本發(fā)明屬于生物化工領(lǐng)域，具體地說，涉及生物柴油制備和多元不飽和脂肪酸酯富集的耦合工藝。

背景技術(shù)：

多元不飽和脂肪酸(PUFAs)是指分子中含有多于一個(gè)雙鍵的長(zhǎng)鏈脂肪酸，屬于人體必需的脂肪酸，需從食物中攝取。根據(jù)PUFA雙鍵位置，將其分為ω-3和ω-6系列，從脂肪酸分子中距離羧基最遠(yuǎn)的甲基段的碳原子計(jì)數(shù)，第一個(gè)雙鍵出現(xiàn)在第三和第四個(gè)碳原子之間的稱為ω-3PUFA，如α-亞麻酸(C18:3)、二十二碳六烯酸(DHA，C22:6)、二十碳五烯酸(EPA，C20:5)等；第一個(gè)雙鍵出現(xiàn)在第六和第七個(gè)碳原子之間的稱為ω-6PUFA，如亞油酸(C18:2)和花生四烯酸(C20:4)等。

研究發(fā)現(xiàn)，很多ω-3PUFAs是具有多種生理活性的功能因子，因此被廣泛應(yīng)用于各領(lǐng)域。然而，大多數(shù)ω-3PUFA來源于深海魚油，但含量比較低，目前ω-3PUFAs的分離方法主要集中在尿素包合法、分子蒸餾、陰離子絡(luò)合法、超臨界萃取、高效液相色譜法、生物酶法等幾種方法。其中尿素包合法較為常用，在有機(jī)溶劑中尿素可以與直鏈飽和脂肪酸形成尿素包合復(fù)合物在低溫下結(jié)晶析出，但該過程需要使用大量有機(jī)溶劑，增添了后續(xù)提純步驟；分子蒸餾可在低溫下汽化待分離物，嚴(yán)格控制溫度得到不同溫度的餾分，可得到較高的ω-3PUFAs，但該過程能耗大；陰離子絡(luò)合法中硝酸銀陰離子可與ω-3PUFAs絡(luò)合，產(chǎn)物親水性強(qiáng)，因此ω-3PUFAs可以以陰離子絡(luò)合物的形式進(jìn)入水相，從而實(shí)現(xiàn)分離，但硝酸銀價(jià)格昂貴，故僅限于實(shí)驗(yàn)室小量制備；利用超臨界CO₂萃取具有ω-3PUFA不發(fā)生氧化等優(yōu)點(diǎn)，但對(duì)設(shè)備的要求比較高?？傊?，以上采用物理或者化學(xué)的方法富集ω-3PUFA存在選擇性差、過程能耗高等問題，迫切需要開發(fā)具有高度選擇性的環(huán)境友好的生物酶法工藝進(jìn)行ω-3PUFAs的富集。但目前關(guān)于酶法工藝富集多元不飽和脂肪酸的工藝繁瑣，成本高，選擇性差，工業(yè)化應(yīng)用前景不明朗。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供生物柴油制備和多元不飽和脂肪酸酯富集的耦合工藝。

為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明提供的生物柴油制備和多元不飽和脂肪酸酯富集的耦合工藝，包括以下步驟：

S1、將油脂、短鏈醇、水和液體脂肪酶在一級(jí)或多級(jí)酶反應(yīng)器中進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后，將所得反應(yīng)液分成重相和輕相；

S2、將S1中的輕相轉(zhuǎn)移至蒸餾塔內(nèi)進(jìn)行蒸餾，分離出碳鏈長(zhǎng)度為C14-C18的脂肪酸酯，用作生物柴油，塔釜液用于進(jìn)一步轉(zhuǎn)化；

S3、將S2中的塔釜液流入裝有固定化脂肪酶的一級(jí)或多級(jí)酶反應(yīng)器中，并加入短鏈醇進(jìn)行反應(yīng)，得到碳鏈長(zhǎng)度為C19及以上的多元不飽和脂肪酸酯。

其中，S1具體為：向一級(jí)或多級(jí)酶反應(yīng)器中加入油脂、油脂摩爾數(shù)4-8倍的短鏈醇、油脂質(zhì)量2％-20％的水以及基于油脂質(zhì)量200-2000個(gè)標(biāo)準(zhǔn)酶活單位的液體脂肪酶，于30℃-55℃反應(yīng)3-8小時(shí)，反應(yīng)結(jié)束后，所得反應(yīng)液經(jīng)離心或靜置分層，得到重相和輕相。

S3具體為：將塔釜液和基于油脂摩爾數(shù)1-3倍的短鏈醇流入裝有基于油脂質(zhì)量200-1000個(gè)酶活單位的固定化脂肪酶的一級(jí)或多級(jí)酶反應(yīng)器中，于20℃-55℃反應(yīng)3-10小時(shí)。

前述的工藝，在反應(yīng)全過程或部分反應(yīng)步驟中采用在線脫水。例如，可用膜進(jìn)行在線脫水，所用的膜包括有機(jī)膜、無機(jī)膜或陶瓷膜；可用分子篩進(jìn)行在線脫水，所用的分子篩為或分子篩；可用低溫短鏈醇進(jìn)行在線脫水，即反應(yīng)器一側(cè)直接與裝有無水短鏈醇的罐體相連，無水短鏈醇的溫度為20-40℃，反應(yīng)器的另一側(cè)與真空泵連接，然后真空泵與冷凝器連接，將反應(yīng)器中真空控制在10-100Mpa，冷凝器溫度為5-15℃。

前述的工藝，S1還包括回收再利用重相中脂肪酶的步驟?？梢杂媚し蛛x回收重相中的脂肪酶，所用的膜包括金屬膜、有機(jī)膜、無機(jī)膜或陶瓷膜等。

本發(fā)明中使用的脂肪酶包括來源于酵母、霉菌、細(xì)菌或其它微生物的脂肪酶；脂肪酶為單種脂肪酶或多種脂肪酶的組合；優(yōu)選地，所述脂肪酶選自由南極假絲酵母(Candida antarctica)、嗜熱絲孢菌(Thermomyces lanuginosus)、黑曲霉(Aspergillus niger)、米曲霉(Aspergillus oryzae)、米黑根毛霉(Rhizomucor miehei)和米根霉(Rhizopus oryzae)所產(chǎn)生的脂肪酶中的至少一種。

本發(fā)明中使用的油脂為含有多元不飽和脂肪酸的生物油脂，包括植物油脂、動(dòng)物油脂、廢食用油、酸化油、油脂精練下腳料和微生物油脂，優(yōu)選魚油和/或微藻油脂等。所述多元不飽和脂肪酸是指分子中含有多于一個(gè)雙鍵的長(zhǎng)鏈脂肪酸，包括但不限于α-亞麻酸(C18:3)、二十二碳六烯酸(C22:6)、二十碳五烯酸(C20:5)，花生四烯酸(C20:4)等。

本發(fā)明中使用的短鏈醇包括甲醇、乙醇、丙醇或丁醇等。所述短鏈醇為勻速或變速添加，從反應(yīng)初始計(jì)時(shí)，3-8小時(shí)內(nèi)流加完畢。

本發(fā)明提供的生物柴油制備和多元不飽和脂肪酸酯富集的耦合工藝，在液體酶催化的前段反應(yīng)過程中，無需對(duì)油脂原料進(jìn)行任何的預(yù)處理，即可使脂肪酸碳鏈長(zhǎng)度為C14-C18的油脂有效轉(zhuǎn)化為對(duì)應(yīng)的脂肪酸酯(轉(zhuǎn)化率達(dá)到90％以上)；進(jìn)而通過蒸餾將C14-C18脂肪酸酯分離，余下的塔釜液進(jìn)而用于第二階段的固定化脂肪酶催化，通過在全過程或部分反應(yīng)過程中引入在線脫水，可以將C19及以上的多元不飽和脂肪酸油脂有效轉(zhuǎn)化為對(duì)應(yīng)的脂肪酸酯，轉(zhuǎn)化率達(dá)到98％以上。本工藝具有油脂原料適用性強(qiáng)，過程環(huán)保清潔，產(chǎn)品得率高等優(yōu)點(diǎn)。

本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)：

在本工藝的第一階段，將C14-C18的油脂有效轉(zhuǎn)化為對(duì)應(yīng)的脂肪酸酯，產(chǎn)生的副產(chǎn)物甘油在水相(重相)中，油相(輕相)進(jìn)而通過蒸餾除去C14-C18脂肪酸酯，余下的塔釜液主要為含多元不飽和脂肪酸的油脂，這樣過程不僅有效減少了副產(chǎn)物甘油對(duì)后續(xù)固酶反應(yīng)的負(fù)面影響；同時(shí)，經(jīng)過中間的蒸餾分離，還大大降低了產(chǎn)物(脂肪酸酯)對(duì)酶促反應(yīng)的抑制，從而可以促進(jìn)含多元不飽和脂肪酸油脂的徹底轉(zhuǎn)化，顯著提高了多元不飽和脂肪酸的轉(zhuǎn)化效果。該工藝可以適用于各種各樣的油脂，后續(xù)產(chǎn)品的分離純化方便易行，能實(shí)現(xiàn)生物柴油制備和多元不飽和脂肪酸富集酯的高效耦合，具有非常好的工業(yè)化應(yīng)用前景。

附圖說明

圖1為本發(fā)明生物柴油制備和多元不飽和脂肪酸酯富集的耦合工藝流程圖。

具體實(shí)施方式

以下實(shí)施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。若未特別指明，實(shí)施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段，所用原料均為市售商品。

實(shí)施例1

將10g Botryococcus sp.微藻油脂(含有二十碳五烯酸和二十二碳六烯酸、基于油脂質(zhì)量10％的水以及基于單位油脂質(zhì)量200個(gè)標(biāo)準(zhǔn)酶活(200U/g大豆油)的來源于南極假絲酵母(Candida antarctica)的液體脂肪酶，置于適于酶催化的一級(jí)或多級(jí)酶反應(yīng)器中?？販?5℃，然后將基于油脂摩爾比為4.5：1的乙醇在3個(gè)小時(shí)內(nèi)勻速加入。反應(yīng)6小時(shí)后，脂肪酸碳鏈長(zhǎng)度為C14-C18的油脂轉(zhuǎn)化為對(duì)應(yīng)的脂肪酸乙酯(轉(zhuǎn)化率為92％)，然后對(duì)反應(yīng)液進(jìn)行分相，分離出含酶的重相和輕相(油相)。重相進(jìn)一步利用膜分離回收酶蛋白，選取截留分子量為15000的有機(jī)膜進(jìn)行上述脂肪酶的回收，酶蛋白的回收率高達(dá)95％，回收的酶液中副產(chǎn)物甘油的殘存量小于5％，回收的酶可以重復(fù)使用。輕相經(jīng)過蒸餾(170-220℃,10mmHg)，分離出C14-C18脂肪酸乙酯(乙酯收率為96％)，余下塔釜液進(jìn)而裝入第二階段的固酶反應(yīng)器(裝有基于單位油脂質(zhì)量200個(gè)標(biāo)準(zhǔn)酶活的來源于米曲霉Aspergillus oryzae的固定化脂肪酶)，同時(shí)加入基于油脂摩爾數(shù)1倍的甲醇，進(jìn)行反應(yīng)，控溫20℃，甲醇在1小時(shí)內(nèi)勻速加完。在該反應(yīng)過程中，進(jìn)行如圖1所示的在線脫水(采用包括有機(jī)膜、無機(jī)膜或陶瓷膜在內(nèi)的膜脫水裝置以及包括或分子篩在內(nèi)的吸水裝置)。反應(yīng)4小時(shí)，體系中碳鏈長(zhǎng)度為C19及以上的多元不飽和脂肪酸油脂到對(duì)應(yīng)脂肪酸甲酯的轉(zhuǎn)化率為98.5％。

實(shí)施例2

將10g C.vulgaris微藻油脂(含有二十碳五烯酸)，基于油脂質(zhì)量5％的水以及入基于單位油脂質(zhì)量200個(gè)標(biāo)準(zhǔn)酶活的來源于米曲霉(Aspergillus oryzae)的液體脂肪酶，置于適于酶催化的一級(jí)或多級(jí)酶反應(yīng)器中?？販?0℃，然后將基于油脂摩爾比為6：1的甲醇在4個(gè)小時(shí)內(nèi)勻速加入。反應(yīng)8小時(shí)后，肪酸碳鏈長(zhǎng)度為C14-C18的油脂轉(zhuǎn)化為對(duì)應(yīng)的脂肪酸甲酯(轉(zhuǎn)化率為93％)。然后對(duì)反應(yīng)液進(jìn)行離心分離，分離出含酶的重相和輕相(油相)。重相進(jìn)一步利用膜分離回收酶蛋白，選取截留分子量為15000的有機(jī)膜進(jìn)行上述脂肪酶的回收，酶蛋白的回收率高達(dá)95％，回收的酶液中副產(chǎn)物甘油的殘存量小于5％，回收的酶可以重復(fù)使用。輕相經(jīng)過蒸餾(170-220℃,10mmHg)，分離出C14-C18脂肪酸甲酯(甲酯收率為96％)，余下塔釜液進(jìn)而裝入第二階段的固酶反應(yīng)器(裝有基于單位油脂質(zhì)量200個(gè)標(biāo)準(zhǔn)酶活的來源于米曲霉Aspergillus oryzae的固定化脂肪酶)，同時(shí)加入基于油脂摩爾數(shù)2倍的甲醇，進(jìn)行反應(yīng)?？販?0℃，甲醇在1小時(shí)內(nèi)加完。在該反應(yīng)過程中，進(jìn)行如圖1所示的在線脫水(包括有機(jī)膜的吸水裝置)。反應(yīng)3小時(shí)，體系中碳鏈長(zhǎng)度為C19及以上的多元不飽和脂肪酸油脂到對(duì)應(yīng)脂肪酸甲酯的轉(zhuǎn)化率為99％。

實(shí)施例3

將10g魚油(含有花生四烯酸，C20:4)基于油脂質(zhì)量2％的水以及基于單位油脂質(zhì)量200個(gè)標(biāo)準(zhǔn)酶活的來源于嗜熱絲孢菌(Thermomyces lanuginosus)的液體脂肪酶以及基于單位油脂質(zhì)量200個(gè)標(biāo)準(zhǔn)酶活的來源于米曲霉(Aspergillus oryzae)的液體脂肪酶，置于適于酶催化的一級(jí)或多級(jí)酶反應(yīng)器中。控溫45℃，然后將基于油脂摩爾比為6：1的乙醇在2個(gè)小時(shí)內(nèi)勻速加入。反應(yīng)5小時(shí)，肪酸碳鏈長(zhǎng)度為C14-C18的油脂轉(zhuǎn)化為對(duì)應(yīng)的脂肪酸乙酯(轉(zhuǎn)化率為93％)，然后對(duì)反應(yīng)液進(jìn)行離心分離，分離出含酶的重相和輕相(油相)。重相進(jìn)一步利用膜分離回收酶蛋白，選取截留分子量為15000的無機(jī)膜進(jìn)行上述脂肪酶的回收，酶蛋白的回收率高達(dá)95％，回收的酶液中副產(chǎn)物甘油的殘存量小于5％，回收的酶可以重復(fù)使用。輕相經(jīng)過蒸餾(170-220℃,10mmHg)，分離出C14-C18脂肪酸乙酯(乙酯收率為96％)，余下塔釜液進(jìn)而裝入第二階段的固酶反應(yīng)器(裝有基于單位油脂質(zhì)量200個(gè)標(biāo)準(zhǔn)酶活的來源于米曲霉Aspergillus oryzae的固定化脂肪酶)，同時(shí)加入基于油脂摩爾數(shù)1倍的乙醇，進(jìn)行反應(yīng)?？販?0℃，乙醇在1小時(shí)內(nèi)勻速加完。在該反應(yīng)過程中，進(jìn)行如圖1所示的在線脫水即反應(yīng)器一側(cè)直接與裝有無水短鏈醇的罐體相連，無水短鏈醇的溫度為20-40℃，反應(yīng)器的另一側(cè)與真空泵連接，然后真空泵與冷凝器連接，將反應(yīng)器中真空控制在10-100Mpa，冷凝器溫度為5-15℃。反應(yīng)3小時(shí)，體系中碳鏈長(zhǎng)度為C19及以上的多元不飽和脂肪酸油脂到對(duì)應(yīng)脂肪酸乙酯的轉(zhuǎn)化率為98％。

實(shí)施例4

將10g魚油、基于油脂質(zhì)量3％的水以及基于單位油脂質(zhì)量100個(gè)標(biāo)準(zhǔn)酶活的來源于南極假絲酵母(Candida antarctica)的液體脂肪酶以及基于單位油脂質(zhì)量300個(gè)標(biāo)準(zhǔn)酶活的來源于嗜熱絲孢菌(Thermomyces lanuginosus)的液體脂肪酶，置于適于酶催化的一級(jí)或多級(jí)酶反應(yīng)器中?？販?0℃，然后將基于油脂摩爾比為4：1的甲醇在2個(gè)小時(shí)內(nèi)勻速加入。反應(yīng)5小時(shí)，肪酸碳鏈長(zhǎng)度為C14-C18的油脂轉(zhuǎn)化為對(duì)應(yīng)的脂肪酸甲酯(轉(zhuǎn)化率為92％)。然后對(duì)反應(yīng)液進(jìn)行靜置分相，分離出含酶的重相和輕相(油相)。重相進(jìn)一步利用膜分離回收酶蛋白，選取截留分子量為15000的陶瓷膜進(jìn)行上述脂肪酶的回收，酶蛋白的回收率高達(dá)95％，回收的酶液中副產(chǎn)物甘油的殘存量小于5％，回收的酶可以重復(fù)使用。輕相經(jīng)過蒸餾(170-220℃,10mmHg)，分離出C14-C18脂肪酸甲酯(甲酯收率為96％)，余下塔釜液進(jìn)而裝入第二階段的固酶反應(yīng)器(裝有基于單位油脂質(zhì)量200個(gè)標(biāo)準(zhǔn)酶活的來源于米曲霉Aspergillus oryzae的固定化脂肪酶)，同時(shí)加入基于油脂摩爾數(shù)2倍的甲醇，進(jìn)行反應(yīng)?？販?5℃，甲醇在1小時(shí)內(nèi)勻速加完。在該反應(yīng)過程中，進(jìn)行如圖1所示的在線脫水(包括陶瓷膜的吸水裝置)。反應(yīng)3小時(shí)，體系中碳鏈長(zhǎng)度為C19及以上的多元不飽和脂肪酸油脂到對(duì)應(yīng)脂肪酸甲酯的轉(zhuǎn)化率為98％。

實(shí)施例5

將10g T.fluviatilis微藻油脂(含有花生四烯酸和二十碳五烯酸)、基于油脂質(zhì)量8％的水以及基于單位油脂質(zhì)量800個(gè)標(biāo)準(zhǔn)酶活的來源于南極假絲酵母(Candida antarctica)的液體脂肪酶，置于適于酶催化的一級(jí)或多級(jí)酶反應(yīng)器中?？販?0℃，然后將基于油脂摩爾比為6：1的乙醇在2個(gè)小時(shí)內(nèi)勻速加入。反應(yīng)5小時(shí)，肪酸碳鏈長(zhǎng)度為C14-C18的油脂轉(zhuǎn)化為對(duì)應(yīng)的脂肪酸乙酯(轉(zhuǎn)化率為93％)。然后對(duì)反應(yīng)液進(jìn)行離心分離，分離出含酶的重相和輕相(油相)。重相進(jìn)一步利用膜分離回收酶蛋白，選取截留分子量為15000的有機(jī)膜進(jìn)行上述脂肪酶的回收，酶蛋白的回收率高達(dá)95％，回收的酶液中副產(chǎn)物甘油的殘存量小于5％，回收的酶可以重復(fù)使用。輕相經(jīng)過蒸餾(170-220℃,10mmHg)，分離出C14-C18脂肪酸乙酯(乙酯收率為95％)，余下塔釜液進(jìn)而裝入第二階段的固酶反應(yīng)器(裝有基于單位油脂質(zhì)量200個(gè)標(biāo)準(zhǔn)酶活的來源于嗜熱絲孢菌(Thermomyces lanuginosus)的固定化脂肪酶以及基于單位油脂質(zhì)量50個(gè)標(biāo)準(zhǔn)酶活的來源于南極假絲酵母的固定化脂肪酶)，同時(shí)加入基于油脂摩爾數(shù)1倍的甲醇，進(jìn)行反應(yīng)?？販?0℃，甲醇在1小時(shí)內(nèi)加完。在該反應(yīng)過程中，進(jìn)行如圖1所示的在線脫水，即反應(yīng)器一側(cè)直接與裝有無水短鏈醇的罐體相連，無水短鏈醇的溫度為20-40℃，反應(yīng)器的另一側(cè)與真空泵連接，然后真空泵與冷凝器連接，將反應(yīng)器中真空控制在10-100Mpa，冷凝器溫度為5-15℃。反應(yīng)4小時(shí)，體系中碳鏈長(zhǎng)度為C19及以上的多元不飽和脂肪酸油脂到對(duì)應(yīng)脂肪酸乙酯的轉(zhuǎn)化率為98％。

實(shí)施例6

將10g T.pseudonana微藻油脂(含有二十二碳六烯酸(DHA，二十碳五烯酸和花生四烯酸)、基于油脂質(zhì)量20％的水以及基于單位油脂質(zhì)量500個(gè)標(biāo)準(zhǔn)酶活的來源于米黑根毛霉(Rhizomucor miehei)的液體脂肪酶，置于適于酶催化的一級(jí)或多級(jí)酶反應(yīng)器中?？販?5℃，然后將基于油脂摩爾比為6：1的乙醇在3個(gè)小時(shí)內(nèi)勻速加入。反應(yīng)8小時(shí)，肪酸碳鏈長(zhǎng)度為C14-C18的油脂轉(zhuǎn)化為對(duì)應(yīng)的脂肪酸乙酯(轉(zhuǎn)化率為92％)，然后對(duì)反應(yīng)液進(jìn)行離心分離。分離出含酶的重相和輕相(油相)。重相進(jìn)一步利用膜分離回收酶蛋白，選取截留分子量為15000的無機(jī)膜進(jìn)行上述脂肪酶的回收，酶蛋白的回收率高達(dá)95％，回收的酶液中副產(chǎn)物甘油的殘存量小于5％，回收的酶可以重復(fù)使用。輕相經(jīng)過蒸餾(170-220℃,10mmHg)，分離出C14-C18脂肪酸乙酯(乙酯收率為96％)，余下塔釜液進(jìn)而裝入第二階段的固酶反應(yīng)器器(裝有基于單位油脂質(zhì)量400個(gè)標(biāo)準(zhǔn)酶活的來源于米曲霉Aspergillus oryzae的固定化脂肪酶)，同時(shí)加入基于油脂摩爾數(shù)1.5倍的甲醇，進(jìn)行反應(yīng)?？販?5℃，甲醇在1小時(shí)內(nèi)勻速加完。在該反應(yīng)過程中，進(jìn)行如圖1所示的在線脫水(包括分子篩在內(nèi)的吸水裝置)。反應(yīng)3小時(shí)，體系中碳鏈長(zhǎng)度為C19及以上的多元不飽和脂肪酸油脂到對(duì)應(yīng)脂肪酸甲酯的轉(zhuǎn)化率為98.5％。

實(shí)施例7

將10g T.fluviatilis微藻油脂(含有花生四烯酸和二十碳五烯酸)、基于油脂質(zhì)量6％的水以及基于單位油脂質(zhì)量500個(gè)標(biāo)準(zhǔn)酶活的來源于米黑根毛霉(Rhizomucor miehei)的液體脂肪酶，置于適于酶催化的一級(jí)或多級(jí)酶反應(yīng)器中?？販?5℃，然后將基于油脂摩爾比為5：1的乙醇在4個(gè)小時(shí)內(nèi)勻速加入。反應(yīng)8小時(shí)，肪酸碳鏈長(zhǎng)度為C14-C18的油脂轉(zhuǎn)化為對(duì)應(yīng)的脂肪酸乙酯(轉(zhuǎn)化率為93％)。然后對(duì)反應(yīng)液進(jìn)行離心分離，分離出含酶的重相和輕相(油相)。重相進(jìn)一步利用膜分離回收酶蛋白，選取截留分子量為15000的陶瓷膜進(jìn)行上述脂肪酶的回收，酶蛋白的回收率高達(dá)95％，回收的酶液中副產(chǎn)物甘油的殘存量小于5％，回收的酶可以重復(fù)使用。輕相經(jīng)過蒸餾(170-220℃,10mmHg)，分離出C14-C18脂肪酸乙酯(乙酯收率為95％)，余下塔釜液進(jìn)而裝入第二階段的固酶反應(yīng)器(裝有基于單位油脂質(zhì)量100個(gè)標(biāo)準(zhǔn)酶活的來源于米曲霉Aspergillus oryzae的固定化脂肪酶以及基于單位油脂質(zhì)量100個(gè)標(biāo)準(zhǔn)酶活的來源于南極假絲酵母Candida antarctica的固定化脂肪酶)，同時(shí)加入基于油脂摩爾數(shù)1倍的乙醇，進(jìn)行反應(yīng)?？販?5℃，乙醇在2小時(shí)內(nèi)勻速加完。在該反應(yīng)過程中，進(jìn)行如圖1所示的在線脫水(采用包括有機(jī)膜、無機(jī)膜或陶瓷膜在內(nèi)的膜脫水裝置以及包括或分子篩在內(nèi)的吸水裝置)。反應(yīng)4小時(shí)，體系中碳鏈長(zhǎng)度為C19及以上的多元不飽和脂肪酸油脂到對(duì)應(yīng)脂肪酸乙酯的轉(zhuǎn)化率為99％。

實(shí)施例8

將10g Chlorella vulgaris微藻油脂(含有DHA，二十二碳六烯酸)、基于油脂質(zhì)量3％的水以及基于單位油脂質(zhì)量500個(gè)標(biāo)準(zhǔn)酶活的來源于米曲霉(Aspergillus oryzae)的液體脂肪酶，置于適于酶催化的一級(jí)或多級(jí)酶反應(yīng)器中?？販?0℃，然后將基于油脂摩爾比為5：1的丙醇在3個(gè)小時(shí)內(nèi)勻速加入。反應(yīng)8小時(shí)，肪酸碳鏈長(zhǎng)度為C14-C18的油脂轉(zhuǎn)化為對(duì)應(yīng)的脂肪酸丙酯(轉(zhuǎn)化率為92％)，然后對(duì)反應(yīng)液進(jìn)行離心分離，分離出含酶的重相和輕相(油相)。重相進(jìn)一步利用膜分離回收酶蛋白，選取截留分子量為15000的有機(jī)膜進(jìn)行上述脂肪酶的回收，酶蛋白的回收率高達(dá)95％，回收的酶液中副產(chǎn)物甘油的殘存量小于5％，回收的酶可以重復(fù)使用。輕相經(jīng)過蒸餾(170-220℃,10mmHg)，分離出C14-C18脂肪酸丙酯(丙酯收率為96％)，余下塔釜液進(jìn)而裝入第二階段的固酶反應(yīng)器(裝有基于單位油脂質(zhì)量500個(gè)標(biāo)準(zhǔn)酶活的來源于米曲霉Aspergillus oryzae的固定化脂肪酶)，同時(shí)加入基于油脂摩爾數(shù)2倍的甲醇，進(jìn)行反應(yīng)?？販?5℃，甲醇在1小時(shí)內(nèi)勻速加完。在該反應(yīng)過程中，進(jìn)行如圖1所示的在線脫水(包括有機(jī)膜的膜脫水裝置以及包括分子篩在內(nèi)的吸水裝置)。反應(yīng)3小時(shí)，體系中碳鏈長(zhǎng)度為C19及以上的多元不飽和脂肪酸油脂到對(duì)應(yīng)脂肪酸甲酯的轉(zhuǎn)化率為98.5％。

實(shí)施例9

將10g Botryococcus sp.微藻油脂(含有二十碳五烯酸和二十二碳六烯酸)、基于油脂質(zhì)量8％的水以及基于單位油脂質(zhì)量800個(gè)標(biāo)準(zhǔn)酶活的來源于南極假絲酵母(Candida antarctica)的液體脂肪酶，置于適于酶催化的一級(jí)或多級(jí)酶反應(yīng)器中?？販?5℃，然后將基于油脂摩爾比為6：1的乙醇在3個(gè)小時(shí)內(nèi)勻速加入。反應(yīng)6小時(shí)，肪酸碳鏈長(zhǎng)度為C14-C18的油脂轉(zhuǎn)化為對(duì)應(yīng)的脂肪酸乙酯(轉(zhuǎn)化率為92％)，然后對(duì)反應(yīng)液進(jìn)行離心分離，分離出含酶的重相和輕相(油相)。重相進(jìn)一步利用膜分離回收酶蛋白，選取截留分子量為15000的有機(jī)膜進(jìn)行上述脂肪酶的回收，酶蛋白的回收率高達(dá)95％，回收的酶液中副產(chǎn)物甘油的殘存量小于5％，回收的酶可以重復(fù)使用。輕相經(jīng)過蒸餾(170-220℃,10mmHg)，分離出C14-C18脂肪酸乙酯(乙酯收率為96％)，余下塔釜液進(jìn)而裝入第二階段的固酶反應(yīng)器(裝有基于單位油脂質(zhì)量200個(gè)標(biāo)準(zhǔn)酶活的來源于南極假絲酵母Candida antarctica的固定化脂肪酶)，同時(shí)加入基于油脂摩爾數(shù)1倍的甲醇，進(jìn)行反應(yīng)?？販?0℃，甲醇在2小時(shí)內(nèi)加完。在該反應(yīng)過程中，進(jìn)行如圖1所示的在線脫水(包括無機(jī)膜的膜脫水裝置以及包括分子篩在內(nèi)的吸水裝置)。反應(yīng)3小時(shí)，體系中碳鏈長(zhǎng)度為C19及以上的多元不飽和脂肪酸油脂到對(duì)應(yīng)脂肪酸甲酯的轉(zhuǎn)化率為98％。

實(shí)施例10

將10g C.vulgaris微藻油脂(含有二十碳五烯酸)、基于油脂質(zhì)量12％的水以及基于單位油脂質(zhì)量2000個(gè)標(biāo)準(zhǔn)酶活的來源于米曲霉(Aspergillus oryzae)的液體脂肪酶，置于適于酶催化的一級(jí)或多級(jí)酶反應(yīng)器中?？販?5℃，然后將基于油脂摩爾比為5：1的甲醇在2個(gè)小時(shí)內(nèi)勻速加入。反應(yīng)5小時(shí)，肪酸碳鏈長(zhǎng)度為C14-C18的油脂轉(zhuǎn)化為對(duì)應(yīng)的脂肪酸甲酯(轉(zhuǎn)化率為92％)，然后對(duì)反應(yīng)液進(jìn)行離心分離，分離出含酶的重相和輕相(油相)。重相進(jìn)一步利用膜分離回收酶蛋白，選取截留分子量為15000的無機(jī)膜進(jìn)行上述脂肪酶的回收，酶蛋白的回收率高達(dá)95％，回收的酶液中副產(chǎn)物甘油的殘存量小于5％，回收的酶可以重復(fù)使用。輕相經(jīng)過蒸餾(170-220℃,10mmHg)，分離出C14-C18脂肪酸甲酯(甲酯收率為96％)，余下塔釜液進(jìn)而裝入第二階段的固酶反應(yīng)器(裝有基于單位油脂質(zhì)量200個(gè)標(biāo)準(zhǔn)酶活的來源于南極假絲酵母Candida antarctica的固定化脂肪酶)，同時(shí)加入基于油脂摩爾數(shù)2倍的乙醇，進(jìn)行反應(yīng)。控溫30℃，乙醇在2小時(shí)內(nèi)加完。在該反應(yīng)過程中，進(jìn)行如圖1所示的在線脫水，即反應(yīng)器一側(cè)直接與裝有無水短鏈醇的罐體相連，無水短鏈醇的溫度為20-40℃，反應(yīng)器的另一側(cè)與真空泵連接，然后真空泵與冷凝器連接，將反應(yīng)器中真空控制在10-100Mpa，冷凝器溫度為5-15℃。反應(yīng)4小時(shí)，體系中碳鏈長(zhǎng)度為C19及以上的多元不飽和脂肪酸油脂到對(duì)應(yīng)脂肪酸乙酯的轉(zhuǎn)化率為98.5％。

實(shí)施例11

將10g魚油(含有二十碳五烯酸和二十二碳六烯酸)、基于油脂質(zhì)量6％的水以及基于單位油脂質(zhì)量1000個(gè)標(biāo)準(zhǔn)酶活的來源于黑曲霉(Aspergillus niger)的液體脂肪酶，置于適于酶催化的一級(jí)或多級(jí)酶反應(yīng)器中?？販?0℃，然后將基于油脂摩爾比為5：1的乙醇在3個(gè)小時(shí)內(nèi)勻速加入。反應(yīng)8小時(shí)，肪酸碳鏈長(zhǎng)度為C14-C18的油脂轉(zhuǎn)化為對(duì)應(yīng)的脂肪酸乙酯(轉(zhuǎn)化率為92％)，然后對(duì)反應(yīng)液進(jìn)行靜置或離心分離，分離出含酶的重相和輕相(油相)。重相進(jìn)一步利用膜分離回收酶蛋白，選取截留分子量為15000的陶瓷膜進(jìn)行上述脂肪酶的回收，酶蛋白的回收率高達(dá)95％，回收的酶液中副產(chǎn)物甘油的殘存量小于5％，回收的酶可以重復(fù)使用。輕相經(jīng)過蒸餾(170-220℃,10mmHg)，分離出C14-C18脂肪酸乙酯(乙酯收率為96％)，余下塔釜液進(jìn)而裝入第二階段的固酶反應(yīng)器(裝有基于單位油脂質(zhì)量100個(gè)標(biāo)準(zhǔn)酶活的來源于南極假絲酵母Candida antarctica的固定化脂肪酶以及基于單位油脂200個(gè)標(biāo)準(zhǔn)酶活的來源于米曲霉Aspergillus oryzae的固定化脂肪酶)，同時(shí)加入基于油脂摩爾數(shù)2倍的甲醇，進(jìn)行反應(yīng)。控溫25℃，甲醇在1小時(shí)內(nèi)加完。在該反應(yīng)過程中，進(jìn)行如圖1所示的在線脫水(包括有機(jī)膜的膜脫水裝置以及包括分子篩在內(nèi)的吸水裝置)。反應(yīng)4小時(shí)，體系中碳鏈長(zhǎng)度為C19及以上的多元不飽和脂肪酸油脂到對(duì)應(yīng)脂肪酸甲酯的轉(zhuǎn)化率為98.5％。

實(shí)施例12

將10g Botryococcus sp.微藻油脂(含有二十碳五烯酸和二十二碳六烯酸)、基于油脂質(zhì)量12％的水以及基于單位油脂質(zhì)量600個(gè)標(biāo)準(zhǔn)酶活的來源于黑曲霉(Aspergillus niger)的液體脂肪酶，置于適于酶催化的一級(jí)或多級(jí)酶反應(yīng)器中?？販?5℃，然后將基于油脂摩爾比為6：1的甲醇在3個(gè)小時(shí)內(nèi)勻速加入。反應(yīng)6小時(shí)，有效油脂到生物柴油的轉(zhuǎn)化率為92％，然后將反應(yīng)液進(jìn)行靜置或離心分離，分離出含酶的重相和輕相(油相)。重相進(jìn)一步利用膜分離回收酶蛋白，選取截留分子量為15000的有機(jī)膜進(jìn)行上述脂肪酶的回收，酶蛋白的回收率高達(dá)95％，回收的酶液中副產(chǎn)物甘油的殘存量小于5％，回收的酶可以重復(fù)使用。輕相經(jīng)過蒸餾(170-220℃,10mmHg)，分離出C14-C18脂肪酸甲酯(甲酯收率為95％)，余下塔釜液進(jìn)而裝入第二階段的固酶反應(yīng)器(裝有基于單位油脂質(zhì)量200個(gè)標(biāo)準(zhǔn)酶活的來源于米黑根毛霉Rhizomucor miehei的固定化脂肪酶)，同時(shí)加入基于油脂摩爾數(shù)2倍的甲醇，進(jìn)行反應(yīng)?？販?0℃，甲醇在2小時(shí)內(nèi)加完。在該反應(yīng)過程中，進(jìn)行如圖1所示的在線脫水，即反應(yīng)器一側(cè)直接與裝有無水短鏈醇的罐體相連，無水短鏈醇的溫度為20-40℃，反應(yīng)器的另一側(cè)與真空泵連接，然后真空泵與冷凝器連接，將反應(yīng)器中真空控制在10-100Mpa，冷凝器溫度為5-15℃。反應(yīng)4小時(shí)，體系中碳鏈長(zhǎng)度為C19及以上的多元不飽和脂肪酸油脂到對(duì)應(yīng)脂肪酸甲酯的轉(zhuǎn)化率為98％。

實(shí)施例13

將10g Chlorella vulgaris微藻油脂(含有DHA，二十二碳六烯酸)、基于油脂質(zhì)量8％的水以及基于單位油脂質(zhì)量500個(gè)標(biāo)準(zhǔn)酶活的來源于嗜熱絲孢菌(Thermomyces lanuginosus)的液體脂肪酶，置于適于酶催化的一級(jí)或多級(jí)酶反應(yīng)器中?？販?5℃，然后將基于油脂摩爾比為6：1的乙醇在4個(gè)小時(shí)內(nèi)勻速加入。反應(yīng)6個(gè)小時(shí)，肪酸碳鏈長(zhǎng)度為C14-C18的油脂轉(zhuǎn)化為對(duì)應(yīng)的脂肪酸乙酯(轉(zhuǎn)化率為92％)，然后將反應(yīng)液進(jìn)行離心分離，分離出含酶的重相和輕相(油相)。重相進(jìn)一步利用膜分離回收酶蛋白，選取截留分子量為15000的有機(jī)膜進(jìn)行上述脂肪酶的回收，酶蛋白的回收率高達(dá)95％，回收的酶液中副產(chǎn)物甘油的殘存量小于5％，回收的酶可以重復(fù)使用。輕相經(jīng)過蒸餾(170-220℃,10mmHg)，分離出C14-C18脂肪酸乙酯(乙酯收率為96％)，余下塔釜液進(jìn)而裝入第二階段的固酶反應(yīng)器(裝有基于單位油脂質(zhì)量200個(gè)標(biāo)準(zhǔn)酶活的來源于南極假絲酵母Candida antarctica的固定化脂肪酶)，同時(shí)加入基于油脂摩爾數(shù)1倍的乙醇進(jìn)行反應(yīng)?？販?5℃，乙醇在1小時(shí)內(nèi)加完。在該反應(yīng)過程中，進(jìn)行如圖1所示的在線脫水(包括陶瓷膜的膜脫水裝置以及包括分子篩在內(nèi)的吸水裝置)。反應(yīng)3小時(shí)，體系中碳鏈長(zhǎng)度為C19及以上的多元不飽和脂肪酸油脂到對(duì)應(yīng)脂肪酸乙酯的轉(zhuǎn)化率為98.5％。

實(shí)施例14

將10g T.pseudonana微藻油脂(含有二十二碳六烯酸、二十碳五烯酸和花生四烯酸)、基于油脂質(zhì)量5％的水以及基于單位油脂質(zhì)量500個(gè)標(biāo)準(zhǔn)酶活的來源于米黑根毛霉(Rhizomucor miehei)的液體脂肪酶，置于適于酶催化的一級(jí)或多級(jí)酶反應(yīng)器中?？販?5℃，然后將基于油脂摩爾比為6：1的乙醇在4個(gè)小時(shí)內(nèi)勻速加入。反應(yīng)8小時(shí)，肪酸碳鏈長(zhǎng)度為C14-C18的油脂轉(zhuǎn)化為對(duì)應(yīng)的脂肪酸乙酯(轉(zhuǎn)化率為92％)。反應(yīng)結(jié)束后，進(jìn)行靜置或離心分離。分離出含酶的重相和輕相(油相)。重相進(jìn)一步利用膜分離回收酶蛋白，選取截留分子量為15000的無機(jī)膜進(jìn)行上述脂肪酶的回收，酶蛋白的回收率高達(dá)95％，回收的酶液中副產(chǎn)物甘油的殘存量小于5％，回收的酶可以重復(fù)使用。輕相經(jīng)過蒸餾(170-220℃,10mmHg)，分離出C14-C18脂肪酸乙酯(乙酯收率為96％)，余下塔釜液進(jìn)而裝入第二階段的固酶反應(yīng)器(裝有單位油脂質(zhì)量100個(gè)標(biāo)準(zhǔn)酶活的來源于南極假絲酵母Candida antarctica的固定化脂肪酶以及基于單位油脂質(zhì)量200個(gè)標(biāo)準(zhǔn)酶活的來源于米黑根毛霉Rhizomucor miehei的固定化脂肪酶)，同時(shí)加入基于油脂摩爾數(shù)1倍的甲醇，進(jìn)行反應(yīng)?？販?5℃，甲醇在1小時(shí)內(nèi)加完。在該反應(yīng)過程中，進(jìn)行如圖1所示的在線脫水(包括有機(jī)膜或無機(jī)膜陶瓷膜在內(nèi)的膜脫水裝置以及包括分子篩在內(nèi)的吸水裝置)。反應(yīng)3小時(shí)，體系中碳鏈長(zhǎng)度為C19及以上的多元不飽和脂肪酸油脂到對(duì)應(yīng)脂肪酸甲酯的轉(zhuǎn)化率為98％。

實(shí)施例15

將10g T.fluviatilis微藻油脂(含有花生四烯酸和二十碳五烯酸)、基于油脂質(zhì)量5％的水以及基于單位油脂質(zhì)量500個(gè)標(biāo)準(zhǔn)酶活的來源于米曲霉(Aspergillus oryzae)的液體脂肪酶，置于適于酶催化的一級(jí)或多級(jí)酶反應(yīng)器中。控溫40℃，然后將基于油脂摩爾比為6：1的乙醇變速加入。30％的乙醇在反應(yīng)前2小時(shí)勻速加完，剩下的70％的乙醇在隨后2個(gè)小時(shí)內(nèi)勻速加完。反應(yīng)8小時(shí)，肪酸碳鏈長(zhǎng)度為C14-C18的油脂轉(zhuǎn)化為對(duì)應(yīng)的脂肪酸乙酯(轉(zhuǎn)化率為92％)。然后將反應(yīng)液進(jìn)行靜置，分離出含酶的重相和輕相(油相)。重相進(jìn)一步利用膜分離回收酶蛋白，選取截留分子量為15000的有機(jī)膜進(jìn)行上述脂肪酶的回收，酶蛋白的回收率高達(dá)95％，回收的酶液中副產(chǎn)物甘油的殘存量小于5％，回收的酶可以重復(fù)使用。輕相經(jīng)過蒸餾(170-220℃,10mmHg)，分離出C14-C18脂肪酸乙酯(乙酯收率為95％)，余下塔釜液進(jìn)而裝入第二階段的固酶反應(yīng)器(裝有基于單位油脂質(zhì)量200個(gè)標(biāo)準(zhǔn)酶活的來源于南極假絲酵母Candida antarctica的固定化脂肪酶)，同時(shí)加入基于油脂摩爾數(shù)1倍的甲醇，進(jìn)行反應(yīng)?？販?5℃，甲醇在1小時(shí)內(nèi)加完。在該反應(yīng)過程中，進(jìn)行如圖1所示的在線脫水(包括有機(jī)膜或陶瓷膜在內(nèi)的膜脫水裝置以及包括分子篩在內(nèi)的吸水裝置)。反應(yīng)3小時(shí)，體系中碳鏈長(zhǎng)度為C19及以上的多元不飽和脂肪酸油脂到對(duì)應(yīng)脂肪酸甲酯的轉(zhuǎn)化率為98.5％。

實(shí)施例16

將10g Chlorella vulgaris微藻油脂(含有DHA，二十二碳六烯酸)、基于油脂質(zhì)量5％的水以及基于單位油脂質(zhì)量800個(gè)標(biāo)準(zhǔn)酶活的來源于南極假絲酵母(Candida antarctica)的液體脂肪酶，置于適于酶催化的一級(jí)或多級(jí)酶反應(yīng)器中。控溫45℃，然后將基于油脂摩爾比為6：1的乙醇變速加入。40％的乙醇在反應(yīng)前2小時(shí)勻速加完，剩下的60％的乙醇在隨后2個(gè)小時(shí)內(nèi)勻速加完。反應(yīng)8小時(shí)，肪酸碳鏈長(zhǎng)度為C14-C18的油脂轉(zhuǎn)化為對(duì)應(yīng)的脂肪酸乙酯(轉(zhuǎn)化率為92％)。然后對(duì)反應(yīng)液進(jìn)行離心分離，分離出含酶的重相和輕相(油相)。重相進(jìn)一步利用膜分離回收酶蛋白，選取截留分子量為15000的陶瓷膜進(jìn)行上述脂肪酶的回收，酶蛋白的回收率高達(dá)95％，回收的酶液中副產(chǎn)物甘油的殘存量小于5％，回收的酶可以重復(fù)使用。輕相經(jīng)過蒸餾(170-220℃,10mmHg)，分離出C14-C18脂肪酸乙酯(乙酯收率為96％)，余下塔釜液進(jìn)而裝入第二階段的固酶反應(yīng)器(裝有基于單位油脂質(zhì)量100個(gè)標(biāo)準(zhǔn)酶活的來源于南極假絲酵母Candida antarctica的固定化脂肪酶以及基于單位油脂質(zhì)量100個(gè)標(biāo)準(zhǔn)酶活的來源于米黑根毛霉Rhizomucor miehei的固定化脂肪酶)，同時(shí)加入基于油脂摩爾數(shù)1倍的甲醇，進(jìn)行反應(yīng)?？販?5℃，甲醇在1小時(shí)內(nèi)加完。在該反應(yīng)過程中，進(jìn)行如圖1所示的在線脫水(包括無機(jī)膜或陶瓷膜在內(nèi)的膜脫水裝置以及包括分子篩在內(nèi)的吸水裝置)。反應(yīng)3小時(shí)，體系中碳鏈長(zhǎng)度為C19及以上的多元不飽和脂肪酸油脂到對(duì)應(yīng)脂肪酸甲酯的轉(zhuǎn)化率為98.5％。

實(shí)施例17

將10g Botryococcus sp.微藻油脂(含有二十碳五烯酸和二十二碳六烯酸)、基于油脂質(zhì)量5％的水以及基于單位油脂質(zhì)量800個(gè)標(biāo)準(zhǔn)酶活的來源于南極假絲酵母(Candida antarctica)的液體脂肪酶，置于適于酶催化的一級(jí)或多級(jí)酶反應(yīng)器中?？販?0℃，然后將基于油脂摩爾比為6：1的丙醇變速加入。40％的丙醇在反應(yīng)前2小時(shí)勻速加完，剩下的60％的丙醇在隨后2個(gè)小時(shí)內(nèi)勻速加完。反應(yīng)8小時(shí)，肪酸碳鏈長(zhǎng)度為C14-C18的油脂轉(zhuǎn)化為對(duì)應(yīng)的脂肪酸丙酯(轉(zhuǎn)化率為92％)。然后對(duì)反應(yīng)液進(jìn)行離心分離，分離出含酶的重相和輕相(油相)。重相進(jìn)一步利用膜分離回收酶蛋白，選取截留分子量為15000的陶瓷膜進(jìn)行上述脂肪酶的回收，酶蛋白的回收率高達(dá)95％，回收的酶液中副產(chǎn)物甘油的殘存量小于5％，回收的酶可以重復(fù)使用。輕相經(jīng)過蒸餾(170-220℃,10mmHg)，分離出C14-C18脂肪酸丙酯(丙酯收率為96％)，余下塔釜液進(jìn)而裝入第二階段的固酶反應(yīng)器(裝有基于單位油脂質(zhì)量200個(gè)標(biāo)準(zhǔn)酶活的來源于南極假絲酵母Candida antarctica的固定化脂肪酶)，同時(shí)加入基于油脂摩爾數(shù)3倍的甲醇，進(jìn)行反應(yīng)。控溫25℃，甲醇在2小時(shí)內(nèi)加完。在該反應(yīng)過程中，進(jìn)行如圖1所示的在線脫水(包括有機(jī)膜或無機(jī)膜在內(nèi)的膜脫水裝置以及包括分子篩在內(nèi)的吸水裝置)。反應(yīng)3小時(shí)，體系中碳鏈長(zhǎng)度為C19及以上的多元不飽和脂肪酸油脂到對(duì)應(yīng)脂肪酸甲酯的轉(zhuǎn)化率為98.5％。

實(shí)施例18

將10g Botryococcus sp.微藻油脂(含有二十碳五烯酸和二十二碳六烯酸)、基于油脂質(zhì)量10％的水以及基于單位油脂質(zhì)量800個(gè)標(biāo)準(zhǔn)酶活的來源于米曲霉(Aspergillus oryzae)的液體脂肪酶，置于適于酶催化的一級(jí)或多級(jí)酶反應(yīng)器中?？販?0℃，然后加入基于油脂摩爾比為6：1的丁醇變速加入，30％的丁醇在反應(yīng)前2小時(shí)勻速加完，剩下的70％的丁醇在隨后2個(gè)小時(shí)內(nèi)勻速加完。反應(yīng)8小時(shí)，肪酸碳鏈長(zhǎng)度為C14-C18的油脂轉(zhuǎn)化為對(duì)應(yīng)的脂肪酸丁酯(轉(zhuǎn)化率為92％)。然后將反應(yīng)液進(jìn)行離心分離，分離出含酶的重相和輕相(油相)。重相進(jìn)一步利用膜分離回收酶蛋白，選取截留分子量為15000的有機(jī)膜進(jìn)行上述脂肪酶的回收，酶蛋白的回收率高達(dá)95％，回收的酶液中副產(chǎn)物甘油的殘存量小于5％，回收的酶可以重復(fù)使用。輕相經(jīng)過蒸餾(170-220℃,10mmHg)，分離出C14-C18脂肪酸丁酯(丁酯收率為96％)，余下塔釜液進(jìn)而裝入第二階段的固酶反應(yīng)器(裝有基于單位油脂質(zhì)量200個(gè)標(biāo)準(zhǔn)酶活的來源于南極假絲酵母Candida antarctica的固定化脂肪酶)，同時(shí)加入基于油脂摩爾數(shù)3倍的甲醇，進(jìn)行反應(yīng)?？販?5℃，甲醇在2小時(shí)內(nèi)加完。在該反應(yīng)過程中，進(jìn)行如圖1所示的在線脫水(包括有機(jī)膜或陶瓷膜在內(nèi)的膜脫水裝置以及包括分子篩在內(nèi)的吸水裝置)。反應(yīng)3小時(shí)，體系中碳鏈長(zhǎng)度為C19及以上的多元不飽和脂肪酸油脂到對(duì)應(yīng)脂肪酸甲酯的轉(zhuǎn)化率為98.5％。

實(shí)施例19

將10g Botryococcus sp.微藻油脂(含有二十碳五烯酸和二十二碳六烯酸)、基于油脂質(zhì)量5％的水以及基于單位油脂質(zhì)量800個(gè)標(biāo)準(zhǔn)酶活的來源于南極假絲酵母(Candida antarctica)的液體脂肪酶，置于適于酶催化的一級(jí)或多級(jí)酶反應(yīng)器中。控溫45℃，然后加入基于油脂摩爾比為3：1的乙醇。乙醇變速加入，40％的乙醇在反應(yīng)前2小時(shí)勻速加完，剩下的60％的乙醇在隨后2個(gè)小時(shí)內(nèi)勻速加完。反應(yīng)8小時(shí)，肪酸碳鏈長(zhǎng)度為C14-C18的油脂轉(zhuǎn)化為對(duì)應(yīng)的脂肪酸乙酯(轉(zhuǎn)化率為93％)。然后將反應(yīng)液進(jìn)行離心分離，分離出含酶的重相和輕相(油相)。重相進(jìn)一步利用膜分離回收酶蛋白，選取截留分子量為15000的無機(jī)膜進(jìn)行上述脂肪酶的回收，酶蛋白的回收率高達(dá)95％，回收的酶液中副產(chǎn)物甘油的殘存量小于5％，回收的酶可以重復(fù)使用。分離出的重相經(jīng)膜回收脂肪酶，以供重復(fù)使用。輕相經(jīng)過蒸餾(170-220℃,10mmHg)，分離出C14-C18脂肪酸乙酯(乙酯收率為96％)，余下塔釜液進(jìn)而裝入第二階段的固酶反應(yīng)器(裝有基于單位油脂質(zhì)量400個(gè)標(biāo)準(zhǔn)酶活的來源于南極假絲酵母Candida antarctica的固定化脂肪酶)，同時(shí)加入基于油脂摩爾數(shù)2倍的甲醇，進(jìn)行反應(yīng)?？販?5℃，甲醇在1小時(shí)內(nèi)加完。在該反應(yīng)過程中，進(jìn)行如圖1所示的在線脫水，即反應(yīng)器一側(cè)直接與裝有無水短鏈醇的罐體相連，無水短鏈醇的溫度為20-40℃，反應(yīng)器的另一側(cè)與真空泵連接，然后真空泵與冷凝器連接，將反應(yīng)器中真空控制在10-100Mpa，冷凝器溫度為5-15℃。反應(yīng)3小時(shí)，鏈長(zhǎng)度為C19及以上的多元不飽和脂肪酸油脂到對(duì)應(yīng)脂肪酸甲酯的轉(zhuǎn)化率為98.5％。

實(shí)施例20

將10g魚油、基于油脂質(zhì)量20％的水以及基于單位油脂質(zhì)量300個(gè)標(biāo)準(zhǔn)酶活的來源于南極假絲酵母(Candida antarctica)的液體脂肪酶和基于單位油脂質(zhì)量600個(gè)標(biāo)準(zhǔn)酶活的來源于米曲霉(Aspergillus oryzae)的液體脂肪酶，置于適于酶催化的一級(jí)或多級(jí)酶反應(yīng)器中?？販?0℃，然后加入基于油脂摩爾比為5：1的乙醇，乙醇變速加入。40％的乙醇在反應(yīng)前2小時(shí)勻速加完，剩下的60％的乙醇在隨后2個(gè)小時(shí)內(nèi)勻速加完。反應(yīng)8小時(shí)，肪酸碳鏈長(zhǎng)度為C14-C18的油脂轉(zhuǎn)化為對(duì)應(yīng)的脂肪酸乙酯(轉(zhuǎn)化率為92％)。然后將反應(yīng)液進(jìn)行離心分離，分離出含酶的重相和輕相(油相)。重相進(jìn)一步利用膜分離回收酶蛋白，選取截留分子量為15000的有機(jī)膜進(jìn)行上述脂肪酶的回收，酶蛋白的回收率高達(dá)95％，回收的酶液中副產(chǎn)物甘油的殘存量小于5％，回收的酶可以重復(fù)使用。輕相經(jīng)過蒸餾(170-220℃,10mmHg)，分離出C14-C18脂肪酸乙酯(乙酯收率為95％)，余下塔釜液進(jìn)而裝入第二階段的固酶反應(yīng)器(裝有基于單位油脂質(zhì)量100個(gè)標(biāo)準(zhǔn)酶活的來源于南極假絲酵母Candida antarctica的固定化脂肪酶和裝有基于單位油脂質(zhì)量900個(gè)標(biāo)準(zhǔn)酶活的來源于米黑根毛霉(Rhizomucor miehei的固定化脂肪酶)，同時(shí)加入基于油脂摩爾數(shù)2倍的甲醇，進(jìn)行反應(yīng)?？販?0℃，甲醇在1小時(shí)內(nèi)加完。在該反應(yīng)過程中，進(jìn)行如圖1所示的在線脫水(包括有機(jī)膜、無機(jī)膜或陶瓷膜在內(nèi)的膜脫水裝置以及包括或分子篩在內(nèi)的吸水裝置)。反應(yīng)2小時(shí)，體系中碳鏈長(zhǎng)度為C19及以上的多元不飽和脂肪酸油脂到對(duì)應(yīng)脂肪酸甲酯的轉(zhuǎn)化率為99％。

雖然，上文中已經(jīng)用一般性說明及具體實(shí)施方案對(duì)本發(fā)明作了詳盡的描述，但在本發(fā)明基礎(chǔ)上，可以對(duì)之作一些修改或改進(jìn)，這對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進(jìn)，均屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。