進行瓊脂糖凝膠電泳,在紫外燈照射下根據(jù)不同的條帶判斷野生純合基因型,雜合基因型以及突變純合基因型;該用TaqI檢測食管癌易感性基因多態(tài)性的方法,方法重復(fù)性好,操作較簡單,成本低,酶切結(jié)果容易辨識,適用范圍廣泛,由于識別特定位點的限制性內(nèi)切酶TaqI適用范圍廣,限制性內(nèi)切酶且引物合成以及各試劑價格低廉,經(jīng)濟實用,極大地降低了檢測基因多態(tài)性的成本。本發(fā)明提供了一種檢測食管癌易感基因的方法,由于識別特定位點的限制性內(nèi)切酶TaqI適用范圍廣,價錢較為經(jīng)濟,進而大大降低了檢測SNP的成本。經(jīng)在線酶切位點分析(http://nc2.neb.com/NEBcutter2/cutshow.php?name=26419975-)發(fā)現(xiàn),SNP位點附近只有TaqI的酶切位點,而當(dāng)SNP位點由G變?yōu)門時,TaqI酶切位點消失,限制性內(nèi)切酶TaqI是最佳選擇。本發(fā)明提供一種操作簡單、成本低、適用范圍廣泛的檢測人食管癌易感基因KRAS基因多態(tài)性rs712的方法,發(fā)現(xiàn)rs712帶有T基因型(尤其是GT基因型)的個體食管癌的發(fā)病風(fēng)險顯著高于帶有GG基因型個體。在此背景下提供此方便、快捷的檢測人食管癌易感基因KRAS多態(tài)性rs712的方法有望預(yù)測癌食管的易感性,可用于臨床的早期診斷。本發(fā)明為了克服現(xiàn)有基因多態(tài)性基因分型技術(shù)中存在的缺陷,提供一種用TaqI檢測人食管癌易感基因KRAS多態(tài)性位點rs712的分型方法,該方法采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴增目的DNA片段,應(yīng)用限制性內(nèi)切酶對DNA擴增片段進行酶切,然后將酶切產(chǎn)物進行瓊脂糖電泳,再由限制酶圖譜分析此段序列的特異酶切位點,通過片段的多樣性來比對不同來源基因序列的差異性。簡而言之,就是先PCR擴增相應(yīng)目的片段,然后進行限制性內(nèi)切酶酶切反應(yīng),電用后觀察比較限制性圖譜來分析序列之間的差異。此方法重復(fù)性好,操作簡單,成本低廉,酶切結(jié)果容易辨識。
附圖說明
圖1是本發(fā)明實施例提供的利用TaqI鑒定食管癌易感基因KRAS多態(tài)性的方法流程圖。
圖2是本發(fā)明實施例提供的引物擴增條件示意圖。
圖3是本發(fā)明實施例提供的KRAS基因多態(tài)性rs712位點的電泳圖譜;
圖中:M道:Marker(100bp DNA Ladder);1道:rs712的TT基因型;2道:rs712的TG基因型;3道:rs712的GG基因型。
圖4是本發(fā)明實施例提供的KRAS基因多態(tài)性rs712位點TT基因型反向測序圖譜。
圖5是本發(fā)明實施例提供的KRAS基因多態(tài)性rs712位點TG基因型反向測序圖譜。
圖6是本發(fā)明實施例提供的KRAS基因多態(tài)性rs712位點GG基因型測序圖譜。
具體實施方式
為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點更加清楚明白,以下結(jié)合實施例,對本發(fā)明進行進一步詳細說明。應(yīng)當(dāng)理解,此處所描述的具體實施例僅僅用以解釋本發(fā)明,并不用于限定本發(fā)明。
下面結(jié)合附圖對本發(fā)明的應(yīng)用原理作詳細的描述。
如圖1所示,本發(fā)明實施例的利用TaqI鑒定食管癌易感基因KRAS多態(tài)性的方法包括以下步驟:
S101:抽提樣品的基因組DNA;
S102:提供擴增人KRAS基因多態(tài)性rs712位點附近序列的正向引物和反向引物,上游引物:5’-GCAG ACTGTTAGCT TTTACC-3’,下游引物:5’-CTATAGGACATGATGCCTAGAAG-3’,以提取的待測人基因組DNA為模板,進行PCR擴增,獲取擴增產(chǎn)物;
S103:使用限制性內(nèi)切酶TaqI進行酶切,獲取相應(yīng)的酶切產(chǎn)物;
S104:將酶切產(chǎn)物采用3%的瓊脂糖凝膠進行電泳,以判定KRAS基因多態(tài)性rs712的各基因型。其中,經(jīng)電泳后有一條條帶者為野生型TT基因型,兩條條帶者為純合突變GG基因型,三條條帶者為雜合基因型TG基因型。
下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明的應(yīng)用原理作進一步的描述。
在本發(fā)明的實施中,正向引物和反向引物的設(shè)計采用Primer6.0軟件進行,設(shè)計的原則綜合考慮引物對PCR擴增的靈敏度、特異度以及擴增效率的影響。按照堿基互不配對的原則設(shè)計引物,引物長度一般在15~30堿基之間,過長或短均會造成特異性差,過長還會導(dǎo)致其延伸溫度大于74℃,不適于TaqDNA聚合酶進行反應(yīng)。引物GC含量在40%~60%之間,Tm值最好在55℃-65℃,GC含量過高或過低都不利于引發(fā)反應(yīng)。堿基要隨機分布,引物自身及引物之間不應(yīng)存在互補序列,否則引物自身會折疊成發(fā)夾結(jié)構(gòu)使引物本身復(fù)性。擴增產(chǎn)物的單鏈不能形成二級結(jié)構(gòu)。引物應(yīng)具有特異性,引物設(shè)計完成以后,應(yīng)對其進行BLAST檢測,以確保其與其它基因不具有互補性。在此基礎(chǔ)上,最終選取的上游引物SEQ ID NO:1序列為5’-GCAG ACTGTTAGCT TTTACC-3’,下游引物SEQ ID NO:2序列:5’-CTATAGGACATGATGCCTAGAAG-3’。由此引物擴增出的面的片段384bp,擴增產(chǎn)物如下:
下劃線部分分別為正向引物和反向引物,第65位bp R代表G/T多態(tài)即SNP位點rs712。該長為384bp的擴增產(chǎn)物經(jīng)限制性內(nèi)切酶TaqI酶切后可產(chǎn)生384bp,321bp(該片段下游序列相比上游序列由于TaqI酶切產(chǎn)生的粘性末端減少兩個單鏈堿基),63bp(該片段下游序列相比上游序列由于TaqI酶切產(chǎn)生的粘性末端增加兩個單鏈堿基)共三種片段類型?;蛐团卸ńY(jié)果:TT基因型顯示一個片段:384bp;TG基因型顯示兩個個片段:384bp、321bp和63bp(63bp太小,所以未顯示出來)的;GG基因型顯示一個片段321bp(63bp太小,所以未顯示出來)。
凝膠電泳分為瓊脂糖凝膠電泳和聚丙烯酰胺凝膠電泳,瓊脂糖(Agarose)是一種線性多糖聚合物,系從紅色海藻產(chǎn)物瓊脂中提取而來的。當(dāng)瓊脂糖溶液加熱到沸點后冷卻凝固便會形成良好的電泳介質(zhì),其密度是由瓊脂糖的濃度決定的,可用于DNA片段的制備電泳。聚丙烯酰胺凝膠主要有兩種方式:一是用于分離和純化雙鏈DNA片段的非變性聚丙烯酰胺凝膠,二是用于分離及純化單鏈DNA片段的變性聚丙烯酰胺凝膠。但綜合考慮實用性、便利性以及經(jīng)濟性,使用瓊脂糖凝膠電泳不失為一種最佳選擇。在本發(fā)明中,引物擴增條件如圖2所示,目的擴增產(chǎn)物使用限制性核酸內(nèi)切酶TaqI5U水浴鍋中酶切6-14h。酶切產(chǎn)物采用3%的瓊脂糖進行瓊脂糖凝膠電泳,在紫外燈照射下根據(jù)不同的條帶判斷野生純合基因型,雜合基因型以及突變純合基因型。
在本發(fā)明中,PCR擴增體系的反應(yīng)條件并不受特別的限制,基于PCR原理三步驟而設(shè)置變性-退火-延伸三個溫度點。在標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)中采用三溫度點法,雙鏈DNA在90~94℃變性,再迅速冷卻至40~60℃,引物退火并結(jié)合到靶序列上,然后快速升溫至70~75℃,在TaqDNA聚合酶的作用下,使引物鏈沿模板延伸。對于較短靶基因(長度為100~300bp時)可采用二溫度點法,除變性溫度外、退火與延伸溫度可合二為一,一般采用94℃變性,65℃左右退火與延伸(此溫度TaqDNA酶仍有較高的催化活性)。而對于待測DNA也沒有較高的濃度及純度要求,既可以是人體體液或組織中提取的DNA,也可以是經(jīng)過預(yù)先降解處理的基因組。但為了方便實施以及減少受試者痛苦,一般優(yōu)先選擇從血液中進行基因組DNA的提取。
本發(fā)明經(jīng)過多年研究,首次證明了KRAS基因單核苷酸多態(tài)性位點rs712位于3’-UTR端,是let-7的靶位點,發(fā)現(xiàn)了在KRAS基因rs712G→T在病例和對照組中的分布存在顯著性差異(P<0.05)。在此基礎(chǔ)上本發(fā)明提供了一種檢測食管癌易感性基因的方法,利用本發(fā)明檢測位點的基因型,方法簡單易行,快速高效,成本低廉,為食管癌的易感基因多態(tài)性的基因型檢測提供了一個簡捷的新途徑。
實施例1.人食管癌組織標(biāo)本測定人KRAS rs712多態(tài)性
在本發(fā)明的具體實施方案中,檢測人KRAS基因多態(tài)rs712的具體步驟如下:
(l)獲取手術(shù)切取的食管癌組織,采用酚-氯仿法提取食管癌組織的基因組DNA作為待測DNA,提取步驟如下:
1)將食管癌組織塊解凍,用生理鹽水洗去血污,剪取0.1g的組織進行碾磨,加入1ml的滅菌水,顛倒混勻,10000rpm離心10min,棄上清,以上步驟重復(fù)兩次。
2)加入200μl的DNA裂解液,5μl的蛋白酶K混勻,55℃水浴消化過夜。
3)消化完成后加入等體積的酚氯仿混合液(1:1),劇烈震蕩,使其變成奶咖色。12000rpm離心10min。
4)取上清時避免觸及中間介質(zhì)以及下層液體。加入等體積的氯仿后顛倒混勻。12000rm離心10min。
5)取上清,注意避免觸及中間介質(zhì)以及下層液體。加入1/10的醋酸鈉以及2.5倍的無水乙醇,顛倒混勻,12000rpm離心10min,棄上清。
6)加入1ml 70%乙醇,使其白色沉淀懸浮,顛倒混勻數(shù)次,12000rpm離心10min,棄上清,室溫靜置5-10min使乙醇揮發(fā)干凈。
7)加入50μl滅菌水溶解DNA,即得食管癌組織基因組DNA。
(2)堿基序列信息從NCBI的dbSNP數(shù)據(jù)庫獲取,在CHIP網(wǎng)站上進行核對,明確準(zhǔn)確無誤后采用Primer Premier 6.0設(shè)計各位點引物,結(jié)合退火溫度、GC含量以及Pubmed中的Blast序列比對結(jié)果(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)等信息篩選出最優(yōu)引物為正向引物序列:5’-GCAG ACTGTTAGCT TTTACC-3’,下游引物:5’-CTATAGGACATGATGCCTAGAAG-3’,進行PCR引物擴增,制備PCR擴增體系:2×TaqPCRMix7.5μl,雙蒸水5.9μl,上游引物0.3μl,下游引物0.3μl以及模板DNA 1.0μl,充分混勻后即得15.0μl PCR擴增反應(yīng)體系;按照第一階段:94℃變性5min,第二階段共包括30個循環(huán)三個步驟,首先94℃變性30s,57℃退火45s,最后72℃延伸45s,第三階段:72℃延伸5min,最終4℃儲存以備用,即得長為384bp的PCR擴增產(chǎn)物;
(3)擴增后的SNP片段用限制性核酸內(nèi)切酶TaqI 5U水浴鍋中酶切6-14h,PCR反應(yīng)產(chǎn)物5μl,限制性內(nèi)切酶0.5μl,Buffer1.0μl以及無核酸酶純水8.5μl共計15μl酶切體系,于水浴鍋中37℃酶切6-14h,即得酶切產(chǎn)物。
(4)酶切產(chǎn)物采用3%的瓊脂糖進行瓊脂糖凝膠電泳,在紫外燈照射下根據(jù)不同的條帶判斷野生純合基因型,雜合基因型以及突變純合基因型(見表1)。
表1rs712位點基因型判定
實施例2.人外周血全血標(biāo)本測定人KRAS rs712多態(tài)性
與實施例1的步驟基本相同,只是采用下面的方法從人外周血中提取基因組DNA作為待測DNA。
按照NEP004-1全血基因組DNA提取試劑盒的操作步驟進行待測血樣基因組DNA的提取,具體步驟如下:
l)在1.5ml離心管中加入300μl血細胞后,再加入900μl細胞裂解液混和均勻,在冰上放置10min后,在離心機中12000rpm離心1min,棄上清,再次加入900μl細胞裂解液,用槍吹起沉淀并混勻后,重復(fù)上述步驟;
2)向沉淀物中加入600μl solution B溶液,用移液槍輕輕吹起沉淀后,加入10μl蛋白酶K混勻,在70℃水浴鍋中放置10min后,12000rpm離心5min。
3)將離心管中的上清轉(zhuǎn)入編過號的新的離心管中,再向新的離心管中加入500μl無水乙醇,期間可能會出現(xiàn)絮狀沉淀物,該絮狀物即為DNA;
4)將混勻的液體轉(zhuǎn)入離心柱中(若一次轉(zhuǎn)不完,可分次轉(zhuǎn)入),室溫靜置2min,再12000rpm離心1min,棄廢液;
5)加入700μl已加入相應(yīng)體積無水乙醇的solution C漂洗液,室溫靜置2min,12000rpm離心1min,棄廢液;
6)加入700μl已加入相應(yīng)體積無水乙醇的solution D漂洗液,室溫靜置2min,12000rpm離心1min,棄廢液;
7)加入500μl solution D漂洗液,12000rpm離心1min,棄廢液;
8)再次離心2min,將離心柱置于新的編過號的離心管中,敞口放入37℃恒溫箱內(nèi)10min直至無明顯乙醇味;
9)在硅基質(zhì)膜中央加入已經(jīng)預(yù)熱到65℃的solution E 100μl,室溫放置5min,12000rpm離心1min,重復(fù)上述步驟一次,終離心后的液體即為提取出的基因組DNA。
提取完畢基因組DNA后按照案例一的步驟進行基因型的鑒定,鑒定結(jié)果如下:將酶切產(chǎn)物用3%的瓊脂糖凝膠電泳后于紫外燈下拍照鑒定。對于不同的基因型,rs712位點不同基因型展現(xiàn)出不同的條帶(見圖3),TT基因型顯示一個片段:384bp;TG基因型顯示兩個個片段:384bp、321bp和63bp(63bp太小,所以未顯示出來)的;GG基因型顯示一個片段321bp(63bp太小,所以未顯示出來)。各基因型均經(jīng)測序以進一步鑒定,測序結(jié)果(見圖4-6)顯示與現(xiàn)有技術(shù)測得的結(jié)果完全相同。
下面結(jié)合實驗對本發(fā)明的應(yīng)用效果作詳細的描述。
1材料與方法
1.1主要儀器與試劑
儀器:BCD-228CH冰箱(新飛電器),HH-2數(shù)顯恒溫水浴鍋(華峰儀器),SmartGel凝膠成像儀(北京賽智創(chuàng)業(yè)),GT9612梯度PCR儀(百泰克生物),WD900SL23-2型號微波爐(格蘭仕電器),DG-300C型電泳儀(鼎國昌盛生物)等。
試劑:NEP004-1 DNA提取試劑盒(鼎國昌盛生物),100bp DNA Ladder(萊風(fēng)生物),2×Taq PCR Mix(萊風(fēng)生物),TaqI(NEB),瓊脂糖(SIGMA)等。
1.2引物設(shè)計
在NCBI的dbSNP數(shù)據(jù)庫中,查KRAS rs712的核苷酸序列如下:
基因序列的第501個堿基R代表了G/T多態(tài),即為rs712的多態(tài)性位點。將以上序列粘貼至引物設(shè)計軟件Primer Premier 6.0中,設(shè)置引物長度和擴增目的片段長度等參數(shù)進行引物設(shè)計,根據(jù)GC含量和退火溫度等選擇最優(yōu)上下游引物,再將此引物與Pubmed中的Blast序列比對功能(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)進行引物比對,最終確定的上下游引物為正向引物序列:5’-GCAG ACTGTTAGCT TTTACC-3’,下游引物:5’-CTATAGGACATGATGCCTAGAAG-3’,引物的合成可以采用本領(lǐng)域通用的方法(如固相合成法),亦可委托生物公司合成。
1.3限制性內(nèi)切酶的選擇
根據(jù)dbSNP中rs712位點的堿基序列,用NEBcutter在線限制性內(nèi)切酶分析軟件,在線搜索獲得可識別突變位點的限制性內(nèi)切酶的信息,綜合考慮其酶切特異性及經(jīng)濟適用性選擇最佳的限制性內(nèi)切酶TaqI。
1.4從全血中提取待測樣本的基因組DNA
嚴格按照離心柱型DNA提取試劑盒操作步驟提取基因組DNA。
l)在1.5ml離心管中加入300μl血細胞后,再加入900μl細胞裂解液混和均勻,在冰上放置10min后,在離心機中12000rpm離心1min,棄上清,再次加入900μl細胞裂解液,用槍吹起沉淀并混勻后,重復(fù)上述步驟;
2)向沉淀物中加入600μl solution B溶液,用移液槍輕輕吹起沉淀后,加入10μl蛋白酶K混勻,在70℃水浴鍋中放置10min后,12000rpm離心5min;
3)將離心管中的上清轉(zhuǎn)入編過號的新的離心管中,再向新的離心管中加入500μl無水乙醇,期間可能會出現(xiàn)絮狀沉淀物,該絮狀物即為DNA;
4)將混勻的液體轉(zhuǎn)入離心柱中(若一次轉(zhuǎn)不完,可分次轉(zhuǎn)入),室溫靜置2min,再12000rpm離心1min,棄廢液;
5)加入700μl已加入相應(yīng)體積無水乙醇的solution C漂洗液,室溫靜置2min,12000rpm離心1min,棄廢液;
6)加入700μl已加入相應(yīng)體積無水乙醇的solution D漂洗液,室溫靜置2min,12000rpm離心1min,棄廢液;
7)加入500μl solution D漂洗液,12000rpm離心1min,棄廢液;
8)再次離心2min,將離心柱置于新的編過號的離心管中,敞口放入37℃恒溫箱內(nèi)10min直至無明顯乙醇味;
9)在硅基質(zhì)膜中央加入已經(jīng)預(yù)熱到65℃的solution E 100μl,室溫放置5min,12000rpm離心1min,重復(fù)上述步驟一次,終離心后的液體即為提取出的基因組DNA;
10)吸取2μl提取出的DNA用NanoPhotometer Pearl微量分光光度計測定其濃度和純度。
2結(jié)果
2.1 PCR擴增
(1)根據(jù)提取基因組DNA的濃度,將研究對象的DNA進行稀釋,使終濃度為20μg/μl。
(2)PCR擴增體系為2×Taq PCR Mix 7.5μl、上游引物和下游引物各0.3μl、模板DNA 1.0μl,最后用雙蒸水補充總體積至15μl。
(3)PCR反應(yīng)條件:第一個階段為預(yù)變性階段,94℃/5min;第二個階段包括三個步驟共30個循環(huán),依次設(shè)置為94℃/30s、57℃退火時間45s、72℃/45s;第三個階段72℃/5min。擴增后的產(chǎn)物序列為:
下劃線部分分別為正向引物和反向引物,第65位bp R代表T/G多態(tài)即SNP位點rs712。
2.2酶切反應(yīng)
酶切體系為PCR擴增產(chǎn)物5μl、上限制性內(nèi)切酶TaqI 5U、Buffer 1.0μl,最后用雙蒸水補充總體積至15μl。混勻后置于水浴鍋中37℃水浴4-16小時。
2.3基因型的判定
將酶切產(chǎn)物用3%的瓊脂糖凝膠在4-10V/cm的條件下,電泳20-40min,至紫外燈下能分清明顯的條帶后并拍照鑒定。對于不同的基因型,rs712位點不同基因型展現(xiàn)出不同的條帶(見圖3),TT基因型顯示一個片段:384bp;TG基因型顯示兩個個片段:384bp、321bp和63bp(63bp太小,所以未顯示出來)的;GG基因型顯示一個片段321bp(63bp太小,所以未顯示出來)。各基因型均經(jīng)測序以進一步鑒定,測序結(jié)果(見圖4-6)顯示與現(xiàn)有技術(shù)測得的結(jié)果完全相同。
以上所述僅為本發(fā)明的較佳實施例而已,并不用以限制本發(fā)明,凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)所作的任何修改、等同替換和改進等,均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。