本發(fā)明申請(qǐng)是基于申請(qǐng)日為2010年4月27日，申請(qǐng)?zhí)枮椤?01080027833.7”(國(guó)際申請(qǐng)?zhí)枮椤皃ct/us2010/001239”)，名稱(chēng)為“神經(jīng)退行性疾病的基因治療”的發(fā)明專(zhuān)利申請(qǐng)的分案申請(qǐng)。

相關(guān)申請(qǐng)的交叉參考

本申請(qǐng)要求2009年5月2日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)?zhí)?1/174/982和2009年6月8日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)?zhí)?1/268,059的35usc§119(e)(l)下的權(quán)利，這些申請(qǐng)以其整體在此引入作為參考。

本發(fā)明一般涉及基因治療方法。特別地，本發(fā)明涉及用于治療影響運(yùn)動(dòng)功能(如由腦和/或脊髓的疾病或損傷影響的運(yùn)動(dòng)功能)的疾病的方法和組合物。

背景技術(shù)：

基因治療是新興的治療影響中樞神經(jīng)系統(tǒng)(cns)疾病的治療模式。通過(guò)發(fā)展能夠有效感染有絲分裂后神經(jīng)元的病毒載體促進(jìn)了cns基因治療。中樞神經(jīng)系統(tǒng)由脊髓和腦組成。脊髓從外周神經(jīng)系統(tǒng)向腦傳導(dǎo)感覺(jué)信息并從腦向不同效應(yīng)器傳導(dǎo)運(yùn)動(dòng)信息。關(guān)于用來(lái)向中樞神經(jīng)系統(tǒng)基因傳遞的病毒載體的綜述，見(jiàn)davidson等，naturerev.(2003)4：353-364。

由于其具有有利的毒性和免疫原性特征、能夠轉(zhuǎn)化神經(jīng)細(xì)胞、并能夠介導(dǎo)在cns中的長(zhǎng)效表達(dá)，腺相關(guān)病毒(aav)載體被認(rèn)為可用于cns基因治療(kaplitt等，nat.genet.(1994)8：148-154；bartlett等，hum.genether.(1998)9：1181-1186；及passini等，j.neurosci.(2002)22：6437-6446)。

aav載體一個(gè)有用的性質(zhì)在于一些aav載體在神經(jīng)細(xì)胞中進(jìn)行逆行和/或順行運(yùn)輸?shù)哪芰?。腦區(qū)域中的神經(jīng)元通過(guò)軸突與末梢腦區(qū)域互相連接，從而為載體傳遞提供了一個(gè)轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)。例如，可以在或接近神經(jīng)元軸突末端處給藥aav載體。神經(jīng)元內(nèi)吞aav載體，并以逆行的方式將其沿軸突向細(xì)胞體傳送。已顯示腺病毒、hsv和假狂犬病病毒具有相似的向腦中末梢結(jié)構(gòu)傳遞基因的性質(zhì)(soudas等，fasebj.(2001)15：2283-2285；breakefield等，newbiol.(1991)3：203-218；和defalco等，science(2001)291：2608-2613)。

一些實(shí)驗(yàn)已經(jīng)報(bào)道通過(guò)aav血清型2(aav2)的腦部轉(zhuǎn)化限定于顱內(nèi)注射點(diǎn)(kaplitt等，nat.genet.(1994)8：148-154；passini等，j.neurosci.(2002)22：6437-6446；和chamberlin等，brainres.(1998)793：169-175)。還有一些證據(jù)表明親神經(jīng)病毒載體(包括aav和慢病毒載體)的逆行軸突運(yùn)輸還能發(fā)生在正常大鼠腦的選擇回路(kaspar等，mol.ther.(2002)5：50-56；kasper等，science(2003)301：839-842以及azzouz等，nature(2004)429：413-417)。roaul等，nat.med.(2005)11(4)：423-428及ralph等，nat.med.(2005)11(4)：429-433報(bào)道了在治療相關(guān)als嚙齒動(dòng)物模型中，肌內(nèi)注射表達(dá)沉默人cu/zn過(guò)氧化物歧化酶(sod1)干擾rna的慢病毒延遲了肌萎縮性側(cè)索硬化(als)的疾病發(fā)病。

通過(guò)aav載體轉(zhuǎn)化的細(xì)胞可以表達(dá)治療性轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物(如酶或神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子)以介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)的有益效果。這些細(xì)胞還可以分泌治療性轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物，其可能隨后被末梢細(xì)胞吸收，在那兒介導(dǎo)其有益效果。這個(gè)過(guò)程已被描述為交叉校正(νeufeld等，science(1970)169：141-146)。

上述重組aav載體的一個(gè)性質(zhì)是需要單鏈dνa(ssdνa)aav基因組在表達(dá)編碼的轉(zhuǎn)基因前必須被轉(zhuǎn)變成雙鏈dna(dsdna)。這一步能用自身互補(bǔ)載體來(lái)規(guī)避，該載體包裝折疊成dsdνa的反向重復(fù)基因組、而不需dna合成或多個(gè)載體基因組間堿基配對(duì)，從而增加aav介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移效率。關(guān)于自身互補(bǔ)aav載體的綜述，見(jiàn)例如，mccarty，d.m.molec.ther.(2008)16：1648-1656。

脊髓性肌萎縮(sma)是一種常染色體隱形遺傳神經(jīng)肌肉疾病，其由運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元生存1(smν1)基因的突變和編碼的smn蛋白的缺失引起(lefebvre等，cell(1995)80：155-165)。smn的缺失導(dǎo)致了脊髓腹(前)角的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元變性，其導(dǎo)致了負(fù)責(zé)爬行、走、頸部控制和吞咽的近端肌肉、以及控制呼吸和咳嗽的不隨意肌的減弱(sumnerc.j.，neurorx(2006)3：235-245)。因此，sma患者表現(xiàn)出肺炎和其他肺部問(wèn)題(如限制性肺病)增加的趨勢(shì)。疾病的發(fā)病和嚴(yán)重程度部分由表型修飾基因smn2確定，smn2能夠產(chǎn)生少量的smn(monani等，hum.moi.genet.(1999)8：1177-1183；lorson等，proc.natl.acad.sci.usa(1999)96：6307-6311))。因此，具有高smn2拷貝數(shù)(3-4個(gè)拷貝)的患者表現(xiàn)出較不嚴(yán)重形式的疾病(稱(chēng)為ii或iii型)，而1-2個(gè)拷貝的smn2通常導(dǎo)致更嚴(yán)重的i型疾病(campbell等，am.j.hum.genet.(1997)61：40-50；lefebvre等，nat.genet.(1997)16：265-269)。目前，對(duì)于sma沒(méi)有有效治療。

治療這種單基因疾病的基本策略是增加sma患者中的smn水平。實(shí)現(xiàn)這個(gè)策略的一種方法是用激活smn2啟動(dòng)子或糾正smn2前mrna剪接模式的小分子調(diào)節(jié)內(nèi)源性smn2基因。也能用反義寡核苷酸和反式剪接rna實(shí)現(xiàn)smn2剪接的改變。然而，盡管在體外調(diào)節(jié)smn2增加了smn水平并重建了sma細(xì)胞系的核芽(gems)，用小分子藥物的功效研究還沒(méi)有轉(zhuǎn)化成臨床上可測(cè)量到的改善(oskoui等，nerotherapeutics(2008)5：499-506)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明是基于以下發(fā)現(xiàn)，傳統(tǒng)重組aav(raav)病毒粒子和重組自身互補(bǔ)aav載體(scaav)能夠?qū)⒒騻鬟f到cns，在cns中成功表達(dá)并治療神經(jīng)退行疾病。這種用于傳遞編碼導(dǎo)致至少部分糾正神經(jīng)病理的治療性分子的基因的治療方法提供了用于治療包括sma的多種神經(jīng)退行疾病的非常可取的方法。

因此在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及一種自身互補(bǔ)腺相關(guān)病毒(scaav)載體，其包括編碼調(diào)節(jié)具有運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元疾病的受試者運(yùn)動(dòng)功能的蛋白質(zhì)的多核苷酸。在某些實(shí)施方案中，運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元疾病選自脊髓性肌萎縮(sma)、肌萎縮性側(cè)索硬化癥(als)、延髓肌肉萎縮癥、脊髓小腦共濟(jì)失調(diào)、原發(fā)性側(cè)索硬化(pls)或外傷性脊髓損傷。

在另外的實(shí)施方案中，在scaav載體中才存在的多核苷酸編碼一種運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元生存(smn)蛋白。在某些實(shí)施方案中，smn蛋白是人smn-1。在又一實(shí)施方案中，smn-1包括與圖9b中所述序列具有至少90％序列同源性的氨基酸序列。在另外的實(shí)施方案中，smn-1包括圖9b中所述的氨基酸序列。

在又一實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及重組aav病毒粒子，其包括如上所述的scaav載體。

在另外的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及包括上述重組aav病毒粒子和藥學(xué)上可接受的賦形劑的組合物。

在又一實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及調(diào)節(jié)具有運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元疾病的受試者的運(yùn)動(dòng)功能的方法，其包括向受試者細(xì)胞給藥治療有效劑量的上述組合物。在某些實(shí)施方案中,將組合物在體外給藥細(xì)胞以轉(zhuǎn)化細(xì)胞，并且將轉(zhuǎn)化細(xì)胞給藥到受試者。在可選實(shí)施方案中，將組合物在體內(nèi)給藥細(xì)胞。

在又一實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及向具有脊髓性肌萎縮(sma)的受試者提供smn蛋白的方法，其包括向需要的受試者細(xì)胞給藥包含上述aav載體的重組aav病毒粒子。在某些實(shí)施方案中，體外將組合物給藥細(xì)胞以轉(zhuǎn)化細(xì)胞、并將轉(zhuǎn)化細(xì)胞給藥到受試者。在可選實(shí)施方案中，體內(nèi)將組合物給藥細(xì)胞。

在上述每一種方法中，能通過(guò)直接脊髓注射給藥組合物。在其他實(shí)施方案中，通過(guò)腦室內(nèi)注射給藥組合物。在另外的實(shí)施方案中，將組合物給藥一側(cè)腦室。在某些實(shí)施方案中,將組合物給藥兩個(gè)側(cè)腦室。在其他實(shí)施方案中，通過(guò)腦室內(nèi)注射和直接脊髓注射給藥組合物。在另外的實(shí)施方案中，通過(guò)鞘內(nèi)注射給藥組合物。

鑒于在此的本發(fā)明的公開(kāi)，本領(lǐng)域技術(shù)人員將容易想到發(fā)明主旨的這些和其他實(shí)施方案。

具體地，本發(fā)明涉及如下各項(xiàng)：

1.一種自身互補(bǔ)的腺相關(guān)病毒(scaav)載體，包括編碼在有運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元疾病的受試者中調(diào)節(jié)運(yùn)動(dòng)功能的蛋白質(zhì)的多核苷酸。

2.根據(jù)項(xiàng)1所述的scaav載體，其中運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元疾病選自脊髓性肌萎縮(sma)、肌萎縮性側(cè)索硬化癥(als)、延髓肌肉萎縮癥、脊髓小腦共濟(jì)失調(diào)、原發(fā)性側(cè)索硬化(pls)、或外傷性脊髓損傷。

3.根據(jù)項(xiàng)2所述的scaav載體，其中運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元疾病是sma。

4.根據(jù)項(xiàng)3所述的scaav載體，其中多核苷酸編碼運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元生存(smn)蛋白。

5.根據(jù)項(xiàng)4所述的scaav載體，其中smn蛋白由人smn-1編碼。

6.根據(jù)項(xiàng)5所述的scaav載體，其中smn蛋白包括與圖9b所述序列具有至少90％序列同源性的氨基酸序列。

7.根據(jù)項(xiàng)6所述的scaav載體，其中smn蛋白包括如圖9b所述的氨基酸序列。

8.一種重組aav病毒粒子，包括根據(jù)項(xiàng)1-7任一項(xiàng)所述的scaav載體。

9.一種組合物，包括根據(jù)項(xiàng)8所述的重組aav病毒粒子和藥學(xué)上可接受的賦形劑。

10.一種在有運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元疾病的受試者中調(diào)節(jié)運(yùn)動(dòng)功能的方法，包括向受試者細(xì)胞給藥治療有效量的根據(jù)項(xiàng)9所述的組合物。

11.一種向有脊髓性肌萎縮(sma)的受試者提供smn蛋白的方法，包括向有需要的受試者細(xì)胞給藥包括根據(jù)項(xiàng)4-7任一項(xiàng)所述的aav載體的重組aav病毒粒子。

12.根據(jù)項(xiàng)10或11任一項(xiàng)所述的方法，其中通過(guò)向小腦深部小腦核的至少一個(gè)區(qū)域給藥來(lái)給藥組合物。

13.根據(jù)項(xiàng)10或11任一項(xiàng)所述的方法，其中通過(guò)直接脊髓注射給藥組合物。

14.根據(jù)項(xiàng)10或11任一項(xiàng)所述的方法，其中通過(guò)腦室內(nèi)注射給藥組合物。

15.根據(jù)項(xiàng)14所述的方法，其中給藥組合物到至少一個(gè)側(cè)腦室。

16.根據(jù)項(xiàng)10或11任一項(xiàng)所述的方法，其中通過(guò)腦室內(nèi)注射和直接脊髓注射給藥組合物。

17.根據(jù)項(xiàng)10或11任一項(xiàng)所述的方法，其中通過(guò)鞘內(nèi)注射給藥組合物。

18.根據(jù)項(xiàng)8所述的重組aav病毒粒子在生產(chǎn)用于在有運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元疾病的受試者中調(diào)節(jié)運(yùn)動(dòng)功能的藥物的用途。

19.包括根據(jù)項(xiàng)4-7任一項(xiàng)所述的aav載體的重組aav病毒粒子在生產(chǎn)用于向有脊髓性肌萎縮(sma)的受試者細(xì)胞提供smn蛋白的藥劑的用途。

附圖說(shuō)明

圖1顯示用aavhsmn1治療相對(duì)未治療的sma小鼠的存活。用aavhsmn1治療增加了sma小鼠的存活。未治療sma小鼠(n＝34，開(kāi)放圓圈)具有15天的壽命中間值。在p0用aavhsmn1治療的sma小鼠(n＝24，閉合圓圈)具有50天的壽命中間值(p<0.0001)，其壽命增加了+233％。

圖2a-2c顯示基因治療治療對(duì)脊髓中smn水平的影響。顯示了與未治療sma和野生型小鼠相比、在腰椎(圖2a)、胸椎(圖2b)和頸椎(圖2c)區(qū)段注射的hsmn蛋白質(zhì)水平。在注射后16、58-66和120-220天進(jìn)行脊髓腰椎、胸椎和頸椎段的免疫印跡。定量來(lái)自三段的免疫印跡，并且，為控制蛋白質(zhì)水平、用β-微管蛋白標(biāo)準(zhǔn)化smn，并以年齡相當(dāng)野生型的百分比做曲線。關(guān)鍵字(以及n值)：sma，未治療的敲除(基因小鼠)(在16天n＝5)；aav，aav8-hsmn治療的sma小鼠(16天，n＝7，在58-66天，n＝5)；scaav，scaav8-hsmn治療的sma小鼠(在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)n＝5)。數(shù)值代表平均值±平均標(biāo)準(zhǔn)誤差。

圖3a-3j顯示在治療和未治療sma小鼠的脊髓運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元中hsmn蛋白的亞細(xì)胞分布和表達(dá)。在轉(zhuǎn)化細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中檢測(cè)到大量的hsmn蛋白(圖3a和3b)。而且，如以插圖中放大的成對(duì)芽(gem-)樣結(jié)構(gòu)(箭頭)所表明，在核中檢測(cè)到hsmn蛋白(圖3a)。還在神經(jīng)元的樹(shù)突(圖3b和3c)和軸突(圖3d)中檢測(cè)到hsmn蛋白。在未治療sma小鼠組織切片中未檢測(cè)到hsmn蛋白(圖3e)。hsmn蛋白(圖3f)和小鼠chat(圖3g)的共定位顯示轉(zhuǎn)化細(xì)胞的亞群是運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元(圖3h和3i)。在16天(白柱)和58-66天(黑柱)測(cè)定了hsmn蛋白免疫陽(yáng)性的chat細(xì)胞的百分比(圖3j)。數(shù)值代表平均值±平均標(biāo)準(zhǔn)誤差。

圖4顯示在治療和未治療sma小鼠脊髓中的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元細(xì)胞數(shù)。顯示了每組在10μm組織切片上計(jì)數(shù)的chat免疫陽(yáng)性神經(jīng)元的平均數(shù)。數(shù)字代表來(lái)自頸椎、胸椎、腰椎和骶段不同水平的每10個(gè)切片的計(jì)數(shù)。數(shù)值代表平均值±平均標(biāo)準(zhǔn)誤差。關(guān)鍵字：*，p<0.05；**，p<0.01；***，p<0.001。

圖5a-5c顯示來(lái)自治療和未治療sma小鼠中肌肉組的肌纖維橫斷面積。aavhsmn1治療增加了來(lái)自多個(gè)肌肉組的肌纖維橫斷面積。來(lái)自16天(圖5a)和58-66天(圖5b)的四頭肌、腓腸肌和肋間肌肉的堆積圖顯示，肌纖維尺寸的分布在治療sma和野生型小鼠間是相似的。在16天總體平均值顯示經(jīng)治療的肌纖維橫斷面積顯著增加(圖5c)。而且，在58-66天，在腓腸肌和肋間肌肉中，治療sma小鼠和年齡相當(dāng)?shù)囊吧椭g的平均面積是統(tǒng)計(jì)學(xué)相似的(圖5c)。數(shù)值代表平均值±平均標(biāo)準(zhǔn)誤差。關(guān)鍵字：wt，未治療野生型；het，未治療雜合體；sma，未治療敲除型；aav，aavhsmn1治療的sma小鼠；*，p<0.05；**，p<0.01；***，p<0.001。

圖6a-6f顯示在治療和未治療sma小鼠肌肉中nmj的結(jié)構(gòu)。在四頭肌、腓腸肌和肋間肌中的結(jié)構(gòu)通過(guò)基因治療得到了改善。顯示了來(lái)自16天未治療sma(圖6a)、治療sma(圖6b)和未治療野生型(圖6c)小鼠、和來(lái)自58-66天治療sma(圖6d)和未治療野生型(圖6e)小鼠的四頭肌神經(jīng)肌接頭(nmj)。分別用神經(jīng)絲蛋白抗體(綠色)和α-金環(huán)蛇毒素染色(紅色)標(biāo)記前突觸和后突觸nmj。在主要組中的箭頭指向下面插圖中重點(diǎn)標(biāo)記的nmj。在每個(gè)動(dòng)物的每種肌肉中隨機(jī)計(jì)數(shù)了至少100個(gè)nmj。正常的nmj被定義為如圖6a所示的具有并未呈現(xiàn)出神經(jīng)絲蛋白異常堆積的前突觸末端。圖6f中的數(shù)值代表平均值±平均標(biāo)準(zhǔn)誤差。關(guān)鍵字：wt，未治療野生型；het，未治療雜合體；sma，未治療敲除型；aav，aavhsmn1治療的sma小鼠；*；p<0.05；**，p<0.01；***，p<0.001。比例尺設(shè)定：20μm。

圖7a-7f顯示了治療和未治療sma小鼠中的行為試驗(yàn)的結(jié)果。治療sma小鼠在行為試驗(yàn)中表現(xiàn)出顯著的改善。治療sma(星號(hào))和未治療野生型(wt)小鼠在16天基本上比未治療sma小鼠(標(biāo)有‘x’)好(圖7a)。從11天及以后，治療sma小鼠比未治療sma對(duì)照明顯更重(圖7b)。在正位反射(圖7c)、負(fù)趨地性(圖7d)、握力(圖7e)和后肢伸展(圖7f)試驗(yàn)中，治療sma小鼠的表現(xiàn)顯著強(qiáng)于未治療sma小鼠。治療sma小鼠在12-16天在正位反射和負(fù)趨地性實(shí)驗(yàn)中與野生型和雜合體小鼠統(tǒng)計(jì)學(xué)上相同(圖7c和7d)。數(shù)值代表平均值±平均標(biāo)準(zhǔn)誤差。關(guān)鍵字：未治療wt(開(kāi)放圓圈)，未治療雜合體(開(kāi)放三角)；未治療sma(開(kāi)放正方形)；aavhsmn1治療的sma小鼠(閉合正方形)；*；p<0.05；**，p<0.01；***，p<0.001。

圖8顯示scaavhsmn1治療和未治療小鼠的存活。用scaavhsmn1治療增加了sma小鼠的存活。在p0用scaavhsmn1治療的sma小鼠(n＝17，閉合三角)具有157天的壽命中間值(p<0.0001)，與之相比未治療sma小鼠為16天(n＝47，開(kāi)放圓圈)。

圖9a-9b(seqidnos：1和2)顯示代表性人運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元生存(smn1)基因的編碼dna序列(圖9a)和對(duì)應(yīng)氨基酸序列(圖9b)。

圖10a-10f顯示scaav8-hsmn表達(dá)增加了sma小鼠的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元計(jì)數(shù)并改善了nmj。圖10a顯示了在注射后16天在胸-腰段與hsmn表達(dá)共定位的mchat免疫陽(yáng)性細(xì)胞的百分比。圖10b-10f顯示在腰椎(圖10b)、胸椎(圖10c)和頸椎段(圖10d)的mchat免疫陽(yáng)性細(xì)胞的平均數(shù)，以及在16、58-66和214-269天在四頭肌(圖10e)和肋間肌肉(圖10f)中的萎縮nmj的平均百分比。作為圖10e和10f的參照，在16天、在未治療sma小鼠的四頭肌和肋間肌肉中75-90％的nmj含有異常萎縮結(jié)構(gòu)(見(jiàn)圖6f)。關(guān)鍵字和n值：sma，未治療敲除型(白柱，在16天n＝8)，aav，aav8-hsmn(陰影柱，在16天n＝8，在58-66天n＝5)；scaav，scaav8-hsmn(黑柱，在每一時(shí)間點(diǎn)n＝5)；wt，未治療wt(方格柱，在16天n＝8，在58-66和216-269天每一個(gè)n＝5)。數(shù)值代表平均值±平均標(biāo)準(zhǔn)誤差。在16天以單向anova和bonferroni多重posthoc分析進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)比較(圖10b-10f)。非配對(duì)雙尾學(xué)生t-檢驗(yàn)比較了1)在16天(圖10a)和58-66天(圖10b-10d)的兩個(gè)載體；2)用scaav8-hsmn治療的在58-66天和214-269天組的相對(duì)chat細(xì)胞數(shù)(圖10b-10d)；3)在214-269天、在年齡相當(dāng)?shù)奈粗委焪t和scaav8-hsmn治療sma小鼠之間的異常nmj相對(duì)數(shù)(e，f)；*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001。

具體實(shí)施方式

除非另外指出，本發(fā)明的實(shí)踐將采用本領(lǐng)域技術(shù)中的常規(guī)化學(xué)、生物化學(xué)、重組dna技術(shù)和免疫學(xué)的方法。這樣的技術(shù)在文獻(xiàn)中有充分解釋。見(jiàn)，例如fundamentalvirology，第二版，vol.i&ii(b.n.fields和d.m.knipe編)；handbookofexperimentalimmunology，vois.i-fv(d.m.weir和cc.blackwell編，blackwellscientificpublications)；t.e.creighton，proteins:structuresandmolecularproperties(w.h.freeman和company，1993)；a.l.lehninger，biochemistry(worthpublishers,inc.，currentaddition)；sambrook,等，molecularcloning:alaboratorymanual(第2版，1989)；methodsinenzymology(s.colowick和n.kaplan編，academicpress,inc.)。

所有在此引用的文獻(xiàn)、專(zhuān)利和專(zhuān)利申請(qǐng)，無(wú)論在前還是在后，都以其全部?jī)?nèi)容引入在本文中作為參考。

1.定義

在本發(fā)明描述中，將使用以下術(shù)語(yǔ)，旨在定義為如下所示。

必須注意到，除非內(nèi)容另外清晰指明，在此說(shuō)明書(shū)和附加權(quán)利要求中所用的單數(shù)形式“a”、“an”和“the”包括復(fù)數(shù)指代。因此，例如，“白細(xì)胞介素受體”包括兩個(gè)或多個(gè)這種受體的混合物，等等。

在此可互換使用的術(shù)語(yǔ)“多肽”和“蛋白質(zhì)”、或編碼其的核苷酸序列分別指蛋白質(zhì)和核苷酸序列，其代表天然序列、其變體或其片段。只要蛋白質(zhì)保持所需要的活性，全長(zhǎng)蛋白質(zhì)(無(wú)論有沒(méi)有信號(hào)序列)、其片段、以及帶有天然序列修飾(如(性質(zhì)上保守的或非保守的)缺失、添加及替換)的蛋白質(zhì)均可在此使用。這些修飾可以是蓄意的(如通過(guò)定點(diǎn)突變)、或者可以是偶然的(如通過(guò)生產(chǎn)蛋白質(zhì)的宿主的突變或者由于pcr擴(kuò)增錯(cuò)誤)。因而，基本上與親代序列同源的活性蛋白質(zhì)，如具有保持天然分子所需活性的70％...80％...85％...90％...95％...98％...99％等的同源性的蛋白質(zhì)，被涵蓋在此使用。

“天然”多肽，如運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元生存(smn)多肽，指與來(lái)源于天然的相應(yīng)分子具有相同氨基酸序列的多肽。此天然序列能從自然中分離、或者通過(guò)重組或合成的方法生產(chǎn)。術(shù)語(yǔ)“天然”序列特別地包含自然發(fā)生的特定分子的截短或分泌形式(如細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域序列)、自然發(fā)生的變體形式(如可選剪接形式)和自然發(fā)生的多肽的等位基因變體。在本發(fā)明的各種實(shí)施方案中，在此公開(kāi)的天然分子是包括如附圖所示全長(zhǎng)氨基酸序列的成熟或全長(zhǎng)天然序列。然而，盡管附圖中公開(kāi)的一些分子以在圖中指定的氨基酸位置1的蛋氨酸殘基開(kāi)始，對(duì)于特定分子，可以使用圖中位于氨基酸位置1上游或下游的其他蛋氨酸殘基作為起始氨基酸殘基?？蛇x地，根據(jù)使用的表達(dá)系統(tǒng)，在此所述的分子可能缺少n末端蛋氨酸殘基。

通過(guò)“變體”意指在此所定義的活性多肽，其與相應(yīng)的全長(zhǎng)天然序列、缺少信號(hào)肽的多肽、多肽的細(xì)胞外區(qū)域、有或無(wú)信號(hào)肽、或者在此公開(kāi)的全長(zhǎng)多肽序列的任何其他片段具有至少大約80％的氨基酸序列同源性。此類(lèi)多肽變體包括(例如)在全長(zhǎng)天然氨基酸序列的n和/或c末端增加或刪除一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基的多肽。通常地，變體與相應(yīng)全長(zhǎng)天然序列相比，具有至少大約80％的氨基酸序列同源性、或者至少大約81％的氨基酸序列同源性、或者至少大約82％的氨基酸序列同源性、或者至少大約83％的氨基酸序列同源性、或者至少大約84％的氨基酸序列同源性、或者至少大約85％的氨基酸序列同源性、或者至少大約86％的氨基酸序列同源性、或者至少大約87％的氨基酸序列同源性、或者至少大約88％的氨基酸序列同源性、或者至少大約89％的氨基酸序列同源性、或者至少大約90％的氨基酸序列同源性、或者至少大約91％的氨基酸序列同源性、或者至少大約92％的氨基酸序列同源性、或者至少大約93％的氨基酸序列同源性、或者至少大約94％的氨基酸序列同源性、或者至少大約95％的氨基酸序列同源性、或者至少大約96％的氨基酸序列同源性、或者至少大約97％的氨基酸序列同源性、或者至少大約98％的氨基酸序列同源性、或者至少大約99％的氨基酸序列同源性。通常地，變體多肽長(zhǎng)度是至少大約10個(gè)氨基酸，如至少大約20個(gè)氨基酸、例如至少大約30個(gè)氨基酸、或者至少大約40個(gè)氨基酸、或者至少大約50個(gè)氨基酸、或者至少大約60個(gè)氨基酸、或者至少大約70個(gè)氨基酸、或者至少大約80個(gè)氨基酸、或者至少大約90個(gè)氨基酸、或者至少大約100個(gè)氨基酸、或者至少大約150個(gè)氨基酸、或者至少大約200個(gè)氨基酸、或者至少大約300個(gè)氨基酸、或更多。

特別優(yōu)選的變體包括性質(zhì)保守的替換，即，在其副鏈相關(guān)的氨基酸家族發(fā)生的那些替換。特別地，氨基酸通常被分為四個(gè)家族：(1)酸性的—天冬氨酸和谷氨酸；(2)堿性的—賴(lài)氨酸、精氨酸、組氨酸；(3)非極性的—丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、色氨酸；和(4)非帶電、極性的—甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸。苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸有時(shí)被分類(lèi)在芳香族氨基酸。例如，能合理預(yù)期分開(kāi)地用異亮氨酸或纈氨酸置換亮氨酸、用谷氨酸置換天冬氨酸、用絲氨酸置換蘇氨酸、或用結(jié)構(gòu)相關(guān)的氨基酸置換氨基酸的類(lèi)似保守性置換，將不會(huì)對(duì)生物活性有較大的影響。例如，目標(biāo)多肽可以包括多至大約5-10個(gè)保守的或非保守的氨基酸替換、或者甚至多至約15-25或50個(gè)保守或非保守氨基酸替換、或者5-50間的任何數(shù)字，只要分子所需的功能保持完整。

"同源性"指兩個(gè)多核苷酸或兩個(gè)多肽部分之間的百分比同源性。當(dāng)在分子的限定長(zhǎng)度上、兩個(gè)dna或兩個(gè)多肽序列呈現(xiàn)至少大約50％、優(yōu)選至少大約75％、更優(yōu)選至少大約80％-85％、優(yōu)選至少大約90％、最優(yōu)選至少大約95％-98％序列同源性時(shí)，其相互間為“實(shí)質(zhì)上同源的”。如在此所用的，實(shí)質(zhì)上同源也指序列相對(duì)于特定dna或多肽序列表現(xiàn)為完全同源性。

通常，“同源性”意指兩個(gè)多核苷酸或多肽序列的分別的核苷酸-核苷酸或氨基酸-氨基酸的確切一致性。能夠通過(guò)比對(duì)序列、計(jì)數(shù)兩個(gè)被比對(duì)序列間匹配的確切數(shù)字、除以較短序列的長(zhǎng)度、并將結(jié)果乘以100，直接比較兩個(gè)分子間的序列信息以確定百分比同源性。能使用容易得到的的計(jì)算機(jī)程序輔助分析，如align，dayhoff,m.o.inatlasofproteinsequenceandstructurem.o.dayhoff編，5suppl.3：353-358，nationalbiomedicalresearchfoundation，washington，dc，其采用了smith和waterman的advancesinappl.math.2：482-489，1981中用于肽分析的局部同源性算法。用于確定核苷酸序列同源性的程序在wisconsin序列分析軟件包(wisconsinsequenceanalysispackage，第8版，來(lái)自geneticscomputergroup,麥迪遜，威斯康辛州)中可以獲得，例如bestfit、fasta和gap程序，其也依賴(lài)于smith和waterman算法。這些程序可以用制造商推薦的缺省參數(shù)很容易地使用，并在上述的wisconsin序列分析軟件包有所描述。例如，使用以缺省計(jì)分表格和六個(gè)核苷酸位置的空隙罰分的smith和waterman同源性算法能確定相對(duì)參照序列的特定核苷酸序列的百分比同源性。

在本發(fā)明上下文中建立百分比同源性的另一方法是使用愛(ài)丁堡大學(xué)版權(quán)的、由johnf.collins和shanes.sturrok開(kāi)發(fā)的、由intelligenetics,inc.(mountainview，加利福尼亞州)公司發(fā)布的mpsrch程序軟件包。從這個(gè)軟件包組件能使用smith-waterman算法，其中缺省參數(shù)被用于計(jì)分表格(例如，空隙開(kāi)放罰分為12、空隙延長(zhǎng)罰分為1、及空隙為6)。從數(shù)據(jù)生成的“匹配”值反映了“序列同源性”。用于計(jì)算序列間百分比同源性或相似度的其他合適的程序是本領(lǐng)域公知的，例如，另一比對(duì)程序是blast，以缺省參數(shù)使用。例如，能夠用以下缺省參數(shù)使用blastn和blastp：基因代碼＝標(biāo)準(zhǔn)；過(guò)濾＝無(wú)；鏈＝兩條；截?cái)嘀担?0；預(yù)期＝10；矩陣＝blosum62；說(shuō)明＝50個(gè)序列；分類(lèi)用＝高分值；數(shù)據(jù)庫(kù)＝非冗余的，基因庫(kù)+embl+ddbj+pdb+基因庫(kù)cds翻譯+swiss蛋白質(zhì)+spupdate+pir。這些程序的細(xì)節(jié)為本領(lǐng)域熟知。

可選地，能通過(guò)在同源性區(qū)域間形成穩(wěn)定雙鏈的條件下雜交、隨后用單鏈特異性核酸酶消化、確定消化片段的大小來(lái)確定同源性?？稍诶鐬樘囟ㄏ到y(tǒng)定義的嚴(yán)謹(jǐn)條件下、在southern雜交實(shí)驗(yàn)中鑒定實(shí)質(zhì)上同源的dna序列。限定合適的雜交條件在本領(lǐng)域技術(shù)的范圍內(nèi)。見(jiàn)，例如sambrook等，上述；dnacloning，上述；nucleicacidhybridization，上述。

通過(guò)術(shù)語(yǔ)“退化變體”指在其核苷酸序列中含有變化的多核苷酸，該多核苷酸編碼與退化變體源自的多核苷酸編碼的多肽具有相同氨基酸序列的多肽。

“編碼序列”或“編碼”所選多肽的序列是當(dāng)位于適當(dāng)調(diào)節(jié)序列的控制下在體內(nèi)轉(zhuǎn)錄(在dna的情況下)和翻譯(在mrna的情況下)成多肽的核酸分子。通過(guò)5’(氨基)端的起始密碼和3’(羧基)端的翻譯終止子確定編碼序列的邊界。轉(zhuǎn)錄終止序列可位于編碼序列的3’端。

通過(guò)“載體”指任何遺傳因素，如質(zhì)粒、噬菌體、轉(zhuǎn)座子、粘粒、染色體、病毒、病毒粒子等，當(dāng)其與適當(dāng)?shù)目刂瞥煞窒噙B時(shí)能夠復(fù)制，并能夠?qū)⒒蛐蛄修D(zhuǎn)移至細(xì)胞。因此，術(shù)語(yǔ)包含克隆和表達(dá)載體，如病毒載體。

通過(guò)“重組載體”指包括能夠在體內(nèi)表達(dá)的異源核酸序列的載體。

通過(guò)“重組病毒”指被遺傳改變(例如通過(guò)向顆粒中添加或插入異源核酸構(gòu)建體)的病毒。

術(shù)語(yǔ)“轉(zhuǎn)基因”指被引入細(xì)胞中并能夠在適當(dāng)?shù)臈l件下轉(zhuǎn)錄成rna，并且可選地翻譯和/或表達(dá)的多核苷酸。一方面，它賦予引入它的細(xì)胞所需的性質(zhì)，或在其他方面導(dǎo)致期望的治療或診斷結(jié)果。

用于指病毒滴度的術(shù)語(yǔ)“基因組顆粒(gp)”或“基因組等同物”，指不考慮感染性和功能的含有重組aavdna基因組的病毒粒子的數(shù)量?？赏ㄟ^(guò)文中實(shí)施例或例如clark等，hum.genether.(1999)10：1031-1039；和veldwijk等，mol.ther.(2002)6：272-278所述的步驟測(cè)定在特定載體制備物中的基因組顆粒的數(shù)量。

用于指病毒滴度的術(shù)語(yǔ)“感染單位(iu)”、“感染性顆粒”或“復(fù)制單位”，指通過(guò)例如mclaughlin等，j.virol.(1988)62：1963-1973所述的感染中心分析(也被稱(chēng)為復(fù)制中心分析)測(cè)定的感染性重組aav載體顆粒的數(shù)量。

用于指病毒滴度的術(shù)語(yǔ)“轉(zhuǎn)化單位(tu)”，指導(dǎo)致如本文實(shí)施例中或例如xiao等，exp.neurobiol.(1997)144：113-124；或fisher等，j.virol.(1996)70：520-532(lfu分析)所述的功能分析中測(cè)定的功能性轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物生產(chǎn)的感染性重組aav載體顆粒的數(shù)量。

術(shù)語(yǔ)“轉(zhuǎn)染”用來(lái)指細(xì)胞吸收外源dna，當(dāng)外源dna已被引入細(xì)胞膜內(nèi)部時(shí)，細(xì)胞被“轉(zhuǎn)染”。通常許多轉(zhuǎn)染技術(shù)在本領(lǐng)域中已知。見(jiàn)，例如graham等(1973)virology，52：456，sambrook等(1989)molecularcloning,alaboratorymanual,coldspringharborlaboratories，紐約，davis等(1986)basicmethodsinmolecularbiology，elsevier,和chu等(1981)gene13：197。能使用此類(lèi)技術(shù)向適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞內(nèi)引入一個(gè)或多個(gè)外源dna部分。

術(shù)語(yǔ)“異源的”當(dāng)其涉及如編碼序列和控制序列的核酸序列時(shí)，其指通常不連接在一起、和/或通常與特定細(xì)胞不相關(guān)的序列。因此，核酸構(gòu)建體或載體的“異源的”區(qū)域是另一個(gè)核苷酸分子內(nèi)或與其連接的核酸片段，其通常與自然界中另外的分子不相關(guān)。例如，核酸構(gòu)建體的異源區(qū)域能夠包括以自然界中編碼序列不相關(guān)序列為側(cè)翼的編碼序列。異源編碼序列的另一例子是構(gòu)建體，其編碼序列自身不存在于自然(如具有不同于天然基因的密碼子的合成序列)。相似地，為了本發(fā)明的目的，用通常不存在于細(xì)胞的構(gòu)建體轉(zhuǎn)染的細(xì)胞被認(rèn)為是異源的。如在此所用，等位基因變異或天然發(fā)生突變事件不產(chǎn)生異源dna。

“核酸”序列指dna或rna序列。術(shù)語(yǔ)捕獲的序列包括任何已知的dna和rna堿基類(lèi)似物，如但不局限于4-乙酰胞嘧啶、8-羥基-n6-甲基腺苷、氮丙定基胞嘧啶、假異胞嘧啶、5-(羧基羥基甲基)尿嘧啶、5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-羧甲基氨基甲基-2-硫脲嘧啶、5-羧甲基-氨基甲基尿嘧啶、二氫尿嘧啶、肌酐、n6-異戊烯腺嘌呤、1-甲基腺嘌呤、1-甲基假尿嘧啶、1-甲基鳥(niǎo)嘌呤、1-甲基次黃嘌呤苷、2,2-二甲基-鳥(niǎo)嘌呤、2-甲基腺嘌呤、2-甲基鳥(niǎo)嘌呤、3-甲基-胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、n6-甲基腺嘌呤、7-甲基鳥(niǎo)嘌呤、5-甲基氨基甲基尿嘧啶、5-甲氧基-氨基-甲基-2-硫脲嘧啶、β-d-甘露糖苷q核苷、5'-甲氧基羰基甲基尿嘧啶、5-甲氧基尿嘧啶、2-甲硫基-n6-異戊烯腺嘌呤、尿嘧啶-5-氧乙酸甲酯、尿嘧啶-5-氧乙酸、oxybutoxosine(無(wú)中譯文)、假尿嘧啶、q核苷、2-巰基胞嘧啶、5-甲基-2-硫脲嘧啶、2-硫脲嘧啶、4-硫脲嘧啶、5-甲基尿嘧啶、-尿嘧啶-5-氧乙酸甲酯、尿嘧啶-5-氧乙酸、假尿嘧啶、q核苷、2-巰基胞嘧啶和2、6-二氨基嘌呤。

術(shù)語(yǔ)dna“控制序列”總體指啟動(dòng)子序列、多腺苷酸化信號(hào)、轉(zhuǎn)錄終止序列、上游調(diào)控區(qū)、復(fù)制起始點(diǎn)、內(nèi)部核糖體進(jìn)入部位(“ires”)、增強(qiáng)子、等等，其共同地在受體細(xì)胞提供編碼序列的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和翻譯。只要被選定的編碼序列能在適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞內(nèi)被復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和翻譯，并不總是需要所有這些控制系列都存在。

此處所用的術(shù)語(yǔ)“啟動(dòng)子”在其一般意義上指含有dna調(diào)控序列的核苷酸區(qū)域，其中調(diào)控序列來(lái)自能夠結(jié)合rna聚合酶并啟動(dòng)下游(3’方向)編碼序列轉(zhuǎn)錄的基因。轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子能包括“誘導(dǎo)型啟動(dòng)子”(其中有效連接至啟動(dòng)子的多核苷酸序列的表達(dá)是被分析物、輔因子、調(diào)控蛋白質(zhì)等誘導(dǎo))、“抑制型啟動(dòng)子”(其中有效連接至啟動(dòng)子的多核苷酸序列的表達(dá)是被分析物、輔因子、調(diào)控蛋白質(zhì)等誘導(dǎo))、和“組成型啟動(dòng)子”。

“有效連接”指元素的排列，其中所述成分如此配置以完成它們的常規(guī)功能。因此，有效連接至編碼序列的調(diào)控序列能夠影響編碼序列的表達(dá)。調(diào)控序列不需要與編碼序列連續(xù)，只要其能發(fā)揮功能指導(dǎo)編碼序列的表達(dá)。因此，例如，插入的未翻譯但轉(zhuǎn)錄的序列可以存在于啟動(dòng)子序列和編碼序列之間，而啟動(dòng)子序列仍被認(rèn)為是“有效連接”至編碼序列。

術(shù)語(yǔ)“神經(jīng)系統(tǒng)”包括中樞神經(jīng)系統(tǒng)和外周神經(jīng)系統(tǒng)。術(shù)語(yǔ)“中樞神經(jīng)系統(tǒng)”或“cns”包括脊椎動(dòng)物的腦和脊髓的所有細(xì)胞和組織。術(shù)語(yǔ)“外周神經(jīng)系統(tǒng)”指腦和脊髓外的神經(jīng)系統(tǒng)部分的所有細(xì)胞和組織。因此，術(shù)語(yǔ)“神經(jīng)系統(tǒng)”包括但不局限于神經(jīng)細(xì)胞、膠質(zhì)細(xì)胞、星狀細(xì)胞、腦脊液(csf)中的細(xì)胞、間質(zhì)間隙中的細(xì)胞、脊髓保護(hù)膜中的細(xì)胞、硬腦膜外細(xì)胞(即，硬腦膜外的細(xì)胞)、與神經(jīng)組織相鄰的或接觸的或被神經(jīng)組織支配的非神經(jīng)組織中的細(xì)胞、在神經(jīng)外膜、神經(jīng)束膜、神經(jīng)內(nèi)膜、索、神經(jīng)束中的細(xì)胞，等等。

用于本發(fā)明目的的“活性的”或“活性”指保持相應(yīng)的天然的或天然發(fā)生的多肽生物活性的治療性蛋白質(zhì)的形式?；钚钥梢源笥凇⒌扔诨蛐∮谙鄳?yīng)的天然的或天然發(fā)生的多肽所觀察到的活性。

當(dāng)指核酸序列時(shí)，通過(guò)“分離的”指指定的分子存在于基本上無(wú)相同類(lèi)型的其他生物大分子的情況下。因此，“編碼特定多肽的分離的核酸分子”指該核酸分子實(shí)質(zhì)上不含不編碼目標(biāo)多肽的其他核酸分子；然而，分子可以包括一些額外的不有害影響組合物基本特性的堿基或部分。

為描述在本申請(qǐng)中在特定核酸分子中核苷酸序列的相對(duì)位置，如，當(dāng)特定核苷酸序列被描述為位于相對(duì)另外一個(gè)序列的“上游”、“下游”、“3-端(3’)”或“5-端(5’)”時(shí)，應(yīng)當(dāng)理解，如本領(lǐng)域中常規(guī)所指的，其指在dna分子的“正義”或“編碼”鏈中序列的位置。

術(shù)語(yǔ)“大約”，特別是在指給定的量時(shí)，指包含正或負(fù)5％的偏差。

術(shù)語(yǔ)“受試者”、“個(gè)體”或“患者”在此可以互換使用，指脊椎動(dòng)物、優(yōu)選哺乳動(dòng)物。哺乳動(dòng)物包括但不局限于小鼠、嚙齒類(lèi)、猿類(lèi)、人類(lèi)、耕作動(dòng)物、運(yùn)動(dòng)動(dòng)物和寵物。

在此應(yīng)用的術(shù)語(yǔ)“調(diào)節(jié)”指改變效果或結(jié)果的數(shù)量或強(qiáng)度，如增強(qiáng)、增加、減少、減小或消除。

如在此應(yīng)用的，術(shù)語(yǔ)“改善”與“緩和”是同義詞，指減少或減輕。例如，人們可以通過(guò)使疾病或疾病的癥狀更不嚴(yán)重來(lái)改善疾病或病的癥狀。

如文中提供的，術(shù)語(yǔ)“治療性”、“有效劑量”或“治療有效劑量”組合物或制劑，指足夠劑量的組合物或制劑以提供所需反應(yīng)，如預(yù)防、延遲發(fā)生或減輕受試者的癥狀或獲得所需的生物效果，如糾正神經(jīng)疾病(例如與運(yùn)動(dòng)神經(jīng)疾病如脊髓性肌萎縮(sma)相關(guān)的細(xì)胞病理)。術(shù)語(yǔ)“治療性糾正”指導(dǎo)致預(yù)防或延遲發(fā)生或減輕受試者體內(nèi)癥狀的糾正程度。所需的確切量根據(jù)受試者不同而不同，依賴(lài)于受試者的物種、年齡和概況、需要治療疾病的嚴(yán)重程度、及特定目標(biāo)大分子、給藥模式等等。本領(lǐng)域技術(shù)人員使用常規(guī)實(shí)驗(yàn)可以確定任何個(gè)體案例中適當(dāng)?shù)摹坝行А绷俊?/p>

“治療”或“治療”特定疾病包括：(1)預(yù)防疾病，即，預(yù)防疾病的發(fā)展或?qū)е略诳赡鼙┞队诨蛞最净技膊〉€沒(méi)有經(jīng)歷或表現(xiàn)疾病癥狀的受試者體內(nèi)發(fā)生的疾病程度較輕；(2)抑制疾病，即，阻滯疾病發(fā)展或逆轉(zhuǎn)疾病狀態(tài)；或(3)減輕疾病的癥狀，即，降低受試者經(jīng)歷癥狀的數(shù)量、以及改變與疾病相關(guān)的細(xì)胞病理。

2.執(zhí)行發(fā)明的方式

在詳細(xì)描述本發(fā)明之前，應(yīng)當(dāng)理解本發(fā)明不局限于特定的成分或過(guò)程參數(shù)，當(dāng)然就其本身而言是可以變動(dòng)的。還應(yīng)當(dāng)理解文中應(yīng)用的術(shù)語(yǔ)僅僅是為了描述發(fā)明特定的實(shí)施方案，而并無(wú)意于限制。

盡管在本發(fā)明的實(shí)踐中能夠使用許多類(lèi)似于或等同于在此描述的方法和材料，在此描述了優(yōu)選的材料和方法。

本發(fā)明的核心是發(fā)現(xiàn)向脊髓性肌萎縮(sma)的侵略性小鼠模型的cns傳遞含有人運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元生存1(hsmn1)cdna的raav病毒粒子產(chǎn)生了遍布脊髓的smn1的表達(dá)。治療的sma小鼠比未治療的、年齡相當(dāng)?shù)耐蛔冃秃懈邤?shù)量的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元。另外，肌纖維大小的評(píng)估證明，來(lái)自治療的sma小鼠的不同肌肉群的單獨(dú)肌纖維的大小與野生型小鼠中觀察到的那些接近。而且，在治療sma小鼠中神經(jīng)肌接頭(nmj)結(jié)構(gòu)與野生型小鼠相似，與之相反，未治療的sma小鼠在前突觸末端表現(xiàn)出神經(jīng)絲蛋白的異常聚集。治療的sma小鼠還在許多行為試驗(yàn)中表現(xiàn)出顯著的改善，說(shuō)明nmj具有功能。重要的是，重組aav治療小鼠與其未治療對(duì)應(yīng)物相比具有顯著延長(zhǎng)的壽命。甚至與用常規(guī)的、非自身互補(bǔ)raav載體治療相比，用自身互補(bǔ)raav載體治療的sma小鼠也表現(xiàn)出生存中值的驚人改善。

這些結(jié)果表明，cns定向、aav介導(dǎo)的smn1基因增加在治療sma的神經(jīng)和肌肉病變方面是非常有效的，證實(shí)了應(yīng)用病毒基因治療作為治療方案用于治療和預(yù)防神經(jīng)和肌肉病變(如sma、以及影響運(yùn)動(dòng)功能的其他疾病)。在此描述的基因治療技術(shù)可以單獨(dú)應(yīng)用，或者與傳統(tǒng)藥物聯(lián)合應(yīng)用。

為了進(jìn)一步理解本發(fā)明，以下提供關(guān)于運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元病理和治療性分子的詳細(xì)討論，以及用于本發(fā)明的各種基因傳遞方法。

運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元病理和治療性分子

本發(fā)明主旨提供了調(diào)節(jié)、糾正或增加具有運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元疾病或運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元損傷的受試者的運(yùn)動(dòng)功能的組合物和方法。僅為了說(shuō)明目的，受試者可能患有一種或多種脊髓性肌萎縮(sma)、肌萎縮性側(cè)索硬化癥(als)、延髓肌肉萎縮癥、脊髓小腦共濟(jì)失調(diào)、原發(fā)性側(cè)索硬化(pls)、或外傷性脊髓損傷。不受特定理論約束，與運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元損傷相關(guān)的病理可以包括皮質(zhì)脊髓束和脊神經(jīng)前根中的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元退行、神經(jīng)膠質(zhì)增生、神經(jīng)絲蛋白異常、有髓纖維損失。例如，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了兩種類(lèi)型的發(fā)?。河绊懮线\(yùn)動(dòng)神經(jīng)元(皮質(zhì)和腦干運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元)的延髓發(fā)病，影響面部肌肉、說(shuō)話和吞咽；和影響下部運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元(脊髓運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元)的四肢發(fā)病，反映為痙攣、全身虛弱、肌肉萎縮、麻痹和呼吸衰竭。在als中,受試者既有延髓又有四肢發(fā)病。在pls中,受試者僅有延髓發(fā)病。

因此,在某些實(shí)施方案中，向受試者提供編碼生物活性分子的raav構(gòu)建體，其在cns中表達(dá)導(dǎo)致了至少部分糾正神經(jīng)病理和/或穩(wěn)定疾病進(jìn)展，如預(yù)防、延緩發(fā)病或減輕受試者的癥狀或獲得所需的生物效果，包括例如與上述運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元疾病相關(guān)的細(xì)胞病理的改變。

通過(guò)實(shí)施例的方式，raav構(gòu)建體中存在的轉(zhuǎn)基因可以是(但不局限于)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元生存蛋白(通過(guò)smn1基因或smn2基因)、胰島素生長(zhǎng)因子(igf-1)、鈣結(jié)合蛋白d28、微清蛋白、hif1-α、sirt-2,、vegf如vegf165、cntf(睫狀神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子)、音猬因子(shh)、紅細(xì)胞生成素(epo)、賴(lài)氨酰氧化酶(lox)、原顆粒體蛋白、催乳素、生長(zhǎng)素釋放肽、神經(jīng)絲抑蛋白、血管生成素、和胎盤(pán)催乳素。

sma(一種常染色體隱性遺傳神經(jīng)肌肉疾病)的分子基礎(chǔ)是運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元生存基因1(smnl)的雜合缺失，其也被稱(chēng)為smn端粒型。在人體內(nèi)發(fā)現(xiàn)一個(gè)smn1基因幾乎同樣的拷貝(稱(chēng)為smn2，其也被稱(chēng)為smn著絲粒型)，并且調(diào)節(jié)疾病嚴(yán)重程度。正常smn1基因的表達(dá)單獨(dú)導(dǎo)致運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元生存(smn)蛋白的表達(dá)。smn2基因表達(dá)導(dǎo)致大約10-20％的smn蛋白和80-90％不穩(wěn)定的/無(wú)功能的smnδ7蛋白。僅有10％的smn2轉(zhuǎn)錄物編碼與smn1相同的功能性全長(zhǎng)蛋白。兩種基因間的這個(gè)功能區(qū)別來(lái)自翻譯沉默性突變，然而其破壞了導(dǎo)致外顯子7在多數(shù)smn2轉(zhuǎn)錄物中遺漏的外顯子剪接增強(qiáng)子。smn蛋白在剪接體組裝中起到已確定的作用，而且還可以介導(dǎo)神經(jīng)元的軸突和神經(jīng)末梢中的mrna運(yùn)輸。

各種smn1分子和smn蛋白的核苷酸和氨基酸序列是已知的。見(jiàn)，例如，圖9a-9b；ncbi登錄號(hào)nm_000344(人)、np_000335(人)、nm_011420(小鼠)、eu791616(豬)、nm_001131470(猩猩)、nm_131191(斑馬魚(yú))、bc062404(大鼠)、nm_001009328(貓)、nm_001003226(狗)、nm_175701(奶牛)。相似地，各種smn2序列是已知的。見(jiàn)，例如ncbi登錄號(hào)nm_022876、nm_022877、nm_017411、ng_008728、bc_000908、bc070242、dq185039(均為人)。

由于其在不同水平軸索中的多種作用，胰島素樣生長(zhǎng)因子(igf-i)是治療包括運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元疾病的神經(jīng)退行疾病的治療性蛋白質(zhì)(見(jiàn)dore等，trendsneurosci(1997)20：326-331)。例如，在腦中它被認(rèn)為降低了神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)的凋亡，保護(hù)神經(jīng)元免遭鐵、秋水仙堿、鈣去穩(wěn)定劑、過(guò)氧化物和細(xì)胞因子的毒性。其還可以調(diào)節(jié)乙酰膽堿和谷氨酸神經(jīng)遞質(zhì)的釋放，并且誘導(dǎo)神經(jīng)絲蛋白、微管蛋白和鞘磷脂堿性蛋白的表達(dá)。在脊髓中，igf-i被認(rèn)為調(diào)節(jié)chat的活性并減輕膽堿能表型的缺失、增強(qiáng)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元出芽、增強(qiáng)髓鞘形成、抑制脫髓鞘、刺激運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元從前體細(xì)胞的增殖和分化、及促進(jìn)神經(jīng)膜細(xì)胞分裂、成熟和生長(zhǎng)。在肌肉中，igf-1顯示誘導(dǎo)乙酰膽堿受體聚集物在神經(jīng)肌接頭處形成、并增加神經(jīng)肌肉功能和肌肉強(qiáng)度。

igf-i基因具有復(fù)雜的結(jié)構(gòu)，其在本領(lǐng)域是公知的。其具有至少兩個(gè)來(lái)自基因轉(zhuǎn)錄子的可變剪接mrna產(chǎn)物。有一個(gè)153個(gè)氨基酸的肽，已知有包括igf-ia或igf-iea的多個(gè)命名,并且有一個(gè)195個(gè)氨基酸的肽,已知有包括igf-ib或igf-ieb的多個(gè)命名。eb形式在人類(lèi)也被稱(chēng)為ec。igf-i的成熟形式是70個(gè)氨基酸的多肽。igf-iea和igf-ieb都含有70個(gè)氨基酸的成熟肽,然而其碳末端延伸的序列和長(zhǎng)度不同。igf-i蛋白，以及igf-iea和igf-ieb的肽序列是已知的，并且在例如國(guó)際申請(qǐng)?zhí)杦o2007/146046中有所描述，在此以其整體引入作為參考。人igf-i的基因組和功能cdna，以及關(guān)于igf-i基因及其產(chǎn)物的其他信息在unigene登錄號(hào)nm_000618中能夠得到。

鈣結(jié)合蛋白d28k(也稱(chēng)為鈣結(jié)合蛋白d28)和微清蛋白是被認(rèn)為涉及鈣緩沖的鈣結(jié)合蛋白。不受特定理論約束，鈣平衡看起來(lái)在具有運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元疾病(例如，als)的受試者中被改變，并且低水平的鈣結(jié)合蛋白-d28k和/或微清蛋白可以通過(guò)降低其處理增加的鈣負(fù)荷的能力增加運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的易損傷性。這種降低可導(dǎo)致細(xì)胞損傷和最終的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元死亡。進(jìn)一步的證據(jù)表明，富含鈣結(jié)合蛋白質(zhì)(如鈣結(jié)合蛋白d28k和微清蛋白)的神經(jīng)元可抵抗退行。

hif-i是一種雜合二聚體蛋白質(zhì)，其由兩個(gè)亞單位組成：(i)一個(gè)組成型表達(dá)的β亞單位，也稱(chēng)為芳烴核轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(arnt)(其被其他相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子共享(例如,二噁英/芳烴受體(dr/ahr))；和(ii)一個(gè)α亞單位(見(jiàn),例如國(guó)際公開(kāi)號(hào)wo96/39426，其描述了最近的hif-iα的親和純化和分子克隆。兩個(gè)亞單位均為堿性螺旋-嚕撲-螺旋(bhlh)-pas家族轉(zhuǎn)錄因子的成員。這些結(jié)構(gòu)域調(diào)控dna結(jié)合和二聚化。轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域位于蛋白質(zhì)的c-末端。堿性區(qū)域由大約15個(gè)主要的負(fù)責(zé)直接dna結(jié)合的堿性氨基酸組成。這個(gè)區(qū)域臨近兩個(gè)兩親性α螺旋，被不同長(zhǎng)度的嚕撲所分開(kāi)，其形成了家族成員間主要的二聚體界面(moore等，proc.natl.acad.sci.usa(2000)97：10436-10441)。pas結(jié)構(gòu)域包含200-300個(gè)氨基酸，其含有大約50個(gè)氨基酸的兩個(gè)松散保守的主要疏水區(qū)，被命名為pasa和pasb。hif-iα亞單位在含氧量正常的條件中不穩(wěn)定，在正常的含氧水平下在培養(yǎng)細(xì)胞中高表達(dá)此亞單位能誘導(dǎo)通常被缺氧誘導(dǎo)的基因表達(dá)。用來(lái)自轉(zhuǎn)錄激活蛋白(如單純皰疹病毒(hsv)vp16、nfκb或酵母轉(zhuǎn)錄因子gal4和gcn4)的強(qiáng)反式激活結(jié)構(gòu)域替代缺氧誘導(dǎo)因子蛋白的c末端(或反式激活)區(qū)域，被設(shè)計(jì)用來(lái)穩(wěn)定含氧量正常條件下的蛋白質(zhì)，并提供強(qiáng)組成型轉(zhuǎn)錄激活。見(jiàn)，例如，國(guó)際文獻(xiàn)號(hào)wo2008/042420中關(guān)于代表性穩(wěn)定缺氧誘導(dǎo)因子蛋白的描述和序列，該缺氧誘導(dǎo)因子蛋白是由來(lái)自hif-lα的dna結(jié)合和二聚體結(jié)構(gòu)域和來(lái)自hsvvp16蛋白的反式激活結(jié)構(gòu)域組成的雜合/嵌合融合蛋白質(zhì)，在此以其整體引入作為參考。還見(jiàn)，美國(guó)專(zhuān)利號(hào)6,432,927和7,053,062關(guān)于組成型穩(wěn)定雜合體hif-iα的描述，此兩篇在此以其整體引入作為參考。

血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vefg)家族的成員屬于最有效的血管生物學(xué)調(diào)節(jié)劑。它們調(diào)節(jié)血管發(fā)生、血管生成以及血管維持。已描述了vegf的四種不同分子變體。165個(gè)氨基酸的變體是在正常細(xì)胞和組織中發(fā)現(xiàn)的主要分子形式。還已知豐度較低的、在116和159位之間刪除44個(gè)氨基酸的較短形式(vegf121)、在116位添加了24個(gè)堿性殘基的較長(zhǎng)形式(vegf189)、以及具有41個(gè)氨基酸插入的另一較長(zhǎng)形式(vegf206，其包括vegf189中發(fā)現(xiàn)的24氨基酸的插入)。vegf121和vegf165是可溶蛋白質(zhì)。vegf189和vegf206看起來(lái)是與細(xì)胞最相關(guān)的。vegf的所有版本是有生物活性的。見(jiàn)，例如tischer等，j.biol.chem.(1991)266：11947-11954，描述了vegf165(也見(jiàn)genbank登錄號(hào)ab021221)、vegf121(也見(jiàn)genbank登錄號(hào)af214570)和vegf189的序列；而houck等，mol.endocrinol.(1991)5：1806-1814描述了vegf206的序列。

cntf(睫狀神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子)是外周神經(jīng)和中樞神經(jīng)神經(jīng)系統(tǒng)中的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)的神經(jīng)細(xì)胞因子。通常因其在支持和存活非神經(jīng)的和神經(jīng)細(xì)胞類(lèi)型中的功能來(lái)識(shí)別cntf。見(jiàn)，例如vergara,c和ramirez,b；brainres,brainres.rev.(2004)47：161-73。

音猥因子(shh)控制重要的發(fā)育過(guò)程，包括神經(jīng)和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的存活。

促紅細(xì)胞生成素(epo)是紅系祖細(xì)胞的主要調(diào)節(jié)劑。然而，它功能性地表達(dá)在神經(jīng)系統(tǒng)中，并據(jù)報(bào)道具有神經(jīng)保護(hù)作用。見(jiàn)，例如bartesaghi,s.，2005.neurotoxicology，26：923-8。編碼人和其他哺乳動(dòng)物epo的基因已被克隆、測(cè)序并表達(dá)，且在物種間顯示編碼區(qū)序列的高度同源性。wen等，blood(1993)82：1507-1516。編碼天然人epo的基因序列，以及獲得其的方法在例如美國(guó)專(zhuān)利號(hào)4,954,437和4,703,008中有所描述，在此將其全部引入作為參考，以及jacobs等(1985)nature313：806-810；lin等(1985)proc.natl.acad.sciusa82：7580；國(guó)際公開(kāi)號(hào)wo85/02610；和歐洲專(zhuān)利申請(qǐng)?zhí)?32,034b1。另外，編碼天然貓科、犬科和豬epo的基因序列是已知的，并可容易地獲得(genbank登錄號(hào)分別為l10606；l13027；和l10607)，編碼猴子(獼猴，macacamulatto)的基因序列也是已知的并可獲得(genbank登錄號(hào)l10609)。

賴(lài)氨酸氧化酶(lox)氧化肽基賴(lài)氨酸的側(cè)鏈，從而將某些賴(lài)氨酸殘基轉(zhuǎn)化為α-氨基己二酸-δ-半醛。這是翻譯后改變，例如，其能夠使膠原和彈性蛋白的組分鏈共價(jià)交聯(lián)。它穩(wěn)定了細(xì)胞外基質(zhì)中的這些蛋白質(zhì)的纖維沉積。lox還可以在多種陽(yáng)離子蛋白質(zhì)中氧化賴(lài)氨酸，這表明其功能比穩(wěn)定或細(xì)胞外基質(zhì)更廣。lox作為前體蛋白被合成；其作為前l(fā)ox出現(xiàn)于細(xì)胞、并被蛋白水解加工成活性酶。見(jiàn)，例如lucero,ha和kagan,hm，cell.moi.lifesci(2006)63：2304-2316。

前顆粒體蛋白(pgrn)是多效性蛋白質(zhì)?；蛑械耐蛔円痤~顳葉退化。cns中的pgrn通過(guò)小膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元表達(dá)，并在腦發(fā)育中發(fā)揮作用。pgrn還涉及包括發(fā)育、傷口修復(fù)和腫瘤形成的多種“組織建?！边^(guò)程。pgrn被彈性蛋白酶轉(zhuǎn)變成顆粒體蛋白(grn)。因?yàn)榍邦w粒體蛋白具有營(yíng)養(yǎng)特性,grn更類(lèi)似于炎性介質(zhì)。cns疾病動(dòng)物模型的基因表達(dá)研究顯示，與小膠質(zhì)細(xì)胞激活和炎癥相關(guān)的prgn不同增加。pgrn表達(dá)的增加可能與小膠質(zhì)細(xì)胞激活和神經(jīng)炎癥密切相關(guān)。而且，在包括運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元疾病和阿爾茨海默病的許多神經(jīng)退化疾病中，在激活小膠質(zhì)細(xì)胞中pgrn表達(dá)增加。研究已經(jīng)將pgrn中的突變作為神經(jīng)退化疾病的起因，并表明在神經(jīng)生存中pgrn功能的重要性。

少突神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞,cns中的髓鞘生成細(xì)胞，在整個(gè)成年期持續(xù)通過(guò)少突膠質(zhì)細(xì)胞前體細(xì)胞(opcs)產(chǎn)生，并為成人cns中鞘磷脂損傷的內(nèi)在修復(fù)所必需。在成人cns中調(diào)節(jié)opc增殖和新的成髓鞘少突神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞生成的生理事件是眾所周知的。最近已有報(bào)道具有多發(fā)硬化(ms，一種脫髓鞘疾病)的患者在妊娠的第三個(gè)月具有降低的復(fù)發(fā)率，表明激素影響少突膠質(zhì)細(xì)胞生成。ms患者的減免期與活性白質(zhì)病變的數(shù)量和大小的降低有關(guān)。小鼠的妊娠導(dǎo)致了母體cns中新的少突神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞生成和有髓鞘的軸突細(xì)胞數(shù)目的增加(gregg等，j.neurosci.(2007)27：1812-1823)。催乳素,一種在妊娠末期達(dá)高峰的激素，顯示能調(diào)節(jié)妊娠期opc增殖并促進(jìn)未交配雌性小鼠的白質(zhì)修復(fù)(gregg等，j.neurosci.(2007)27：1812-1823)。

人胎盤(pán)催乳素(hpl,一種也是在妊娠的第三個(gè)月達(dá)高峰的激素)可能對(duì)少突膠質(zhì)細(xì)胞生成有類(lèi)似的影響。hpl具有一些與人生長(zhǎng)激素(hgh)和催乳素性質(zhì)上相似的生物學(xué)活性，并且看起來(lái)是igf-i產(chǎn)生的主要調(diào)節(jié)劑。已顯示hgh和igf-i都是成人cns中髓鞘形成的刺激劑(carson等，neuron(1993)10：729-740，peltwon等，neurology(1977)27：282-288)。因此，涉及脫髓鞘的cns疾病(如ms、als、中風(fēng)和脊髓損傷)的治療可能獲益于基于prl或hpl的治療，如通過(guò)腦室內(nèi)注射表達(dá)rhprl或hpl的病毒載體。

生長(zhǎng)素釋放肽是生長(zhǎng)激素釋放的介質(zhì)，是一種胃激素。見(jiàn)，例如wu等，ann.surg.(2004)239：464。

神經(jīng)絲氨酸蛋白是絲氨酸蛋白酶抑制劑家族的成員。在某些cns疾病中,神經(jīng)絲氨酸蛋白能潛在地通過(guò)阻斷tpa的作用發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。見(jiàn)，例如galliciotti,g和sonderegger,p，frontbiosci(2006)11：33；simonin等，(2006)26：10614；miranda,e和lomas,da，cellmoilifesci(2006)63：709。

血管生成素是rna酶超家族成員。它是循環(huán)的正常成分，但也涉及作為在運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元疾病的風(fēng)險(xiǎn)因子。

在本發(fā)明的某些組合物和方法中，編碼一種以上上述治療性分子的一種以上轉(zhuǎn)基因能夠被傳遞，其中每一轉(zhuǎn)基因均有效連接至啟動(dòng)子以使得轉(zhuǎn)基因能從單一aav載體表達(dá)。在另外的方法中，轉(zhuǎn)基因可被有效連接至相同的啟動(dòng)子。每個(gè)轉(zhuǎn)基因編碼一個(gè)生物活性分子，其在cns中的表達(dá)導(dǎo)致神經(jīng)病理的至少部分糾正。此外，在一個(gè)以上轉(zhuǎn)基因被傳遞的情況中，轉(zhuǎn)基因可通過(guò)一個(gè)以上aav載體傳遞，其中每個(gè)aav載體含有有效連接至一啟動(dòng)子的一轉(zhuǎn)基因。

(如在任何不同分析和動(dòng)物模型中測(cè)得的，保持所需生物活性的)天然分子、及其活性片段和類(lèi)似物，包括在此進(jìn)一步描述的那些，將被用于本發(fā)明。

編碼用于本發(fā)明的所需蛋白質(zhì)的多核苷酸能夠使用分子生物學(xué)的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)制備。例如，能使用重組的方法(如通過(guò)從表達(dá)基因的細(xì)胞篩選cdna和基因組庫(kù)、或通過(guò)已知包含該基因的載體衍生基因)獲得編碼上述分子的多核苷酸序列。還可以基于已知序列合成(而不是克隆)生產(chǎn)感興趣的基因。能使用特定系列的適當(dāng)?shù)拿艽a子設(shè)計(jì)分子。然后從用標(biāo)準(zhǔn)方法制備的重疊寡核苷酸組裝完整序列并組裝成完整的編碼序列。見(jiàn)，例如edge,nature(1981)292：756；nambair等，science(1984)223：1299；和jay等，j.biol.chem.(1984)259：6311。

因此，特定的核酸序列能獲自包含所需序列的載體、或在適當(dāng)?shù)臅r(shí)候使用本領(lǐng)域已知的多種寡核苷酸合成技術(shù)(如定點(diǎn)突變和聚合酶鏈反應(yīng)(pcr)技術(shù))全部或部分合成。見(jiàn)，例如sambrook,上述。獲得編碼所需序列的核苷酸序列的一種方法是：通過(guò)退火在常規(guī)自動(dòng)化多核苷酸合成儀中生產(chǎn)的重疊合成寡核苷酸的互補(bǔ)組、而后用適當(dāng)?shù)膁na連接酶連接，并通過(guò)pcr擴(kuò)增連接的核苷酸序列。見(jiàn)，例如jayaraman等，proc.natl.acad.sciusa(1991)88：4084-4088。另外，寡核苷酸指導(dǎo)的合成(jones等，nature(1986)54：75-82)、事先存在的核苷酸區(qū)域的寡核苷酸指導(dǎo)的突變(riechmann等，nature(1988)332：323-327和verhoeyen等，science(1988)239:1534-1536)、及使用t4dna聚合酶的缺口寡核苷酸的酶法填補(bǔ)(queen等，proc.natl.acad.sci.usa(1989)86：10029-10033)能被用于提供用于本發(fā)明主旨方法的分子。

一旦生成，使用如下進(jìn)一步描述的重組病毒載體傳遞構(gòu)建體。

aav基因傳遞技術(shù)

使用任意幾個(gè)raav基因傳遞技術(shù)向問(wèn)題受試者傳遞上述構(gòu)建體。用于基因傳遞的幾個(gè)aav介導(dǎo)的方法是本領(lǐng)域已知的。如下面進(jìn)一步描述的，能夠?qū)⒒蛑苯觽鬟f給受試者，或可選地在體外傳遞給適當(dāng)?shù)募?xì)胞(如來(lái)自受試者的細(xì)胞)、并將細(xì)胞重新移植給受試者。

已經(jīng)開(kāi)發(fā)了用于基因傳遞的多種aav載體系統(tǒng)。使用本領(lǐng)域已知的技術(shù)能夠容易地構(gòu)建aav載體。見(jiàn)，例如美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5,173,414和5,139,941；國(guó)際公開(kāi)號(hào)wo92/01070(公布于1992年1月23日)和wo93/03769(公布于1993年3月4日)；lebkowski等，molec.cell.biol.(1988)8：3988-3996；vincent等，vaccines90(1990)(coldspringharborlaboratorypress)；carter,bj.currentopinioninbiotechnology(1992)3：533-539；muzyczka,n.currenttopicsinmicrobiol,andimmunol.(1992)158：97-129；kotin,r.m.humangenetherapy(1994)5：793-801；shelling和smith，genetherapy(1994)1：165-169；及zhou等，j.exp.med.(1994)179：1867-1875。下面還進(jìn)一步詳述了aav載體系統(tǒng)。

aav基因組是含有大約4681個(gè)核苷酸的線性、單鏈dna分子。aav基因組一般包含一個(gè)在每個(gè)末端以反向末端重復(fù)(itrs)為側(cè)翼的內(nèi)部非重復(fù)的基因組。itr大約有145個(gè)堿基對(duì)長(zhǎng)。itr具有多種功能，包括提供dna復(fù)制起點(diǎn)及包裝用于病毒基因組的信號(hào)?；蚪M的內(nèi)部非重復(fù)部分包括兩個(gè)大的開(kāi)放閱讀框，稱(chēng)為aav復(fù)制(rep)和衣殼(cap)基因。rep和cap基因編碼允許病毒復(fù)制和包裝成病毒粒子的病毒蛋白質(zhì)。特別地，從aavrep區(qū)表達(dá)一個(gè)至少四個(gè)病毒蛋白的家族，rep78、rep68、rep52、和rep40，根據(jù)其表觀分子量命名。aavcap區(qū)編碼至少三個(gè)蛋白質(zhì)，vpi、vp2和vp3。

aav已被設(shè)計(jì)成通過(guò)刪除aav基因組的內(nèi)部非重復(fù)部分(即rep和cap基因)及在itr間插入異源基因來(lái)傳遞目標(biāo)基因。異源基因通常被功能性連接至能夠在適當(dāng)?shù)臈l件下啟動(dòng)患者目標(biāo)細(xì)胞中基因表達(dá)的(組成型、細(xì)胞特異型或誘導(dǎo)型)。每種類(lèi)型啟動(dòng)子的例子是本領(lǐng)域中公知的。還能包括終止信號(hào)如多聚核苷酸位點(diǎn)。

aav是輔助依賴(lài)性病毒；即，它需要與輔助病毒(例如，腺病毒、皰疹病毒或牛痘)共同感染以形成aav病毒粒子。在缺乏與輔助病毒共同感染時(shí)，aav形成潛伏狀態(tài)，在此狀態(tài)中病毒基因組插入到宿主細(xì)胞染色體，但是并不生產(chǎn)感染性病毒粒子。隨后輔助病毒感染能“拯救”整合的基因組，允許其復(fù)制、并將其基因組包裝至感染性aav病毒粒子。因?yàn)閍av能夠感染來(lái)自不同種的細(xì)胞，輔助病毒必須是與宿主細(xì)胞同種的。因此，例如，人的aav將在犬類(lèi)腺病毒共同感染的犬類(lèi)細(xì)胞中復(fù)制。

可以使用下面更詳細(xì)描述的本領(lǐng)域公知的各種技術(shù)生產(chǎn)包含目標(biāo)基因的重組aav病毒粒子。野生型aav和輔助病毒可被用于提供用來(lái)生產(chǎn)raav病毒粒子必要的復(fù)制功能(見(jiàn),例如美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5,139,941，在此以其全文引入作為參考)?？蛇x地，含有輔助功能基因的質(zhì)粒與以一種公知輔助病毒感染組合能被用做復(fù)制功能的來(lái)源(見(jiàn)，例如美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5,622,856和美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5,139,941，兩者均在此以全文引入作為參考)。相似地，含有輔助功能基因的質(zhì)?？梢耘c以野生型aav感染組合使用，以提供必要的復(fù)制功能。當(dāng)與raav載體組合使用時(shí)，這三種方法每一種都足以生產(chǎn)raav病毒粒子。本領(lǐng)域技術(shù)人員也能使用本領(lǐng)域公知的其他方法生產(chǎn)raav病毒粒子。

在本發(fā)明的一實(shí)施方案中，使用一個(gè)三次感染的方法(詳細(xì)描述于美國(guó)專(zhuān)利號(hào)6,001,650中，在此以其整體引入作為參考)生產(chǎn)raav病毒粒子，因?yàn)檫@種方法不需要使用感染性輔助病毒，使得生產(chǎn)的raav病毒粒子沒(méi)有任何可檢測(cè)的輔助病毒存在。通過(guò)使用三個(gè)用于raav病毒粒子生產(chǎn)的載體完成這個(gè)：一個(gè)aav輔助功能載體、一個(gè)附屬功能載體、和一個(gè)raav表達(dá)載體。然而，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，這些載體編碼的核酸序列能以多種組合在兩個(gè)或多個(gè)載體上提供。

如在此解釋的，aav輔助功能載體編碼“aav輔助功能序列”(即rep和cap)，其反向用于生產(chǎn)性aav復(fù)制和衣殼化。優(yōu)選地，aav輔助功能載體支持有效的aav載體生產(chǎn)，而不產(chǎn)生任何可檢測(cè)的野生型aav病毒粒子(即含有功能性rep和cap基因的aav病毒粒子)。此種載體的一個(gè)例子，phlp19,描述于美國(guó)專(zhuān)利號(hào)6,001,650中,在此以其全文引人做為參考。aav輔助功能載體的rep和cap基因能夠來(lái)自如上面解釋的任何已知aav血清型。例如，aav輔助功能載體可以具有來(lái)自aav-2的rep基因和來(lái)自aav-6的cap基因；本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到其它rep和cap基因組合是可能的，限定特征是支持raav病毒粒子生產(chǎn)的能力。

附屬功能載體編碼aav依賴(lài)其復(fù)制的非aav衍生的病毒和/或細(xì)胞功能(即，“附屬功能”)的核苷酸序列。附屬功能包括那些aav復(fù)制所需的功能，包括但不局限于，涉及aav基因轉(zhuǎn)錄激活、階段特異性aavmrna剪接、aavdna復(fù)制、cap表達(dá)產(chǎn)物合成、以及aav衣殼裝配的那些部分?；诓《镜母綄俟δ苣軌騺?lái)自任何已知的輔助病毒(如腺病毒、皰疹病毒、和牛痘病毒)。在一實(shí)施方案中，使用附屬功能質(zhì)粒pladeno5(關(guān)于pladeno5的詳細(xì)內(nèi)容描述在美國(guó)專(zhuān)利號(hào)6,004,797中，在此以其全文引人做為參考)。此質(zhì)粒提供了一套完整的用于aav載體生產(chǎn)的腺病毒附屬功能，但缺少形成復(fù)制全能性腺病毒的必要成分。

為了進(jìn)一步理解aav，下面提供了更詳細(xì)的關(guān)于重組aav表達(dá)載體和aav輔助和附屬功能的討論。

重組aav表達(dá)載體

使用已知技術(shù)構(gòu)建重組aav(raav)表達(dá)載體，以至少提供作為在轉(zhuǎn)錄方向上的有效連接成分、包括轉(zhuǎn)錄起始區(qū)、目標(biāo)多核苷酸和轉(zhuǎn)錄終止區(qū)的控制元素。選擇在目標(biāo)細(xì)胞中(如在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中)有功能的控制元素。得到的含有有效連接成分的構(gòu)建體與功能性aavitr序列(5'和3')相結(jié)合。

aavitr區(qū)的核酸序列是已知的。aav-2的序列見(jiàn)，例如kotin,r.m.(1994)humangenetherapy5：793-801；berns,k.i.“parvoviridaeandtheirreplication”infundamentalvirology，第二版(b.n.fields和d.m.knipe編)。在本發(fā)明的載體中使用的aavitr不需要具有野生型核苷酸序列，而且可以(如通過(guò)核苷酸的插入、缺失、或替換)被改變。另外，aavitr可以衍生自幾個(gè)aav血清型的任何一個(gè)，包括但不局限于，aav-1、aav-2、aav-3、aav-4、aav-5、aav-6、aav-7、aav-8、aav-9等。而且，在aav表達(dá)載體中在所選核苷酸序列兩邊的5'和3'itr不需要一定是相同的或來(lái)自于相同的aav血清型或分離群，只要其功能為，即，能夠從宿主細(xì)胞基因組或載體切除和挽救目標(biāo)序列，以及當(dāng)在細(xì)胞中存在aavrep基因產(chǎn)物時(shí)，能夠?qū)na分子整合至受體細(xì)胞基因組中。

用于常規(guī)aav載體的適當(dāng)?shù)亩嗪塑账岱肿邮巧儆诨虼蠹s5千堿基(kb)的大小。選定的多核苷酸序列被有效連接至在受試者體內(nèi)指導(dǎo)其轉(zhuǎn)錄或表達(dá)的控制元素上。此類(lèi)控制元素能夠包含通常與選定基因相關(guān)的控制序列?？蛇x地，能夠使用異源控制序列。有用的異源控制序列通常包括來(lái)自于編碼哺乳動(dòng)物或病毒基因序列的那些。啟動(dòng)子的非限制性例子包括但不局限于，巨細(xì)胞病毒(cmv)啟動(dòng)子(kaplitt等，nat.genet.(1994)8：148-154)、cmv/人β3-球蛋白啟動(dòng)子(mandel等，j.neurosci.(1998)18：4271-4284)、gfap啟動(dòng)子(xu等，genether.(2001)8：1323-1332)、1.8-kb的神經(jīng)元特異性烯醇酶(nse)啟動(dòng)子(klein等，exp.neurol.(1998)150：183-194)、雞β肌動(dòng)蛋白(cba)啟動(dòng)子(miyazaki，gene(1989)79：269-277)、β-葡糖苷酸酶(gusb)啟動(dòng)子(shipley等，genetics(1991)10：1009-1018)、和如分離自人泛素a、人泛素b、和人泛素c的那些泛素啟動(dòng)子，如美國(guó)專(zhuān)利號(hào)6,667,174中所描述的,在此以其全文引入作為參考。為了延長(zhǎng)表達(dá)，可以另外將其他調(diào)控元素(如，例如土撥鼠肝炎病毒調(diào)控后元素(wpre)(donello等，j.virol.(1998)72：5085-5092)或者牛生長(zhǎng)激素(bgh)多腺苷酸位點(diǎn))有效連接至轉(zhuǎn)基因。另外，來(lái)自非病毒基因(如鼠科金屬硫因蛋白基因)的序列也將被發(fā)現(xiàn)用于文中。此類(lèi)啟動(dòng)子序列可以從例如stratagene(圣地亞哥，加利福尼亞州)購(gòu)買(mǎi)。

對(duì)于一些cns基因治療應(yīng)用，可能有必要控制轉(zhuǎn)錄活性。為了此目的，能夠通過(guò)包括各種調(diào)控元素和藥物響應(yīng)性啟動(dòng)子(如(例如)haberma等，genether.(1998)5.1604-16011；和ye等，science(1995)283：88-91所述)，獲得使用病毒載體基因表達(dá)的藥理調(diào)控。

能通過(guò)向aav基因組(已從其中切出了主要aav開(kāi)放閱讀框(“orfs”))中直接插入選定序列、構(gòu)建具有aavitr結(jié)合的目標(biāo)多核苷酸分子的aav表達(dá)載體。還能刪除aav基因組的其他部分，只要保留足夠的itr部分以保證復(fù)制和包裝功能。能使用本領(lǐng)域熟知技術(shù)設(shè)計(jì)此類(lèi)構(gòu)建體。見(jiàn)，例如美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5,173,414和5,139,941；國(guó)際公開(kāi)號(hào)wo92/01070(1992年1月23日公開(kāi))和wo93/03769(1993年3月4日公開(kāi))；lebkowski等，(1988)molec.cell.biol.8：3988-3996；vincent等(1990)vaccines90(coldspringharborlaboratorypress)；carter(1992)currentopinioninbiotechnology3：533-539；muzyczka(1992)currenttopicsinmicrobiolandimmunol.158：97-129；kotin(1994)humangenetherapy5：793-801；shelling和smith(1994)genetherapy1：165-169；及zhou等(1994)j.exp.med.179：1867-1875。

可選地，能使用(如，sambrook等上述的)標(biāo)準(zhǔn)連接技術(shù)，從病毒基因組或從包含其的另一載體上切出aavitr并融合另一載體中存在的所選核酸構(gòu)建體的5'和3'端。例如，能夠在20mmtris-clph7.5、10mmmgc12、10mmdtt、33μg/mlbsa、10mm-50mmnacl、及或者40μmatp、0.01-0.02(韋斯)單位t4dna連接酶中在0℃完成(對(duì)于“粘性末端”連接)或者在1mmatp、0.3-0.6(韋斯)單位t4dna連接酶中在14℃完成(對(duì)于“鈍性末端”的連接)。通常在30-100μg/ml總dna濃度(總終濃度為5-100nm)中進(jìn)行分子間的“粘性末端”連接。含有itr的aav載體已在例如美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5,139,941中有所描述。特別地，其中描述的幾個(gè)aav載體可獲自美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(“atcc”)，登錄號(hào)為53222、53223、53224、53225和53226。

在某些實(shí)施方案中,raav表達(dá)載體提供為自身互補(bǔ)raav構(gòu)建體。通常，raavdna作為長(zhǎng)度大約為4600核苷酸的單鏈dna(ssdna)分子被包裝入病毒衣殼。病毒感染細(xì)胞后，單個(gè)dna鏈被轉(zhuǎn)變成雙鏈dna(dsdna)形式。只有dsdna對(duì)細(xì)胞的蛋白質(zhì)是有用的，細(xì)胞將其所含的基因或多基因轉(zhuǎn)錄成rna。因此，aav常規(guī)復(fù)制策略需要從新合成互補(bǔ)dna鏈。在表達(dá)前將ssdnaaav基因組轉(zhuǎn)變成dsdna的這個(gè)步驟能夠通過(guò)使用自身互補(bǔ)載體來(lái)避免。

通過(guò)堿基配對(duì)來(lái)自?xún)蓚€(gè)感染病毒的互補(bǔ)鏈生產(chǎn)自身互補(bǔ)載體，其不需要dna合成(見(jiàn)，例如nakai等，j.virol.(2000)74：9451-9463)。這種鏈間堿基配對(duì)或鏈退火(sa)是可能的，因?yàn)閍av以相同效率包裝正或負(fù)dna鏈(berns,k.i.，microbiol.rev.(1990)54：316-329)。

因此，并不被理論所限制，通過(guò)sa或dna合成的dsdna轉(zhuǎn)變的需求能通過(guò)包裝作為單分子的兩個(gè)鏈來(lái)完全避免。這能夠通過(guò)利用在aav復(fù)制循環(huán)期間aav生產(chǎn)二聚體反向重復(fù)基因組的傾向性來(lái)實(shí)現(xiàn)。如果這些二聚體足夠小，它們能夠以常規(guī)aav基因組相同的方式被包裝，ssdna分子的兩半能夠折疊和堿基配對(duì)以形成一半長(zhǎng)度的dsdna分子。dsdna的轉(zhuǎn)變不依賴(lài)于宿主細(xì)胞dna合成和載體濃縮(mccarty等，genether.(2001)8：1248-1254)。

scaav病毒構(gòu)建體包括大約4.6kb并且能夠被包裝入正常aav衣殼。每個(gè)已知的aav血清型能夠以相似效率包裝scaav基因組(見(jiàn)，例如sipo等，genether.(2007)14：1319-1329)。因此，在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，scaav載體包括選自aav1、aav2、aav3、aav4、aav5、aav6、aav7、aav8、或aav9血清型的衣殼蛋白。然而，scaav載體可以包括來(lái)自任何已知血清型的衣殼蛋白或本領(lǐng)域已知的修飾衣殼蛋白。這些scaav載體還可以是假型載體，其含有在第二種aav血清型衣殼中的一種aav血清型基因組。此類(lèi)載體可包括(例如)含有aav2衣殼和aav1基因組的aav載體、或含有aav5衣殼和aav2基因組的aav載體(auricchio等，(2001)hum.mol.genet.，10(26)：3075-81)。

首先，相信在scaav載體中的轉(zhuǎn)基因序列能僅含有大約2.2kb。然而，它看起來(lái)比之前所認(rèn)為的具有更大的包裝能力。例如，wu等，humangenether.(2007)18：171-182成功包裝了超過(guò)3300bp的scaav-2構(gòu)建體，并且證明為完全dna酶抗性的二聚體反向重復(fù)基因組。當(dāng)在培養(yǎng)細(xì)胞中檢測(cè)時(shí)，這些載體產(chǎn)生了ssaav上預(yù)期的轉(zhuǎn)化效率的增加。

能通過(guò)產(chǎn)生約一半常規(guī)基因組大小的載體質(zhì)粒組合選擇純化感染性雙鏈形式，或通過(guò)使用約一半基因組大小的載體質(zhì)粒(在提供雙鏈病毒合成的aav病毒的一個(gè)末端決定序列中具有一個(gè)突變)，生產(chǎn)scaav載體。這兩種方法均生成共價(jià)連接在一末端重復(fù)的+和–鏈病毒基因組。

特別地，正常單體aav基因組的生成依賴(lài)于每一圈dna合成中兩個(gè)itr依次的有效分辨率。此反應(yīng)被兩個(gè)較長(zhǎng)的aavrep同型的ssdna內(nèi)切酶活性介導(dǎo)。在末端決定位點(diǎn)缺刻itr，隨后是由宿主dna聚合酶從缺口延長(zhǎng)dna。在末端決定位點(diǎn)被在另一端起始的復(fù)制復(fù)合體接觸前，當(dāng)rep不能缺刻末端決定位點(diǎn)時(shí)就形成了二聚體基因組。

通過(guò)抑制一末端重復(fù)的分辨率能大大增加在scaavprep中二聚體基因組的產(chǎn)量。這可以通過(guò)從一個(gè)itr刪除末端決定位點(diǎn)序列來(lái)容易地完成，這樣使得rep蛋白不能產(chǎn)生重要的ssdna缺刻(見(jiàn)，例如mccarty等，genether.(2003)10：2112-2118和wang等，genether.(2003)10：2105-2111)。然后在另一itr起始的復(fù)制復(fù)合體通過(guò)發(fā)夾結(jié)構(gòu)復(fù)制并回到起始端。復(fù)制進(jìn)行到模板分子的一端，在每一端留下dsdna反向重復(fù)及野生型itr，并在中間留下突變itr。然后此二聚體反向重復(fù)能夠從兩個(gè)野生型itr端進(jìn)行正常數(shù)輪復(fù)制。每一個(gè)被取代的子鏈包含每一端的ssdna反向重復(fù)和完整itr并在中間有突變itr。在取代鏈的3'端開(kāi)始包裝入aav衣殼。從具有一突變itr的構(gòu)建體的scaav生產(chǎn)通常產(chǎn)生超過(guò)90％的二聚體基因組。

從突變itr構(gòu)建體生產(chǎn)和純化scaav載體與常規(guī)ssaav相同，如下所述。然而，如果使用點(diǎn)雜交或southern雜交，優(yōu)選將載體dna在堿性條件下應(yīng)用于雜交膜上以防止互補(bǔ)鏈的再退火。另外，可能在離突變itr足夠近的地方產(chǎn)生一個(gè)假的rep缺刻位點(diǎn)，會(huì)允許末端分辨率和單體基因組的產(chǎn)生。通常能通過(guò)轉(zhuǎn)基因盒轉(zhuǎn)變關(guān)于突變與野生型末端重復(fù)將此避免。

見(jiàn)，例如mccarty,d.m.，molec.ther.(2008)16：1648-1656；mccarty等，genether.(2001)8：1248-1254；mccarty等，genether.(2003)10：2112-2118；wang等，genether.(2003)10：2105-2111)；wu等，humangenether.(2007)18：171-182；美國(guó)專(zhuān)利公開(kāi)號(hào)2007/0243168和2007/0253936,在此以其全文引入做為參考；以及在此用于生產(chǎn)scaav構(gòu)建體的方法的實(shí)施例。

為了本發(fā)明的目的，用于從aav表達(dá)載體(既包括常規(guī)的也包括sc載體)生產(chǎn)raav病毒粒子的適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞包括微生物、酵母細(xì)胞、昆蟲(chóng)細(xì)胞、和哺乳動(dòng)物細(xì)胞，其能夠或者已經(jīng)被用于異源dna分子的受體，并且其能夠生長(zhǎng)于例如懸浮培養(yǎng)基、生物反應(yīng)器、等等。術(shù)語(yǔ)包括被轉(zhuǎn)化的初始細(xì)胞的后代。因此，用于文中的“宿主細(xì)胞”通常指被外源dna序列轉(zhuǎn)化的細(xì)胞。在本發(fā)明的實(shí)踐中優(yōu)選來(lái)自人穩(wěn)定細(xì)胞系293(能容易地通過(guò)例如美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心以登錄號(hào)atcccrl1573獲得)的細(xì)胞。特別地，人細(xì)胞系293是被5型腺病毒dna片段轉(zhuǎn)化(graham等(1977)j.gen.virol.36：59)并且表達(dá)腺病毒e1a和e1b基因(aiello等(1979)virology94：460)的人胚胎腎細(xì)胞系。293細(xì)胞系很容易被轉(zhuǎn)化，并且提供生產(chǎn)raav病毒粒子的特別方便的平臺(tái)。

aav輔助功能

含有上述aav表達(dá)載體的宿主細(xì)胞一定被賦予能夠提供aav輔助功能，以便復(fù)制和包裝以aavitr為側(cè)翼的核苷酸序列，從而產(chǎn)生raav病毒粒子。aav輔助功能通常是aav衍生的編碼序列，其能夠被表達(dá)以提供aav基因產(chǎn)物，其轉(zhuǎn)而反式作用于生產(chǎn)型aav復(fù)制。在此應(yīng)用aav輔助功能以互補(bǔ)aav表達(dá)載體所缺少的必要的aav功能。因此，aav輔助功能包括一個(gè)或兩個(gè)主要的aavorf，即rep和cap編碼區(qū)，或其功能同源物。

通過(guò)“aavrep編碼區(qū)”指aav基因組的art識(shí)別區(qū)(art-recognizedregion)，其編碼復(fù)制蛋白rep78、rep68、rep52和rep40。這些rep表達(dá)產(chǎn)物已顯示具有很多功能，包括識(shí)別、結(jié)合及缺刻dna復(fù)制的aav起點(diǎn)、dna解鏈酶活性和調(diào)節(jié)從aav(或者其他異源性)啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄。rep表達(dá)產(chǎn)物總體在aav基因組復(fù)制中是必需的。對(duì)于aavrep編碼區(qū)的描述，見(jiàn)，例如，muzyczka,n.(1992)currenttopicsinmicrobiol.andimmunol.158：97-129；和kotin,r.m.(1994)humangenetherapy5：793-801。aavrep編碼區(qū)適當(dāng)?shù)耐次锇ㄈ税捳畈《?(hhv-6)rep基因，其也已知能介導(dǎo)aav-2dna復(fù)制(thomson等(1994)virology204：304-311)。

通過(guò)“aavcap編碼區(qū)”指編碼衣殼蛋白vpl、vp2和vp3或其功能性同源物的aav基因組的art識(shí)別區(qū)(art-recognizedregion)。這些cap表達(dá)產(chǎn)物供給包裝功能，其總體上為包裝病毒基因組所必需。對(duì)于aavcap編碼區(qū)的描述，見(jiàn)，例如,muzyczka,n.和kotin,r.m.(上述)。

通過(guò)在轉(zhuǎn)染aav表達(dá)載體之前或同時(shí)用aav輔助構(gòu)建體轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞將aav輔助功能引入宿主細(xì)胞。因此aav輔助構(gòu)建體被用于提供aavrep和/或cap基因的至少瞬時(shí)表達(dá)以互補(bǔ)缺失生產(chǎn)型aav轉(zhuǎn)染所必需的aav功能。aav輔助構(gòu)建體缺少aavitr，而不能復(fù)制、也不能包裝它們自身。

這些構(gòu)建體能夠是質(zhì)粒、噬菌體、轉(zhuǎn)座子、粘粒、病毒或病毒粒子形式。已經(jīng)描述了許多aav輔助構(gòu)建體，例如通常應(yīng)用的質(zhì)粒paav/ad和pim29+45，其編碼rep和cap表達(dá)產(chǎn)物。見(jiàn)，例如samulski等(1989)j.virol.63：3822-3828；和mccarty等(1991)j.virol.65：2936-2945。已經(jīng)描述了許多編碼rep和/或cap表達(dá)產(chǎn)物的其他載體。見(jiàn)，例如美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5,139,941。

aav附屬功能

宿主細(xì)胞(或包裝細(xì)胞)也必須被賦予能夠提供非aav衍生的功能，或“附屬功能”，以生產(chǎn)raav病毒粒子。附屬功能是非aav衍生的病毒和/或細(xì)胞功能，aav依賴(lài)于其進(jìn)行復(fù)制。因此，附屬功能包括至少那些在aav復(fù)制中所需的非aav蛋白質(zhì)和rna，包括涉及aav基因轉(zhuǎn)錄激活、階段特異性aavmrna剪接、aavdna復(fù)制、cap表達(dá)產(chǎn)物合成和aav衣殼裝配的那些?；诓《镜母綄俟δ苣軌騺?lái)自于任何已知的輔助病毒。

特別地，能夠使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法將附屬功能引入并隨后表達(dá)于宿主細(xì)胞中。通常通過(guò)用不相關(guān)輔助病毒感染宿主細(xì)胞提供附屬功能。已知許多合適的輔助病毒，包括腺病毒；皰疹病毒如單純皰疹病毒1和2型；以及牛痘病毒。在此也可以發(fā)現(xiàn)非病毒輔助功能的用途，如使用任何不同已知試劑細(xì)胞同步化所提供的那些。見(jiàn)，例如buller等(1981)j.virol.40：241-247；mcpherson等(1985)virology147：217-222；schlehofer等(1986)virology152：110-117。

可選地，能夠使用上述的附屬功能載體提供附屬功能。見(jiàn)，例如美國(guó)專(zhuān)利號(hào)6,004,797和國(guó)際公開(kāi)號(hào)wo01/83797，在此以其全文引入做為參考。提供附屬功能的核酸序列能夠來(lái)自天然來(lái)源，如來(lái)自腺病毒顆?；蚪M，或使用本領(lǐng)域已知的重組或合成方法構(gòu)建。如上面所解釋的，已證實(shí)對(duì)于附屬輔助功能并不需要完全互補(bǔ)的腺病毒基因。特別地，已顯示不能進(jìn)行dna復(fù)制及后期基因合成的腺病毒突變體可允許aav復(fù)制。ito等，(1970)j.gen.virol.9：243；ishibashi等，(1971)virology45：317。相似地，已顯示在e2b和e3區(qū)域的突變體支持aav復(fù)制，表明e2b和e3區(qū)域可能不涉及提供附屬功能。carter等，(1983)virology126：505。然而，在e1區(qū)域缺陷、或者具有刪除e4區(qū)域的腺病毒不能支持aav復(fù)制。因此，e1a和e4區(qū)域可能直接或間接為aav復(fù)制所必需。laughlin等，(1982)j.virol.41：868；janik等，(1981)proc.natl.acad.sci.usa78：1925；carter等，(1983)virology126：505。其他鑒定的ad突變體包括：elb(laughlin等(1982)，上述；janik等(1981)，上述；ostrove等，(1980)virology104：502)；e2a(handa等，(1975)j.gen.virol.29：239；strauss等，(1976)j.virol.17：140；myers等，(1980)j.virol.35：665；jay等，(1981)proc.natl.acad.sci.usa78：2927；myers等，(1981)j.biol.chem.256：567)；e2b(carter，adeno-associatedvirushelperfunctions，inicrchandbookofparvoviruses(p.tijssen編，1990))；e3(carter等(1983)，上述)；和e4(carter等(1983)，上述；carter(1995))。盡管在e1b編碼區(qū)具有突變的腺病毒提供的附屬功能研究產(chǎn)生了矛盾的結(jié)果，samulski等，(1988)j.virol.62：206-210已報(bào)道elb55k是aav病毒粒子生產(chǎn)所必需，而elb19k不是。此外，國(guó)際公開(kāi)wo97/17458和matshushita等，(1998)genetherapy5：938-945,描述了編碼各種ad基因的附屬功能載體。特別優(yōu)選的附屬功能載體包括腺病毒varna編碼區(qū)域、腺病毒e4orf6編碼區(qū)域、腺病毒e2a72kd編碼區(qū)域、腺病毒e1a編碼區(qū)域、以及缺少完整elb55k編碼區(qū)的腺病毒e1b區(qū)域。此類(lèi)載體在國(guó)際公開(kāi)號(hào)wo01/83797中有描述。

作為用輔助病毒感染宿主細(xì)胞、或用附屬功能載體轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞的結(jié)果，附屬功能被表達(dá)，其反式激活aav輔助構(gòu)建體以生產(chǎn)aavrep和/或cap蛋白。rep表達(dá)產(chǎn)物從aav表達(dá)載體切除重組dna(包括目標(biāo)dna)。rep蛋白還服務(wù)于復(fù)制aav基因組。表達(dá)的cap蛋白裝配成衣殼，而重組aav基因組被包裝入衣殼。因此，跟著發(fā)生了生產(chǎn)型aav復(fù)制，并且dna被包裝入raav病毒粒子?！爸亟Maav病毒粒子”或“raav病毒粒子”在此被定義為感染性、復(fù)制缺陷病毒，包括aav蛋白外殼，其包裝兩邊以aavitr為側(cè)翼的異源目標(biāo)核苷酸序列。

重組aav復(fù)制后，能使用多種常規(guī)純化方法(如柱層析、cscl梯度、等等)從宿主細(xì)胞純化raav病毒粒子。例如，能夠使用多個(gè)柱純化步驟，如陰離子交換柱、親和柱和/或陽(yáng)離子交換柱上的純化。見(jiàn)，例如國(guó)際公開(kāi)號(hào)wo02/12455。而且，如果使用感染表達(dá)附屬功能，能用已知方法滅活殘留輔助病毒。例如，能通過(guò)加熱至大約60℃(例如)20分鐘或更長(zhǎng)，將腺病毒滅活。這種治療有效地僅滅活輔助病毒，因?yàn)閍av是極端熱穩(wěn)定的而輔助腺病毒是不耐熱的。

然后，能夠使用下述的技術(shù)，用得到的含有目標(biāo)核苷酸序列的raav病毒粒子進(jìn)行基因傳遞。

組合物和傳遞

a.組合物

一旦生產(chǎn)出來(lái)，編碼目標(biāo)基因的raav病毒粒子將被配方成適于傳遞的組合物。組合物將包括足夠的遺傳物質(zhì)以生成治療有效劑量的目標(biāo)基因，即，足夠劑量以(1)防止疾病發(fā)展或在有可能暴露于疾病或者有患病傾向但還未經(jīng)歷或表現(xiàn)出疾病癥狀的受試者體內(nèi)導(dǎo)致疾病以較輕強(qiáng)度發(fā)生；(2)抑制疾病，即阻滯發(fā)展或逆轉(zhuǎn)疾病的狀態(tài)；或(3)減輕疾病癥狀，即降低受試者經(jīng)歷的癥狀數(shù)量，以及改變疾病相關(guān)的細(xì)胞病理。

恰當(dāng)?shù)膭┝窟€依賴(lài)于接受治療的哺乳動(dòng)物(例如人或非人靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物或其他哺乳動(dòng)物)、年齡和被治療受試者的概況、治療的疾病的嚴(yán)重性、給藥模式、以及其他因素。本領(lǐng)域技術(shù)人員能很容易地確定恰當(dāng)?shù)挠行┝?，并且下面提供了代表性劑量?/p>

組合物還包含藥學(xué)可接受賦形劑。此類(lèi)賦形劑包括任何藥學(xué)制劑，其自身不誘導(dǎo)有害于接受組合物的個(gè)體的抗體產(chǎn)生，并且其可以被給藥而不產(chǎn)生過(guò)度毒性。藥學(xué)可接受賦形劑包括但不局限于，山梨醇、多種tween化合物的任何一種、以及液體(如水、鹽水、甘油和酒精)。其中藥學(xué)可接受的鹽類(lèi)能包括，例如，無(wú)機(jī)酸鹽類(lèi)(如鹽酸鹽、氫溴酸鹽、磷酸鹽、硫酸鹽等等)；及有機(jī)酸鹽(如乙酸鹽、丙酸鹽、丙二酸鹽、苯甲酸鹽、等等)。另外，輔助的物質(zhì)(如潤(rùn)濕劑或乳化劑、ph緩沖物質(zhì)等等)可以出現(xiàn)在此賦形劑中。藥學(xué)可接受賦形劑的深入討論可以在remington'spharmaceuticalsciences(mackpub.co.，n.j.1991)中找到。

配方可以是液體或(例如凍干的)固體。配方還可以作為氣霧劑給藥。

一個(gè)特別有用的配方包括目標(biāo)raav病毒粒子與一種或多種二元或多元醇和(可選的)去污劑(如山梨醇酯)的組合。見(jiàn)，例如美國(guó)專(zhuān)利號(hào)6,764,845，在此以其全文引入做為參考。

b.傳遞

通常地，使用體內(nèi)或體外轉(zhuǎn)化技術(shù)將重組病毒粒子引入受試者。如果在體外轉(zhuǎn)化，將從受試者中移出所需的受體細(xì)胞、用重組載體轉(zhuǎn)化、再引入受試者。可選地，能使用同種的或異種的細(xì)胞(其中那些細(xì)胞在受試者內(nèi)不產(chǎn)生不恰當(dāng)?shù)拿庖叻磻?yīng))。用于向哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞傳遞的適當(dāng)?shù)募?xì)胞包括來(lái)自器官、腫瘤或細(xì)胞系的哺乳動(dòng)物細(xì)胞類(lèi)型。例如，能使用人類(lèi)、小鼠、山羊、綿羊、牛、狗、貓、和豬細(xì)胞。使用的合適的細(xì)胞類(lèi)型包括但不局限于成纖維細(xì)胞、肝細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、角化細(xì)胞、造血細(xì)胞、上皮細(xì)胞、肌細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞和干細(xì)胞。另外，能在體外轉(zhuǎn)化神經(jīng)祖細(xì)胞，然后將其傳送到cns。

能夠在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基中通過(guò)組合重組病毒和所需細(xì)胞轉(zhuǎn)化細(xì)胞，并且使用常規(guī)技術(shù)如southern雜交和/或pcr，或通過(guò)使用選擇性標(biāo)記篩選那些帶有目標(biāo)dna的細(xì)胞。然后如上所述，能將轉(zhuǎn)化的細(xì)胞配方成藥學(xué)組合物，并通過(guò)下面描述的各種技術(shù)將一種或多種劑量的組合物引入受試者。

對(duì)于體內(nèi)傳遞，將重組病毒粒子配方成藥物組合物，并以指定的方式直接給藥一種或多種劑量。對(duì)于鑒別人腦中的結(jié)構(gòu)，見(jiàn)例如thehumanbrain:surface,three-dimensionalsectionalanatomywithmri,andbloodsupply，第二版eds.deutero等，springervela，1999；atlasofthehumanbrain，eds.mai等，academicpress；1997；和co-planarsterotaxicatlasofthehumanbrain:3-dimensionalproportionalsystem:anapproachtocerebralimaging，eds.tamarack等，thymemedicalpub.，1988。對(duì)于鑒別小鼠腦中的結(jié)構(gòu)，見(jiàn)，例如themousebraininsterotaxiccoordinates，第二版，academicpress，2000。如果需要，可以將人腦與其他哺乳動(dòng)物腦的類(lèi)似結(jié)構(gòu)關(guān)聯(lián)。例如，多數(shù)哺乳動(dòng)物(包括人類(lèi)和嚙齒類(lèi))表現(xiàn)出內(nèi)嗅海馬投射物的類(lèi)似局部解剖結(jié)構(gòu)，其具有在投射至海馬背側(cè)或中隔極點(diǎn)的外側(cè)和內(nèi)側(cè)內(nèi)嗅皮層的外側(cè)部分的神經(jīng)元，而至腹側(cè)海馬的投射主要來(lái)自在嗅皮層內(nèi)側(cè)部分的神經(jīng)元(principlesofneuralscience，第四版，edskandel等，mcgraw-hill，1991；theratnervoussystem，第二版，ed.paxinos，academicpress，1995)。而且，內(nèi)嗅皮層的ii層細(xì)胞投射至齒狀回，并且它們終止于齒狀回分子層的外側(cè)三分之二。來(lái)自iii層細(xì)胞的軸突雙向投射至海馬的ca1和ca3海馬角區(qū)，終止于多洼層分子層。

為了向中樞神經(jīng)系統(tǒng)的特定區(qū)域、特別是腦部特定區(qū)域特異性傳遞載體，可以通過(guò)立體定位微注射給藥。例如，在手術(shù)當(dāng)天，患者帶有固定到位(螺旋固定于頭顱)的立體定位框基。使用高分辨mri對(duì)帶有立體定位框基(mri兼容，帶可信標(biāo)記)的腦部成像。然后將mri影像傳送至運(yùn)行立體定位軟件的電腦。使用一系列冠狀、矢狀和軸向圖像來(lái)確定載體注射的目標(biāo)位置和軌跡。軟件直接將軌跡翻譯成適于立體定位框的3維坐標(biāo)。在入口上打出鉆孔，并將帶有針的立體定位器植入指定的深度。然后注射在藥物可接受媒介中的載體。然后通過(guò)直接注射將載體給藥至初始目標(biāo)位點(diǎn)，并沿軸突逆向運(yùn)輸至遠(yuǎn)端目標(biāo)位點(diǎn)。可以使用另外的給藥途徑(例如在直接目視下的表層皮質(zhì)應(yīng)用、或其他非立體定位應(yīng)用)。

在本發(fā)明中能夠使用任何血清型的重組aav，其中重組aav可以是自身互補(bǔ)aav或非自身互補(bǔ)aav。在發(fā)明的某些實(shí)施方案中使用的病毒載體血清型選自aav1、aav2、aav3、aav4、aav5、aav6、aav7、aav8、和aav9(見(jiàn),例如gao等(2002)pnas，99：11854-11859；和viralvectorsforgenetherapy:methodsandprotocols，ed.machida，humanapress，2003)。還能使用在此所述的之外的其他血清型。而且，在此描述的方法中也能使用假型aav載體。假型aav載體是在第二種aav血清型衣殼中含有一種aav血清型基因組的那些；例如，含有aav2衣殼和aav1基因組的aav載體或含有aav5衣殼和aav2基因組的aav載體(auricchio等，(2001)hum.moi.genet.，10(26)：3075-81)。

通過(guò)使用針、導(dǎo)管或相關(guān)儀器、使用本領(lǐng)域已知的神經(jīng)外科技術(shù)(如通過(guò)立體定位注射)注射入例如腦室區(qū)(如一個(gè)或兩個(gè)側(cè)腦室)以及注射入紋狀體(如紋狀體的尾狀核和殼核)、小腦、脊髓、和神經(jīng)肌接頭，可以將重組病毒粒子或體外轉(zhuǎn)化的細(xì)胞直接傳送到神經(jīng)組織(如外周神經(jīng)、視網(wǎng)膜、脊神經(jīng)節(jié)、神經(jīng)肌接頭、及cns)(見(jiàn)，例如stein等，jvirol73：3424-3429，1999；davidson等，pnas97：3428-3432，2000；davidson等，nat.genet.3：219-223，1993：及alisky和davidson，hum.genether.11：2315-2329，2000)。在一個(gè)說(shuō)明性實(shí)施方案中，通過(guò)向受試者或患者的脊髓直接注射高滴度載體溶液實(shí)現(xiàn)傳遞。

在另一說(shuō)明性實(shí)施方案中，涉及一種方法，其通過(guò)向受試者腦的小腦的深部小腦核(dcn)區(qū)至少一個(gè)區(qū)域給藥含有轉(zhuǎn)基因的重組aav載體來(lái)傳遞轉(zhuǎn)基因到受試者脊髓和/或腦干區(qū)。在小腦深部是稱(chēng)之為深部小腦核的灰質(zhì)，被稱(chēng)為內(nèi)(頂)核、間位(間位)核和側(cè)(齒狀)核。如在此所用的，術(shù)語(yǔ)“深部小腦核”總體指這三個(gè)區(qū)域，其中可能靶標(biāo)這三個(gè)區(qū)域的一個(gè)或多個(gè)。病毒傳遞是在有助于轉(zhuǎn)基因在脊髓和/或腦干區(qū)域表達(dá)的條件下、在受試者脊髓的至少一個(gè)亞區(qū)進(jìn)行。這些亞區(qū)包括一個(gè)或多個(gè)頸椎、胸椎、腰椎或骶。

不受限于理論，本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案在于能夠向脊髓的每個(gè)區(qū)域提供治療性分子(例如蛋白質(zhì)或多肽)?？梢酝ㄟ^(guò)向dcn注射aav載體(包括scaav載體)來(lái)實(shí)現(xiàn)這個(gè)目的。而且，靶標(biāo)每個(gè)脊髓區(qū)域的單個(gè)神經(jīng)板可能是重要的。神經(jīng)板是腦和脊髓區(qū)域中特異的亞區(qū)。在某些實(shí)施方案中可能希望靶標(biāo)某脊髓區(qū)域的特定神經(jīng)板。因?yàn)檫\(yùn)動(dòng)神經(jīng)元損傷也可能發(fā)生在上運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元，可能還希望向腦干區(qū)域提供治療性分子(例如蛋白質(zhì)或肽)。在一個(gè)實(shí)施方案中，可能希望提供治療性分子到脊髓(包括某些或所有亞區(qū))和腦干(包括某些或所有亞區(qū))。本發(fā)明使用向dcn中引入aav載體以實(shí)現(xiàn)上述治療性分子向脊髓區(qū)和/或腦干的傳遞。

靶標(biāo)脊髓(如神經(jīng)節(jié))的另一方法是通過(guò)鞘內(nèi)傳遞、而不是注射到脊髓組織本身。此種傳送有很多優(yōu)點(diǎn)。目標(biāo)蛋白被釋放到周?chē)鷆sf，而且與病毒不同，被釋放蛋白質(zhì)能夠滲透脊髓實(shí)質(zhì)，正如其在急性鞘內(nèi)注射后表現(xiàn)的那樣。事實(shí)上，病毒載體的鞘內(nèi)傳遞能夠保持局部表達(dá)。鞘內(nèi)基因治療的另一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是鞘內(nèi)方式模擬了已在人體中常規(guī)使用的腰椎穿刺(即脊髓穿刺)給藥。

用于給藥重組載體或轉(zhuǎn)化細(xì)胞的另一方法是通過(guò)向脊神經(jīng)節(jié)(drg)神經(jīng)元傳遞，例如通過(guò)注射到硬膜外腔并隨后擴(kuò)散到drg。例如，重組載體或轉(zhuǎn)化的細(xì)胞能夠在蛋白質(zhì)擴(kuò)散至drg的條件下、通過(guò)鞘內(nèi)插管被傳遞。見(jiàn)，例如，chiang等，actaanaesthesiol.sin.(2000)38：31-36；jain,k.k.，expertopin.investig.drugs(2000)9：2403-2410。

然而，另外一種給藥至cns的模式使用對(duì)流增強(qiáng)傳遞(ced)系統(tǒng)，其為載體的任何非手動(dòng)傳遞。在ced的一個(gè)實(shí)施方案中，通過(guò)使用非手動(dòng)傳遞系統(tǒng)產(chǎn)生壓力梯度。通過(guò)使用ced，重組載體能被傳遞到cns大片區(qū)域的很多細(xì)胞。而且，被傳遞的載體在cns細(xì)胞(例如神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞)中有效地表達(dá)轉(zhuǎn)基因。任何對(duì)流增強(qiáng)傳遞設(shè)備可適用于傳遞重組載體。在一優(yōu)選的實(shí)施方案中，設(shè)備是滲透泵或輸液泵。滲透泵和輸液泵均可從多個(gè)廠商(例如alzetcorporation，hamiltoncorporation，alza,inc.帕洛阿爾托，加利福尼亞州)處買(mǎi)到。通常以下面的ced設(shè)備傳遞重組載體。導(dǎo)管、插管或其他注射設(shè)備被插入所選受試者的cns組織。立體定位圖和定位設(shè)備是可買(mǎi)到的，例如購(gòu)自asiinstruments，沃倫，密歇根州。還可以使用從ct和/或mri影像得到的解剖圖進(jìn)行定位，以幫助指導(dǎo)注射設(shè)備至所選靶標(biāo)。而且，因?yàn)樵诖嗣枋龅姆椒軌驅(qū)嵺`以至于受試者相對(duì)大面積地吸收重組載體，所以需要比較少的輸液管。因?yàn)橥饪撇l(fā)癥通常與滲透數(shù)量相關(guān)，這種傳遞模式能服務(wù)于降低使用傳統(tǒng)傳遞技術(shù)所見(jiàn)的副作用。關(guān)于ced傳遞的詳細(xì)描述，見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利號(hào)6,309,634，在此以其全文引入做為參考。

側(cè)腦室內(nèi)、或腦室內(nèi)傳遞重組aav載體可以在一個(gè)或多個(gè)腦室進(jìn)行，腦室中充滿著腦脊液(csf)。csf是充滿腦室的澄清液體，其存在于蛛網(wǎng)膜下腔，而且環(huán)繞腦和脊髓。csf由脈絡(luò)叢產(chǎn)生，并通過(guò)滲出或傳輸腦組織液到腦室中。脈絡(luò)叢是沿側(cè)腦室底部和第三和第四腦室頂部排列的結(jié)構(gòu)。某些研究表明，這些結(jié)構(gòu)能夠每天產(chǎn)生400-600ccs液體，符合每天四次充滿中樞神經(jīng)系統(tǒng)的量。在成年人中，此液體的體積被計(jì)算出有125至150ml(4-5oz)。csf是連續(xù)形成、循環(huán)和吸收。某些研究表明，每天可能產(chǎn)生大約430至450ml(接近2杯)的csf。某些計(jì)算估計(jì)，在成人中生產(chǎn)量等于每分鐘大約0.35ml，在人類(lèi)嬰兒中為每分鐘大約0.15。側(cè)腦室的脈絡(luò)叢生產(chǎn)多數(shù)csf。csf流經(jīng)室間孔進(jìn)入第三腦室，在第三腦室加入了由第三腦室產(chǎn)生的csf，并繼續(xù)沿中腦水管流入第四腦室。第四腦室加入了更多的csf；然后該液體經(jīng)過(guò)馬讓迪氏孔和盧施卡孔流入蛛網(wǎng)膜下腔。然后csf循環(huán)經(jīng)過(guò)腦基底、向下流及脊髓并向上到達(dá)大腦半球。csf通過(guò)蛛網(wǎng)膜絨毛和顱內(nèi)血管竇排空流入血液。

一方面，公開(kāi)的方法包括向困擾的受試者的cns給藥攜帶編碼治療性產(chǎn)物的轉(zhuǎn)基因的raav病毒粒子，并允許轉(zhuǎn)基因在給藥位點(diǎn)附近的cns內(nèi)表達(dá)，在表達(dá)蛋白通過(guò)csf被轉(zhuǎn)運(yùn)到遍及csf時(shí)、該表達(dá)為足夠水平以發(fā)揮治療性效果。在一些實(shí)施方案中，方法包括給藥攜帶治療性轉(zhuǎn)基因的高滴度病毒粒子組合物，以便轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物以治療性水平表達(dá)于表達(dá)產(chǎn)物發(fā)生作用最終位點(diǎn)的遠(yuǎn)端cns中的第一位點(diǎn)。

在實(shí)驗(yàn)小鼠中，注射的aav溶液的總體積為例如1至20μl。對(duì)于其他哺乳動(dòng)物，包括人類(lèi)，適當(dāng)按比例決定體積和傳遞速率。治療可以由每個(gè)位點(diǎn)單次注射組成、或可以在一個(gè)或多個(gè)位點(diǎn)重復(fù)。能使用多個(gè)注射位點(diǎn)。例如，在某些實(shí)施方案中，除了第一給藥位點(diǎn)外，含有攜帶轉(zhuǎn)基因的病毒載體的組合物還可以被給藥至另一位點(diǎn)，該位點(diǎn)可以是第一給藥位點(diǎn)的對(duì)側(cè)或同側(cè)。注射可以是單次或多次、單側(cè)或雙側(cè)。

治療劑量可以是(連續(xù)或間歇的)單劑量規(guī)劃、或多劑量規(guī)劃。而且，可以給藥給受試者盡可能合適的多劑量。如果是給藥多劑量，第一次給藥的配方可以與后面的配方相同或不同。因此，例如，第一次給藥能以aav載體的形式，而第二次給藥是腺病毒、質(zhì)粒dna、蛋白組合物等等形式。而且，后面的傳遞也可以是與第二次傳遞模式相同或不同。

另外，受試者可以通過(guò)文中公開(kāi)的傳遞方法的組合接受本發(fā)明的raav載體。因此，受試者可以接受至少兩個(gè)注射位點(diǎn)的aav載體注射，注射位點(diǎn)選自腦室內(nèi)注射、直接脊髓注射、鞘內(nèi)注射和腦實(shí)質(zhì)內(nèi)腦注射(例如，紋狀體、小腦，包括深部小腦核)。在一實(shí)施方案中，受試者可以通過(guò)以下方式接受raav載體：1)至少一次腦室內(nèi)注射,和至少一次直接脊髓注射或2)至少一次腦室內(nèi)注射和至少一次鞘內(nèi)注射或3)至少一次腦室內(nèi)注射和至少一次腦實(shí)質(zhì)內(nèi)腦注射或4)至少一次直接脊髓注射和至少一次鞘內(nèi)注射或5)至少一次直接脊髓內(nèi)注射和至少一次腦實(shí)質(zhì)內(nèi)腦注射或6)至少一次鞘內(nèi)注射和至少一次腦實(shí)質(zhì)內(nèi)腦注射。

應(yīng)當(dāng)理解通過(guò)傳遞重組病毒粒子能表達(dá)一個(gè)以上轉(zhuǎn)基因?？蛇x地，如文中所述，也能向受試者傳遞(每個(gè)表達(dá)一個(gè)或多個(gè)不同的轉(zhuǎn)基因的)分開(kāi)的載體。因此，能夠同時(shí)或順序傳遞多個(gè)轉(zhuǎn)基因。而且，還涉及以本發(fā)明方法傳遞的載體和其他合適組合物和治療組合。另外，能使用蛋白質(zhì)和核酸治療的組合。

確定最有效給藥途徑和治療有效劑量的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的，并隨著載體、治療組合物、靶細(xì)胞和被治療受試者的不同而不同。使用(例如)一個(gè)或多個(gè)待解決特定疾病的動(dòng)物模型能夠很容易地確定治療有效劑量?！爸委熡行┝俊睂⒙湓谝粋€(gè)相對(duì)寬的范圍，其可以通過(guò)臨床試驗(yàn)確定。例如，對(duì)于體內(nèi)注射raav病毒粒子，劑量將大約是約10⁶至10¹⁵個(gè)重組病毒基因組粒子，更優(yōu)選10⁸至10¹⁴個(gè)基因組粒子重組病毒，或在這些范圍中足以提供所需效果的任何劑量。在某些實(shí)施方案中,組合物中載體的濃度或滴度是至少為：(a)56,7、8、9、10、15、20、25、或50(x10¹²gp/ml)；(b)56、7、8、9、10、15、20、25、或50(x10⁹tu/ml)；或(c)5、6、7、8、9、10、15、20、25、或50(x10¹⁰iu/ml)。

對(duì)于體外轉(zhuǎn)化，被傳遞至細(xì)胞的raav病毒粒子的有效劑量大約是10⁸至10¹³個(gè)重組病毒。在藥物組合物中轉(zhuǎn)化細(xì)胞的量依次是大約10⁴至10¹⁰個(gè)細(xì)胞，更優(yōu)選10⁵至10⁸個(gè)細(xì)胞。本領(lǐng)域技術(shù)人員通過(guò)建立劑量響應(yīng)曲線的常規(guī)試驗(yàn)?zāi)芎苋菀椎卮_認(rèn)其他有效劑量。

通常，傳遞1μl至1ml(如從0.01至約.5ml)的組合物，例如傳遞約0.05至約0.3ml(如0.08、0.09、0.1、0.2等，及這些范圍內(nèi)任何數(shù)字)的組合物。

動(dòng)物模型

可以在適當(dāng)?shù)膭?dòng)物模型中檢測(cè)使用包括如上所述轉(zhuǎn)基因的aav病毒粒子的治療效果和安全性。例如，顯示與人疾病最相似的動(dòng)物模型包括能自發(fā)地發(fā)展成特定疾病的高發(fā)病率的動(dòng)物種、或那些已被誘導(dǎo)至疾病的動(dòng)物種。

特別是，已知并且已生成了幾種用于sma的動(dòng)物模型。見(jiàn)，例如sumnerc.j.，neurorx(2006)3：235-245；schmid等，j.childneurol.(2007)22：1004-1012。如上面所解釋的，sma(一種常染色體隱性遺傳神經(jīng)肌肉疾病)的分子基礎(chǔ)是運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元生存基因(smn1)的純合缺失。在人類(lèi)中發(fā)現(xiàn)了與smn1基因幾乎相同的拷貝，稱(chēng)為smn2，其調(diào)節(jié)著疾病的嚴(yán)重程度。與人相反，小鼠具有相當(dāng)于smn1的單一基因(smn)。此基因的純合缺失對(duì)于胚胎是致命的，并導(dǎo)致大量細(xì)胞死亡，這表明smn基因產(chǎn)物對(duì)細(xì)胞的生存和功能是必需的。向缺少smn的小鼠中引入smn2的兩個(gè)拷貝能挽救胚胎致死率，產(chǎn)生具有sma表型的小鼠(monani等，hum.moi.genet.(2000)9：333-339。高拷貝數(shù)的smn2挽救小鼠，是因?yàn)樵谶\(yùn)動(dòng)神經(jīng)元中產(chǎn)生了足夠的smn蛋白。也見(jiàn)hsieh-li等，nat.genet.(2000)24：66-70，其報(bào)道了表達(dá)人smn2的轉(zhuǎn)基因小鼠系的產(chǎn)生。特別是，在smn-/-背景中帶有smn2的轉(zhuǎn)基因小鼠顯示出與那些sma患者類(lèi)似的脊髓和骨骼肌中的病理改變。這些小鼠中病理改變的嚴(yán)重程度與含有外顯子7編碼區(qū)域的smn蛋白的量相關(guān)。此小鼠模型的表型包括運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元細(xì)胞缺失、骨骼肌萎縮、異常的神經(jīng)肌接頭(nmj)、行為缺陷、癱瘓和縮短的、大約2周的壽命。le等，hum.mol.genet.(2005)14：845-857。

相似地，als的動(dòng)物模型是已知的。als是致死的神經(jīng)退行疾病，其特征為皮質(zhì)、腦干和脊髓中運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的選擇性缺失。疾病的進(jìn)展能導(dǎo)致肢體、中軸和呼吸肌萎縮。運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元細(xì)胞死亡伴隨著反應(yīng)性神經(jīng)膠質(zhì)增生、神經(jīng)絲蛋白異常和皮質(zhì)脊髓束和前根中大的有髓鞘纖維的顯著缺失。盡管als的病因還不清楚，積聚的證據(jù)表明，散發(fā)的(sals)和家族的(fals)als共同具有許多相似的病理特征；因此，提供了對(duì)其中任一個(gè)形式的研究能導(dǎo)致普遍治療的希望。fals數(shù)量大約占確診病例的10％，其中的20％與cu/zn超氧化物歧化酶(sodi)的顯性遺傳突變相關(guān)。表達(dá)突變?nèi)藄odi蛋白的轉(zhuǎn)基因小鼠(例如sodig93a小鼠)概括了許多als的病理特征，并且是研究als的可買(mǎi)到的動(dòng)物模型。對(duì)于sals，牽涉眾多病理機(jī)制作為根本原因，包括谷氨酸誘導(dǎo)的興奮性中毒、毒素暴露、蛋白酶體功能障礙、線粒體損傷、神經(jīng)絲蛋白解體和神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)支持缺乏。

實(shí)驗(yàn)性自身免疫腦脊髓炎(eae)，也稱(chēng)為實(shí)驗(yàn)性過(guò)敏性腦脊髓炎，提供了ms的動(dòng)物模型。eae與不同形式和階段的ms非常相像。eae是急性或慢性復(fù)發(fā)性、獲得性、炎性和脫髓鞘的自身免疫病。為了創(chuàng)建該疾病，用構(gòu)成髓鞘(環(huán)繞神經(jīng)元的絕緣鞘)的蛋白質(zhì)注射動(dòng)物。這些蛋白質(zhì)在被注射小鼠內(nèi)誘導(dǎo)了自身免疫反應(yīng)，其產(chǎn)生與人ms非常接近的疾病過(guò)程。eae在許多不同的動(dòng)物種(包括小鼠、大鼠、豚鼠、兔子、短尾猴、恒河猴和狨猴)中被誘導(dǎo)。

脊髓和延髓肌肉萎縮(sbma)是成人發(fā)作的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元疾病，其由雄激素受體(ar)基因外顯子1的三核苷酸重復(fù)(tnr)擴(kuò)張所導(dǎo)致。此疾病特征在于運(yùn)動(dòng)和感覺(jué)神經(jīng)元退行、近端肌肉萎縮和內(nèi)分泌異常(如男子乳腺發(fā)育和生育力下降)。只有男性發(fā)展癥狀，而女性攜帶者通常無(wú)癥狀。sbma的分子基礎(chǔ)是三核苷酸cag重復(fù)的擴(kuò)張，三核苷酸cag重復(fù)在雄激素受體(ar)基因的第一個(gè)外顯子中編碼多谷氨酰胺段(polyq)。病理標(biāo)記是在腦干和脊髓及其他內(nèi)臟器官殘留的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元中含有帶擴(kuò)張polyq的突變和截?cái)郺r的核內(nèi)包涵體(ni)。已創(chuàng)建了幾個(gè)轉(zhuǎn)基因小鼠模型用于研究sbma的發(fā)病機(jī)制。見(jiàn)，例如katsuno等，cytogen.andgenomeres.(2003)100：243-251。例如，攜帶在人ar啟動(dòng)子下的純239cag的轉(zhuǎn)基因小鼠模型和攜帶具有擴(kuò)張cag的截短ar的另一個(gè)模型顯示了脊髓運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的運(yùn)動(dòng)損傷和核內(nèi)ni。攜帶具有擴(kuò)張polyq的全長(zhǎng)人ar的轉(zhuǎn)基因小鼠表明進(jìn)行性運(yùn)動(dòng)損傷和神經(jīng)病理以及表型的性別差異。這些模型概括了sbma中觀察到的表型表達(dá)。

馬查多-約瑟夫病(mjd，也稱(chēng)為脊髓小腦共濟(jì)失調(diào)3型，由具有多谷氨酰胺擴(kuò)張的突變共濟(jì)失調(diào)蛋白3引起。已生成了mjd、及其他多谷氨酰胺脊髓小腦共濟(jì)失調(diào)的小鼠模型。對(duì)于這些模型的綜述，見(jiàn)例如gould，v.f.c.neurorx(2005)2：480-483。

因此，本領(lǐng)域的動(dòng)物模型標(biāo)準(zhǔn)可用于篩選和/或評(píng)估本發(fā)明方法和組合物在治療運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元疾病方面的活性和/或有效性。

發(fā)明的試劑盒

本發(fā)明還提供試劑盒。在某些實(shí)施方案中,本發(fā)明的試劑盒包括一個(gè)或多個(gè)含有編碼目標(biāo)蛋白的重組載體的包裝物。試劑盒還可能包含一套合適的說(shuō)明書(shū)，通常為書(shū)面說(shuō)明書(shū)，其涉及對(duì)于文中所述任何方法的載體的使用。

試劑盒可以包括任何常規(guī)的、適當(dāng)?shù)陌b中的組分。例如，如果重組載體作為干燥配方被提供(例如，凍干或干粉)，通常使用帶有彈性瓶塞的小瓶，以便于通過(guò)彈性瓶塞注射液體可以很容易地重懸載體。帶有非彈性、可移動(dòng)的封蓋(例如密封的玻璃)或彈性瓶塞的安瓶最方便地用于液體配方。還涵蓋與特定裝置(如注射器或灌輸裝置(如微型真空泵))組合使用的包裝。

涉及使用或重組載體的說(shuō)明書(shū)通常包括用于本方法使用的劑量、給藥方案、和給藥途徑方面的信息。包裝物可以是單位劑量、大容積包裝(例如，多劑量包裝)或亞單位劑量。本發(fā)明試劑盒中提供的說(shuō)明書(shū)通常為標(biāo)簽上或包裝插入物(例如，包含在試劑盒中的紙張)上的書(shū)面指示，但也可以接受機(jī)讀的指示(例如，在磁盤(pán)或光存儲(chǔ)盤(pán)上執(zhí)行的指示)。

2.實(shí)驗(yàn)

下面是實(shí)現(xiàn)本發(fā)明特定實(shí)施方案的例子。提供這些例子僅用于說(shuō)明性目的，而無(wú)意以任何方式限制本發(fā)明范圍。

已經(jīng)盡力以保證關(guān)于所用數(shù)字(例如，量、溫度等)的精確度，但是，當(dāng)然應(yīng)該允許一些實(shí)驗(yàn)錯(cuò)誤和偏差。

材料與方法

aav載體。范例人smn1基因的開(kāi)放閱讀框(開(kāi)放閱讀框序列顯示于圖9a；對(duì)應(yīng)的氨基酸序列顯示于圖9b；以genbank登錄號(hào)nm_000344可找到完整的核苷酸序列)被克隆至一個(gè)含有aav2反向末端重復(fù)(itr)和1.6kb巨細(xì)胞病毒增強(qiáng)子/雞β-肌動(dòng)蛋白(cba)啟動(dòng)子或scaav2itr和0.4kb人β-葡萄糖苷酸酶(gusb)啟動(dòng)子的穿梭質(zhì)粒中。scaav包裝反應(yīng)中重組基因組的尺寸限制需要小啟動(dòng)子的使用(mccarty,d.m.molec.ther.(2008)16：1648-1656)。因此，選擇0.4kbgusb啟動(dòng)子，因?yàn)槠淦毡楸磉_(dá)遍及包括脊髓運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的cns(passini等，j.virol.(2001)75：12382-12392)。通過(guò)三質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染人293細(xì)胞將每個(gè)重組質(zhì)粒包裝進(jìn)aav血清型8衣殼(見(jiàn)，例如美國(guó)專(zhuān)利號(hào)6,001,650，在此以其全文引入做為參考)，并且如以前報(bào)道的將病毒粒子柱純化(o'riordan等，j.genemed.(2000)2：444-454.)。得到的載體aav2/8-cba-hsmnl(aav-hsmnl)和scaav2/8-gusb-hsmnl(scaav-hsmnl)分別擁有每ml8.3e12和2.8e12基因組拷貝的滴度。

動(dòng)物和方法。交配雜合體(smn^+/-、hsmn2^+/+、smnδ7^+/+)育種對(duì)，并且在出生日(p0)，新生幼鼠接受兩個(gè)腦半球的側(cè)腦室和上腰脊髓中的總共3次注射，每次2μl。對(duì)于aav-hsmn1和scaav-hsmn1，病毒載體總劑量分別是5.0e10和1.7e10的基因組拷貝。所有的注射用如(passini等，j.virol.(2001)75：12382-12392)所述精細(xì)拉成的玻璃微管針進(jìn)行。注射后，幼鼠被剪腳趾并測(cè)定基因型(le等，hum.moi.genet.(2005)14：845-857)以鑒定sma(smn^-/-、hsmn2^+/+、smnδ7^+/+)、雜合體和野生型(smn^+/+、hsmn2^+/+、smnδ7^+/+)小鼠。所有窩被揀選出7個(gè)幼鼠以控制存活的幼崽群大小。不注射一些幼崽以生成未治療對(duì)照組。

western雜交。為進(jìn)行生化分析，在16天和58-66天處死治療和未治療小鼠，用磷酸鹽緩沖液(pbs)灌注，解剖脊髓并分成腰椎、胸椎和頸椎段，并在液氮中速凍。使用t-per裂解緩沖液和蛋白酶抑制劑混合物(pierce，羅克福德，伊利諾斯州)、以50mg/ml濃度將組織勻漿。在10,000rcf下離心6分鐘使勻漿物澄清，并使用bca分析(pierce,羅克福德，伊利諾斯州)測(cè)量蛋白質(zhì)濃度。將10-20μg勻漿物蛋白質(zhì)在4-12％sds-page上分離，轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜上，并用小鼠單克隆抗-smn(1:5,000bdbiosciences，圣何塞，加利福尼亞州)和兔多克隆抗-β-微管蛋白(1:750，santacruzbiotechnology，圣克魯斯，加利福尼亞州)抗體檢測(cè)。用紅外線二抗(1:20,000，li-corbiosciences，林肯市，內(nèi)布拉斯加州))孵育膜，通過(guò)用odyssey(li-corbiosciences)定量熒光來(lái)觀察蛋白質(zhì)條帶。分子量標(biāo)記物確定了條帶大小。

免疫組化。為了組化分析，在16天和58-66天處死治療和未治療小鼠，用4％多聚甲醛(ph7.4)灌注，移出脊髓并放置于30％蔗糖中48-72小時(shí)，在oct中包埋并以低溫恒溫器切成10μm的冰凍切片。在室溫(rt)下將脊髓切片封閉1h，并隨后與小鼠單克隆抗-smn抗體(1：200稀釋)孵育以鑒定aav來(lái)源hsmn的表達(dá)，或與山羊多克隆抗-乙酰膽堿轉(zhuǎn)移酶(chat)抗體(millipore；伯靈頓，馬薩諸塞州；1：100稀釋)孵育以鑒定脊髓第8層和9層(腹角)的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元，或兔多克隆抗膠質(zhì)細(xì)胞原纖維酸性蛋白(gfap)抗體(sigma-aldrich，1:2,500稀釋)以鑒定星形細(xì)胞。在rt下孵育一抗1h，隨后在4℃、在濕室中孵育過(guò)夜。然后脊髓切片與fitc偶聯(lián)的抗兔二抗或gy3偶聯(lián)的抗山羊二抗(jacksonimmunoresearch；西格羅夫，賓夕法尼亞州：1：250稀釋)在rt下孵育1h。為增加smn和chat免疫陽(yáng)性信號(hào)，分別根據(jù)廠家指導(dǎo)進(jìn)行tsa信號(hào)擴(kuò)增試劑盒(perkinelmer；沃爾瑟姆，馬薩諸塞州)或檸檬酸抗原恢復(fù)步驟(vectorlabs；伯靈格姆，加利福尼亞州)。用vectashield封片介質(zhì)(vectorlabs；伯靈格姆，加利福尼亞州)封蓋切片。

運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元計(jì)數(shù)。在頸椎、胸椎和腰椎段中計(jì)數(shù)chat免疫陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)。在沿三個(gè)脊髓段縱軸的腹角中以100x放大率進(jìn)行兩側(cè)計(jì)數(shù)。鄰近片層至少相隔100微米以防止相同細(xì)胞的兩次計(jì)數(shù)。特別注意比較不同動(dòng)物間的解剖學(xué)相匹配片層并且由單一觀察者盲法評(píng)估所有細(xì)胞計(jì)數(shù)。位于脊髓第8層和第9層、表現(xiàn)出明顯高于背景的熒光chat信號(hào)的細(xì)胞被認(rèn)為是運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元。

肌纖維大小。為外周組織學(xué)分析，如(avila等，j.clin.invest.(2007)117：659-671)報(bào)道，以石蠟處理來(lái)自每只小鼠右側(cè)的固定四頭肌、腓腸肌和肋間肌、并染色蘇木精伊紅以確定肌纖維大小。來(lái)自每只動(dòng)物的每個(gè)肌肉的大約500個(gè)非重疊肌纖維被隨機(jī)選取并以60x放大率拍照。使用metamorph軟件(moleculardevices，桑尼維爾，加利福尼亞州)測(cè)量每個(gè)肌纖維的橫斷面積。

神經(jīng)肌接頭染色(nmj)。來(lái)自每只小鼠左側(cè)的固定肌肉群被保存在pbs中用于nmj分析。如(lesbordes等，hum.mol.genet.(2003)12：1233-1239)報(bào)道，進(jìn)行來(lái)自四頭肌、腓腸肌和肋間肌的所挑肌肉纖維的全部染色。通過(guò)與針對(duì)150kd神經(jīng)絲同型的兔多克隆抗體(nf-m，millipore，比爾里卡，馬薩諸塞州，1：200稀釋)在4℃孵育過(guò)夜、隨后用生物素化抗兔二抗(jacksonimmunoresearch，1：200稀釋)標(biāo)記前突觸神經(jīng)末梢。用1：5000的alexa555偶聯(lián)的α-金環(huán)蛇毒素(molecularprobes，尤金，俄勒岡州)在rt下3h標(biāo)記肌肉終板上的乙酰膽堿受體。將染色的肌纖維固定在載片上，用vectashield封片，并在落射熒光下觀察。為nmj定量，隨機(jī)選擇來(lái)自每只動(dòng)物的每個(gè)肌肉的最小100個(gè)nmj，并在顯微鏡下評(píng)估。使用zeisslsm510-meta顯微鏡捕獲共聚焦影像。

行為試驗(yàn)。在正位反射中，每只小鼠被放置于仰臥位，并測(cè)定小鼠在所有四爪之上重定位自身所花費(fèi)的時(shí)間。對(duì)于每只動(dòng)物重復(fù)步驟3次，三個(gè)分?jǐn)?shù)的平均值被定為扶正分?jǐn)?shù)。如果小鼠60秒內(nèi)不反應(yīng)，試驗(yàn)終止。在負(fù)趨地性中，每一只小鼠被放在45°平臺(tái)上面朝下方。如果小鼠轉(zhuǎn)動(dòng)180°成“頭部向上”位置，則認(rèn)為實(shí)驗(yàn)成功。給每只小鼠三次機(jī)會(huì)以在180秒或更短的時(shí)間完成任務(wù)。在握力強(qiáng)度中，前肢和后肢被一起放在線柵上并沿網(wǎng)格橫向輕輕拖動(dòng)。以力傳感器(以克為單位)記錄阻力。在后肢伸展試驗(yàn)中，通過(guò)尾巴將每只小鼠懸吊5秒，在任意系統(tǒng)基礎(chǔ)上記錄產(chǎn)生的伸展。與野生型小鼠中觀察到的類(lèi)似的兩后肢健康伸展給分為4。兩后肢的急劇伸展角度或“弱伸展”是3分。一次單腿伸展被定為2分。不表現(xiàn)伸展的小鼠給分為1。最后，當(dāng)幼鼠將兩后肢拉到一起、有效地將其穿過(guò)另一個(gè)時(shí)，出現(xiàn)0分。

統(tǒng)計(jì)學(xué)。用單向anova和bonferroni多重posthoc比較和非配對(duì)雙尾學(xué)生t-檢驗(yàn)分析行為試驗(yàn)、運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元數(shù)目、肌纖維橫截面積和nmj。用相當(dāng)于mantel-haenszel檢驗(yàn)的log-rank檢驗(yàn)分析kaplan-meier存活曲線。所有的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析用graphpadprismv4.0(graphpadsoftware，圣地亞哥，加利福尼亞州)進(jìn)行。p<0.05的值被認(rèn)為有顯著性。

實(shí)施例1

使用aav介導(dǎo)的smn1傳遞的治療顯著增加了存活率

向生后0天(p0)的sma小鼠腦室內(nèi)注射aav-hsmn1到兩側(cè)腦室，并通過(guò)直接脊髓注射進(jìn)上腰脊髓每只小鼠總劑量5.0e10的基因組拷貝。將治療和未治療sma小鼠隨機(jī)分為存活群(其中所有小鼠保持不被打擾并在人道終點(diǎn)被處死)，或分為年齡相當(dāng)群(其中所有小鼠在與末期未治療sma小鼠做年齡匹配比較16天后被處死)。

在存活群中，與未治療sma對(duì)照的15天相比，以aav-hsmn1治療sma小鼠顯示壽命中值顯著增加至50天(p<0.0001，圖1)。所有治療sma小鼠在15天還活著，與未治療sma小鼠的0％相比，治療sma小鼠的87.5％在19天還活著。kaplan-meier曲線表顯示治療的雙峰生存分布，其中第一組在17-27天死亡，而第二組在58-66天死亡(圖1)。在第一組，大部分治療sma小鼠顯示了離床活動(dòng)，但小鼠生長(zhǎng)有障礙并且最終發(fā)現(xiàn)死于籠中。第二組治療sma小鼠在58-66天表現(xiàn)出離床活動(dòng)和體重增加，但最終發(fā)展成嚴(yán)重的后肢壞死，導(dǎo)致動(dòng)物的安樂(lè)死。照這樣，58-66天的小鼠與16天的年齡相當(dāng)群平行分析。

實(shí)施例2

smn在脊髓中的aav-介導(dǎo)表達(dá)和運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元計(jì)數(shù)

在cns給藥aav-hsmn1之后，hsmn蛋白水平增加遍及脊髓。在aav治療sma小鼠的16天，與未治療sma和野生型小鼠相比，在注射腰椎段中的hsmn蛋白水平分別增加了大約34.0和3.6倍(圖2a)。hsmn蛋白表達(dá)的增加延伸至其他段，其包括在16天、胸椎和頸椎脊髓中增加到野生型水平之上>2.0倍(圖2b和2c)。在第二組中，hsmn蛋白表達(dá)在aav治療sma小鼠中持續(xù)58-66天。注射的腰椎和相鄰胸椎和頸椎區(qū)分別比年齡相當(dāng)wt對(duì)照高大約2.5、2.2和1.2倍。

組織切片的免疫染色顯示在16天和58-66天、治療sma小鼠脊髓背角和腹角中的hsmn蛋白(圖3)。通過(guò)密切檢查轉(zhuǎn)化細(xì)胞，檢測(cè)到遍布細(xì)胞質(zhì)及核中紋樣結(jié)構(gòu)中以斑點(diǎn)模式的載體來(lái)源hsmn的表達(dá)(圖3a)。而且，hsmn蛋白定位于不同顆粒樣結(jié)構(gòu)中的神經(jīng)突，該顆粒樣結(jié)構(gòu)能被觀察到跨越樹(shù)突和軸突全長(zhǎng)(圖3b-3d)。在sma小鼠中很低水平內(nèi)源性hsmn蛋白低于細(xì)胞中免疫檢測(cè)閾值(圖3e)。

chat和hsmn的共定位證實(shí)了轉(zhuǎn)化細(xì)胞的一個(gè)亞類(lèi)實(shí)際上是運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元(圖3f-3i)。在16天，aav-hsmn1轉(zhuǎn)化了在脊髓腰椎、胸椎和椎頸段大約18-42％的chat陽(yáng)性細(xì)胞(圖3j)。此百分?jǐn)?shù)在58-66天更高，其中在三個(gè)脊髓段有60-70％的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元表達(dá)外源hsmn(圖3j)。與未治療突變體相比，治療sma小鼠中運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元數(shù)目有總體增加(圖4)。然而，在16天和58-66天，與野生型小鼠相比，治療sma小鼠中的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元明顯更少(圖4)。

進(jìn)行了來(lái)自未治療、只腦室內(nèi)(icv)注射和僅腰椎注射的雜合體小鼠的頸椎組織切片的hsmn免疫染色。單獨(dú)icv注射對(duì)于腦中明顯的aav轉(zhuǎn)化情況沒(méi)有貢獻(xiàn)，但盡管如此，生成了用僅腰部注射不能實(shí)現(xiàn)的頸部脊髓的實(shí)質(zhì)性靶標(biāo)。特別是，僅icv注射導(dǎo)致了頸部脊髓表達(dá)hsmn。這與腰椎段的實(shí)質(zhì)內(nèi)注射相反，該注射顯示出很少的頸部脊髓轉(zhuǎn)化，可能是因?yàn)樘幱谧⑸洳课坏慕h(yuǎn)端。有時(shí)，在未治療雜合體和野生型小鼠的核內(nèi)可觀察到具有紋樣外觀的smn免疫陽(yáng)性信號(hào)。然而，在未治療sma小鼠核內(nèi)觀察不到這個(gè)免疫染色模式。

因此，在p0小鼠中icv和腰椎注射的組合提供了廣泛、普遍的脊髓轉(zhuǎn)化。aav8-hsmn的icv注射靶標(biāo)用于轉(zhuǎn)化的錯(cuò)頸部脊髓。

實(shí)施例3

aav治療對(duì)肌纖維尺寸、nmj和行為的影響

選擇四頭肌(近端)、腓腸肌(遠(yuǎn)端)和肋間肌(呼吸)肌肉用于分析，因?yàn)樗鼈冿@示出明顯的退行。在第16天、未治療sma小鼠中，肌纖維是小的而且多數(shù)單個(gè)細(xì)胞包含<100μm²的橫截面積(圖5a)。來(lái)自未治療sma小鼠的少于10％的肌纖維包含大于200μm²的橫截面積。相反地，在aav-hsmn1治療sma小鼠中肌纖維尺寸的分布與野生型相似，且許多細(xì)胞在16天和58-66天分別具有大于200或大于400μm²的橫截面積(圖5a和5b)。在16天的整體平均值顯示來(lái)自治療sma小鼠的肌纖維比那些來(lái)自未治療sma小鼠的大2倍以上(圖5c)。另外，在58-66天、治療sma小鼠中，四頭肌、腓腸肌和肋間肌的平均肌纖維橫截面積分別為野生型小鼠的67％、76％和82％(圖5c)。

來(lái)自16天未治療sma小鼠的神經(jīng)肌接頭(nmj)分析顯示在前突觸末端神經(jīng)絲蛋白的異常積累(圖6a)。在未治療sma小鼠中來(lái)自四頭肌、腓腸肌和肋間肌的大約75-90％的前突觸末端顯示出此標(biāo)志性病理(圖6f)。相反地，來(lái)自aav-hsmn1治療sma小鼠的大部分前突觸末端不含有此萎縮結(jié)構(gòu)(圖6b、6d)。在16天和58-66天，分別只有來(lái)自sma小鼠的10-25％和5％的前突觸末端顯示出此標(biāo)志性病理(圖6f)。然而，與野生型相比，治療導(dǎo)致了在前突觸末端更多的分枝(圖6b-6e)。在來(lái)自治療sma和野生型小鼠的后突觸nmj上，α-金環(huán)蛇毒素染色產(chǎn)生了“餅樣”結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)是乙酰膽堿受體功能網(wǎng)絡(luò)的指示物(圖6b-6e)。

對(duì)治療和非治療小鼠進(jìn)行已在此小鼠模型驗(yàn)證了的周期性行為試驗(yàn)(butchbach等，neurobiol.dis.(2007)27：207-219；el-khodar等，exp.neurol.(2008)212：29-43)。治療sma小鼠具有良好的身體分值和走動(dòng)技巧，而未治療小鼠是不受控制及麻痹的(圖7a)。治療sma小鼠比未治療sma對(duì)照明顯更重，盡管它們從未達(dá)到野生型的大小(圖7b)。治療sma小鼠在扶正延遲中顯示出顯著改善(圖7c)。在治療sma小鼠完成負(fù)趨地性試驗(yàn)中也有顯著的改善，該試驗(yàn)測(cè)量空間運(yùn)動(dòng)行為(圖7d)。另外，治療sma小鼠在握力強(qiáng)度和伸展其后肢能力中也顯示出顯著的改善(圖7e、7f)。

實(shí)施例4

使用自身互補(bǔ)aav對(duì)壽命的影響

不為理論所限制，由于雙鏈重組基因組，預(yù)期自身互補(bǔ)aav(scaav)載體具有更快的表達(dá)動(dòng)力學(xué)(綜述于mccarty,d.m.molec.ther.(2008)16：1648-1656)。這種表達(dá)的快速增加可能在高侵略性疾病或介入時(shí)間窗口小的病征中是有益的。因此，為確定早期表達(dá)是否能夠改善效率，設(shè)計(jì)并檢驗(yàn)了一個(gè)scaav載體(scaav-hsmn1)。使用如實(shí)施例1中進(jìn)行的相同注射位點(diǎn)，將劑量為1.7e10基因組拷貝的scaav-hsmn1給藥到p0sma小鼠。

以scaav-hsmn1治療導(dǎo)致了157天的生存中值引人注目和顯著的改善(p<0.0001)，其相比于aav-hsmn1治療和未治療小鼠分別增加了+214％和+881％(圖8)。大約42％的scaav治療小鼠具有大于1000％的生存中值的增加(對(duì)數(shù)倍增加)。而且，scaav2/8-gusb-hsmn1治療導(dǎo)致了88％的sma小鼠生存超過(guò)66天,相反aav2/8-cba-hsmn1治療的為0％。scaav治療sma小鼠具有健康的身體分?jǐn)?shù)，養(yǎng)得很好，體重增加，并在其整個(gè)生命中保持下地活動(dòng)。有趣的是，scaav治療sma小鼠僅發(fā)展成輕微的后肢壞死，此壞死從不進(jìn)展成嚴(yán)重的表型。大多數(shù)scaav治療sma小鼠死于未預(yù)期的及突然出現(xiàn)的呼吸窘迫，其包括呼吸時(shí)聽(tīng)得見(jiàn)的咔噠的喘息和降低的呼吸率。

為了更好的理解使用scaav8-hsmn所觀察到的生存率增加的基礎(chǔ)，在p0治療另外的sma小鼠、并在注射后16或64(58-66d)天處死，從生存曲線中分析長(zhǎng)期生存的scaav8治療小鼠(圖8)。在16天，來(lái)自scaav8-hsmn組的smn表達(dá)水平大約是那些wt動(dòng)物中觀察到的60-90％。這些水平實(shí)質(zhì)上低于在此時(shí)間點(diǎn)的aav8-hsmn治療得到的水平。在scaav8-hsmn治療sma小鼠中，在58-66和120-220天，腰椎和胸椎段的smn水平分別高于或等于wt水平(圖2a和2b)。相反，在所有時(shí)間點(diǎn)，頸部脊髓中的smn水平保持相對(duì)低。

使用hsmn免疫染色來(lái)自注射后16天和157天的未治療sma、aav8-hsmn治療sma、和scaav8-hsmn治療sma小鼠的冰凍組織切片，檢測(cè)腰椎脊髓中aav載體向性比較。在使用aav8-hsmn的16天觀察到與神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)學(xué)一致的彌散hsmn免疫染色模式。hsmn和mgfap的雙免疫標(biāo)記證實(shí)了aav8-hsmn轉(zhuǎn)化細(xì)胞的一亞類(lèi)是星形膠質(zhì)細(xì)胞。相反地，scaav8治療導(dǎo)致了hsmn僅在具神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)的不同細(xì)胞體中表達(dá)，其不與gfap共定位。hsmn和運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元標(biāo)記物mchat的雙免疫標(biāo)記證實(shí)了scaav8-hsmn和aav8-hsmn轉(zhuǎn)化細(xì)胞的一亞類(lèi)是運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元。如以157天的scaav8-hsmn所示范的，也可以在有兩種表達(dá)載體的脊髓中間神經(jīng)元細(xì)胞層中觀察到hsmn表達(dá)。因此，與aav8-hsmn相反，scaav8-hsmn治療sma小鼠的組織分析顯示，hsmn表達(dá)很大程度上限制于神經(jīng)元。

此外，hsmn和mchat的雙免疫染色顯示，與aav8-hsmn相比、用scaav8-hsmn轉(zhuǎn)化的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元百分?jǐn)?shù)顯著增加(圖10a)。用scaav更有效的靶標(biāo)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元與chat-陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)的顯著增加有關(guān)(圖10b-10d)。在16天、對(duì)四頭肌和肋間肌中nmj的分析也顯示，與aav8-hsmn相比、用scaav-hsmn顯著降低了萎縮結(jié)構(gòu)的數(shù)量(圖10e和10f)。然而，在216-269天的異常nmj數(shù)量有所增加，其伴隨著scaav-hsmn組中運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元細(xì)胞計(jì)數(shù)的降低(圖10b-10f)。

總結(jié)而言，在出生時(shí)、將aav8-hsmn注射到sma小鼠模型的cns中導(dǎo)致了遍布脊髓的smn廣泛表達(dá)，該表達(dá)翻譯成骨骼肌生理的強(qiáng)勁改善。治療sma動(dòng)物還表現(xiàn)出行為試驗(yàn)上的顯著改善，表明神經(jīng)肌接頭是有功能的。重要的是，以aav8-hsmn治療增加sma小鼠壽命中值至50天，相比于未治療對(duì)照為15天。而且，用自身互補(bǔ)aav載體注射sma小鼠導(dǎo)致了改善的效率，包括顯著延長(zhǎng)壽命中值至157天。這些數(shù)據(jù)表明，cns定向、aav介導(dǎo)的smn增強(qiáng)在解決嚴(yán)重sma小鼠模型的神經(jīng)和肌肉病變中是非常有效的。

因此，本發(fā)明公開(kāi)了治療脊髓疾病的組合物和方法。盡管發(fā)明主旨的優(yōu)選實(shí)施例已被詳細(xì)描述，應(yīng)當(dāng)理解在不偏離在此所述的發(fā)明精神和范圍的情況下能夠做明顯的變動(dòng)。