技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于材料制備領(lǐng)域，更具體地，涉及一種水凝膠材料及其制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

三維多孔納米支架能夠模仿天然細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)，為細(xì)胞生長提供支持，廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)、組織工程學(xué)等研究領(lǐng)域。幾乎所有的組織細(xì)胞在體內(nèi)都是在三維條件下生長，細(xì)胞被包裹在由膠原纖維作為主要成分組成的納米纖維水凝膠之中，此外，細(xì)胞外基質(zhì)中還含有大量的不溶性基質(zhì)蛋白和可溶性生長因子。但目前研究中細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)中所采用的大多都是二維培養(yǎng)，即細(xì)胞在培養(yǎng)板或者培養(yǎng)皿上進(jìn)行培養(yǎng)，這與體內(nèi)生長環(huán)境相差較大，影響細(xì)胞生長，甚至?xí)鸺?xì)胞基因或者功能變化。如何體外構(gòu)建具有模仿天然細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能的人工支架材料，為細(xì)胞提供三維生長環(huán)境一直是生物、醫(yī)學(xué)以及材料工程領(lǐng)域基礎(chǔ)研究和產(chǎn)品開發(fā)的熱點(diǎn)。

自組裝短肽RADA16-I是4個(gè)重復(fù)的精氨酸-丙氨酸-天冬氨酸-丙氨酸序列，即（精氨酸-丙氨酸-天冬氨酸-丙氨酸）₄，當(dāng)其水溶液調(diào)節(jié)至pH=7時(shí)會形成由納米纖維網(wǎng)絡(luò)構(gòu)成的水凝膠，與天然細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)很相似，作為組織工程支架、藥物載體和止血材料在生物醫(yī)學(xué)工程領(lǐng)域有廣泛的應(yīng)用，是自組裝短肽水凝膠材料的典型代表。但是一個(gè)顯著的缺點(diǎn)是該材料水溶液具有明顯的酸性(pH=3～4)，不能與細(xì)胞懸液和活性分子直接混合原位成凝膠，即很難實(shí)現(xiàn)細(xì)胞包埋在RADA 16-I水凝膠中進(jìn)行三維生長。

目前關(guān)于細(xì)胞培養(yǎng)的報(bào)道仍是采用先制備水凝膠然后在其表面種植細(xì)胞的二維培養(yǎng)模式，不能實(shí)現(xiàn)真正的三維細(xì)胞培養(yǎng)。而將該材料直接注射體內(nèi)修復(fù)損傷和用于止血時(shí)較低的pH會對宿主組織造成損害。自1993年首次報(bào)道該材料以來，人們對RADA16-I進(jìn)行了大量的研究，但是對于其酸性的缺點(diǎn)仍不能有效解決。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明根據(jù)目前自組裝水凝膠材料中的不足，提供了一種水凝膠材料。

本發(fā)明的另一目的在于提供上述水凝膠材料的制備方法。

本發(fā)明的另一目的在于提供上述水凝膠材料的應(yīng)用。

本發(fā)明的技術(shù)目的通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：

本發(fā)明提供了一種短肽，所述短肽序列為：（精氨酸-丙氨酸-天冬氨酸-丙氨酸）₄-異亮氨酸-賴氨酸-異亮氨酸-賴氨酸-異亮氨酸-賴氨酸-纈氨酸-丙氨酸-纈氨酸。

本發(fā)明同時(shí)保護(hù)包含所述短肽的水凝膠材料。

本發(fā)明所提供的水凝膠材料，是短肽先與堿液混合，再與緩沖液混合后，在中性pH條件下自組裝形成，該短肽是在RADA16-I 序列的基礎(chǔ)上，連接多個(gè)酸性和堿性氨基酸，然后通過非共價(jià)鍵作用結(jié)合形成具有特定功能的多肽水凝膠材料。

本發(fā)明是以低分子量自組裝短肽為基礎(chǔ)的水凝膠，為細(xì)胞三維生長提供空間，用于構(gòu)建組織工程支架。本材料可在常溫中性pH條件下形成納米纖維水凝膠，模仿了天然細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)，具有良好的理化性能和生物相容性，支持細(xì)胞三維生長，滿足組織工程支架的要求，而且可負(fù)載活性分子藥物，例如生長因子、短肽藥物?？蓮V泛應(yīng)用于軟骨、血管、神經(jīng)、皮膚等人工器官的再生和損傷的修復(fù)。

本發(fā)明同時(shí)提供所述的水凝膠材料的方法，包括將短肽配置成短肽水溶液，先與堿液混合，調(diào)節(jié)pH得到pH中性溶液，然后再與緩沖液混合，自組裝形成所述水凝膠材料。

所述堿液為NaOH溶液或Trsi-base溶液；所述緩沖液為PBS溶液或DMEM溶液。

優(yōu)選地，所述短肽水溶液的濃度為5~15 mg/mL。

優(yōu)選地，所述堿液的濃度為0.1~1 mol/mL，所述pH為7~7.4。

優(yōu)選地，所述短肽水溶液與緩沖液混合體積比為（1~5）：1。

更優(yōu)選地，所述短肽水溶液與緩沖液混合體積比為2：1。

本發(fā)明短肽序列的合成是采用了現(xiàn)有的接枝方向獲得，由于目前未有成型的理論支持何種改性（即接枝序列和接枝位置）能夠獲得真正在中性條件下合成的自組裝多肽水凝膠，不同的序列排列方式不同，電荷分布也不同，同時(shí)結(jié)構(gòu)內(nèi)部自組裝方式均會影響最終的接枝效果，因此，上述接枝物的具體接枝位點(diǎn)和接枝序列排布，對最終效果影響非常大。

與現(xiàn)有多肽自組裝水凝膠相比，本發(fā)明在生理?xiàng)l件下（pH為7-7.4）即可形成三維多孔水凝膠，由直徑約20 nm的納米纖維網(wǎng)絡(luò)構(gòu)成，凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，可為細(xì)胞三維培養(yǎng)提供支撐作用。將含有功能性氨基酸序列引入，能夠促進(jìn)細(xì)胞生長、粘附，同時(shí)也可負(fù)載活性分子藥物，如生長因子、短肽藥物，獲得控制釋放。也可注射使用，操作簡便，是非常理想的生物材料。

本發(fā)明所述的中性pH下自組裝成的水凝膠材料，且使用過程都是中性的，不會對細(xì)胞核宿主組織產(chǎn)生危害，能夠用于真正的三維培養(yǎng)細(xì)胞，方法為將細(xì)胞懸液與所述短肽材料進(jìn)行混合，得到包埋細(xì)胞的水凝膠/細(xì)胞復(fù)合體，并加入培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。

進(jìn)一步地，所述的中性pH下，與緩沖液，例如PBS、DMEM等混合自組裝成水凝膠的多肽材料在運(yùn)用于軟骨、血管、神經(jīng)或皮膚的再生和損傷修復(fù)中，具有極大的應(yīng)用前景。本發(fā)明提供的短肽中性條件下與細(xì)胞懸液混合后可均勻分散細(xì)胞，加入細(xì)胞培養(yǎng)基即可進(jìn)行細(xì)胞三維培養(yǎng)，不需要其他操作。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果：

本發(fā)明提供了一種可在常溫中性pH條件，即在人體生理?xiàng)l件自組裝形成三維多孔納米纖維水凝膠。利用本發(fā)明技術(shù)制備的材料具有更好的生物相容性，可實(shí)現(xiàn)原位負(fù)載細(xì)胞/活性分子以及體內(nèi)原位注射，在細(xì)胞三維培養(yǎng)、組織工程生物支架材料和藥物載體領(lǐng)域具有非常廣闊的應(yīng)用前景和臨床應(yīng)用價(jià)值。

附圖說明

圖1為短肽和Tris-base溶液混合后，再與PBS或DMEM溶液混合，在中性pH條件下，形成水凝膠。

圖2為短肽和Tris-base溶液混合后，在其上滴加PBS，在中性pH條件下，形成水凝膠。

圖3為在所形成的水凝膠上加入DMEM，滲透到水凝膠的DMEM顏色未改變，說明形成的水凝膠為中性pH。

圖4為實(shí)施例1中水凝膠材料的原子力纖維鏡圖。

圖5為流變性能對比圖，PA/PBS為短肽同PBS混合，PA/DMEM為改性短肽同DMEM混合。G’為儲能模量，G”為損耗模量。G’遠(yuǎn)大于G”，說明形成了穩(wěn)定的水凝膠。

圖6為神經(jīng)干細(xì)胞球在納米纖維水凝膠中三維生長形貌，從圖中可以看出神經(jīng)干細(xì)胞球在本發(fā)明專利制備的納米纖維水凝膠中可以三維生長，并長出較長的軸突。

具體實(shí)施方式

下面通過實(shí)施例和附圖對本發(fā)明進(jìn)行具體描述，有必要在此指出的是本實(shí)施例只用于對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步說明，但不能理解為對本發(fā)明保護(hù)范圍的限制，該領(lǐng)域的技術(shù)熟練人員可以根據(jù)上述本發(fā)明的內(nèi)容作出一些非本質(zhì)的改進(jìn)和調(diào)整。

除非特別說明，本發(fā)明采用的試劑、方法和設(shè)備為本技術(shù)領(lǐng)域常規(guī)試劑、方法和設(shè)備。

短肽的制備：

短肽制備采用通用的制備技術(shù)，即多肽合成儀進(jìn)行合成制備。多肽合成儀以固相合成為反應(yīng)原理，在密閉的防爆玻璃反應(yīng)器中使氨基酸按照已知順序(序列，一般從C端-羧基端 向 N端-氨基端)不斷添加、反應(yīng)、合成，操作最終得到多肽載體。實(shí)際合成中，主要采用fmoc固相合成法。

短肽制備：

取一定量的樹脂置于固相反應(yīng)器中，加入5 ml無水 DMF浸泡溶脹2小時(shí)，減壓抽去溶劑DMF。第一氨基酸耦聯(lián)到樹脂上的方法為，F(xiàn)moc保護(hù)氨基酸、HBTU和DMAP溶于DMF中，加入DIPEA，室溫?fù)u蕩反應(yīng)"10小時(shí)，減壓抽去溶劑，以DMF洗滌樹脂。加入乙酸酐：吡啶：DMF=2：1：3的溶液，搖蕩30分鐘，封閉樹脂上未反應(yīng)的官能團(tuán)。依次用DMF，DCM和DMF洗滌樹脂，20%派啶/DMF脫保護(hù)，時(shí)間為10分鐘和20分鐘。然后按照已知順序，一般從C端-羧基端向N端-氨基端不斷添加、反應(yīng)、合成，操作最終得到多肽。

多肽的切除和沉淀

樹脂用DCM洗滌幾遍后，真空抽干。往裝有樹脂的多肽固相反應(yīng)器中緩慢加入三氟乙酸/三異丙基硅烷/水溶液，反應(yīng)3小時(shí).過濾，氮?dú)獯等ゴ蟛糠值娜軇┖?，向殘液中倒入無水乙醚，出現(xiàn)白色絮狀沉淀，離心后倒去溶劑乙醚，向沉淀中加入無水乙醚振蕩，同樣條件下離心，再重復(fù)一次，除去大部分的雜質(zhì)。沉淀真空干燥。固體殘留物用離子水溶解，冷凍干燥得到白色絮狀固體，-20°C保存。

多肽的分離純化

將凍干的粗品多肽，溶于20%乙腈/水溶液進(jìn)行高效液相色譜(HPLC)分離。用含有0.6%的乙腈和水溶液進(jìn)行梯度洗脫。收集主要峰產(chǎn)物，進(jìn)行電噴霧質(zhì)譜或MAL-DI-TOF質(zhì)譜鑒定。減壓旋蒸除去HPLC的樣品鋒中的乙腈。在冷凍干燥機(jī)上冷凍干燥，獲得目標(biāo)產(chǎn)物短肽。

實(shí)施例1：水凝膠的多肽材料制備：

將實(shí)施例1制備得到的短肽（其序列為:（精氨酸-丙氨酸-天冬氨酸-丙氨酸）₄-異亮氨酸-精氨酸-異亮氨酸-精氨酸-異亮氨酸-賴氨酸-纈氨酸-丙氨酸-纈氨酸）溶于超純水后，配置成濃度為5~15ml/mL的溶液，與Tris-base（或NaOH）溶液混合，Trsi-base（或NaOH）溶液的濃度為0.1~1 mol/mL，調(diào)節(jié)其pH值至7，再與PBS（或DMEM）溶液以體積比2：1混合，靜置后迅速形成凝膠，待性狀穩(wěn)定后，即可投入使用。

如圖1~5所示，混合后形成水凝膠，失去流動(dòng)性。圖4中原子力纖維鏡觀察水凝膠由納米纖維構(gòu)成。

實(shí)施例2：三維細(xì)胞培養(yǎng)

以超純水為溶劑，配成濃度為5-15 mg/mL的短肽溶液并和Tris-base（或NaOH）溶液混合，將細(xì)胞懸液與調(diào)整至中性pH的短肽溶液混合，得到均勻的細(xì)胞/短肽混合物，再同PBS（或DMEM）溶液以體積比2:1混合得到包埋有細(xì)胞的三維水凝膠，靜置后迅速形成凝膠，加入細(xì)胞培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。

實(shí)施例2中包埋細(xì)胞為神經(jīng)干細(xì)胞球，如圖6所示，可以看出神經(jīng)干細(xì)胞球在本發(fā)明專利制備的納米纖維水凝膠中可以三維生長，并達(dá)到了100%的存活率，同時(shí)長出較長的軸突。