專利名稱：PrP樣基因的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及核酸、由這些核酸編碼的蛋白質和涉及使用這些核酸和/或蛋白質的試驗。
背景技術：
朊病毒是導致人和動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)海綿狀腦病的傳染性病原體。朊病毒與細菌、病毒和類病毒不同。目前主要的假設是朊病毒蛋白的感染性不需要任何核酸組分。另外，感染一種動物(如人)的朊病毒不會容易地感染別的動物(如小鼠)。
對朊病毒及其所致疾病研究的一個重大進步是稱為朊病毒蛋白(“PrP”)的蛋白質的發(fā)現(xiàn)和純化〔Bolton等人，Science，2181309-11(1982)；Prusiner等人，Biochemistry，216942-50(1982)；McKinley等人，Cell，3557-62(1983)〕。已在轉基因動物中克隆、測序和表達了完整的朊病毒蛋白編碼基因。PrPC由一單拷貝的宿主基因所編碼〔Basler等人，Cell，46417-28(1986)〕，一般見于神經(jīng)元的外表面。一個主要的假設是PrPC轉變成稱為PrPSc的修飾形式而導致了朊病毒疾病。
對于動物和人的可傳染的神經(jīng)變性疾病的傳染和致病，朊病毒蛋白的羊搔癢癥同種型(PrPSc)似乎(appear)是必需的。參見S.B.Prusiner，“Molecular biology ofprion disease”，Science，2521515-1522(1991)。動物最常見的朊病毒疾病是綿羊和山羊的搔癢癥和牛的牛海綿狀腦病(BSE)〔J.Wilesmith和Wells，Microbiol.Immunol.，17221-38(1991)〕。已鑒定了人類的4種朊病毒疾病(1)庫魯病，(2)克羅依茨費爾特-雅各布綜合征(CJD)，(3)格-施-沙病(GSS)，(4)致命的家族失眠癥(FFI)〔D.C.Gajdusek，Science，197943-960(1977)；Medori等人，N.Engl.J.Med.，326444-449(1992)〕。人朊病毒疾病表現(xiàn)為單一發(fā)生的、遺傳的和傳染性疾病，這從一開始就提出了一個難題，可用PrP的細胞性基因起源來解釋。
大多數(shù)CJD病例是單一發(fā)生的，但大約10-15％是遺傳性的常染色體疾病，這種疾病系人PrP基因中的突變所致〔Hsiao等人，Neurology，401820-1827(1990)；Goldfarb等人，Science，258806-808(1992)；Kitamato等人，Proc.R.Soc.Lond.，343391-398〕。醫(yī)原性CJD是由尸體腦垂體人生長激素和腦硬膜移植所致〔Brown等人，Lancet，34024-27(1992)〕。盡管有無數(shù)次試圖將CJD與傳染源(如食用感染了搔癢癥的羊肉)聯(lián)系起來，但是除了醫(yī)原性引起的病例外，迄今一直不能確定這種聯(lián)系〔Harries-Jones等人，J.Neurol.Neurosurg.Psychiatry，511113-1119(1988)〕。另一方面，據(jù)信數(shù)十年來肆虐Fore和新幾內亞高地附近部落的庫魯病是由于食親屬尸體尸腦過程中受到傳染而播散〔M.P.Alpers，Slow TransmissibleDiseases of the Nervous System，第1卷，S.B.Prusiner和W.J.Hadlow編輯(NewYorkAcademic出版社)，pp.66-90(1979)〕。
CJD傳播給實驗性靈長類動物已有很長的歷史，始于William Hadlow′s對庫魯病與羊搔癢癥之間相似性的認識。1959年，Hadlow提出，將從臨死的庫魯病患者身上制得的抽提物接種到非人類的靈長類身上，觀察該動物是否如預計那樣在較長的培育期后發(fā)生此病〔W.J.Hadlow，Lancet，2289-290(1959)〕。7年后，Gajdusek、Gibbs和Alpers證明了在18-21個月的培育期后庫魯病傳播給黑猩猩〔Gajdusek等人，Nature，209794-796(1966)〕。庫魯病和CJD兩者的神經(jīng)病理學具有相似性〔Klazto等人，Lab Invest.，8799-847(1959)〕，這促進了使用黑猩猩進行類似的實驗，并在1968年報道了些病的傳播〔Jr.Gibbs等人，Science，161388-389(1968)〕。在過去的25年里，已將大約300例CJD、庫魯病和GSS傳播給各種類人猿和猴子。
這類實驗費用高、動物稀缺以及常被認為非人道，限制了這項工作的開展，使積累的知識有限。當從對人靈長動物的研究中獲得了最可靠的傳播數(shù)據(jù)時，已將人朊病毒疾病的一些病例傳染給嚙齒動物，但顯然規(guī)律性較差〔Jr.Gibbs等人，Slow Transmissible Diseases of the Nervous System，第2卷，S.B.Prusiner和W.J.Hadlow編輯(New YorkAcademic出版社)，pp.87-110(1979)；Tateishi等人，Prion Diseases of Humans and Animals，Prusiner等人編輯，(LondonEllis Horwood)，pp.129-134(1992)〕。
牛朊病毒傳播給人并產(chǎn)生變異的克羅依茨費爾特-雅各布綜合征(vCJD)的可能性提高了理解PrPC轉變?yōu)镻rPSc的重要性〔G.Chazot等人，Lancet，3471181(1996)；R.G.Will等人，Lancet，347921-925(1996)〕。早期的研究表明，PrPSc的N末端可被截短而不喪失搔癢癥傳染性〔S.B.Prusiner等人，Biochemistry，216942-6950(1982)；S.B.Prusiner等人，Cell，38127-134(1984)〕，并且相應的，截短PrPSc的N末端仍使得它轉變成PrPC〔M.Rogers等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，903182-3186(1993)〕。
近來的研究已發(fā)展到能在分子水平上觀察PrPC變?yōu)镻rPSc的結構轉換。例如，雖然其N末端部分相對地無結構和柔軟，但是它有助于穩(wěn)定C末端部分的結構性元件〔D.G.Donne等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，9413452-13457(1997)〕。而且，免疫學研究已證明PrPSc中N末端抗原表位是隱蔽性的，這支持了在朊病毒增殖過程中該區(qū)域發(fā)生了深刻的構象變化的觀點〔Peretz等人，J.Mol.Biol.，273614-622(1997)〕。
盡管取得這些進展，但是對該致病性轉變過程的結構生物學的了解在許多方面還不完全。例如，未能準確知道PrPC的哪個結構區(qū)域對于發(fā)生構象變化是必需的或充分的。也不知PrPC的哪個區(qū)域對傳染性是必需的或充分的。有證據(jù)表明，朊病毒的品系現(xiàn)象和種族屏障由另一中PrP構象所編碼，但是，這些構象的精確結構性決定簇尚未能精確地確定〔Telling等人，Science，2742079-2082(1996)；Billeter等人，Pro.Natl.Acad.Sci.USA，947281-7285(1997)〕。近來的研究已確定了小鼠PrP(MoPrP)的4個殘基，這些殘基看來能與假定其促進了PrPC轉變?yōu)镻rPSc的構象變化的一個假定因子(即X蛋白)相互作用〔Telling等人，Cell，8379-90(1995)〕。所有這4個氨基酸一起形成了重組PrIP90-231和重組PrIP29-231三級結構中的假定的X蛋白結合位點〔D.G.Donne等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，9413452-13457(1997)；T.L.James等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，9410086-10091(1997)〕。然而，盡管有幾篇論文報道了結合PrP的蛋白質，但是，X蛋白的身份仍難以確定。最后，雖然重折疊的重組的PrP分子的結構可能像PrPC，但是，仍缺乏PrPSc的結構解決方案。
確定PrP功能的一種策略是鑒定與PrP相似的蛋白質和闡明這些蛋白質的功能。對朊病毒相關基因的鑒定和研究也許能提供對神經(jīng)變性疾病的整體生物學和疾病進展的理解，還可提供對導致朊病毒介導疾病的機制改變的理解。因而，本領域需要鑒定和研究編碼具有類似朊病毒結構和/或功能的蛋白質的基因。
發(fā)明概述本發(fā)明提供編碼Doppel(“Dpl”)蛋白的核酸、Dpl肽以及使用該Dpl核酸和/或肽的實驗。在具體方面，Dpl蛋白是由SEQ ID NO1的核苷酸序列及其簡并序列所編碼。另外，本發(fā)明的特征是分離的核酸序列含有Dpl啟動子，以及能在嚴謹條件下與SEQ ID NO1雜交的序列。在相關方面，本發(fā)明的特征是含有編碼人Dpl多肽的核酸的表達載體和宿主細胞。本發(fā)明還涉及與人Dpl多肽特異性結合的抗體、生產(chǎn)人Dpl多肽的方法、鑒定表達Dpl的細胞的方法、使用Dpl基因和Dpl多肽改變培養(yǎng)基的和體內的細胞功能和朊病毒傳染性的方法，以及通過檢測Dpl編碼與調控序列中的改變和Dpl表達水平的改變來鑒定有變性疾病風險的個體。
本發(fā)明的一個主要目的是提供一種分離的人Dpl多肽編碼核酸，用于人Dpl(如在重組宿主細胞中)的表達，和用于例如人Dpl多肽結合性化合物的鑒定(尤其是那些影響人Dpl多肽介導的活性的化合物，這些化合物可用于調節(jié)Dpl活性)。
本發(fā)明的另一目的是提供一種分離的人Dpl多肽編碼核酸，用于產(chǎn)生具有Dpl基因功能的非人類轉基因動物模型，具體是以Dpl基因過量或異位表達為特征的“敲入(knock-in)”了Dpl的非人轉基因動物。
具體而言，Dp看來與PrP基因座產(chǎn)物具有協(xié)同性相互作用，Dpl基因座突變減少了動物感染PrP搔癢癥形式PrPSc的動物的培育期。為了調整朊病毒介導疾病所需的培育時間以及鑒定能調整可測量的朊病毒感染癥狀發(fā)作所需培育時間的化合物，在實驗中應用了該DNA的表達產(chǎn)物，還公開了編碼Dpl的DNA。
本發(fā)明的特征還有，在嚴謹條件下某些DNA序列能與編碼Dpl的DNA、或者與編碼Doppel的DNA互補的DNA雜交。這些DNA序列較佳至少長25個核苷酸，更佳長50個核苷酸。Dpl的肽片段(如那些在實驗中有用的)較佳至少長10個氨基酸，更佳至少長30個核苷酸。
本發(fā)明另一特征是具有宿主動物和遺傳不同的動物二者序列的嵌合性Dpl基因以及含有這些基因的轉基因動物。
本發(fā)明的一個目的是提供編碼新穎的Dpl蛋白及其功能等價物(functionalequivalent)的核苷酸序列。
本發(fā)明的另一目的是提供一種經(jīng)遺傳工程改造的表達編碼Dpl的核苷酸序列的細胞系。
本發(fā)明的又一目的是提供選擇性與Dpl蛋白或其肽結合的抗體。
本發(fā)明的又一目的是提供一種方法，借助該方法，可對某化合物或化合物文庫測試其激活或阻斷Dpl核苷酸序列表達蛋白質活性的能力。
本發(fā)明的一個優(yōu)點是能增加Dpl活性和/或表達的某些突變加速了朊病毒的傳染，因而，可以較早鑒定出動物實驗(如轉基因HuPrP小鼠實驗)中某接種物的朊病毒傳染性。
本發(fā)明的一個方面內容是表達下列物質的轉基因小鼠(1)人Dpl；(2)人Dpl和人PrP；(3)Dpl和PrP的人/小鼠嵌合基因；(4)牛Dpl；(5)牛Dpl和牛PrP；(6)Dpl和PrP的牛/小鼠嵌合基因；(7)(1-6)與消除了內源性Dpl和/或PrP基因的組合；(7)綿羊Dpl；(8)山羊Dpl；(9)麋鹿Dpl；和(10)鹿Dpl。在1996年10月15日出版的美國專利5565183號、1998年6月9日出版的5763740號、1998年8月4日出版的5789655號和1998年8月11日出版的5792901號中描述了可用于本發(fā)明的轉基因小鼠，本文納入這些文獻作為參考。
在閱讀了本文公開的內容之后，本領域的熟練技術人員將會明白本發(fā)明的這些和其它目的、優(yōu)點和特征。
附圖的簡短說明

圖1A是闡述Dpl(PrnD)基因位置的基因組結構和編碼區(qū)域的示意圖。圖1B闡述了Dpl的剪接變體和該區(qū)域中所鑒定的EST。
圖2A-2E是小鼠Dpl基因的核苷酸和相應的氨基酸序列。
圖3是闡述外顯子1的交替剪接供體位點的示意圖。
圖4是Prn基因區(qū)域的結構概觀，在圖的上面是最豐富形式的Prnp和PrnD剪接的mRNA(細線)。嵌合的cDNA以粗線表示，在染色體基因的上面顯示了用于RT-PCR的寡核苷酸引物(箭頭)的位置。
圖5是闡述Dpl cDNA變種Prnp外顯子2的結構的示意圖，所有cDNA共同的PrnD外顯子2分別以交叉的影線和空心框表示。
圖6是闡述在4個Prnp0/0小鼠系中PrP基因崩裂的結構示意圖。大的黑箭頭顯示缺失外顯子3剪接受體并與晚發(fā)病共濟失調的發(fā)展有關的等位基因。小的垂直箭頭表示在Ngsk和Rcm等位基因中缺失了外顯子3剪接受體的部位?？招目蚴荘rP的編碼區(qū)域，灰色框是PrP UTR。酶是E，Eco RI；X，XbaI；K，Kpn I。
圖7和8闡述了具有相同和保守區(qū)域的代表性PrP分子的人(SEQ IDNO2)Dpl、小鼠(SEQ ID NO3)Dpl和大鼠(SEQ ID NO4)Dpl的多條序列排列對比圖。
圖9是各具有其預測特征性位置的Dpl和PrP蛋白結構的示意圖。PrP中發(fā)現(xiàn)的3個d螺旋顯示在灰色框中，其中，A、B和C代表3個預測的Dpl螺旋。具有+符號的白色框顯示了一組堿性殘基。
最佳實施例的詳細描述在描述本文的DNA分子、蛋白質和使用方法之前，應理解本發(fā)明并不是限于描述的具體分子，當然可以進行改變。還應理解本文所用的術語僅是以描述具體的實施例為目的，而不意味著限制，因此本發(fā)明的范圍僅由后面的來限定。
除非作定義，本文所用的技術和科學術語的含義與本發(fā)明所屬領域普通技術人員通常所理解的一致。雖然在實際應用中或本發(fā)明的實驗中可使用任何與本文所描述的類似或相同的方法和材料，但是下面將描述優(yōu)選的方法和實施例。本文提及的所有出版物都被納入本文作為參考，以公開和描述與被引用的出版物有關的方法和/或材料。
本文僅僅提供本申請的申請日之前公開的出版物。本文不能解釋為承認本發(fā)明由于先前的發(fā)明而不能先于這些出版物授權。另外，所提供的出版日期可能與準確的出版日期不同，這可能需要單獨地去確認。
定義本文所用術語“核酸”指寡核苷酸、核苷酸及其片段或部分，以及肽核酸(PNA)、片段、部分或其反義分子，該術語還指可能是單鏈或雙鏈并代表有義或反義鏈的基因組的或合成的DNA或RNA。其中，“核酸”指特殊的核酸序列(如Dpl多肽的編碼核酸)，“核酸”指包含編碼與所述多肽功能上相等多肽的核酸(如為簡并變體的核酸)，或者編碼所述多肽的生物活性變體或片段的核酸。類似地，本文所用“多肽”指寡肽、肽或蛋白質。其中，所述“多肽”指天然蛋白質分子的氨基酸序列，“多肽”和類似的術語并不意味該氨基酸序列限于與所述蛋白質分子有關的完整、天然的氨基酸序列。
“反義核酸”指具有與某給定核酸序列(如編碼Dpl多肽的核酸序列)互補的核苷酸序列，它包括與所給定核酸序列的轉錄和翻譯有關的核酸序列(如編碼Dpl多肽的核酸的啟動子)，其中，反義核酸能與Dpl多肽的編碼核酸序列雜交。特別重要的是反義核酸能在體外或體內抑制Dpl編碼核酸的轉錄和/或剪接和/或翻譯。
本文所用“肽核酸”指含有可在其中加入氨基酸殘基(如賴氨酸)和氨基的寡聚體的分子。這些小分子，也稱為反基因試劑，能通過與它們的核酸互補(模板)鏈結合而停止轉錄延伸〔Nielsen等人，Anticancer Drug Des，853-63(1993)〕。
“多肽”指氨基酸鏈，而不管其長度或翻譯后的修飾(如糖基化)。
本文所用“Dpl多肽”指具有i)天然的Dpl多肽，ii)Dpl多肽的生物活性片段，iii)Dpl多肽的生物活性多肽類似物，或者iv)Dpl多肽的生物活性變體的氨基酸序列的重組或非重組多肽。本發(fā)明的多肽可從任何物種中獲得，如哺乳動物或非哺乳動物〔如爬行動物、兩棲動物、禽類(如雞)〕，特別是哺乳動物，包括人、嚙齒動物(如小鼠或大鼠)、牛、羊、豬、鼠、或者馬，優(yōu)選大鼠或人；本發(fā)明的多肽也可是天然的、合成的、半合成的或重組的?！叭薉pl多肽”指從人分離得到的人Dpl多肽的氨基酸序列，它包括所有的天然產(chǎn)生的等位變體，而不限于與所述蛋白質分子有關的完整、天然的氨基酸序列。
本文所用“抗原性氨基酸序列”是指單獨或與一種載體分子結合可在哺乳動物體內引發(fā)抗體應答的氨基酸序列。
人Dpl多肽的“變體”指具有一個或多個氨基酸改變的氨基酸序列。變體可具有“保守”性改變，其中取代的氨基酸具有類似的結構或化學特性，如用異亮氨酸取代亮氨酸。更少見的是，變體可具有“非保守”性改變，如用色氨酸取代甘氨酸。類似的較小的變異還可包括氨基酸的刪除或插入或兩者。使用本領域熟知的計算機程序(如DNAstar軟件)可以找到指南以確定哪個和有多少個氨基酸殘基可被取代、插入或被刪除而不喪失生物學或免疫學活性。
“缺失”是指與天然產(chǎn)生的Dpl多肽的氨基酸序列或核苷酸序列相比，分別缺少一個或多個氨基酸或核苷酸殘基的氨基酸序列或核苷酸序列中的改變。
“插入”或“加成”指與天然產(chǎn)生的Dpl多肽的氨基酸序列或核苷酸序列相比，分別增加了一個或多個氨基酸或核苷酸殘基的氨基酸序列或核苷酸序列中的改變。
“取代”指與天然產(chǎn)生的Dpl多肽的氨基酸序列或核苷酸序列相比，一個或多個氨基酸或核苷酸被不同的氨基酸或核苷酸所置換而闡述的結果。
術語“生物活性”指具有天然產(chǎn)生的Dpl多肽的結構、調節(jié)或生化功能的人Dpl多肽。同樣的，“免疫學活性”指天然的、重組的或合成的人Dpl多肽或它們的寡肽在適當?shù)膭游锘蚣毎姓T導特異性免疫應答并與特異性抗體結合的的能力。
本文所用“衍生物”指編碼人Dpl多肽的核酸或其編碼的人Dpl多肽的化學修飾。這些修飾的例子可能是以烷基、?；虬被〈藲洹：怂嵫苌锞幋a保留了天然Dpl多肽主要生物學特征的多肽。
本文所用術語“分離的”指感興趣的化合物(如核酸或多肽)存在于與它天然產(chǎn)生的環(huán)境不同的環(huán)境中。“分離的”包括樣品中的感興趣的化合物已被充分富集，和/或該樣品中感興趣的化合物被部分或充分地純化。
本文所用術語“充分純化的”指從其天然的環(huán)境中分離出來的至少60％、較佳75％、最佳90％沒有其天然與其伴隨的組分的化合物(如核酸或多肽)。
“嚴謹”通常指約Tm-5℃(在探測器溫度以下5℃)到Tm以下20℃-25℃的范圍內。本領域熟練的技術人員將會理解，可進行嚴謹性雜交以鑒定或檢測相同的核酸序列或者鑒定或檢測類似的或相關的核酸序列。
本文所用術語“雜交”將包括“一條核酸鏈通過堿基配對與互補鏈結合的任何過程”〔Coombs，Dictionary of Biotechnology，Stockton Press，New YorkNY(1994)〕。Dieffenbach等人〔PCR Primer，a Laborary Manual，Cold Spring HarborPress，Plainview NY(1995)〕描述了在聚合酶鏈式反應技術中進行的擴增。
“轉化”指在摻入新的DNA(即對于細胞來說是外源性DNA)之后導致細胞中的永久或暫時性遺傳改變，較佳是永久性遺傳改變?？蓪⑿碌腄NA摻入宿主細胞的基因組中或者將該新的DNA作為附加元素暫時或穩(wěn)定地保持而實現(xiàn)遺傳改變。當細胞是哺乳動物細胞時，一般將DNA導入該細胞的基因組中以實現(xiàn)永久性遺傳改變。
“構建物”指以表達特異的核苷酸序列為目的而產(chǎn)生的、或者用于構建其它重組核苷酸序列的一種重組核酸，一般是重組DNA。
“操作性連接”指一DNA序列和一調節(jié)序列以以下方式連接即當此適當?shù)姆肿?如轉錄激活蛋白)結合于該調節(jié)序列時可使其基因表達。
“有效插入”指將某感興趣的核苷酸序列置于能指導該導入的感興趣核苷酸序列轉錄和翻譯的一核苷酸序列毗鄰處(即，有利于產(chǎn)生例如Dpl序列編碼的多肽)。
“Dpl相關疾病”指與Dpl功能改變(如由于Dpl表達異?；駾pl表達缺陷或Dpl蛋白缺陷)有關的生理狀況或疾病。這些Dpl相關疾病可包括但不一定限于朊病毒樣疾病或其它涉及神經(jīng)毒性和/或神經(jīng)變性的類似疾病。
本文所用術語“轉基因”描述已經(jīng)或即將被人為地插到哺乳動物，尤其是活的哺乳動物的細胞基因組中的遺傳物質。
“轉基因生物”指在其細胞的一部分中具有作為染色體外因子存在的或穩(wěn)定地整合到該細胞品系DNA中的非內源性(即異種的)核酸序列的非人類生物體(如單細胞生物，如酵母)、哺乳動物、非哺乳動物(如線蟲或果蠅)。
“轉基因動物”指在其細胞的一部分中具有作為染色體外因子存在的或穩(wěn)定地整合到該細胞品系DNA中的(即在大多數(shù)或全部細胞的基因組序列中)非內源性(即異種的)核酸序列的非人類動物，通常是哺乳動物?？赏ㄟ^對宿主動物的胚胎或胚胎干細胞進行基因操作，將異種核酸導入這類轉基因動物的品系中。小鼠是一種優(yōu)選的動物。
靶基因的“敲除”指基因序列上的改變，其結果導致了該靶基因功能下降，較佳的是這些靶基因的表達不可測知或不顯著。Dpl基因的敲除指Dpl基因的功能已大大降低，以致于檢測不到Dpl的表達或僅以不顯著水平表達。本發(fā)明的“敲除”轉基因可以是具有Dpl基因雜合敲除或純合敲除的轉基因動物?！扒贸边€包括條件性敲除，即在例如將動物暴露于促進靶基因改變的物質中之后、將促進靶基因位點(如在Cre-lox系統(tǒng)的Cre)重組的酶導入之后，或者使用指導靶基因后天改變的其他方法之后，才發(fā)生靶基因的改變。
靶基因的“敲入”指在宿主細胞基因組中發(fā)生的導致該靶基因表達改變〔如提高(包括異位的)或減少表達〕的改變，如通過導入該靶基因的額外的拷貝，或通過有效地插入用來提高該靶基因內源拷貝表達的調節(jié)序列。本發(fā)明的“敲入”轉基因可以是具有Dpl基因雜合敲入或純合敲入的轉基因動物?！扒萌搿币舶l件性敲入。
術語“Prnp0/0或Prnp-Abl”指一種轉基因動物，它的PrP基因已消除，用“0/0”表示兩個等位基因都已消除，而o/+表示僅有一個基因被消除。特別地，所涉及的動物一般是其PrP基因已消除的轉基因小鼠，即PrP敲除小鼠。在PrP基因被破壞的小鼠中，不表達小鼠PrP蛋白。
術語“朊病毒”指已知的導致動物包括牛和人患病(海綿狀腦病)的傳染性顆粒。術語“朊病毒”的英文“prion”是“protein(蛋白)”和“infection(傳染)”的縮寫，該顆粒若非專有則主要由PrP基因編碼的PrPSc分子組成。朊病毒與細菌、病毒和類病毒不同。已知的朊病毒包括那些感染動物導致搔癢癥(一種可傳播的、綿羊和山羊神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病)和牛海綿體腦病(BSE)或“瘋?！辈∫约柏埖呢埡＞d體腦病的朊病毒。已知4種影響人類的朊病毒疾病(1)庫魯病，(2)克羅依茨費爾特-雅各布綜合征(CJD)，(3)格-施-沙病(GSS)，(4)致命的家族失眠癥(FFI)。本文使用的朊病毒包括導致所有或任何這些疾病的或者其它在任何動物中使用的、尤其是在人、牛和其它農(nóng)場動物中使用的所有形式的朊病毒。
術語“PrP基因”或“Prnp基因”在本文中可交換使用，描述表達蛋白質(如1996年10月15日發(fā)表的美國專利5565186號的圖3-5中所顯示的)的遺傳物質和在副標題“病原性突變和多態(tài)性”下所列出的那些多態(tài)性和突變。PrP基因可以來自任何動物，包括本文所述的“宿主”和“實驗”動物，以及其任何和所有的多態(tài)性和突變，該術語還包括其他仍待發(fā)現(xiàn)的PrP基因。
本文所用的術語“人工PrP基因”包括“嵌合的PrP基因”以及其它重組構建的基因，當它們包括在宿主動物(如小鼠)的基因組中時，將使該哺乳動物易于被那些僅天然感染遺傳上與其不同的實驗哺乳動物(如人、?；蚓d羊)的朊病毒所感染。通常，人工基因包括基因工程改造的哺乳動物的PrP基因的密碼子序列，即天然序列的一個或多個(但不是全部，一般少于40個)密碼子被不同的密碼子取代，優(yōu)選被遺傳上與其不同的哺乳動物(如人)的相應的密碼子取代。經(jīng)基因工程改變的這種哺乳動物將被用來檢測樣品中僅感染遺傳上與其不同的哺乳動物的朊病毒。人工基因的例子有小鼠PrP基因，該基因編碼美國專利5565186號的圖3、4和5中所示的序列，該序列具有一個或多個不同的取代密碼子，這些取代密碼子選自那些圖中所示的人、牛和綿羊的密碼子，取代了小鼠相同位置上的密碼子，條件是不是所有的小鼠密碼子都被不同的人、?；蚓d羊的密碼子所取代。本發(fā)明的人工PrP基因不僅可包括遺傳上于其不同的動物的密碼子，還可包括與遺傳性朊病毒疾病(如CJD)相關的密碼子和密碼子序列，以及與天然PrP基因無關、但當插入動物時將使該動物易于被通常只感染遺傳上與其不同的動物的朊病毒所感染的密碼子和序列。
術語“嵌合基因”、“嵌合PrP基因”等在本文中可交換使用，指一種人工構建的基因，該基因含有宿主動物(如小鼠)的密碼子，該宿主動物的一個或多個密碼子被遺傳上與其不同的的實驗動物(如人、牛或綿羊)的相應密碼子所取代。在一個具體例子中，嵌合基因由宿主種類(如小鼠)的哺乳動物的PrP基因的起始序列和終止序列(即N末端和C末端密碼子)組成，還包含另一種(如人)實驗哺乳動物的PrP基因的相應部分的核苷酸序列。當此嵌合基因被插入宿主哺乳動物的基因組中時，它將使該哺乳動物易于被通常只感染另一種哺乳動物的朊病毒所感染。本文公開的較佳的嵌合基因是Mhu2M，它含有小鼠PrP基因的起始序列和終止序列以及被相應的人的序列取代的非末端序列區(qū)域，該相應的人序列和小鼠PrP基因表達的蛋白質有9個殘基不同。
術語“宿主動物”和“宿主哺乳動物”指將對它們的基因組進行基因工程和人工操作以使它們含有它們天然原本不存在的遺傳物質的動物。例如，宿主動物包括由于插入本發(fā)明的人工基因或者遺傳上與其不同的實驗動物的天然PrP基因而改變了它們的內源性PrP基因的小鼠、倉鼠和大鼠。
術語“宿主動物”和“宿主哺乳動物”指將對它們的基因組進行基因工程和人工操作以使它們含有它們天然原本不存在的遺傳物質的動物。例如，宿主動物包括它們的內源性Dpl基因已改變了的小鼠、倉鼠和大鼠。在一個較佳實施例中，這些宿主動物還具有由于插入人工基因或者遺傳上與其不同的實驗動物的天然PrP基因而改變了的PrP基因。
術語“實驗動物”和“實驗哺乳動物”指與宿主動物遺傳上不同，即其PrP基因與宿主動物PrP基因之間存在差異的動物。實驗動物可以是人們希望在其身上進行檢測試驗以確定某給定樣品中是否含有其通常易于感染的朊病毒的任何動物。例如，實驗動物可以是人、牛、綿羊、豬、馬、貓、狗、火雞或雞，人們希望確定具體的樣品中是否含有通常只感染這些實驗動物的朊病毒。通過將實驗動物的PrP基因序列導入宿主動物并給宿主動物接種通常只感染實驗動物的朊病毒而進行上述實驗。
術語“遺傳上不同的動物”和“遺傳上不同的哺乳動物”指一種導入了宿主動物天然PrP密碼子序列的動物，該宿主動物的PrP密碼子序列與遺傳上與其不同的實驗動物有17個或更多個密碼子不同，較佳有20個或更多的不同，最佳有28-40個密碼子不同。因而，相對于人、牛和綿羊的PrP基因，小鼠的PrP基因是遺傳上不同的，但是相對于倉鼠它不是遺傳上不同的。
術語“消除的PrP基因”、“破壞的PrP基因”在本文中可交換使用，指以使基因不起作用的方式已被改變(如加入和/或去除核苷酸)的內源性PrP基因。Büeler等人〔Nature，356577-582(1992)〕公開了非功能性PrP基因的例子和制備這些基因的方法，本文納入該文作為參考。較佳的是，兩個等位基因都被破壞。
術語“消除的Dpl基因”、“破壞的Dpl基因”等在本文中可交換使用，指以使基因不起作用的方式已被改變(如加入和/或去除核苷酸)的內源性Dpl基因。
術語“雜交動物”、“轉基因雜交動物”等在本文中可交換使用，指具有改變的Dpl活性的第一種動物與第二種動物雜交繁育得到的動物，該第二種動物含有(1)消除的內源PrP基因、(2)嵌合或人工PrP基因和/或(3)遺傳上不同的動物的PrP基因。例如，可通過使具有Dpl轉基因敲入的小鼠與僅含有(1)牛PrP基因(可存在高拷貝數(shù))或者與(2)嵌合的PrP基因的小鼠雜交而繁育獲得雜交小鼠。在另一例子中，可通過使具有未受到調節(jié)的Dpl活性的PrP0/0小鼠與具有可誘導的外源性人PrP基因的小鼠雜交，繁育獲得雜交小鼠。術語雜合體包括一種雜合體的后代和包括兩種雜合體的近交后代，只要產(chǎn)生的后代易于被通常只感染遺傳上與其不同的動物的朊病毒所感染，并且感染后的病癥在大約350天以內、較佳是250天以內是可觀察的。
術語“培育時間”應指從給動物接種朊病毒開始，到該動物由于被感染而首次顯示出可檢測的病癥為止的這段時間。減少培育時間較佳為約200天±50天以內，更佳為約50天±20天以內。
“抗體”指能與抗原結合的免疫球蛋白。本文所用抗體包括整個抗體以及能結合感興趣的抗原表位、抗原或抗原片段的抗體片段(如F(ab′)2、Fab′、Fab、Fv)。
本發(fā)明的抗體是免疫反應性的或免疫特異性的，因此可特異性地和選擇性地與Dpl蛋白結合。Dpl的抗體較佳是免疫特異性的，即基本上不與相關物質發(fā)生交叉反應。雖然術語“抗體”包括所有類型的抗體(如單克隆抗體)，但是，本發(fā)明的抗體宜采用本文所述的噬菌體展示方法獲得。本發(fā)明較佳的抗體是純化的抗體。純化的抗體指與其它天然相關的蛋白質、碳水化合物和脂質充分地分離。這種抗體與Dpl蛋白(或其抗原片段)“優(yōu)先地結合”，即基本上不識別和結合其它無關抗原分子。
本文所用“特異性地激活”指能激活Dpl或其片段或類似物以啟動本文所述的Dpl介導的生物活動的試劑，但是，該試劑基本上不與樣品(如生物樣品)中的其它分子結合。
本文所用“特異性地抑制”指能抑制Dpl或其多肽、片段或類似物活性的試劑。較佳的是，該試劑在體內或體外能激活或抑制它所結合的蛋白質的生物活性。
“大大地增加”指與對照的水平相比(對照實驗中沒有激活劑)在活性或其他可測定的表型特征上至少有大約2倍的增加，較佳至少有大約5倍的增加，更佳在活性上比對照實驗至少有約10倍的增加。
“大大地降低”或“大大地減少”指與對照的水平相比，在活性或其它可測定的表型特征上有大約80％的降低或減少，較佳是減少到對照水平的50％，或者更佳地減少到對照水平的約10％或更少。
術語“篩選方法”和“試驗方法”指篩選能夠作為1)Dpl活性和/或2)朊病毒感染培育時間的激活劑或抑制劑的候選化合物的方法。
術語“治療”在本文中一般指獲得理想的藥理學和/或生理學效果。該效果可以是預防性的，能完全或部分地預防疾病或其癥狀的發(fā)生，和/或可以是治療性的，能部分或完全地治愈疾病和/或該疾病引起的副作用。本文所用“治療”包括治療哺乳動物特別是人的疾病，它包括(a)預防易患該疾病或癥狀、但還未診斷出的受檢者發(fā)生疾病或癥狀；(b)抑制該疾病癥狀，即阻止它的發(fā)展；或(c)緩解該疾病癥狀，即導致該疾病消退。
本發(fā)明總的方面本文所描述的是一種179個殘基的新穎的Dpl蛋白(Dpl)，它與所有已知的朊病毒蛋白(PrP)有～25％的相同性。由于為鑒定PrP樣基因而進行的數(shù)據(jù)庫檢索沒有獲得相應的信息，且在這些努力下進行的雜交研究并不富有成效〔Westaway等人，Nucleic Acids Res.，142035-2044(1986)〕，因此，進行了含有PrP基因的大粘?？寺〉臏y序〔Lee等人，Genome Res.，81022-1037(1998)〕。雖然具有相關功能的大多數(shù)脊椎動物基因沒有排列成簇，但是一些相關基因排在一起。在對人、綿羊和小鼠PrP基因周圍區(qū)域的研究中，沒有鑒定出另外的開放讀框(ORF)。僅當延長從Prnpb/b(ILN/J)小鼠分離得到的粘?？寺〉臏y序時，才發(fā)現(xiàn)PrP的下游是一個新穎的開放讀框。
該Dpl基因座稱為“Prnd”，是PrP基因Prnp的16Kb的下游，它產(chǎn)生1.7和2.7Kb兩種主要的轉錄產(chǎn)物，以及通過PrnP的基因間剪接產(chǎn)生一些與不常見的嵌合轉錄產(chǎn)物。還鑒定到PrP和Dpl之間的多順反子mRNA。與PrP一樣，DplmRNA在胚胎形成時期表達，但與PrP相反，它在CNS中低水平表達而在睪丸中高水平表達。Dpl在發(fā)生晚發(fā)病性共濟失調和浦肯野細胞變性的兩種Prnp0/0品系的CNS中未受到調節(jié)，但在不發(fā)生共濟失調的一些Prnp0/0小鼠品系中不是這樣。Dpl可能是神經(jīng)毒性的，這解釋了為什么Prnp0/0小鼠的一些品系會發(fā)生神經(jīng)變性。Dpl還可能對其它非神經(jīng)元細胞類型有毒性。
而且，Dpl和PrP之間基本同源表明這兩種蛋白質可能共有一些生物特性，同樣地，Dpl可含有一種理解朊病毒生物學的新元素。通過鑒定Prnd作為PrP樣基因的第一候選物，我們已開始確定Prn基因家族。令人感興趣的是，Dpl的過度達象一些突變體和外源性PrP一樣，在小鼠的CNS中產(chǎn)生了神經(jīng)變性。另外，Dpl和PrP可通過競爭作為共同受體蛋白質的配體，直接或間接地相互作用。本發(fā)明提供了一種檢驗這些假設的方法。
Dpl核酸術語“Dpl基因”和“Prnd”一般指Dpl的編碼區(qū)域?！癉pl基因”和“Prnd”還指編碼特異性Dpl多肽的開放讀框、內含子和涉及表達調節(jié)的毗鄰5′和3′端的非編碼核苷酸序列，該序列高達約1Kb超出轉錄區(qū)域，但有可能在兩方向之一上延伸。編碼Dpl的DNA序列可以是cDNA或基因組DNA或其片段?？蓪⒃摶驅脒m當?shù)妮d體中，以保持在染色體外或者整合到宿主中。
本文所用的術語“cDNA”包括含有在天然成熟的mRNA種類中發(fā)現(xiàn)的序列件排列所有核酸，其中的序列元件是外顯子(如編碼該編碼多肽的開放讀框的序列)與3′和5′非編碼區(qū)域。一般的mRNA種類具有毗鄰的外顯子，和通過核RNA剪接去除間插內含子，可產(chǎn)生編碼Dpl多肽的一連續(xù)開放讀框。
雖然其它來源的其它基因組Dpl序列可能具有非毗鄰開放讀框(如內含子間斷了蛋白編碼區(qū)域)，但是人基因組Dpl序列的編碼序列沒被內含子間斷。感興趣的基因組序列包含存在于起始密碼子和終止密碼子之間的核酸，如在所列出的序列中所定義的，它包括通常存在于天然染色體中的所有的內含子。它還包括在成熟mRNA中發(fā)現(xiàn)的3′和5′非翻譯區(qū)域。它還包括特異性轉錄和翻譯調節(jié)序列，如啟動子、增強子等，其中包括在該轉錄區(qū)域5′或3′端的約1Kb(但可能更長)的側接基因組DNA。該基因組DNA可以被分離成100kbp或更小的片段；以及基本上沒有側翼染色體序列。
該5′區(qū)域序列和更遠的5′上游序列和3′下游序列可用作啟動子元件(包括增強子結合位點)，提供在表達Dpl的組織中的表達。本發(fā)明Dpl啟動子元件的序列可以以所有動物種類〔如哺乳動物或非哺乳動物(如爬行動物、兩棲動物、禽類(如雞)〕、尤其是哺乳動物的核苷酸序列為基礎，包括人、嚙齒動物(如小鼠或大鼠)、牛、綿羊、豬、鼠或馬，較佳是大鼠或人；本發(fā)明Dpl啟動子元素的序列也可以從天然的、合成的、半合成的或重組的所有來源中分離或產(chǎn)生。
使用特異性表達Dpl的組織來確定表達的模式，并提供能模擬天然表達模式的啟動子?？墒褂脝幼訁^(qū)域中自然存生的多態(tài)性來確定表達中的自然變異，特別是那些可能與疾病有關的變異?；蛘?，可將突變導入該啟動子區(qū)域中，以確定用實驗所確定的系統(tǒng)中表達改變的效果。鑒定特異性DNA基序的方法涉及本領域熟知的轉錄因子(如與已知的結合基序相類似的序列)的結合、凝膠阻滯研究等。例如，參見Blackwell等人，Mol Med，1194-205(1995)；Mortlock等人，GenomeRes.，6327-33(1996)；和Joulin等人，Eur J Biochem，232620-626(1995)。
在一個實施例中，使用啟動子來調節(jié)Dpl的表達。如下所述，Dpl在胚胎的心臟組織和成年腦的一個神經(jīng)元亞組中表達。從而，可使用由Dpl啟動子指導的發(fā)育時控表達來促進操作性連接于Dpl啟動子的異源基因的表達。可由Dpl啟動子表達的感興趣的典型基因包括但不一定限于標記基因(如可標記表達Dpl的神經(jīng)元細胞的基因)和報道基因(如熒光素酶、CAT等)。這些標記基因和報道基因可有助于闡明Dpl的正常生理功能、鑒定調節(jié)Dpl的機理和/或尋找能調節(jié)Dpl表達的生物活性試劑(如候選的藥物制劑)等。
可使用這些調節(jié)序列來鑒定Dpl表達的轉錄或翻譯調節(jié)所需的順式反應序列，尤其是在不同的組織或發(fā)育的不同階段中，以及鑒定能調節(jié)或介導Dpl表達的順式反應序列和反式反應因子。為了促進野生型或改變的Dpl或感興趣的其它蛋白質在培養(yǎng)的細胞中或在胚胎、胎兒或成年組織中的表達，以及為了用于基因治療，可將這些轉錄和翻譯控制區(qū)域操作性連接于Dpl基因或其它基因。還可使用Dpl轉錄和翻譯控制區(qū)域來鑒定能調節(jié)Dpl啟動子活性從而調節(jié)Dpl表達的胞外信號分子。
用于本發(fā)明的核酸組合物可適當?shù)鼐幋a所有的或一部分Dpl多肽。Dpl序列可用于Dpl相關疾病狀態(tài)的形成和/或該蛋白質變體的自然發(fā)生。按照常規(guī)方法，通過化學合成寡核苷酸、限制性酶消化、PCR擴增等可獲得此DNA序列的片段。對于大多數(shù)部分，DNA片段至少有約10個核苷酸，一般至少有約15個核苷酸，更通常的情況至少有約18-20個核苷酸，更通常至少有約25-50個核苷酸。這些小的DNA片段可用作PCR、雜交篩選等的引物。較大的DNA片段即超過100個核苷酸的片段可用于產(chǎn)生編碼的多肽。在擴增反應(如PCR)中將使用一對引物。引物序列的精確組成對本發(fā)明來說并不是關鍵性的，但是在大多數(shù)應用中，如本領域所周知的，引物將在嚴謹下將與目標序列雜交。較佳的是，選擇將會產(chǎn)生至少約50個核苷酸、較佳至少約100個核苷酸擴增產(chǎn)物的一對引物。選擇引物序列的算法通常已知，可在商業(yè)軟件包中得到。擴增引物與DNA的互補鏈雜交，并相互引導延伸。
分離和獲得高純度的Dpl基因，通常認為不同于完整的哺乳動物染色體。一般情況下，可獲得除Dpl序列或其片段以外基本上無其他核酸序列的DNA，通常其純度至少約50％，一般至少約90％，并且通常是“重組”的，即側接一個或多個通常與自然產(chǎn)生的染色體無關的核苷酸。
該DNA序列可用于各種用途。它們可用作鑒定編碼朊病毒樣蛋白的其它基因的探針，或者用于鑒定不同動物中的Dpl同源物。哺乳動物的同源物具有基本上相互類似的序列，即至少有75％、一般至少有90％、更通常至少有95％的序列相同?？梢詤⒄招蛄袨榛A計算序列的相似性，該參照序列可以是一系列較大的序列，如保守的基序、編碼區(qū)域、側翼區(qū)域等。參照序列一般至少長約18個核苷酸，更一般至少長約30個核苷酸，它可延伸成該完整序列以供比較。序列分析的算法在本領域中是周知的，如BLAST，在Altschul等人，J Mol Biol，215403-10(1990)中有描述。
通過在低嚴謹條件下雜交檢測到具有序列相似性的核酸，例如，在50℃和6×SSC(0.9M鹽水/0.09M檸檬酸鈉)中，且當55℃用1×SSC(0.15M氯化鈉/0.015M檸檬酸鈉)洗滌時雜交產(chǎn)物仍維持結合?？稍诟邍乐敆l件下如在50℃以上和0.1×SSC(15mM鹽水/0.15mM檸檬酸鈉)雜交確定序列的相同性。通過使用探針，尤其是DNA序列的標記探針，可分離同源的或相關的基因。同源基因的來源可以是任何動物，如靈長類，具體是人類；嚙齒動物，如大鼠和小鼠、犬、貓、牛、綿羊、馬、酵母、果蠅、Caenhorabditis等。
還可用編碼Dpl的DNA鑒定生物樣品中此基因的表達。文獻報道已建立了探查細胞中是否存在特殊的核苷酸序列(如基因組DNA或RNA)的方法，不需在此作詳細的闡明。從細胞樣品中分離出mRNA?？赏ㄟ^RT-PCR，采用反轉錄酶形成互補的DNA鏈，接著使用對受檢DNA序列有特異性的引物進行聚合酶鏈式反應擴增得到的mRNA?；蛘?，采用凝膠電泳分離mRNA樣品，將其轉移到合適的載體上(如硝酸纖維素、尼龍等)，然后用受檢DNA的一條片段作為探針進行探測。也可使用其它技術，如寡核苷酸連接試驗、原位雜交和與排列在固體芯片上的DNA探針雜交。mRNA與Dpl序列雜交的檢出表明樣品中有Dpl基因表達。
出于一些目的，可對Dpl核酸序列進行修飾，特別是在胞內使用它們時，例如，為了切割基因，將它們加到核酸切割試劑中，如螯合的金屬離子(如鐵或鉻等)的試劑中。
可對Dpl基因座的序列，包括側接啟動子區(qū)域和編碼區(qū)域，以本領域周知的各種方法進行突變，以產(chǎn)生啟動子強度、編碼蛋白質的序列等的目標改變。這些突變的DNA序列或產(chǎn)物將與本文所提供的序列在基本上相似，即至少分別有1個核苷酸或氨基酸不同，可能會至少有2個核苷酸或氨基酸不同，但不會超過10個。序列變化可以是取代、插入或刪除。刪除可進一步包括較大的改變，如一個功能區(qū)或外顯子的刪除。感興趣的其它修飾包括抗原表位標記，如含有FLAG系統(tǒng)、HA等。為了研究亞細胞定位，可使用具有綠熒光蛋白(GFP)的融合蛋白?？墒褂眠@些突變的基因來研究Dpl多肽與其它多肽(如與Dpl共表達的Nkx-6.1)之間的結構-功能關系，或者改變影響它們的功能或調節(jié)的蛋白質的特性。這些修飾的Dpl序列可用于例如產(chǎn)生轉基因動物。
克隆的基因體外誘變技術是已知的。可在Gustin等人，Biotechniques，1422(1993)、Barany，Gene，37111-23(1985)、Colicelli等人，Mol Gen Genet，199537-9(1985)和Prentki等人，Gene，29303-13(1984)的文章中找到搜索突變體的方法的例子。在Sambrook等人，Molecular CloningA Laboratory Manual，CSH出版社，pp.15.3-15.108(1989)、Weiner等人，Gene，12635-41(1993)、Sayers等人，Biotechniques，13592-6(1992)、Jone等人，Biotechniques，12528-30(1992)、Barton等人，Nucleic Acids Res，187349-55(1990)、Marotti等人，Gene Anal Tech，667-70(1989)和Zhu，Anal Biochem，177120-4(1989)的文章中可找到定點特異性誘變的方法。
Dpl基因含有宿主動物部分(如宿主動物的末端部分)和遺傳上與其不同的實驗動物的中間部分，其中該中間部分包含了設計成與宿主疾病狀態(tài)相匹配的特異性的改變。另外，本發(fā)明包括含有人工基因或受到遺傳上不同的動物的Dpl基因調節(jié)的表達的轉基因動物、雜交轉基因動物(不同轉基因動物相互之間或者與具有消除的內源性朊病毒蛋白基因的轉基因動物之間的后代)、標準化的朊病毒制品和試驗方法(該方法使用該制品和遺傳改變的動物來檢測樣品中的致病性朊病毒)。
人工基因包含一條序列，當將其插入動物(如小鼠)的基因組中時能使該動物易于感染通常只感染遺傳上與其不同的動物(如人、牛、綿羊、豬、雞、貓或狗)的特殊種類的朊病毒。人工Dpl基因可部分或全部由人工多核苷酸序列(即在天然Dpl基因序列中不存在的密碼子序列)組成?；蛘撸斯せ蚩捎伤拗鲃游锏拿艽a子序列和一個或多個密碼子取代基組成，其中，密碼子取代基優(yōu)選是遺傳上不同的動物的相應Dpl基因密碼子，意味著此Dpl基因與宿主動物的Dpl基因有20個或更多個密碼子不同。還公開了可通過含有增強的啟動子的Dpl基因的超表達，和/或遺傳上與之不同的動物的高拷貝數(shù)天然Dpl基因，來獲得含有Dpl基因表達水平提高的轉基因動物。雜交轉基因動物包括由兩種轉基因動物之間交配產(chǎn)生的動物，特別是含有遺傳上不同的動物的完整朊病毒蛋白的轉基因動物(如含有人朊病毒蛋白基因的小鼠)與內源性朊病毒蛋白基因遭破壞的動物(如具有消除的朊病毒蛋白基因的小鼠)之間交配產(chǎn)生的動物。雜交動物還特別包括具有嵌合性朊病毒蛋白基因的轉基因動物與具有已消除內源性朊病毒蛋白基因的動物交配產(chǎn)生的動物。
Dpl轉基因動物可用Dpl編碼核酸來產(chǎn)生遺傳上修飾的非人類動物或在細胞系中產(chǎn)生位點特異基因修飾。術語“轉基因”包括具有Dpl基因活性被刪除或其它方式敲除的、具有能在宿主細胞中穩(wěn)定傳播的外源性Dpl基因的、具有Dpl基因表達改變的“敲入”的、或者具有操作性連接于一報道基因的外源性Dpl啟動子的基因已被修飾的動物。特別令人感興趣的是Dpl的純合性和雜合性敲除動物。
可通過同源重組產(chǎn)生轉基因動物，其中Dpl基因座已改變?；蛘?，可將核酸構建物隨機整合到基因組中。用于穩(wěn)定整合的載體包括質粒、反轉錄病毒和其它動物病毒、YAC等。值得注意的是轉基因動物較佳選自小鼠屬(如小鼠)、大鼠屬(如大鼠)、穴兔屬(如家兔)和倉鼠屬(如倉鼠)。更佳的是該動物是Dpl基因表達或功能有缺陷的或含有其它一些改變的小鼠。
對“敲除”動物進行基因操作以大大降低或消除內源性Dpl功能，較佳是這些靶基因表達不可檢測或不顯著。可采用不同的方法達到“敲除”的目的。刪除天然Dpl同系物全部或部分的染色體可能引起非編碼區(qū)域尤其是啟動子區(qū)域、3′調節(jié)序列、增強子的缺失，或者能激活Dpl基因表達的基因的缺失。還可通過導入能阻斷天然Dpl基因表達的反義構建物達到功能性敲除〔例如，參見Li等人，Cell，85319-329(1996)〕。
也可條件性地敲除Dpl基因功能。條件性地敲除動物是這樣一種轉基因動物，其在接觸了能促進靶基因改變的物質之后、導入了能促進靶基因位點(如Cre-loxP系統(tǒng)中的Cre)重組的酶之后、或在使用了使靶基因改變的其它方法之后，方表現(xiàn)出Dpl基因功能缺陷的動物。
例如，可使用Cre-loxP系統(tǒng)來產(chǎn)生條件性地敲除了Dpl基因功能的轉基因動物〔參見，如Kilby等人，Trends Genet，9413-421(1993)〕。Cre是一種能消除稱為loxP的兩段識別序列之間的DNA的酶?？梢愿鞣N方式使用這個系統(tǒng)來產(chǎn)生Dpl的條件性地敲除。例如，可產(chǎn)生兩種獨立的轉基因小鼠一種是側接loxP位點的Dpl序列的轉基因，另一種是Cre的轉基因?？蓪re轉基因置于可誘導性啟動子或受發(fā)育過程調節(jié)的啟動子的控制下〔Gu等人，Cell，731155-1164(1993)；Gu等人Science，265103-106(1994)〕，或者在組織特異性或細胞類型特異性啟動子(如神經(jīng)元特異性啟動子或腦組織特異性啟動子)的控制下。然后使Dpl轉基因動物與Cre轉基因動物交配，以產(chǎn)生僅存在那些發(fā)育期間表達Cre的細胞中有Dpl基因缺陷的后代。
可產(chǎn)生具有外源性Dpl基因的轉基因動物。例如，轉基因動物可含有“敲入”的Dpl基因，這樣宿主細胞的基因組中含有可導致Dpl基因表達改變〔如增加(包括異位的)或減少表達〕的改變，如通過導入靶基因的額外拷貝，或者有效地插入一調控序列以增加靶基因內源拷貝的表達?！扒萌搿鞭D基因動物可以是雜合性敲入或純合性敲入了Dpl基因的轉基因動物。敲入也包括條件性敲入。
導入宿主細胞基因組中以產(chǎn)生轉基因動物的外源性基因通常來自宿主動物以外的不同動物，或者在其編碼或非編碼序列中有別的改變。導入的基因可以是野生型基因、自然產(chǎn)生的多態(tài)性或經(jīng)基因操作(如前述在編碼或非編碼區(qū)域中缺失、取代或插入操作)的序列。導入的基因可編碼Dpl多肽，或可利用操作性連接于一報道基因的Dpl啟動子。當導入的基因是一編碼序列時，它一般可操作性連接于一組成性或可誘導性啟動子，以及在宿主動物中表達所需的其它調節(jié)序列。
感興趣的特異性構建物包括但不限于反義Dpl或基于Dpl序列的核酶，后者將阻斷Dpl的表達以及顯性負Dpl突變的表達和Dpl基因的過度表達?？蓪⒖蓹z測的標記物(如lac Z)導入Dpl基因座，上調相應的Ngn基因的表達結果將不難檢測到表型中的變化。還令人感興趣的是能聯(lián)合利用Dpl基因的啟動子區(qū)域和一報道基因或Dpl編碼區(qū)域的構建物。具有編碼截短的或改變的(如突變的)Dpl的序列的構建物也是使人感興趣的。
修飾的細胞或動物可用于研究Dpl以及涉及CNS與胚胎發(fā)育的其它蛋白質的功能和調節(jié)。這些修飾的細胞或動物還可用于研究例如受Dpl影響的神經(jīng)毒性和/或神經(jīng)變性過程的功能和調節(jié)，以及用于研究體內的朊病毒基因家族。因而，本發(fā)明的轉基因動物可用于鑒定Dpl的下游靶標和潛在的Dpl受體，因為它們可能在與Dpl缺陷有關的表型中起作用。
動物還可用于功能研究、藥物的篩選等，如確定候選藥物對胚胎發(fā)育、神經(jīng)變性或者對Dpl相關疾病或病癥的癥狀(如神經(jīng)毒性相關癥狀)的影響?？稍贒pl基因中進行一系列小的刪除和/或取代，以確定在DNA結合、轉錄調節(jié)等中不同的多肽編碼區(qū)域所起的作用。使通常不產(chǎn)生Dpl蛋白(如異位表達)的細胞表達Dpl蛋白可引起細胞行為的改變。這些動物也可用于探索神經(jīng)變性的機制模型，特別是斑塊形成的機理，如腦中PrPSc斑塊的形成。
用于同源性重組的DNA構建物將至少包含具有所需遺傳修飾的Dpl基因的一部分，且將包括與靶基因座同源的區(qū)域。用于隨機整合的DNA構建物不需要包括介導重組的同源區(qū)域。為了方便，可包括用于陽性和陰性選擇的標記物。通過同源重組產(chǎn)生具有靶基因修飾的細胞的方法在本領域中是周知的。轉染哺乳動物細胞的各種技術，可參見Keown等人，Methods in Enzymology，185527-537(1990)的文章。
對于胚胎干細胞，可以使用一胚胎干細胞系，或者可以獲得宿主(如小鼠、大鼠、豚鼠等)的新鮮胚胎細胞。將這些細胞放在適當?shù)某衫w維細胞飼養(yǎng)層中培養(yǎng)或使其在適當?shù)纳L因子(如白血病抑制因子，LIF)存在下生長。當ES細胞轉化后，可用它們來產(chǎn)生轉基因動物。轉化后，將這些細胞接種在適當培養(yǎng)基的飼養(yǎng)層中。使用選擇性培養(yǎng)基可檢測到含有該構建物的細胞。集落生長足夠長的時間后，將它們挑出并分析是否發(fā)生同源重組或構建物整合。然后將那些陽性集落用于胚胎操作和胚泡注射。從4-6周齡超排卵雌性動物得到胚泡。用胰蛋白酶處理ES細胞，然后將該改變的細胞注入胚泡的囊胚腔中。注射后，將該胚泡放回假孕雌性動物的各子宮角中。然后使雌性動物進入妊娠期，并在所得的同窩仔中篩選出具有該構建物的突變細胞。通過提供的胚泡和ES細胞的不同表型，不難檢測到嵌合的后代。
篩選嵌合動物是否存在修飾的基因。使具有修飾基因的嵌合動物(一般是嵌合雄性)與野生型動物交配，以產(chǎn)生雜合體，然后使雜合體交配以產(chǎn)生純合體。如果基因改變導致發(fā)育中在一些(時間)點時死亡，那么可將其組織和器官作為同種異體的或同類系移植物，或者在體外培養(yǎng)。
單基因或多基因消除小鼠產(chǎn)生的明顯形態(tài)學缺陷為Dpl和PePC功能的精確配置鋪平了道路。可使用異源性啟動子元件評估浦肯野細胞變性中Dpl過度表達的作用，或在殘存的Prn BAC和YAC克隆中存在的緊密連接的基因的作用〔Westaway等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，916418-6422(1994)〕。檢測過度表達Dpl的或者不包含或包含PrnD的突變等位基因的小鼠對朊病毒感染的易感性將是令人感興趣的。
還可以使用非哺乳動物模型，特別是使用那些生物學和遺傳學特征明確的生物〔如線蟲(C.elegans)、黃猩猩果蠅(D.melanogaster)和釀酒酵母(S.cerevisiae)〕來研究遺傳功能。例如，可以在線蟲同系物的Dpl基因中或Dpl啟動子區(qū)域制造轉座子插入(Tcl)。為了確定涉及朊病毒樣蛋白發(fā)揮功能的生理和生化途徑，可以使用Dpl基因序列敲除或補充確定的遺傳損傷。眾所周知人的基因能補充低級胚胎模型中的突變。
Dpl多肽的生產(chǎn)可以使用Dpl編碼核酸來合成全長的Dpl多肽或其片段(尤其是相應的功能區(qū)片段)、DNA結合位點等；還包括目標多肽與其它蛋白質或其部分的融合。對于表達，可以使用表達盒提供誘導性或組成性轉錄和翻譯的起始區(qū)域，將編碼區(qū)域操作性連接在轉錄起始區(qū)域、轉錄和翻譯終止區(qū)域的轉錄控制下?？墒褂迷诒磉_宿主中能起作用的各種轉錄起始區(qū)域。
按照常規(guī)方法，取決于表達的目的，該多肽可在原核生物或真核生物中表達?？墒褂脝渭毎?如大腸桿菌、枯草桿菌、釀酒酵母)或高等生物(如脊椎動物，特別是哺乳動物)的細胞(如COS 7細胞)作為表達宿主細胞來大規(guī)模生產(chǎn)此蛋白質。在許多情況下，可能需要在哺乳動物細胞中表達Dpl基因，特別是在該編碼的多肽需要自然折疊和翻譯后修飾時。也可在實驗室里合成小的肽。
由于使用表達宿主大量獲得該多肽，因此可按照常規(guī)方法將其分離和純化?？蓪⒈磉_宿主制備成裂解物，并采用HPLC、排阻層析、凝膠電泳、親和層析法或其它純化技術純化該裂解物。純化的多肽一般至少是80％純，較佳至少90％純，且可到達并包括100％純。純化指去除與其它蛋白質以及細胞碎片。
可以使用Dpl多肽來生產(chǎn)抗體，此時為產(chǎn)生該特殊多肽的特異性抗體而需提供短片段，為產(chǎn)生針對該多肽的表面的抗體需提供較大片段或完整的蛋白質?？梢援a(chǎn)生針對Dpl的野生型或突變型，包括可能與疾病狀態(tài)或自然發(fā)生的等位基因變體有關的Dpl形式的抗體?？赏ㄟ^免疫接種表達Dpl的細胞，免疫接種膜上插入了Dpl多肽的脂質體來產(chǎn)生針對相應于這些功能域或天然蛋白質的分離的肽的抗體。
按照常規(guī)方法，采用表達的該多肽或蛋白質作為免疫原，直接或與已知的免疫原性載體(如KLH、pre-S HBsAg、其它的病毒的或真核生物的蛋白等)偶聯(lián)來制備抗體?？蛇m當?shù)厥褂貌煌淖魟┻M行一系列的注射。對于單克隆抗體，一次或多次加強注射后，分離脾臟，通過細胞融合使淋巴細胞無限增殖，然后篩選出高親和力抗體結合的細胞。然后擴增能產(chǎn)生所需抗體無限增殖的細胞(即雜交瘤)。進一步的描述可參見Monoclonal AntibodiesA Laboratory Manual(Harlow和Lane編輯，Cold Spring Harbor Laboratories，Cold Spring Harbor，紐約，1988)。如果需要，可以分離編碼重鏈和輕鏈的mRNA，在大腸桿菌中通過克隆進行誘變，混合的重鏈和輕鏈進一步增加了該抗體的親和力。除體內免疫接種產(chǎn)生抗體外其他方法包括與噬菌體“展示”文庫結合，一般連同體外親和力成熟。
可使用本發(fā)明使用的Dpl基因來鑒定其它哺乳動物的Dpl基因和它們的功能特征。感興趣的Dpl基因包括但不限于哺乳動物〔如人、嚙齒動物(如小鼠或大鼠)、牛、貓、犬等〕和非哺乳動物(如雞、爬行動物等)。根據(jù)與已知基因序列的同源性進行鑒定、分離、測序以及與表征未知基因的方法在本領域中是周知的(參見，如Sambrook等人，Molecular CloningA Laboratory Manual，CSH出版社，1989)。
藥物篩選可使用本發(fā)明的動物模型以及體外使用Dpl多肽的方法來鑒定能影響Dpl表達(如影響Dpl啟動子的功能)或與Dpl多肽相互作用的候選制劑。感興趣的制劑可包括那些能增強、抑制、調節(jié)或其它影響Dpl活性和/或表達的制劑?？墒褂媚芨淖僁pl活性和/或表達的制劑，例如治療或研究伴有Dpl活性增加的疾病(如神經(jīng)變性疾病)；治療各種神經(jīng)變性或發(fā)育的病癥，如長出不恰當?shù)纳窠?jīng)突起物或由于Dpl的表達、活性和/或構象改變而引起的其它病癥；以及促進體外或體內PrPSc的發(fā)育。候選制劑包括合成分子(如小分子藥物、肽，或其它合成產(chǎn)生的分子或化合物，以及重組產(chǎn)生的基因產(chǎn)物)以及自然產(chǎn)生的化合物(如多肽、內源因子、植物抽提液等)。
藥物篩選試驗本發(fā)明特別感興趣的是鑒定具有影響Dpl表達和/或功能的活性的制劑。這些制劑是開發(fā)用于治療如神經(jīng)突起增加和/或不恰當或者可能與Dpl活性改變有關的其它病癥的候選藥物。藥物篩選所鑒定的藥物是能在染病細胞中替代或增強Dpl功能的藥物。相反地，能逆轉或抑制Dpl功能的制劑可提供一種方法來調節(jié)神經(jīng)變性或神經(jīng)毒性(尤其是浦肯野細胞的神經(jīng)變性和神經(jīng)毒性)。特別感興趣的是篩選試驗能選出對人細胞具有低毒性的制劑。
本文所用術語“制劑”指具有改變或模擬Dpl的表達或生理功能能力的分子，如蛋白質或藥物。一般將多個試驗混合物與不同濃度的制劑進行平行實驗，以獲得它們對各種濃度的不同反應。通常，以這些濃度中的一個作為陰性對照，即以零濃度或檢測水平以下的濃度作為陰性對照。
候選制劑包括許多化學種類，雖然它們通常是有機分子，但優(yōu)選分子量大于50小于約2500道爾頓的小有機化合物。候選制劑含有與蛋白質進行結構性相互作用所必需的功能基團，尤其是氫鍵，一般至少包括胺基、羰基、羥基或羧基，優(yōu)選至少有兩個功能性化學基團。候選制劑一般含有被一個或多個上述功能性基團取代的環(huán)碳(鏈)或雜環(huán)結構和/或芳族或聚芳族結構。還可在生物分子中尋找候選制劑，它們包括但不限于肽、糖類、脂肪酸、類固醇、嘌呤、嘧啶、它們的衍生物、結構類似物或組合物。
可從各種各樣來源獲得候選制劑，包括從合成的或天然的化合物文庫。例如，可使用許多方法隨機或定向合成各種各樣有機化合物和生物分子，包括隨機化的寡核苷酸和寡肽的表達?；蛘?，可利用或不難制得細菌、真菌、植物和動物抽提液形式的天然化合物。另外，通過常規(guī)的化學、物理和生物方法不難修飾天然的或合成生產(chǎn)的文庫和化合物，可用于產(chǎn)生組合性文庫。可對已知的藥物制劑進行定向的或隨機的化學修飾，如酰化、烷化、酯化、酰胺化等，以產(chǎn)生結構性類似物。
候選制劑的體內篩選可篩選能夠影響Dpl表達或功能或者減少與Dpl表達或功能改變有關的不良表型(如一種癥狀)的制劑。在本文的一個較佳實施例中，描述了在轉基因動物體內進行的候選制劑的篩選。適用于篩選試驗的轉基因動物包括Dpl表達改變的任何轉基因動物，以及可包括具有如外源的和穩(wěn)定遺傳的人Dpl基因序列、由操作性連接于一報道基因的(去除了人的)Dpl啟動子序列組成的報道基因(如β-半乳糖苷酶、CAT或其它易于檢測表達的基因)、或者進行了Dpl基因純合性敲除或雜合性敲除的轉基因動物。轉基因動物的遺傳改變可以是純合的或雜合的，當將一序列導入該動物的基因組中以使其表達時，該動物可含有該序列的多個拷貝。當進行體內篩選試驗以鑒定能影響Dpl啟動子活性的制劑時，該Dpl啟動子可操作性連接于一報道基因(如熒光素酶)并且可整合到非人類宿主動物的基因組中或培育的哺乳動物細胞系的基因組中。
將候選制劑給予Dpl表達已改變了的非人轉基因動物，測定該候選制劑的效果。為了獲得所需的結果，可以以任何需要的和/或適當?shù)倪f送方式給予該候選制劑。例如，可通過注射(如靜脈注射、肌肉內注射、皮下注射，或者直接注射到可獲得所需的效果的組織中)、口服、或其它任何可取的方式給予該候選制劑。通常，體內篩選將涉及接受不同劑量和濃度的候選制劑(從不含有制劑到接近可順利地遞送給該動物的上限量)的許多動物，以及可包括以不同劑型遞送該制劑。可單獨給予該制劑，或者與兩種或多種制劑聯(lián)合給予，特別是當制劑聯(lián)合給藥時可產(chǎn)生協(xié)同效果。
可通過適當評估Dpl功能(如通過檢測報道基因或融合基因的表達)或評估與Dpl表達有關的表型監(jiān)測給藥對轉基因動物的影響。例如，當篩選用的轉基因動物含有Dpl表達缺陷時(如由于該基因的敲除)，可通過測定對照小鼠的神經(jīng)變性水平相對于Dpl缺陷性轉基因小鼠和/或野生型小鼠所產(chǎn)生的水平(如通過評估受治療小鼠的共濟失調水平)來評估候選制劑的效果。評估嚙齒動物神經(jīng)缺陷的方法在本領域中是周知的。當進行體內篩選試驗以鑒定能影響Dpl啟動子的活性，和能影響非人轉基因動物或培養(yǎng)的哺乳動物細胞系(它們含有操作性連接于一報道基因的Dpl啟動子)的活性的制劑時，可通過監(jiān)測Dpl啟動子所致的表達(通過檢測該報道基因)和改變的Dpl啟動子活性與神經(jīng)元活性和/或變性的相互關系，來篩檢候選制劑對Dpl啟動子活性的影響。或者或另外，可通過Dpl mRNA或蛋白質水平的檢測(定性的或定量的)評估Dpl啟動子活性。當候選制劑以所需的方式影響到Dpl表達和/或影響到Dpl相關表型時，可確定該候選制劑適用于Dpl相關疾病或PrP相關疾病的治療。
候選制劑的體外篩選除了在Dpl轉基因動物中進行制劑的篩選外，還可以采用各種體外實驗，包括體外標記的蛋白質-蛋白質結合試驗、蛋白質-DNA結合試驗、電泳遷移率變動試驗、蛋白質結合的免疫試驗等。例如，通過提供大量的Dpl蛋白，可鑒定能結合、調節(jié)或模仿該蛋白質作用的配體或底物。還可使用純化的蛋白質確定三維晶體結構，可用該結構來模擬分子間的相互作用、轉錄調節(jié)等。
篩選試驗可以是一種結合試驗，其中，可將一個或多個分子連接于一個標記物，該標記物直接或間接提供了可檢測信號。不同的標記物包括放射性同位素、熒光素、化學發(fā)光劑、酶、特異性結合的分子、顆粒(如磁性顆粒)等。特異性結合分子包括諸如生物素和鏈酶親和素、地高辛和抗地高辛等之間的配對。根據(jù)已知的方法，就特異性結合成員而言，互補成員通常用一分子標記供檢測。
在本文所述的篩選試驗中可包括各種其它試劑。對于結合試驗，這些試劑包括那些能促進最優(yōu)化的蛋白質-蛋白質結合、蛋白質-DNA結合和/或減少非特異性或背景相互作用的試劑，如鹽、中性蛋白(如白蛋白)、去污劑等?？梢允褂酶倪M試驗效率的試劑，如蛋白酶抑制劑、核酸酶抑制劑、抗微生物制劑等?？梢匀魏雾樞蚣尤胫T組分的混合物以提供所要的結合?？稍诤线m的溫度下進行培育，一般為4-40℃。選擇培育時期以使活性最優(yōu)，但也可優(yōu)化培育時間以利于快速高通量篩選。一般0.1-1小時已足夠。
感興趣的其它試驗是檢測模擬Dpl功能的制劑。例如，將候選制劑加到缺少功能性Dpl的細胞中，然后篩選出在功能性試驗中能再現(xiàn)Dpl活性的制劑。在一個具體的實施例中，篩選出能減少朊病毒疾病發(fā)生培育時間的模擬未受到調節(jié)的Dpl活性的制劑。
許多哺乳動物的基因在酵母和低級動物中有同系物。對這些同系物的生理作用以及它們與其它蛋白質在體內和體外的相互作用的研究可促進對它們的生物學功能的了解。除了基于遺傳互補的模型外，酵母已顯示出其可作為通過Chien等人，Proc.Natl.Sci.USA，889578-9582(1991)描述的雙雜交系統(tǒng)進行蛋白質-蛋白質相互作用研究的有力工具。特別令人感興趣的是該雙雜交系統(tǒng)用于探究Dpl蛋白引起的轉錄激活以及鑒定與Dpl相互作用的eDNA編碼多肽。與Dpl的結合可影響具體靶蛋白質的功能/活性，或者可使自身功能受到調節(jié)，以及對正常的或特殊的疾病狀態(tài)具有實用性。
確定的候選制劑可將具有所需藥物活性的化合物以生理上可接受的載體給予宿主，以治療由于或部分由于由正常Dpl功能的缺陷(如與未受到調節(jié)的Dpl水平有關的神經(jīng)疾病)所致的疾病。還可使用該化合物提高Dpl功能?？梢栽S多方式給予該治療制劑，如口服、局部給予、胃腸道外給予(如皮下注射)、腹膜內給予、通過靜脈注射、血管內給予等。特別感興趣的是吸入治療。取決于導入的方法，該化合物可以各種方式配制。制劑中具有治療活性的化合物的濃度范圍為約0.1-100wt.％。
可將藥物組合物制成不同的劑型，如顆粒、片劑、丸劑、栓劑、膠囊、懸浮液、藥膏、洗劑等。可將適合于口服和局部給藥的藥用級有機或無機載體和/或稀釋劑制成含有該治療活性化合物的組合物。本領域周知的稀釋劑包括水性介質、植物或動物油和脂肪?？墒褂梅€(wěn)定劑、潤濕劑和乳化劑、用來改變滲透壓的鹽或用于保證適當pH值的緩沖液和表皮滲透增強劑作為輔助劑。
藥物遺傳學藥物遺傳學是連接個體基因型與該個體新陳代謝的能力或對治療制劑反應的能力的橋梁。新陳代謝或目標敏感性的差異可導致嚴重的毒性，或者由于改變藥物的生物活性劑量和血濃度之間的關系可導致治療失敗。在過去幾年里，大量的研究已建立了代謝酶或藥物尋靶的多樣性和反應與毒性之間的良好關系。可利用這些關系來個別給予治療劑量。
使用多態(tài)等位基因的基因型可評價一個個體是否對具體治療方案有良好反應。還可在藥物篩選試驗中使用該多態(tài)性序列，以確定候選治療制劑的劑量和特異性。采用靶向治療篩選候選Dpl多態(tài)性，以確定是否對治療效果有影響，例如，治療神經(jīng)疾病。如上所述進行藥物篩選試驗。一般檢測兩種或多種不同的序列多態(tài)性對治療的反應。
當某具體序列多態(tài)性與有差別的藥物效果相關時可進行診斷篩選。在前面部分已詳細描述了診斷的方法。檢測到存在具體的多態(tài)性，用其來產(chǎn)生治療染病個體的有效治療策略。
Dpl相關疾病的檢測Dpl水平的檢測和/或Dpl不同構象的存在可提供一種診斷Dpl相關的神經(jīng)變性疾病的方法。具體而言，檢測到Dpl表達的變化和/或Dpl構象的變化可能與涉及浦肯野細胞變性的疾病(如遺傳性的小腦皮層萎縮、全身性癲癇伴緊張陣攣發(fā)作(GTCS)、脊髓小腦共濟失調6型等)有關。測定Dpl水平和/或該蛋白質不同構象還可用于其它的神經(jīng)變性疾病，正如本領域熟練技術人員將在本公開中所看到的一樣。
通過對患者的任何方便樣品(如活檢物質、血樣、從面頰上刮得的物質等)中的蛋白質、DNA或RNA序列和/或雜交分析可進行Dpl相關疾病的診斷。分析可能患有Dpl相關疾病的患者的核酸樣品中是否存在易感Dpl的多態(tài)性。典型患者的基因型在至少一條染色體上將至少有一種易感性突變。能影響此基因產(chǎn)物的活性或表達并使得對Dpl相關疾病(如神經(jīng)變性疾病)敏感性增加的多態(tài)性Dpl序列，被認為是易感多態(tài)性。通過分析它們的DNA或mRNA，與未染病個體的序列相比，以確定是否存在易感染的多態(tài)性，從而對個體進行篩檢。
篩檢還可根據(jù)Dpl蛋白質的功能性特征或抗原特征進行。篩檢時可采用檢測Dpl蛋白中易感多態(tài)性的免疫試驗。當許多不同的突變導致某具體疾病表型時，功能性蛋白試驗可作為有效的篩檢工具。
可進行生化研究以確定Dpl編碼區(qū)域或控制區(qū)域中的候選序列多態(tài)性是否與疾病有關。例如，在啟動子或增強子序列中影響Dpl的表達的改變可導致對神經(jīng)疾病(如朊病毒介導的疾病)的易感性。采用本領域周知的各種方法比較候選變體等位基因的表達水平與正常等位基因的表達水平。確定啟動子或增強子強度的方法包括對所表達的天然蛋白質進行定量測定，將變體控制元件插入具有報道基因(如β-半乳糖苷酶、熒光素酶、氯霉素乙酰轉移酶等)的載體中，從而提供方便的定量方法，等等?？赏ㄟ^與野生型蛋白質的比較確定編碼的Dpl蛋白質的活性。
可用許多方法分析核酸中特異序列的存在。當可得到大量的DNA時，直接使用基因組DNA。或者，將感興趣的區(qū)域克隆到合適的載體中，并使其生長到足夠的量，以用于分析?？衫帽磉_Dpl基因的細胞作為mRNA的來源，可直接檢測該mRNA或者反轉錄為cDNA，以用于分析?？刹捎贸Ｒ?guī)的方法〔如聚合酶鏈反應(PCR)〕擴增核酸，以提供足夠的量用于分析。在Saiki等人，Science，239487(1985)的文章中描述了PCR的應用；在Sambrook等人(Molecular CloningALaboratory Manual，CSH出版社，1989，pp.14.2-14.33)的文章中可找到當前技術的綜述。還可采用擴增的方法，通過使用對此多態(tài)性特異的引物確定多態(tài)性是否存在。或者，本領域還已知各種方法，利用寡核苷酸連接作為檢測多態(tài)性的工具，例如，參見Riley等人，Nucl.Acid Res.，182887-2890(1990)和Delahunty等人，Am.J.Hum.Genet.，581239-1246(1996)的文章。
在擴增反應中可包括可檢測的標記物。合適的標記物包括熒光染料〔如異硫氰酸熒光素(FITC)、羅丹明、德克薩斯紅、藻紅蛋白、別藻藍蛋白、6-羧基熒光素(6-FAM)、2′，7′-二甲氧基-4′，5′-二氯-6-羧基熒光素(JOE)、6-羧基-X-羅丹明(ROX)、6-羧基-2′，4′，7′，4，7-六氯熒光素(HEX)、5-羧基熒光素(5-FAM)或N，N，N′，N′-四甲基-6-羧基羅丹明(TAMRA)〕、放射性標記物(如32P、33P、35S、3H)等。標記可以是兩級系統(tǒng)，擴增的DNA與生物素、半抗原等具有高親和力的結合伙伴(如親和素)、特異性抗體等偶聯(lián)，而該結合伙伴又偶聯(lián)于一可檢測的標記物。該標記物可以與一種或兩種引物偶聯(lián)?；蛘?，將擴增中使用的核苷酸文庫標記，以便將標記物摻入到擴增的產(chǎn)物中。
采用本領域許多方法中的一種分析核酸樣品，例如擴增的或克隆的片段?？刹捎秒p脫氧或其它方法對該核酸測序，將堿基序列與任一條中性Dpl序列(如未染病個體的Dpl序列)比較。還可采用Southern印跡、斑點印跡等方法測定與變體序列的雜交中該序列的存在。如US 5445934或WO 95/35505中所述，對照和變體序列與固定在固相載體上的一組寡核苷酸探針陣列之間的雜交模式還可用作檢測變體序列存在的工具。采用單鏈構象多態(tài)性(SSCP)分析、變性梯度凝膠電泳(DGGE)、錯配剪切檢測和凝膠基質(matrice)中的異源雙鏈性分析來檢測DNA序列改變所產(chǎn)生的表現(xiàn)為電泳遷移率改變的構象變化?；蛘撸绻环N多態(tài)性產(chǎn)生或破壞了限制性內切酶(限制性片段長度多態(tài)性，RFLP)的識別位點，那么可使用該酶消化樣品，然后依產(chǎn)物大小將其分級分離，以確定片段是否被消化。采用凝膠或毛細管電泳，特別是丙烯酰胺和瓊脂糖凝膠電泳進行分級分離。
如US 5445934或WO 95/35505中所述，對照和變體序列與固定在固相載體上的一組寡核苷酸探針陣列之間的雜交模式還可作為檢測變體序列存在的工具。在本發(fā)明的一個實施例中，提供了一組寡核苷酸陣列，陣列上不連續(xù)的位點與Dpl基因座的mRNA或基因組DNA的至少一部分互補。這樣的陣列可包含一系列的寡核苷酸，各寡核苷酸可特異性地與Dpl基因座產(chǎn)生的一條核酸序列如mRNA、cDNA、基因組DNA等雜交。通常這樣的陣列將包括至少2種不同的多態(tài)性序列，即位于該基因座中唯一位點上的多態(tài)性，通常至少有約5種，更通常至少有約10種，且該陣列可包括50-100種不同的多態(tài)性。陣列上的寡核苷酸序列一般至少為12個核苷酸，其長度可以是所提供的多態(tài)性序列的長度，或者該序列可擴展到側接區(qū)域中以產(chǎn)生長100-200個核苷酸的片段。陣列的例子可參見Hacia等人，NatureGenetics，14441-447(1996)、Lockhart等人，Nature Biotechnol，141675-1680(1996)和De Risi等人，Nature Genetics，14457-460(1996)的文章。
可在篩檢性免疫試驗中使用Dpl多態(tài)性的特異性抗體。Dpl的減少或增加和/或多態(tài)性相關的Dpl疾病的存在表明所懷疑的疾病是Dpl相關的疾病。從懷疑患有Dpl相關疾病的患者得到樣品。本文所用的樣品包括組織活檢、生物液體、器官或組織培養(yǎng)得到的液體和從生理組織中抽提得到的液體，以及這些液體的衍生物和組分。樣品中的細胞數(shù)量通常至少約103個，一般至少104，更一般至少約105?？梢苑蛛x得到細胞，或對于固體組織而言，可以分析組織切片?；蛘呖梢灾苽浼毎呀馕?。
可采用許多方法進行診斷。不同的方法都可確定在懷疑具有Dpl易感多態(tài)性的患者細胞中是否存在正常的或異常的Dpl或其量的改變。例如，可根據(jù)常規(guī)方法用細胞或組織學切片染色進行檢測。將感興趣的抗體加到細胞樣品中，然后培養(yǎng)足夠長時間，以使其結合于抗原表位，培養(yǎng)時間一般至少約10分鐘。可以用放射性同位素、酶、熒光素、化學發(fā)光劑或其它定向檢測的標記物標記抗體?；蛘撸褂玫诙贵w或試劑擴增該信號。這些試劑在本領域中是周知的。例如，可將第一抗體與生物素偶聯(lián)，加入與辣根過氧化物酶偶聯(lián)的親和素作為第二試劑。使用底物進行最后的檢測，在過氧化物酶存在下出現(xiàn)顏色變化?？捎貌煌椒y定抗體結合存在與否，這些方法包括分離細胞的流式細胞術、顯微術、放射顯影、閃爍計數(shù)等。
如果具體的疾病狀態(tài)與Dpl的構象轉變有關，那么可依靠對Dpl蛋白質的疾病相關構象的識別進行診斷?？刹捎么朔N疾病相關構象的特征來區(qū)分Dpl蛋白的與疾病有關形式與其它形式，這些特征如不溶性、對蛋白酶消化的抗性、可利用的抗原表位的變化等。
另一診斷方法依賴于對抗體和裂解物中Dpl之間的結合的體外檢測。可采用各種特異性試驗實現(xiàn)樣品或其組分中Dpl結合濃度的檢測。可以采用常規(guī)的夾心試驗。例如，先將Dpl特異性抗體結合到不溶性表面或載體上。具體的結合方式并不重要，只要它能與本發(fā)明的試劑和所有的方法相容即可。它們可共價或非共價結合到版上，較佳是非共價結合。
不溶性載體可以是多肽可結合的、并容易與可溶性物質分離的、且與所有的方法都相容的的任何組合物。這些載體的表面可以是固體或多孔的和任何方便的形狀。受體所結合的合適的不溶性載體包括珠子(如磁性珠)、膜和微量滴定板。這些一般由玻璃、塑料(如聚苯乙烯)、多糖、尼龍或硝酸纖維素制成。微量滴定板特別方便，因為使用少量的試劑和樣品就可同時進行大量的試驗。
然后可將患者樣品裂解物加到含有抗體的分離的可檢測載體中(例如，微量滴定板的分離的孔)。較佳的是，平行進行一系列標準品(含有已知濃度的正常和/或異常的Dpl)和樣品及其作為對照的等分的檢測。較佳的是，將各樣品和標準加到多個孔中，這樣可獲得各自的平均值。培養(yǎng)時間應足以使其結合，一般約0.1-3小時就足夠了。培養(yǎng)之后，通常洗滌不溶性載體，洗去不結合的組分。通常使用具有適當pH(一般為7-8)的稀釋的非離子去污劑介質作洗滌介質?？梢韵礈?-6次，用足量的體積徹底地將樣品中存在的非特異性結合蛋白質洗去。
洗滌之后，加入含有第二抗體的溶液。該抗體將充分特異地與Dpl結合，這樣，可區(qū)分于存在的其它組分?？梢詷擞浀诙贵w以利于直接或間接定量測定結合?？蛇M行第二受體結合的直接測量的標記物例子包括放射性標記(3H或125I)、熒光素、染料、珠子、化學發(fā)光劑、膠粒等?？蛇M行結合的間接測量的標記物例子包括酶，該酶的底物可提供有色的或熒光產(chǎn)物。在一個較佳的實施例中，使用在加入適當?shù)牡孜锖罂商峁┛蓹z測的產(chǎn)物信號的共價結合的酶標記抗體。用于偶聯(lián)的合適的酶的例子包括辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶、蘋果酸脫氫酶等。從商業(yè)途徑得不到時，采用本領域熟練技術人員周知的技術不難制備這些抗體-酶促偶聯(lián)物。培養(yǎng)時間應足以使標記的配體與存在的分子結合。通常約0.1-3小時足夠，一般1小時就足夠了。
第二結合步驟之后，再次洗滌該不溶性載體，去除非特異性結合的物質。可采用常規(guī)方法檢測結合的偶聯(lián)物所產(chǎn)生的信號。當使用酶偶聯(lián)物時，可提供適當?shù)拿傅孜镆孕纬煽蓹z測的產(chǎn)物。
其它的免疫試驗在本領域中是周知的，并可用于診斷中。奧托洛尼平板提供了一種簡單的測定抗體結合的方法。使用所述的Dpl特異性檢測系統(tǒng)，方便地使用夾心試驗所述的標記方法，可對濾紙上的蛋白質凝膠或蛋白質斑點進行Western印跡。
其它感興趣的診斷試驗是基于Dpl蛋白的功能性特性。這些試驗在大量不同序列的變化導致共同表型時特別有用。例如，一種功能性試驗可以由Dpl基因產(chǎn)物介導的細胞的轉錄文庫中的變化為基礎。其它的試驗可檢測由于插入、刪除或截短導致的構象改變、大小改變、或者Dpl蛋白的亞細胞定位的改變。
在蛋白質截短的實驗中，將Dpl基因或其轉錄產(chǎn)物擴增得到的PCR片段作為體內轉錄/翻譯反應的模板以產(chǎn)生蛋白質產(chǎn)物。采用凝膠電泳進行分離以確定該多態(tài)性基因是否編碼截短的蛋白質，其中，截短可能伴有功能的喪失。
還可進行多態(tài)性的診斷性篩檢，以篩檢出遺傳上與易感朊病毒介導疾病(如CJD)有聯(lián)系的多態(tài)性，尤其是通過使用微衛(wèi)星標記物或單核苷酸多態(tài)性來進行。通常，微衛(wèi)星多態(tài)性本身不是表型表達，但它連接于導致疾病易感性序列。然而，在一些情況下，微衛(wèi)星序列本身可影響基因的表達。如上所述，可單獨進行微衛(wèi)星連接的分析，或者與多態(tài)性的直接檢測組合進行。已很好地證明了微衛(wèi)星標記在基因分型中的用途。例如，參見Mansfield等人，Genomics，24225-233(1994)；Ziegle等人，Genomics，141026-1031(1992)；Dib等人，同上。
用于所述方法的微衛(wèi)星基因座具有下面的通式
U(R)nU′，其中，U和U′是唯一確定具體基因座的非重復性側接序列，R是一重復的基序，n是重復數(shù)。該重復基序至少長2個核苷酸，多達7個，通常長2-4個。重復可是以是單一的或復合的。側接序列U和U′能唯一確定了人基因組中的微衛(wèi)星基因座。U和U′長至少約18個核苷酸，可在重復的任一側延伸幾百至約1kb個堿基。在U和U′中選擇序列作為擴增引物。引物序列的精確組成對于本發(fā)明并不是關鍵的，但它們必須能在嚴謹條件下與側接序列U和U′分別雜交。選擇擴增引物的標準先前已討論。為了最大程度地分辨該基因座的大小差異，較佳的是選擇一種與該重復序列接近的引物序列，這樣總擴增產(chǎn)物的長度在100到500個核苷酸之間。
特異性基因座的重復數(shù)值n在一個種群中是多態(tài)性的，從而產(chǎn)生了位于擴增引物之間的DNA長度的個體差異。該數(shù)值的變化范圍為至少1個重復到多達100個或以上的重復。
使用引物來擴增含有該重復的基因組DNA的區(qū)域。如先前所述，將可檢測的標記物方便地加入到擴增反應中。可進行多重擴增，在此擴增中，可將幾組引物混合在同一反應試管中。當可用于分析的樣品DNA的量有限時，這是非常有利的。這些引物組的各個引物可方便地用不同的熒光染料標記。
擴增之后，將產(chǎn)物按大小分級分離?？刹捎媚z電泳、具體是變性丙烯酰胺或瓊脂糖凝膠電泳進行分級分離?？蓞⒁奌unkapillar等人，Science，25459-74(1991)，使用變性聚丙烯酰胺凝膠與DNA自動測序儀聯(lián)合的一套方便系統(tǒng)。自動測序儀對于分開的PCR反應的多重擴增產(chǎn)物或混合產(chǎn)物特別有用。還可將毛細管電泳用于分級分離?？稍贚anders等人，BioTechniques，1498-111(1993)中找到關于毛細管電泳的綜述。擴增產(chǎn)物的大小與存在于這些引物所限定的基因座中的重復數(shù)值(n)成比例。在種群中，該大小是多態(tài)性的，因此是該基因座的等位基因標記。
Dpl活性表達增加的動物(如本文所述的兩PrP0/0品系)還顯示，發(fā)展朊病毒感染癥狀所用的培育時間減少了。根據(jù)這一觀察，本發(fā)明提供了使用Dpl表達改變的動物來測定朊病毒感染性的試驗方法。該方法通過給本發(fā)明的Dpl轉基因或雜交哺乳動物接種受試樣品，并觀察該哺乳動物足夠長的時間以確定它們是否產(chǎn)生了與朊病毒有關的疾病癥狀，從而確定該樣品是否感染了朊病毒?？赡軐е聞游顳pl表達水平增加的原因有1)天然的內源性Dpl突變，如在基因篩檢中鑒定到Dpl基因座有突變；2)轉基因動物產(chǎn)生Dpl突變，由于缺失PrP基因座引起Dpl基產(chǎn)物表達增加；和/或3)導入了編碼Dpl多肽的外源性轉基因。
本發(fā)明的Dpl動物還可用于確定動物死因的方法中。這種方法涉及給本發(fā)明的Dpl轉基因或雜交動物接種體液或組織，如死亡動物抽提得到的腦組織(較佳的是給對照動物接種朊病毒的標準制品)，并觀察該轉基因或雜交動物(和對照動物)，以確定該動物是否產(chǎn)生了朊病毒感染癥狀。
在一個較佳實施例中，本發(fā)明的Dpl活性改變的動物還具有PrP基因座改變的基因組。典型的動物包括但不限于(1)消除了內源性PrP基因的動物，如在美國專利5698763號中公開的；(2)內源性PrP基因消除并從遺傳上與其不同的動物得到的外源性PrP轉基因的動物，如美國專利5792901號和美國專利申請系列號08/935363所公開的；和(3)內源性PrP基因消除并具有可誘導性PrP轉基因的動物，如美國專利申請系列09/052963中公開的。
優(yōu)選的宿主動物是小鼠和倉鼠，而因為對產(chǎn)生轉基因動物已有相當?shù)闹R，因此小鼠最佳。其它可能的宿主動物包括那些屬于小鼠屬(如小鼠)、大鼠屬(如大鼠)、穴兔屬(如家兔)、和倉鼠屬(如倉鼠)和豚鼠屬(如豚鼠)的動物。通?？墒褂谜Ｍ耆L成的成年體重少于1kg、易飼養(yǎng)和維持的哺乳動物。可改變宿主PrP基因，使其包括牛屬、綿羊屬、豬屬和人屬實驗動物的遺傳上與其不同的PrP基因的密碼子。較佳的是，改變小鼠宿主的PrP基因以包括人、牛或綿羊PrP基因的密碼子，包括牛的PrP密碼子最佳。牛是較佳的，因為本發(fā)明的一個重要目的是使用該動物來檢測牛群中數(shù)量有統(tǒng)計學意義的牛，以確定這些牛是否受到導致BSE(所謂“瘋?！辈?的朊病毒感染。
本發(fā)明還提供一種檢測藥物治療朊病毒感染引起的疾病的療效的方法，該方法包括，給予用朊病毒感染(較佳的用標準的朊病毒制品)的轉基因或雜交動物以待測藥物，觀察和/或檢測該哺乳動物以確定該藥物是否幫助治療或緩解該疾病或其癥狀的進展。這些方法在美國專利5792901和美國專利申請系列08-935363中已公開，本文納入此兩文作為參考。
本發(fā)明還提供了一種通過給予一種能下調Dpl表達和/或降低Dpl活性的化合物治療朊病毒病的方法。由于Dpl活性增加與朊病毒病培育期的減少有關，且由于PrPC可拯救增加的Dpl表型(它們可能在一通途中相互作用或競爭)，所以降低Dpl活性可減緩或停止朊病毒病的進展，例如，預防在對PrPSc的反應中神經(jīng)元的變性。
Dpl編碼核酸的治療用途可將Dpl編碼核酸導入細胞中以實現(xiàn)該細胞的轉化，較佳的是穩(wěn)定的轉化。根據(jù)本領域周知的方法〔如采用電泳、顯微注射、使用重組(較佳是復制缺陷的)病毒的脂質轉染，和本領域中周知的其它方法〕，可將Dpl編碼核酸導入細胞中。較佳的是，將Dpl編碼的核酸操作性連接于一能促進Dpl多肽表達達到所需水平的啟動子上(如得自CMV、SV40、腺病毒的啟動子，或組織特異和或細胞類型特異性啟動子)。可通過存在于Dpl編碼構建物中的或與Dpl編碼構建物共轉染的質粒上的可選擇標記基因的表達，選擇和/或富集含有Dpl編碼核酸的轉化細胞。通常，可選擇的標記提供了對抗生素的抗性，如對四環(huán)素、潮霉素、新霉素等的抗性。其它的標記可包括胸苷激酶等。
可采用本領域周知的各種方法評估轉化細胞表達Dpl編碼核酸的能力。例如，可采用Northern印跡檢測Dpl表達以測定與相關基因的DNA探針雜交的mRNA?？刹捎帽绢I域周知的方法在體外培養(yǎng)中進一步分離和擴增這些表達所需基因的細胞。選擇用于Dpl編碼DNA轉化的宿主細胞將隨著離體治療的目的(如Dpl肽產(chǎn)物)、細胞植入的部位和本領域隨普通技術人員明白的其他因素而改變。
體內傳送用于在靶細胞中表達的感興趣的核酸的方法是本領域周知的。例如，基因的體內傳送方法一般采用將DNA(如含有感興趣的DNA的病毒)導入靶細胞的生物學方法或將DNA導入靶細胞的機械方法(如直接將DNA注射到細胞中，脂質體融合、使用“基因槍”的氣動注射等)。
可根據(jù)這些因素如體外轉化和靶細胞對轉化的敏感性不難確定有效感染靶組織、轉化足量的細胞并提供了所需水平的Dpl產(chǎn)物的DNA量和/或感染性病毒顆粒的量。通常，可從動物模型中有效傳送和表達所需基因的DNA的量推斷出DNA的量。例如，用于在人體內傳送的DNA的量略約為大鼠中有效DNA的量的100倍。
不論是體內或離體導入Dpl的編碼DNA，該DNA(或表達該DNA的細胞)可與其它的基因和其它的制劑組合給藥。另外，Dpl的編碼DNA(或表達Dpl DNA的重組細胞)可用于例如治療與Dpl產(chǎn)物減少有關但不與Dpl本身的功能改變有關的疾病。
實施例給出下面的實施例以便給本領域中普通技術人員提供怎樣安排和使用本發(fā)明的全部公開內容和描述，這并不是對發(fā)明者所認為的范圍的限制，也并不表示下面的實施例就是所有的實施例或是僅有的實驗。已作出努力以確保所使用的數(shù)值(如數(shù)據(jù)、溫度等)的精確性，但也應考慮到一些實驗誤差和偏差。除非有另外的說明，份是重量份，分子量是平均分子量，溫度是攝氏度，壓力是大氣壓或接近大氣壓。
實施例1Prnd基因座的鑒定先前對含有人、綿羊和小鼠PrP基因的“a”等位基因Prnpa的噬菌體和粘粒分子克隆的大規(guī)模測序研究揭示，不論是在與PrP直接毗鄰的位置上還是在內含子序列上都不存在另外的編碼區(qū)域〔Lee等人，Genome Res.，81022-1037(1998)〕。然而，采用“Xgrail 1.3c”程序進行分析〔Uberbacher等人，ORNL/TM 11741(1991)〕，對3′方向上進一步延伸的小鼠Penpb粘粒克隆I/LnJ-4〔Westaway等人，Neuron，759-68(1991)〕的測序卻揭示了在第36119位到第36751位核苷酸之間存在一候選的編碼區(qū)域(圖1A)。
按照標準的步驟增殖粘粒和YAC克隆，這在先前已有描述〔D.Westaway，Cell，76117-29(1994)〕?？蓮腗illenium Pharmaceuticals友善提供的文庫中鑒定出129Sv/J BAC克隆321L17。
該預測的ORF的氨基酸序列(圖2)與哺乳動物、有袋動物和禽類的PrP具有同源性。我們將該假定的基因稱為Prnd(由劃線的英文字母組成prion genecomplex，downstream)，將其蛋白產(chǎn)物稱為“Dpl”(downstream，prionprotein-like德語，“double”)。
Southern印跡分析表明該假定的Prnd的編碼區(qū)域在小鼠的基因組中是一單拷貝序列。為了排除Prnd ORF是I/LnJ小鼠的特異體質，我們對C57B6衍生的YAC克隆〔Westaway等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，976418-6422(1994)〕和129/SvJ BAC克隆321L17的相應的染色體區(qū)域進行了測序。結果表明兩者的ORF相同。而且，在大鼠和人中存在相關的ORF，人的PrnD基因位于27kb的PRNP的3′端。這些資料表明將可在所有的哺乳動物中找到PrnD基因。
實施例2Prnd基因座的結構分離出Prnd cDNA以證明由此區(qū)域轉錄的mRNA的剪接，并定義適當?shù)木幋a外顯子。使用野生型成年小鼠腦的cDNA作為起始物質進行cDNA文庫篩選和cDNA末端快速擴增(RACE)是受到稱贊的方法。
PrnD RNA的RACE克隆對于5′RACE分析，使用Perkin-Elmer 2400熱循環(huán)儀，用銜接引物APl和Prnd反義鏈引物DW112(即5′-CGGTTGGTCCACGGCGACCCGAA-3′，SEQID NO6，0.2μM)擴增“馬拉松”小鼠腦cDNA(Clontech，Palo Aito，CA)，其中，“降落式(touchdown)”PCR的條件是94℃20秒鐘，然后以94℃5秒鐘、72℃360秒鐘為一輪，進行5輪循環(huán)；以94℃5秒鐘、70℃360秒鐘為一輪，進行5輪循環(huán)；以94℃ 5秒鐘、68℃360秒鐘為一輪，進行30淋循環(huán)。采用Taq聚合酶與“TaqStar”抗體(Clontech，Palo Alto，CA)。將按大小進行分級分離反應得到的產(chǎn)物重懸浮在Tricine緩沖液中，使用以下嵌套引物組進行第二輪的PCRAP2通用引物和Prnd引物ORFP-R2(0.2μM)，即5′-GCAGATCTCTTTGATCAGCC-3′(SEQ ID NO7)〔94℃60秒鐘，然后以94℃ 10秒鐘、57℃20秒鐘、72℃150秒鐘為一輪，共進行20輪循環(huán)〕。接下來的檢驗通過與激酶標記的內部引物DW95(即5′-CAGATCCACCGAAGCTCGGG-3′(SEQ ID NO8)〕雜交進行驗證，PCR反應產(chǎn)物要么直接進行測序，要么隨后將其克隆到質粒載體pCR2.1TOPO(Invitrogen)中。采用類似的策略克隆3′RACE產(chǎn)物，使用嵌套引物DW111，即5′-TGGTGACCAGCTGCGTCAACGCCA-3′(SEQ ID NO9)和DW192，即5′-TGGGAAGGCCCTGAGCGACAACCGTG-3′(SEQ ID NO10)。
Prnd mRNA的RT-PCR采用酸-酚方法制備了總RNA，并在寡dT-乳膠(Quiagen)上進行聚A選擇。使用100ng的聚A+RNA引物和寡dT或者隨機的六聚物引物(如所注)和MuL V反轉錄酶，如制造商(Stratagene，La Jolla，CA)所推薦的方法進行cDNA第一鏈的合成。將與或不與反轉錄酶共培育的2ng等分cDNA合成反應產(chǎn)物直接擴增，或者超濾濃縮和脫鹽。不與反轉錄酶共培育時，用450μl水稀釋40ul的cDNA第一鏈合成反應產(chǎn)物(相當于160ng的cDNA)，并將其注入分子量截斷值50000的“Eluticon”微量濃縮器(Owl Scientific)。接著14000xg離心，用500μl水洗膜，離心，翻轉并用10μl水洗脫。每次PCR反應使用2.5μl的該制品?；蛘?，使用Superscript反轉錄酶(Life Technologies)(每次擴增反應使用2.5μl)反轉錄10μl的總RNA，反應總體積50μl。如下所述在標準反應緩沖液中進行“Hot-start”擴增(“Platinum Taq”，Life Technologies or AdvantageKlen Taq，Clontech)。引物組如下Prnd外顯子1a到PrnD外顯子2DW189＝5′-GCTCCAAGCTTCAGAGGCCACAGTAGCA-3′(SEQ ID NO11)和DW96，5′-TTACTTCACAATGAACCAAACGAAAC-3′(SEQ ID NO12)(1μM)94℃180秒鐘；以94℃15秒、65℃30秒、72℃75秒為一輪，進行40輪循環(huán)；使用PlatinumTaq聚合酶和終濃度為2mM的MgCl2。
基因間外顯子2到PrnD外顯子2DW117，5′-GAGTGGAGGTCTTCGCGCA-3′(SEQ ID NO13)和DW96(0.5μM)95℃300秒鐘，然后以95℃10秒、55℃20秒、72℃150秒為一輪，進行45輪循環(huán)，使用Platinum Taq聚合酶和終濃度為2.5mM的MgCl2。
Prnp外顯子2到PrnD外顯子25′UT.3〔Westaway。Neuron，759-68(1991)〕和DW96(0.2μM)95℃300秒鐘，然后以94℃15秒、60℃30秒、72℃120秒為一輪，進行40輪循環(huán)，使用Platnium Taq聚合酶和終濃度分別為2.5μM和4％的MgCl2和DMSO。
大鼠Prnp外顯子2到PrnD的3′末端(由ESTAI136375限定)DW213，5′TCAAAACTGAACCATTTCAACCCAACTGAAGTATTCTGCC-3′(SEQ IDNO14)和DW214，5′-ACCCAGCGTTCTGGCCCGGTATTAGGATT-3′(SEQ IDNO15)(劃下滑線的是與小鼠基因序列錯配的)。94℃120秒鐘，接著以94℃15秒、72℃240秒為一輪，進行40輪循環(huán)。β-肌動蛋白根據(jù)制造商(Statagene，La Jolla，CA)推薦的方法使用。
使用RACE和RT-PCR分析得到的結果搜尋公共數(shù)據(jù)庫中匹配的EST，并可從小鼠、人和大鼠的數(shù)據(jù)庫中檢索到一數(shù)據(jù)(圖1B)。從Balb/C睪丸cDNA文庫中檢索到1.5Kb和1.7Kb的PrnD cDNA。這些克隆與在Northern印跡中觀察到的主要的Dpl mRNA種類相對應。還可在Northern印跡中看到一2.7Kb的較大轉錄產(chǎn)物，3′RACE提供了外顯子2交替剪接的良好證據(jù)，這可能說明該mRNA種類。
兩種主要的cDNA克隆的檢驗結果表明它們幾乎是全長的，因為它們含有3′端的polyA區(qū)段和交替剪接的5′外顯子的部分序列。5′RACE分析與這些克隆的序列非常一致，表明剪接事件從短的5′外顯子開始，這表明外顯子la和1b分別起始于第34124位或第34277位核苷酸，到緊靠外顯子2(Prnd ORF，第36204位核苷酸)的5′端的共同剪接受體(圖1B、2A、2B)。這也與小鼠Dpl ESTAA796652的序列一致，該序列由外顯子1b到外顯子2的剪接所產(chǎn)生(圖1B)。
采用RT-PCR反應，使用不同的引物將PrnD 5′非翻譯區(qū)域外顯子的5′邊界置于大約30個核苷酸的間隔之內(圖2A)。進行引物延伸反應和核酶保護實驗以獲得精確的基因定位。除了使用6000Ci/mmol γ32P-ATP(“Kinase Max”，Ambion IncNEN)將引物標記為/E9×107dpm/pmol的比活性外，如前所述(Westaway等人，1987)進行引物延伸反應，使用引物DW197(5′-CCAGCCGGTTCTTCATGGTGAATCTCGG-3′，SEQ ID NO16，雜交溫度為65℃)和DW123a(5′-CATGGTGAATCTCGGTTCTC-3′，SEQ ID NO17，雜交溫度為55℃)。使用以同樣方式標記的42聚寡核苷酸進行核酶保護試驗(“Muitl-NPA”，Ambion Inc.)。
這些基因圖譜實驗的結果非常一致，確定了一組mRNA起始位點，即RACEcDNA和EST gbAA796652(從小鼠乳腺得到)所限定的5′末端的13-18個上游核苷酸。這種排布也與人Prnd cDNA的結構一致。因為此5′非編碼外顯子的交替的3′邊界起因于使用了兩個交替的剪接供體，所以稱它為“外顯子1a/1b”。應注意的是，已在牛PrP基因中觀察到類似的排布〔Horuichi等人，Biochem.Biophys.Res.Commun.，233600-654(1997)〕。由于外顯子1a或1b均不含與在染色體ORF同框的ATG密碼子，這些cDNA(和下面所述的其它cDNA)表明Prnd的起始密碼子位于36212位核苷酸的剪接受體的3′端。這個ATG是保守的并與啟動真核mRNA的Kozak共有序列非常一致〔共有序列GCCGCCa/gCCATGG(SEQ ID NO18、SEQ ID NO19)；PrnDAGATTCACCATGA(SEQIDNO20)〕(Kozak等人，Nucleic Acids Res.，158125-8148，1987)。PrnD起始位點的位置以與Prn-p本身類似的方式組織起來，其中，ATG密碼子位于外顯子3的剪接受體3′端的10個核苷酸之間〔Westaway等人，Cell，51651-662(1987)〕。
獨立衍生的cDNA的內部結構表明，Prnd mRNA 3′UTR是在分開的外顯子中編碼并進行交替剪接(圖1B)。因而，ORF終止子密碼子(36779位)的3′剪接供體28個核苷酸和另一下游37472位的密碼子在～38006位提供一剪接受體，這提供了對Northern印跡(下述)所檢測到的～1.7和2.7kb RNA的解釋。發(fā)現(xiàn)在I/LnJ-4粘粒中含有polyA區(qū)段的cDNA克隆終止于39099和39315位。雖然更多的3′位點在共有序列聚腺苷酸化信號(即AATAAA)之前，但在5′位點上卻缺乏類似的基序。值得注意的是，CTTAAA序列位于polyA尾5′端的27個核苷酸中。此3′基因構造與眾不同，表現(xiàn)在(i)3′UTR編碼序列中內含子稀少，(ii)37472位和38006位的剪接位點與公認的共有序列(這樣內含子精確邊界的確定位置用核苷酸冗余而復雜化，因而該邊界可能偏移這些坐標+1或+2位)或品系多態(tài)性不同，和(iii)內含子2確定了Prnd的假定的蛋白質編碼外顯子是一種內部外顯子，而不是末端外顯子，如同Prnp的情況一樣。這個外顯子具有575或1268個核苷酸(取決于剪接供體位點的選擇)，這違反了99％的內部外顯子的長度少于400個堿基的規(guī)律〔Berget，J.Biol.Chem.，2702411-2414(1995)〕。
實施例3使用得自ILn/J-4粘粒的完整的570bp PrnD ORF片段，使用總RNA(50g加樣)或寡dT選擇的RNA(7g加樣)進行Northern印跡分析。根據(jù)制造商的指導使用Trizol試劑(Gibco)制備了總RNA。使用Oligotex mRNA試劑盒(Qiagen)分離polyA+RNA。在乙二醛樣品緩沖液中將RNA樣品50℃加熱30分鐘，然后如制造商所建議，在1.2％瓊脂糖凝膠上進行電泳(AmbionInc.m Woodland，TX)。使用渦輪式印跡裝置(turboblotter)將RNA轉移至HybondN+(Amersham)在5×SSC、10mM NaOH的溶液中2小時，在5×SSC中清洗，紫外固定(Statagene，La Jolla，CA)，然后在加入用引物RM1(即5′-ATGAAGAACCGGCTGGGTAC-3′，SEQ ID NO21)和DW96以及129Sv/J基因組DNA模板產(chǎn)生的540bp的Dpl ORF PCR a-dCTP32隨機引導探針〔Feinberg等人，Anal.Biochem.，1326-13(1983)〕之前，進行預雜交〔6×SSC、1％SDS、3％(w/v)葡聚糖硫酸酯、10μg/ml經(jīng)超聲波處理的青魚精子的DNA〕。使膜雜交16小時，然后室溫以2×SSC/1％(w/v)SDS清洗5分鐘，65℃以2×SSC/1％(w/v)SDS洗滌30分鐘，然后65℃以1×SSC/1％(w/v)SDS洗滌30分鐘。將印跡在-80℃暴光3天。這使野生型小鼠的睪丸和心臟polyA+RNA中的大約1.7kb和2.7kb的Prnd mRNA顯示出來。在腦中沒有檢測到Prnd mRNA。
采用RT-PCR，可在成年腦cDNA和14天胚胎中檢測到將外顯子1a剪接到外顯子2產(chǎn)生的野生型小鼠的mRNA(圖3)。在一些成年腦樣品中檢測到另外的cDNA種類(其中的一個反映了外顯子1b的包涵體)。可從Prnd EST交配動物的組織來源得到的Dpl mRNA表達的一些初步證據(jù)(圖1B)從成年乳腺、胚胎期的心臟和成年脾中分別得到小鼠EST AA796652、AA104098和AA190150?？偠灾琍rnd mRNA在胚胎、外圍組織中表達，且在成年CNS中低水平表達。
如DNA序列數(shù)據(jù)所預測的那樣，電泳遷移率類似的種類存在于Tg(MoPrP-B)2091小鼠腦的RNA中，隱匿著高拷貝數(shù)陣列的ILn/J-4粘粒轉基因，其中首先要注意Dpl。如上所述，相應的產(chǎn)物在相同重量的對照小鼠腦中不能檢測到。
實施例4Dpl序列的計算機分析使用排列對比程序FASTA_3〔Pearson等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，852444-2448(1988)〕和PSI_BLAST〔S.F.Altschul等人，Nucleic Acids Res.，253389-402(1997)〕在SWISSPROT和TREMBL〔A.Bairoch等人，Nucleic AcidsRes.，19增補的2247-9(1991)；Stoesser等人，Biochemistry，377185-7193(1998)〕不同的非冗余組合序列數(shù)據(jù)庫中檢索人和小鼠Dpl序列。該Dpl蛋白顯示與許多PrP序列的關系遠但有顯著的同源性(24-26％相同，～160個殘基)〔FASTA 3值E()＝0.00015，其中E()是序列偶然匹配的期望值；PSI_BLASTE()＝2×10(-41)，與家養(yǎng)狗的PrP排列相比〕。
使用TopPred 2〔G.von Heijne，J Mol Biol.，225487-94(1992)〕和TMPred〔參見如D.S.Millican等人，Endocr Res.，24387-90(1998)〕預測了可能的跨膜片段。人和MoDop的N末端信號肽切割位點預測在使用SignalP程序〔H.Nielsen，Int J Neural Syst.，8581-99(1997)〕所顯示的位置上。這個程序定位真核信號肽的準確性為～70％。然而，50％的II型N末端跨膜片段被過分預測為信號肽。GPI附著位點(以w表示)和連續(xù)的兩個殘基位點(w+1和w+2)具有不同的殘基偏愛和反感，如w位點偏愛絲氨酸和天冬氨酸〔Y.Furukawa，Biochim Biophys Acta，1328185-96(1997)；P.Harrison，資料未公開〕且在切斷的C末端信號肽中需要一段大部分是疏水的殘基(8-31殘基)。通過2-8個疏水性更大的殘基節(jié)段將這個區(qū)域從w+2中分離開。兩種信號都在Dpl序列中發(fā)現(xiàn)。從關于GPI錨的文獻檢索、Dpl和PrP之間C末端序列的同源性，以及從序列數(shù)據(jù)庫(P.Harrison，數(shù)據(jù)未公開)中挑選出來的代表性GPI錨著蛋白組確定了Dpl上最可能的GPI錨附著位點〔(w，w+1，w+2)＝G155A(G或A)〕(圖2和5)。由于w+1幾乎不是一個大的脂肪族疏水性或芳族氨基酸(97％，63個例子中有61個不是)以及w+2幾乎不帶電荷(或是大的脂肪族疏水性或芳族氨基酸)(98％，63個例子中有62個是上述情況)，所以通過多條序列排列對比〔(w，w+1，w+2)＝G157LR〕提示的GPI錨位點是靠不住的(圖2)(P.Harrison，數(shù)據(jù)未公開)。因為類似的原因可能不完全相信該區(qū)域中其它可能的附著位點，只是除了上面提示的位點(w，w+1，w+2)＝G155A(G或A)外。
實施例5嵌合的Prnp/PrnD mRNA與RACE和cNDA克隆類似，還使用了基因尋找程序“GRAIL”來鑒定PrnD的可能的5′外顯子。I/LnJ-4粘粒序列的相關區(qū)域分析并未檢測到外顯子1a/1b，但是檢測到Prnp和PrnD的ORF之間有兩種假定的有義鏈外顯子(第29589-29672位核苷酸的“Grail外顯子6”；和第29798-29832位核苷酸的“Grail外顯子7”)。使用位于“Grail外顯子6”中的引物，可從成年野生型小鼠腦RNA擴增得到cDNA，并進行DNA測序以證實從第29671位核苷酸的共有序列剪接供體到PrnD外顯子2剪接受體的剪接(圖4)。
這些RT-PCR分析明確了Grail外顯子6為一種新的5′外顯子(圖4，基因間外顯子2)，但我們未能鑒定到包括PrnD外顯子1a/1b(或“Grail外顯子7”)的cDNA，提示外顯子1a的5′保守序列構成了正確的PrnD啟動子。然后檢驗了包括“Grail外顯子6”的PrnD mRNA起源于更遠的5′啟動子的可能性。由于Prnp啟動子位于僅23Kb遠且以正確的轉錄取向的位置上，所以這也是PrnD啟動子的強候選物。在對野生型小鼠的腦cDNA進行RT-PCR分析中使用定位于Prnp外顯子2的5′引物和PrnD外顯子2的3′引物，獲得了一種產(chǎn)物(圖4)。分析這些cDNA的序列，證實了它們的嵌合本質，即是說，在外顯子2的Prnp轉錄單位中開始，在開始于外顯子2a的PrnD轉錄單位中結束(圖5)。在Prnp外顯子2和PrnD外顯子2a之間插入一些包括“Grail 6”外顯子的cDNA，從而確定了這個外顯子的5′邊界為第29671位核苷酸上的一共有序列剪接受體位點。其它的cDNA包括一額外的外顯子(基因間外顯子2)，此外顯子在一cDNA亞組中位于第25482位和26004位核苷酸之間。這兩種基因間外顯子的交替使用產(chǎn)生了各種嵌合性mRNA(圖5)。
由于在高等哺乳動物的染色體基因里僅有一個基因間剪接的先例〔Magrangeas等人，J.Biol.Chem.，27316005-16010(1998)〕，所以我們設法在第二中動物中驗證我們的觀察。使用大鼠Prnp外顯子2序列和與小鼠PrnD外顯子3的3′邊界同源的EST AI136375，對大鼠組織進行RT-PCR實驗。
正如所預計的，在腦和睪丸中都檢測到包括基因間外顯子兩種排列的類似的嵌合cDNA。由于這兩種基因間外顯子在小鼠和大鼠(未呈現(xiàn))之間的保守性差，并且在PrnD ORF的框內不具有ATG密碼子，所以我們認為它們不具有蛋白質編碼功能。
實施例6表達Dpl的細胞系的建立為了更好地研究Dpl的活性和/或細胞的相互作用，將Dpl轉基因轉染到已建立的一株神經(jīng)元細胞系中。
哺乳動物Dpl表達載體的制備通過擴增B6-9 YAC克隆制備了PrnD cDNA盒，寡核苷酸引物對為DW174(5′-CGGAATTCCAGCCTTTCCCTTGCCGATTCAC-3′)與DW175(5′-GCTCTAGAACTGGGCTACCTCTGTCTACCT-3′)。這對引物的5′引物改變了外顯子2a剪接受體位點。接著用EcoR1和Xba消化，將所得到的cDNA盒用凝膠純化，并克隆到哺乳動物表達載體pcDNA3.0中(Invitrogen)。
穩(wěn)定的Dpl細胞系的建立將pcDNA3.0 Dpl(1-5g)加到0.1mL Opti-MEM(Life Technologies)中，與15LLipofectAMINE試劑(Life Technologies)混合，然后室溫培育40分鐘。培育在添加了10％胎牛血清〔FBS〕(Life Technologies)的高葡糖DMEM(LifeTechnologies)中的神經(jīng)-2a細胞〔N2a〕(ATCC)，在6cm盤中生長至鋪滿了盤的60％。以Hank平衡鹽溶液〔HBBS〕洗滌細胞二次，各盤中加入2ml Opti-MEM，輕輕的攪拌將脂質/DNA混合物滴加到各盤中，然后37℃培育細胞5小時。還用缺少PrnD插入的pcDNA3.0和不含有DNA的作為陰性對照的Opti-MEM/脂質混合物轉染細胞。然后加給細胞1mL含有20％FBS的DMEM，并在37℃培育過夜。用胰蛋白酶處理細胞后，將其接種在含有含10％FBS和1mg/mL G418的DMEM的10cm平板上。選出單個集落并進行2周的選擇之后擴增，維持在含有10％FBS和0.3mg/mL的DMEM中。
制備細胞系的RNA使細胞在75cm瓶中生長到有～80％鋪滿，用12mL HBBS洗滌3次。將細胞刮到5mL冰冷的HBBS中，4℃1000xg離心5分鐘，得到細胞沉淀。細胞重懸于1mL冰冷的HBBS中，將其轉移到?jīng)]有RNA的Microfuge管(Ambion)中，4℃ 14000rpm離心沉淀1分鐘。將沉淀重懸于0.6mL新鮮配制的變性溶液中(4M硫氰酸胍、25mM檸檬酸鈉、pH7.0、0.5％肌氨酰、0.1M β-巰基乙醇)。接著加入60L 2M醋酸鈉、0.6mL pH4.0的酸苯酚和0.13mL氯仿∶異戊醇(24∶1)，然后劇烈搖動試管，使其內容物混合。將樣品置于冰中培育20分鐘，然后4℃ 14000rpm離心20分鐘。將水相轉移到新的沒有RNA的Microfuge管中，然后加入0.6mL冰冷的異丙醇。搖動混合試管中的溶液，在-20℃培育1小時。然后4℃14000rpm離心試管20分鐘，除去異丙醇。用75％乙醇洗滌沉淀，加入經(jīng)DEPC處理的ddH2O，將沉淀震松，-20℃培育20分鐘。然后4℃14000rpm離心試管20分鐘，去除乙醇。在空氣中干燥后，將沉淀重懸于30LDEPC-ddH2O中，測量1L溶液260nm的吸收值，確定RNA濃度，然后用干冰將樣品急速冷凍并保存在-80℃。
Dpl細胞系的Northern印跡分析在冰上將RNA樣品解凍，并加入DEPC-ddH2O使其濃度為2g/L。分析各樣品5L。使用NorthernMax試劑盒(Ambion)在含有甲醛的1％瓊脂糖凝膠上分級分離總RNA。然后再使用NorthernMax試劑盒將該凝膠轉移到Nytran-plus膜(S & S)上。使用引物DW95和DW96，通過PrnD cDNA盒的PCR擴增制備400bp的Dpl ORF片段，并使用DECAprimeII試劑盒(Ambion)進行隨機的引導(primed)。使用ExpressHyb溶液(Clontech)使膜雜交，并將其在-80℃暴露在X射線中72小時。
實施例7Prnp0/0小鼠中的Dpl調節(jié)和共濟失調行為已確定Prnp0/0品系中Prnd表達的改變對小鼠品系的兩種PrP敲除品系中觀察到的共濟失調負有責任〔Sakaguchi等人，Nature，380528-531(1996)〕。從Prnp0/0小鼠不同品系制得的cDNA在半定量RT-PCR分析中的表現(xiàn)不同。這種差異與消除的等位基因的結構設計和PrP缺陷表型相符。在圖6中顯示了4種獨立產(chǎn)生的等位基因的結構，它們符合兩種主要的分類那些產(chǎn)生于PrP外顯子3內部的插入/刪除的結構〔Büeler等人，Nature，356577-582(1992)；Manson等人，Mol.Neurobiol，8121-127(1994)〕，它們沒有發(fā)生晚發(fā)病的共濟失調；而兩個等位基因去除了整個的PrP ORF，但還保留了外顯子3的5′端～1Kb的區(qū)域，該區(qū)域包含外顯子3剪接受體位點。因而相對于野生型小鼠，具有完整的剪接受體的Zrch Prnp0/0小鼠〔Büeler等人，Nature，356577-582(1992)〕沒有給出增加的信號，而具有消除的外顯子3剪接受體位點的Rcm和Ngsk品系Prnp0/0小鼠顯示出嵌合性mRNA的強有力增加。用交替引物組進行對照PCR反應來排除cDNA制備物之間的細微差異。
Northern印跡分析顯示，在發(fā)生共濟失調的兩個Prnp0/0品系中，腦中的Dpl mRNA表達水平顯著增加。因而，腦中PrnD mRNA的過度表達與Ngsk和Rcm Prnp0/0小鼠的共濟失調的發(fā)生有關，而Zrch Prnp0/0小鼠腦中的PrnDmRNA的低水平則不伴隨著小腦功能障礙。下表歸納了這些結果表1Prnp0/0小鼠品系中的小腦共濟失調和Dpl的表達

在Prnp0/0小鼠的Ngsk和Rcm品系中發(fā)生了Prnd的極度過度表達，兩個品系都發(fā)生了共濟失調。同樣驚人的發(fā)現(xiàn)是不過度表達Prnd的Arch Prnp0/0小鼠中浦肯野細胞仍維持健康。這些發(fā)現(xiàn)表明Prnd的過度表達對浦肯野細胞是有毒的。由于嵌合mRNA的表達依賴于Prnp啟動子，所以讓人感興趣的是注意到此啟動子在浦肯野細胞中是活躍的(Nishida，發(fā)表中)，推斷假定的浦肯野細胞特異性增強子元件存在于Prnp/Prnd基因間區(qū)域中的Sal I限制性位點的Prnp內含子2或3′中〔Fischer等人，EMBO J.，151255-1264(1996)〕。
實施例8Dpl蛋白的預測特征對可得到的Dpl肽序列進行的比較揭示了一種高度保守的蛋白質，這給Dpl是一種在選擇壓力下的功能性基因產(chǎn)物提供了證據(jù)(圖7和8)。小鼠和大鼠的Dpl蛋白有＞90％的相同性，而具有人Dpl ORF的小鼠則有76％的序列相同性。小鼠和人之間的大部分的序列差異(94％，32/34)是保守性氨基酸置換。Dpl和小鼠PrP之間的同源性估計在20-24％之間，稍微低于雞和哺乳動物PrP之間的同源性(31-34％)〔Gabriel等人，Molecular cloning and structural analysisof a candidate chicken prion protein。In Prion Diseases of Humans and Animals，S.B.Prusiner，J.Collinge，J.Powell和B.Anderton編輯(LondonEllis Horwood)，pp.407-431(1992)；Harris等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，887664-7668(1991)〕。所有3種動物的Dpl具有預測的N末端信號肽切割位點，這表明它們與PrPC一樣是在分泌途徑中合成的(圖9)。PrP具有一組與預測的N末端信號肽切割位點毗鄰的富含精氨酸和賴氨酸的堿性殘基，而Dpl在第25位到第38位殘基之間(其中有7個殘基是堿性的，占50％)具有類似的特征。
Dpl缺少一種使人信服的富含His/Pro/Gly八次重復的區(qū)域，該區(qū)域在PrP中存在并被認為在體內與Cu(II)離子結合〔Brown等人，Nature，390684-687(1997)；Stckel等人，Biochemistry，377185-7193(1998)；Viles等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，962042-2047〕。然而，小鼠Dpl在密碼子41-46之間具有一個類似于雞PrP密碼子103-108之間PSSGGS基序的短PSSGGQ基序。這個觀察的意義并不確定，因為我們不能確定Dpl或PrP是否是原始的分子，即Dpl是產(chǎn)生于PrP的新近基因復制還是產(chǎn)生于缺陷基因的復制?？傊?，可以認為這個基序代表了一種已缺失的退化的重復，或者是被擴增的在PrP中形成重復結構的原型單元。
Dpl缺少一個與AGAAAAGA基序顯著同源的區(qū)域，該基序在所有已知PrP序列中完全保守并且對應于小鼠PrP密碼子的112-119位〔Bamborough等人，Cold Spring Harb.Symp.Quant.Biol.，61495-509(1996)；Stckel等人，J.Mol.Biol.，245362-374(1995)〕。這種差異可能表明Dpl和PrP之間的顯著功能性分歧，因為PrP的這個區(qū)域已顯示出對ER膜的PrP拓撲學是關鍵性的〔Hegde等人，Science，279827-834(1998)〕，并且合成的PrP肽106-126也已顯示對接觸過合成肽106-126的原代培養(yǎng)物有神經(jīng)毒性〔Forloni等人，Nature，362543-546(1993)〕。
PrP在其C末端第231位的絲氨酸上具有一個附著糖基磷脂酰肌醇(GPI)的錨位點〔Stahl等人，Cell，51229-240(1987)〕。和PrP一樣，Dpl具有一個疏水的C末端區(qū)域，我們預測這可能與添加GPI錨位點或單一的跨膜區(qū)域相容。雖然Dpl缺少一個與倉鼠PrP231密碼子相應的絲氨酸殘基，但是我們預測GPI可附著在155位的甘氨酸上。已證明附著在甘氨酸上的GPI是α-葉酸受體〔W.Yan和M.Ratnam，Biochemistry，3414594-600(1995)〕。令人感興趣的是兔PrP序列的檢驗結果表明在231位殘基上沒有絲氨酸，這提示要么兔PrP沒有GPI錨著，要么它可能通過甘氨酸殘基而不是絲氨酸錨定GPI。
這兩種進化上相關蛋白質表面上的保守殘基還是一種功能上重要元素的有用指示器〔Lichtarge等人，J.Molec.Biol.，257342-358(1996)〕。PrP具有兩個共有的N連接糖基化位點，其形式為N-x-(S或T)。與MoPrP中螺旋B上的N181類似的該N連接的糖基化位點仍保留在Dpl中，而螺旋C上的位點則已丟失(圖8和9)。螺旋B上的此唯一的暴露的保守性殘基為此種復合型糖基化的一些功能提供了理由。發(fā)現(xiàn)另一保守性共有N連接糖基化位點在一暴露的表面環(huán)中這個位置(MoDop N-72NVT)的第13位殘基氨基末端。小部分N糖基化蛋白質(～23％)具有一個或多個未糖基化的共有位點，且N糖基化蛋白質中僅有～10％的共有位點是未糖基化的〔G.von Heijne，J Mol Biol.，225487-94(1992)〕，表明這個位點也有可能被糖基化。
使用GRASP算法〔Nicholls等人，Proteins，11281-296(1991)〕評估得到的Dpl和PrP的表面靜電勢能不同。在PrP分子表面的兩側分布著正負電荷區(qū)(R.Riek，Nature，382180-2)，提示膜結合有方向性。Dpl保留了PrP中看到的正電荷區(qū)，雖然這些區(qū)域的邊界并不相同；但是，Dpl缺少一個類似的負電荷區(qū)(資料未給出)，而是中性/正電荷區(qū)。通常，在Dpl表面的一些區(qū)域上具有更多的正電荷，但在PrP中，認為這些區(qū)域是構象上異源的(即殘基121-231)。看來如果發(fā)現(xiàn)有相互作用時，這些帶電表面的分布有可能在多聚化中起作用。仍待確定Dpl和PrP是否競爭與共同受體相結合。
由于PrnD mRNA在野生型動物的CNS中以低水平表達，所以我們?yōu)樵诮M成性巨細胞病毒啟動子控制下的表達PrnD cDNA的轉染細胞中的Dpl蛋白質找到了證據(jù)。將非轉染的N2A細胞和含有CMV/Dpl質粒的穩(wěn)定轉染的細胞系在存在可選擇性標記下培養(yǎng)，獲得RNA，采用Northern印跡分析進行評估。盡管在陽性對照(睪丸RNA)中檢測到1.7kb和2.8kb的PrnD mRNA，但是在非轉染的N2A細胞中沒有檢測到。在8個穩(wěn)定轉染的細胞系中，有5個顯示了豐富水平的預計衍生自該表達質粒的0.9kb mRNA。
實施例9采用Western印跡檢測Dpl選擇兩個具有豐富mRNA的克隆，采用Western印跡，使用直接抗Dpl-2合成肽的抗血清進行進一步分析。采用FMOC化學物合成了對應于71-84位殘基的Dpl肽2的15個殘基(NH-CFGAEGNRYYAANYY-COOH，SEQ IDNO5)，并通過游離的巰基將其偶聯(lián)于馬來酰亞胺活化的KLH。將此偶聯(lián)肽與RIBI佐劑混合，然后皮下接種家兔。
使細胞在10cm盤上生長至約80％鋪滿，用10mL HBBS洗滌3次。然后將細胞刮到5mL HBBS中，4℃ 1000xg離心5分鐘，得到沉淀。將沉淀重懸于0.1mL細胞裂解緩沖液中〔20mM Tris-HCl、pH8.0、150mM NaCl、0.5％TritonX-100，0.5％脫氧膽酸鈉、1Complete mini蛋白酶抑制劑片劑(BoehringerMannheim)〕，然后將其轉移到無菌的Microfuge管中，4℃攪拌10分鐘。4℃14000rpm離心沉淀10分鐘，將上清液轉移到一干凈的Microfuge管中。根據(jù)制造商(Bio-Rad)的推薦采用Bradford試驗測定蛋白質的濃度。將樣品放置于4XLaemmli緩沖液中-80℃保存。
兩個細胞系都具有強烈的非均相分散信號，它們的表觀Mr為30-36KDa。非轉染細胞和不表達PrnD mRNA的克隆沒有可比較的信號。通過用抗肌動蛋白抗血清探測證實了凝膠加樣的標準化。由于所預測的全長Dpl和N末端與C末端加工的Dpl的大小分別為20.4KDa和14.9KDa，所以我們推定Dpl是高度糖基化的。這個結論與N連接的糖基化位點的兩個共有位點的存在一致，且和PrPC本身的情況很相似，在PrPC中通過加入碳水化合物鏈使得20KDa的多肽鏈增長為33-35KDa的鏈。
實施例10
通過高水平表達轉基因陣列編碼的MoPrP-A的來拯救Ngsk Prnp0/0小鼠，證明了可通過高水平的PrPC克服這些小鼠的Dpl超表達(Nishida等人，發(fā)表中)。在這些通過野生型MoPrP-A的過度表達拯救的Tg(P)Ngsk/Prnp0/0小鼠中，轉基因是用Syrian倉鼠Cos.Tet載體構建的，它不含有Dpl ORF〔Scott等人，Protein Sci.，1986-997(1992)〕。Tg(P)Ngsk/Prnp0/0小鼠中的PrnD mRNA水平與缺少此轉基因的Ngsk Prnp0/0同窩仔不同。因而，如果小腦變性直接歸因于PrnD的超表達，那么由PrP的超表達進行的“拯救”必須根據(jù)轉錄后的機制進行估計可能是PrPC滴定除去了Dpl的毒性作用，也許是通過一種直接的物理性相互作用競爭共同受體而起作用。
雖然本發(fā)明通過具體的實施例進行了描述，但本領域中那些熟練的技術人員應能理解，在不偏離本發(fā)明真正的實質和范圍的情況下可以對其作出各種變化以及用相等物取代。另外，為了適應具體的情況、材料、物質的組成、方法、方案或步驟，可以對發(fā)明的目的、實質和范圍作出許多的修改。所有的這些修改都包括在后面的權利要求書所述的范圍內。
序列表<110>S.普魯賽納(Prusiner，Stanley)P.特倫布萊(Tremblay，Patrick)R.穆爾(Moore，Richard)D.韋斯特韋(Westaway，David)L.E.胡德(Hood，Leroy E.)I.李(Lee，Inyoul)<120>PrP樣基因<130>6510-130W01<140>09/309,317<141>1999-05-11<160>21<170>FastSEQ for Windows Version 4.0<210>1<211>540<212>DNA<213>小家鼠(mus musculis)<400>1atgaagaacc ggctgggtac atggtgggtg gccatcctct gcatgctgct tgccagccac 60ctctccacgg tcaaggcaag gggcataaag cacaggttca agtggaaccg gaaggtcctg 120cccagcagcg gcggccagat caccgaagct cgggtagctg agaaccgccc aggagccttc 180atcaagcaag gccggaagct ggacatcgac tttggagcag agggcaacag gtactacgcg 240gctaactatt ggcagttccc tgatgggatc tactacgaag gctgctctga agccaacgtg 300accaaggaga tgctggtgac cagctgcgtc aacgccaccc aggcggccaa ccaggctgag 360ttctcccggg agaagcagga tagcaagctc caccagcgag tcctgtggcg gctgatcaaa 420gagatctgct ccgccaagca ctgcgatttc tggctggaaa ggggagctgc gcttcgggtc 480gccgtggacc aaccggcgat ggtctgcctg ctgggtttcg tttggttcat tgtgaagtaa 540<210>2<211>176<212>PRT<213>智人(homo sapiens)<400>2Met Arg Lys His Leu Ser Trp Trp Trp Leu Ala Thr Val Cys Met Leu1 5 10 15Leu Phe Ser His Leu Ser Ala Val Gln Thr Arg Gly Ile Lys His Arg20 25 30Ile Lys Trp Asn Arg Lys Ala Leu Pro Ser Thr Ala Gln Ile Thr Glu35 40 45Ala Gln Val Ala Glu Asn Arg Pro Gly Ala Phe Ile Lys Gln Gly Arg5055 60Lys Leu Asp Ile Asp Phe Gly Ala Glu Gly Asn Arg Tyr Tyr Glu Ala65 70 75 80Asn Tyr Trp Gln Phe Pro Asp Gly Ile His Tyr Asn Gly Cys Ser Glu85 90 95Ala Asn Val Thr Lys Glu Ala Phe Val Thr Gly Cys Ile Asn Ala Thr100 105 110Gln Ala Ala Asn Gln Gly Glu Phe Gln Lys Pro Asp Asn Lys Leu His115 120 125Gln Gln Val Leu Trp Arg Leu Val Gln Glu Leu Cys Ser Leu Lys His130 135 140Cys Glu Phe Trp Leu Glu Arg Gly Ala Gly Leu Arg Val Thr Met His145 150 155 160Gln Pro Val Leu Leu Cys Leu Leu Ala Leu Ile Trp Leu Met Val Lys165 170 175<210>3<211>179<212>PRT<213>小家鼠(mus musculis)<400>3Met Lys Asn Arg Leu Gly Thr Trp Trp Val Ala Ile Leu Cys Met Leu1 5 10 15Leu Ala Ser His Leu Ser Thr Val Lys Ala Arg Gly Ile Lys His Arg20 25 30Phe Lys Trp Asn Arg Lys Val Leu Pro Ser Ser Gly Gly Gln Ile Thr35 40 45Glu Ala Arg Val Ala Glu Asn Arg Pro Gly Ala Phe Ile Lys Gln Gly50 55 60Arg Lys Leu Asp Ile Asp Phe Gly Ala Glu Gly Asn Arg Tyr Tyr Ala65 70 75 80Ala Asn Tyr Trp Gln Phe Pro Asp Gly Ile Tyr Tyr Glu Gly Cys Ser85 90 95Glu Ala Asn Val Thr Lys Glu Met Leu Val Thr Ser Cys Val Asn Ala100 105 110Thr Gln Ala Ala Asn Gln Ala Glu Phe Ser Arg Glu Lys Gln Asp Ser115 120 125Lys Leu His Gln Arg Val Leu Trp Arg Leu Ile Lys Glu Ile Cys Ser130 135 140Ala Lys His Cys Asp Phe Trp Leu Glu Arg Gly Ala Ala Leu Arg Val145 150 155 160Ala Val Asp Gln Pro Ala Met Val Cys Leu Leu Gly Phe Val Trp Phe165 170 175Ile Val Lys<210>4<211>179<212>PRT<213>鼠鼠(rat rattus)<400>4Met Lys Asn Arg Leu Gly Thr Trp Gly Leu Ala Ile Leu Cys Leu Leu1 5 10 15Leu Ala Ser His Leu Ser Thr Val Lys Ala Arg Gly Ile Lys His Arg20 25 30Phe Lys Trp Asn Arg Lys Val Leu Pro Ser Ser Gly Gln Ile Thr Glu35 40 45Ala Gln Val Ala Glu Asn Arg Pro Gly Ala Phe Ile Lys Gln Gly Arg50 55 60Lys Leu Asp Ile Asp Phe Gly Ala Glu Gly Asn Lys Tyr Tyr Ala Ala65 70 75 80Asn Tyr Trp Gln Phe Pro Asp Gly Ile Tyr Tyr Glu Gly Cys Ser Glu85 90 95Ala Asn Val Thr Lys Glu Val Leu Val Thr Arg Cys Val Asn Ala Thr100 105 110Gln Ala Ala Asn Gln Ala Glu Phe Ser Arg Glu Lys Gln Asp Ser Lys115 120 125Leu His Gln Arg Val Leu Trp Arg Leu Ile Lys Glu Ile Cys Ser Thr130 135 140Lys His Cys Asp Phe Trp Leu Glu Arg Gly Ala Ala Leu Arg Ile Thr145 150 155 160Val Asp Gly Leu Gln Ala Met Val Cys Leu Leu Gly Phe Ile Trp Phe165 170 175Ile Val Lys<210>5<211>19<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成的肽<400>5Asn His Cys Phe Gly Ala Glu Gly Asn Arg Tyr Tyr Ala Ala Asn Tyr1 5 10 15Tyr Cys His<210>6<211>23<212>DNA<213>智人(homo sapien)<400>6cggttggtcc acggcgaccc gaa 23<210>7<211>20<212>DNA<213>智人(homo sapien)<400>7gcagatctctttgatcagcc20<210>8<211>20<212>DNA<213>智人(homo sapien)<400>8cagatccacc gaagctcggg20<210>9<211>24<212>DNA<213>智人(homo sapien)<400>9tggtgaccag ctgcgtcaac gcca 24<210>10<211>26<212>DNA<213>智人(homo sapien)<400>10tgggaaggcc ctgagcgaca accgtg 26<210>11<211>28<212>DNA<213>人工序列<220><223>合成的寡核苷酸<400>11gctccaagct tcagaggcca cagtagca 28<210>12<211>26<212>DNA<213>人工序列<220><223>合成的寡核苷酸<400>12ttacttcaca atgaaccaaa cgaaac 26<210>13<211>19<212>DNA<213>人工序列<220><223>合成的寡核苷酸<400>13gagtggaggt cttcgcgca 19<210>14<211>40<212>DNA<213>人工序列<220><223>合成的寡核苷酸<400>14tcaaaactga accatttcaa cccaactgaa gtattctgcc40<210>15<211>29<212>DNA<213>人工序列<220><223>合成的寡核苷酸<400>15acccagcgtt ctggcccggt attaggatt29<210>16<211>28<212>DNA<213>人工序列<220><223>合成的寡核苷酸<400>16ccagccggtt cttcatggtg aatctcgg 28<210>17<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>合成的寡核苷酸<400>17catggtgaat ctcggttctc 20<210>18<211>13<212>DNA<213>人工序列<220><223>共有序列<400>18gccgccacca tgg 13<210>19<211>13<212>DNA<213>人工序列<220><223>共有序列<400>19gccgccgcca tgg 13<210>20<211>13<212>DNA<213>人工序列<220><223>與共有序列匹配<400>20agattcacca tga 13<210>21<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>合成的寡核苷酸<400>21atgaagaacc ggctgggtac 20
權利要求
1.分離的Doppel(Dpl)多肽。
2.如權利要求1所述的人Dpl多肽，其特征在于，所述多肽含有選自SEQID NO2、SEQ ID NO3和SEQ ID NO4的氨基酸序列。
3.分離的核酸序列或其互補序列，其特征在于，所述序列或其互補序列包含編碼權利要求1所述的Dpl多肽的核酸序列。
4.如權利要求3所述的分離的核酸序列，其特征在于，所述序列包含SEQID NO1的核酸序列。
5.一種重組表達載體，其特征在于，所述載體包含權利要求3所述的核酸序列。
6.一種分離的重組宿主細胞，其特征在于，所述細胞含有權利要求1所述的核酸序列。
7.一種轉基因動物，其特征在于，該轉基因動物包含的基因組中至少一個內源性Dpl基因的等位基因已被改變。
8.如權利要求7所述的轉基因動物，其特征在于，所述改變導致Dpl基因表達的增加。
9.如權利要求7所述的轉基因動物，其特征在于，所述動物還包含有至少一個內源性PrP等位基因被消除的基因組。
10.如權利要求9所述的轉基因動物，其特征在于，所述基因組已被有效地插入了來自遺傳上與其不同的動物的外源性PrP基因。
11.一種分離的抗體，其特征在于，所述抗體能特異地與權利要求1所述的人Dpl多肽結合。
12.一種促進檢測朊病毒感染性的方法，其特征在于，所述方法包括下列步驟取得待測試動物的組織樣品；將該樣品接種到權利要求7所述的轉基因動物上；和觀察該轉基因動物的朊病毒病癥狀。
全文摘要
本發(fā)明提供編碼Doppel(“Dpl”)蛋白、Dpl肽的核酸和利用該Dpl核酸和/或肽進行的試驗。在相關方面,本發(fā)明的特征是包含編碼人Dpl多肽的核酸的表達載體和宿主細胞。本發(fā)明還涉及能與人Dpl多肽特異性結合的抗體、產(chǎn)生人Dpl多肽的方法、鑒定表達Dpl的細胞的方法、使用Dpl基因和Dpl多肽改變培養(yǎng)的和體內的細胞功能和朊病毒傳染性的方法,以及通過檢測Dpl編碼與調控序列和Dpl表達水平的改變來鑒定患朊病毒病風險的個體。
文檔編號G01N33/53GK1355845SQ00808973
公開日2002年6月26日 申請日期2000年5月11日 優(yōu)先權日1999年5月11日
發(fā)明者S·B·普魯賽納, P·特倫布萊, R·穆爾, D·韋斯特韋, L·E·胡德, I·李 申請人:加利福尼亞大學董事會, 多倫多大學管理委員會, 華盛頓大學