本發(fā)明涉及一種高純青蒿素的生物提取方法，屬于植物藥有效成分提取技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

青蒿素是指復(fù)合花序植物黃花蒿（即中藥青蒿）葉中提取得到的一種無(wú)色針狀晶體，它的莖中不含藥青蒿。分子式為C₁₅H₂₂O₅。是對(duì)于腦型瘧疾和抗氯喹瘧疾，具有速效和低毒的特點(diǎn)的有效藥物，曾被世界衛(wèi)生組織稱(chēng)做是“世界上唯一有效的瘧疾治療藥物”?？汞懠沧饔脵C(jī)理主要在于在治療瘧疾的過(guò)程通過(guò)青蒿素活化產(chǎn)生自由基，自由基與瘧原蛋白結(jié)合，作用于瘧原蟲(chóng)的膜系結(jié)構(gòu)，使其泡膜、核膜以及質(zhì)膜均遭到破壞，線粒體腫脹，內(nèi)外膜脫落，從而對(duì)瘧原蟲(chóng)的細(xì)胞結(jié)構(gòu)及其功能造成破壞。根據(jù)世衛(wèi)組織的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，自2000年起，撒哈拉以南非洲地區(qū)約2.4億人口受益于青蒿素聯(lián)合療法，約150萬(wàn)人因該療法避免了瘧疾導(dǎo)致的死亡。因此，很多非洲民眾尊稱(chēng)其為東方神藥。

目前現(xiàn)有以青蒿酸為原料制備青蒿素提取回收率極低，在10%以內(nèi)，工藝流程十分復(fù)雜，需要反復(fù)柱層析，且青蒿素和其生物及化學(xué)合成前體的制備方法，工藝流程復(fù)雜、提取回收率低、僅單一提取純化青蒿素、溶劑易燃易爆，同時(shí)提取后的青蒿素對(duì)胚胎有較高的選擇性毒性，較低劑量即可使胚胎死亡而導(dǎo)致流產(chǎn)，注射部位淺時(shí)，易引起局部疼痛和硬塊，安全型較差，所以急需一種安全型較強(qiáng)、提取率較高的青蒿素提取方法。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題：針對(duì)目前現(xiàn)有提取的青蒿素對(duì)胚胎有較高的毒性，安全性較低，且工藝流程十分復(fù)雜，需要反復(fù)柱層析的問(wèn)題，提供了一種高純青蒿素的生物提取方法，本發(fā)明通過(guò)制備出一種無(wú)菌復(fù)合培養(yǎng)基，將含有青蒿素的黃花蒿接種培養(yǎng)，以吲哚乙酸導(dǎo)流，富集于葉片，經(jīng)腐爛、水解、發(fā)霉、最終收集霉菌，過(guò)柱洗脫，蒸餾得一種無(wú)生物毒性的青蒿素選本發(fā)明將富集青蒿素的葉片進(jìn)行水解，葉片中植物蛋白水解形成的多肽和氨基酸與青蒿素中過(guò)氧基團(tuán)進(jìn)行復(fù)合，改善青蒿酸生物毒性，可使青蒿素安全性大大增強(qiáng)，從而降低對(duì)生物安全的威脅。

為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明采用如下所述的技術(shù)方案是：

（1）選取黃花蒿嫩葉片，用清水洗滌3～5次后，自然晾干，收集干燥黃花蒿嫩葉片，按質(zhì)量比1:8，將其與質(zhì)量分?jǐn)?shù)75%乙醇溶液攪拌混合，浸泡處理3～5h后，用紫外燈滅菌處理10～15min，隨后在無(wú)菌條件下，將滅菌處理后的葉片切割至大小為1.0cm²的嫩葉葉片，備用；

（2）按重量份數(shù)計(jì)，分別稱(chēng)量1～2份六芐氨基嘌呤、2～3份激動(dòng)素、2～3份吲哚乙酸和3～5份2,4-二氯苯氧乙酸和15～20份去離子水置于燒杯中，攪拌混合收集得激素調(diào)節(jié)液，按質(zhì)量比1:5;25，將激素調(diào)節(jié)液、豆粕和MS培養(yǎng)基混合，制備得初級(jí)培養(yǎng)基；

（3）將上述制備的初級(jí)培養(yǎng)基置于28～32℃發(fā)酵處理2～3天，過(guò)濾并收集濾液，在120～125℃下滅菌處理10～15min，在3500～4000r/min下離心分離10～15min，收集上層清液，再按質(zhì)量比1:10，將純度≥97%的青蒿素與上層清液攪拌混合，在45～50℃下水浴加熱1～2h，制備得青蒿酸混合液；

（4）按質(zhì)量比1:5.將上述制備的青蒿酸混合液與MS培養(yǎng)基攪拌混合，紫外燈滅菌處理10～15min，制備得無(wú)菌復(fù)合培養(yǎng)基，按質(zhì)量比1:25，將步驟（1）制備的嫩葉葉片接種至無(wú)菌復(fù)合培養(yǎng)基上，隨后每隔24h，按0.05g/cm²施加量，將3g/L吲哚乙酸無(wú)水乙醇溶液淋灑至嫩葉葉片表面，在24～28℃下弱光培養(yǎng)10～12天，控制光強(qiáng)為15～20Lx；

（5）待培養(yǎng)完成后，收集葉片并密封發(fā)酵5～7天，待發(fā)酵完成后，將其搗碎并質(zhì)量4500～6000r/min離心分離10～15min，隨后過(guò)濾并收集上層清液，，將上層清液通過(guò)Sephadex LH-20凝膠柱進(jìn)行洗脫處理，控制凝膠柱中流動(dòng)相為甲醇-氯仿混合液，甲醇：氯仿=7:3，待洗脫完成后收集得油狀物，即得一種高純青蒿素。

本發(fā)明的應(yīng)用方法：按重量份數(shù)計(jì)，分別稱(chēng)量1～2份本發(fā)明制得的青蒿素、10～15份淀粉、7～8份質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%羧甲基淀粉溶液、2～3份硬脂酸鎂和25～30份去離子水?dāng)嚢杌旌?，隨后注模壓片并干燥固化制備得青蒿素片劑，將制得的青蒿素片劑按每次一片，每天三次的劑量進(jìn)行服用，經(jīng)檢測(cè)，本發(fā)明可使瘧原蟲(chóng)對(duì)異亮氨酸的攝入量減少90.5%，人體過(guò)敏率為0.3%，安全性較強(qiáng)。

本發(fā)明與其他方法相比，有益技術(shù)效果是：

（1）本發(fā)明制得的青蒿素可使瘧原蟲(chóng)對(duì)異亮氨酸的攝入量減少90%以上；

（2）本發(fā)明制得的青蒿素人體過(guò)敏率低于0.5%，安全性較強(qiáng)；

（3）本發(fā)明制得的青蒿素原料環(huán)保無(wú)公害，對(duì)環(huán)境無(wú)污染。

具體實(shí)施方式

首先選取黃花蒿嫩葉片，用清水洗滌3～5次后，自然晾干，收集干燥黃花蒿嫩葉片，按質(zhì)量比1:8，將其與質(zhì)量分?jǐn)?shù)75%乙醇溶液攪拌混合，浸泡處理3～5h后，用紫外燈滅菌處理10～15min，隨后在無(wú)菌條件下，將滅菌處理后的葉片切割至大小為1.0cm²的嫩葉葉片，備用；按重量份數(shù)計(jì)，分別稱(chēng)量1～2份六芐氨基嘌呤、2～3份激動(dòng)素、2～3份吲哚乙酸和3～5份2,4-二氯苯氧乙酸和15～20份去離子水置于燒杯中，攪拌混合收集得激素調(diào)節(jié)液，按質(zhì)量比1:5;25，將激素調(diào)節(jié)液、豆粕和MS培養(yǎng)基混合，制備得初級(jí)培養(yǎng)基；將上述制備的初級(jí)培養(yǎng)基置于28～32℃發(fā)酵處理2～3天，過(guò)濾并收集濾液，在120～125℃下滅菌處理10～15min，在3500～4000r/min下離心分離10～15min，收集上層清液，再按質(zhì)量比1:10，將純度≥97%的青蒿素與上層清液攪拌混合，在45～50℃下水浴加熱1～2h，制備得青蒿酸混合液；按質(zhì)量比1:5.將上述制備的青蒿酸混合液與MS培養(yǎng)基攪拌混合，紫外燈滅菌處理10～15min，制備得無(wú)菌復(fù)合培養(yǎng)基，按質(zhì)量比1:25，將嫩葉葉片接種至無(wú)菌復(fù)合培養(yǎng)基上，隨后每隔24h，按0.05g/cm²施加量，將3g/L吲哚乙酸無(wú)水乙醇溶液淋灑至嫩葉葉片表面，在24～28℃下弱光培養(yǎng)10～12天，控制光強(qiáng)為15～20Lx；待培養(yǎng)完成后，收集葉片并密封發(fā)酵5～7天，待發(fā)酵完成后，將其搗碎并質(zhì)量4500～6000r/min離心分離10～15min，隨后過(guò)濾并收集上層清液，將上層清液通過(guò)Sephadex LH-20凝膠柱進(jìn)行洗脫處理，控制凝膠柱中流動(dòng)相為甲醇-氯仿混合液，甲醇：氯仿=7:3，待洗脫完成后收集得油狀物，即得一種高純青蒿素。

實(shí)例1

首先選取黃花蒿嫩葉片，用清水洗滌3次后，自然晾干，收集干燥黃花蒿嫩葉片，按質(zhì)量比1:8，將其與質(zhì)量分?jǐn)?shù)75%乙醇溶液攪拌混合，浸泡處理3h后，用紫外燈滅菌處理10min，隨后在無(wú)菌條件下，將滅菌處理后的葉片切割至大小為1.0cm²的嫩葉葉片，備用；按重量份數(shù)計(jì)，分別稱(chēng)量1份六芐氨基嘌呤、2份激動(dòng)素、2份吲哚乙酸和3份2,4-二氯苯氧乙酸和15份去離子水置于燒杯中，攪拌混合收集得激素調(diào)節(jié)液，按質(zhì)量比1:5;25，將激素調(diào)節(jié)液、豆粕和MS培養(yǎng)基混合，制備得初級(jí)培養(yǎng)基；將上述制備的初級(jí)培養(yǎng)基置于28℃發(fā)酵處理2天，過(guò)濾并收集濾液，在120℃下滅菌處理10min，在3500r/min下離心分離10min，收集上層清液，再按質(zhì)量比1:10，將純度≥97%的青蒿素與上層清液攪拌混合，在45℃下水浴加熱1h，制備得青蒿酸混合液；按質(zhì)量比1:5.將上述制備的青蒿酸混合液與MS培養(yǎng)基攪拌混合，紫外燈滅菌處理10min，制備得無(wú)菌復(fù)合培養(yǎng)基，按質(zhì)量比1:25，將嫩葉葉片接種至無(wú)菌復(fù)合培養(yǎng)基上，隨后每隔24h，按0.05g/cm²施加量，將3g/L吲哚乙酸無(wú)水乙醇溶液淋灑至嫩葉葉片表面，在24℃下弱光培養(yǎng)10天，控制光強(qiáng)為15Lx；待培養(yǎng)完成后，收集葉片并密封發(fā)酵5天，待發(fā)酵完成后，將其搗碎并質(zhì)量4500r/min離心分離10min，隨后過(guò)濾并收集上層清液，將上層清液通過(guò)Sephadex LH-20凝膠柱進(jìn)行洗脫處理，控制凝膠柱中流動(dòng)相為甲醇-氯仿混合液，甲醇：氯仿=7:3，待洗脫完成后收集得油狀物，即得一種高純青蒿素。

按重量份數(shù)計(jì)，分別稱(chēng)量1份本發(fā)明制得的青蒿素、10份淀粉、7份質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%羧甲基淀粉溶液、2份硬脂酸鎂和25份去離子水?dāng)嚢杌旌希S后注模壓片并干燥固化制備得青蒿素片劑，將制得的青蒿素片劑按每次一片，每天三次的劑量進(jìn)行服用，經(jīng)檢測(cè)，本發(fā)明可使瘧原蟲(chóng)對(duì)異亮氨酸的攝入量減少90.5%，人體過(guò)敏率為0.3%，安全性較強(qiáng)。

實(shí)例2

首先選取黃花蒿嫩葉片，用清水洗滌4次后，自然晾干，收集干燥黃花蒿嫩葉片，按質(zhì)量比1:8，將其與質(zhì)量分?jǐn)?shù)75%乙醇溶液攪拌混合，浸泡處理4h后，用紫外燈滅菌處理12min，隨后在無(wú)菌條件下，將滅菌處理后的葉片切割至大小為1.0cm²的嫩葉葉片，備用；按重量份數(shù)計(jì)，分別稱(chēng)量2份六芐氨基嘌呤、3份激動(dòng)素、3份吲哚乙酸和4份2,4-二氯苯氧乙酸和17份去離子水置于燒杯中，攪拌混合收集得激素調(diào)節(jié)液，按質(zhì)量比1:5;25，將激素調(diào)節(jié)液、豆粕和MS培養(yǎng)基混合，制備得初級(jí)培養(yǎng)基；將上述制備的初級(jí)培養(yǎng)基置于29℃發(fā)酵處理2天，過(guò)濾并收集濾液，在122℃下滅菌處理12min，在3750r/min下離心分離12min，收集上層清液，再按質(zhì)量比1:10，將純度≥97%的青蒿素與上層清液攪拌混合，在47℃下水浴加熱2h，制備得青蒿酸混合液；按質(zhì)量比1:5.將上述制備的青蒿酸混合液與MS培養(yǎng)基攪拌混合，紫外燈滅菌處理12min，制備得無(wú)菌復(fù)合培養(yǎng)基，按質(zhì)量比1:25，將嫩葉葉片接種至無(wú)菌復(fù)合培養(yǎng)基上，隨后每隔24h，按0.05g/cm²施加量，將3g/L吲哚乙酸無(wú)水乙醇溶液淋灑至嫩葉葉片表面，在27℃下弱光培養(yǎng)11天，控制光強(qiáng)為17Lx；待培養(yǎng)完成后，收集葉片并密封發(fā)酵6天，待發(fā)酵完成后，將其搗碎并質(zhì)量5200r/min離心分離12min，隨后過(guò)濾并收集上層清液，將上層清液通過(guò)Sephadex LH-20凝膠柱進(jìn)行洗脫處理，控制凝膠柱中流動(dòng)相為甲醇-氯仿混合液，甲醇：氯仿=7:3，待洗脫完成后收集得油狀物，即得一種高純青蒿素。

按重量份數(shù)計(jì)，分別稱(chēng)量2份本發(fā)明制得的青蒿素、12份淀粉、8份質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%羧甲基淀粉溶液、3份硬脂酸鎂和27份去離子水?dāng)嚢杌旌?，隨后注模壓片并干燥固化制備得青蒿素片劑，將制得的青蒿素片劑按每次一片，每天三次的劑量進(jìn)行服用，經(jīng)檢測(cè)，本發(fā)明可使瘧原蟲(chóng)對(duì)異亮氨酸的攝入量減少90.5%，人體過(guò)敏率為0.3%，安全性較強(qiáng)。

實(shí)例3

首先選取黃花蒿嫩葉片，用清水洗滌5次后，自然晾干，收集干燥黃花蒿嫩葉片，按質(zhì)量比1:8，將其與質(zhì)量分?jǐn)?shù)75%乙醇溶液攪拌混合，浸泡處理5h后，用紫外燈滅菌處理15min，隨后在無(wú)菌條件下，將滅菌處理后的葉片切割至大小為1.0cm²的嫩葉葉片，備用；按重量份數(shù)計(jì)，分別稱(chēng)量2份六芐氨基嘌呤、3份激動(dòng)素、3份吲哚乙酸和5份2,4-二氯苯氧乙酸和20份去離子水置于燒杯中，攪拌混合收集得激素調(diào)節(jié)液，按質(zhì)量比1:5;25，將激素調(diào)節(jié)液、豆粕和MS培養(yǎng)基混合，制備得初級(jí)培養(yǎng)基；將上述制備的初級(jí)培養(yǎng)基置于32℃發(fā)酵處理3天，過(guò)濾并收集濾液，在125℃下滅菌處理15min，在4000r/min下離心分離15min，收集上層清液，再按質(zhì)量比1:10，將純度≥97%的青蒿素與上層清液攪拌混合，在50℃下水浴加熱2h，制備得青蒿酸混合液；按質(zhì)量比1:5.將上述制備的青蒿酸混合液與MS培養(yǎng)基攪拌混合，紫外燈滅菌處理15min，制備得無(wú)菌復(fù)合培養(yǎng)基，按質(zhì)量比1:25，將嫩葉葉片接種至無(wú)菌復(fù)合培養(yǎng)基上，隨后每隔24h，按0.05g/cm²施加量，將3g/L吲哚乙酸無(wú)水乙醇溶液淋灑至嫩葉葉片表面，在28℃下弱光培養(yǎng)12天，控制光強(qiáng)為20Lx；待培養(yǎng)完成后，收集葉片并密封發(fā)酵7天，待發(fā)酵完成后，將其搗碎并質(zhì)量6000r/min離心分離15min，隨后過(guò)濾并收集上層清液，將上層清液通過(guò)Sephadex LH-20凝膠柱進(jìn)行洗脫處理，控制凝膠柱中流動(dòng)相為甲醇-氯仿混合液，甲醇：氯仿=7:3，待洗脫完成后收集得油狀物，即得一種高純青蒿素。

按重量份數(shù)計(jì)，分別稱(chēng)量2份本發(fā)明制得的青蒿素、15份淀粉、8份質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%羧甲基淀粉溶液、3份硬脂酸鎂和30份去離子水?dāng)嚢杌旌?，隨后注模壓片并干燥固化制備得青蒿素片劑，將制得的青蒿素片劑按每次一片，每天三次的劑量進(jìn)行服用，經(jīng)檢測(cè)，本發(fā)明可使瘧原蟲(chóng)對(duì)異亮氨酸的攝入量減少90.5%，人體過(guò)敏率為0.3%，安全性較強(qiáng)。