本發(fā)明屬于轉基因植物的安全評價領域，具體涉及一種轉基因青蒿的環(huán)境安全評價方法。

背景技術：

瘧疾(malaria)是由瘧原蟲所致的蟲媒傳染病。瘧疾流行于102個國家和地區(qū)，據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)估計，有20億人口居住在疾病區(qū)，特別是在非洲、東南亞和中、南美洲的一些國家，惡性瘧死亡率極高。非洲地區(qū)的世界衛(wèi)生組織(WHO)對這種疾病的負擔是最重的，估計所有死亡中有90％的人死于瘧疾，而5歲以下的兒童占因瘧疾死亡的78％。

目前，對瘧疾最有效的治療方法是以青蒿素為基礎的聯(lián)合療法。青蒿素是從青蒿中分離出的倍半萜內(nèi)脂藥物，但青蒿的青蒿素含量很低，而青蒿素的人工合成則成本高，價格昂貴。

利用基因工程方法是一種很有望提高青蒿素產(chǎn)量的方法，近年來，青蒿素生物合成的分子調(diào)控機制研究取得了顯著性進展，青蒿素的生物合成途徑中的幾種編碼關鍵酶基因，包括ADS，AaWRKY1，CYP71AV1和CPR，已經(jīng)從青蒿中克隆。如：在唐克軒教授實驗室，通過農(nóng)桿菌介導的轉化，轉入CYP71AV1和CPR基因，獲得了轉基因青蒿GYR，該品系顯著增加了青蒿素的含量。在商業(yè)化之前，轉基因植物應該在環(huán)境釋放實驗中進行環(huán)境安全評價。

然而，轉基因(GM)植物的培育中，由于其潛在的生態(tài)及人類健康風險而受到關注，雖然在基因工程中只插入了一小段外源DNA序列，但是由此產(chǎn)生的新型的有機體可能導致雜草化或者環(huán)境生存的不耐受性，并且影響到生態(tài)環(huán)境等。因此，轉基因植物的抗逆性和生存能力的問題，必須進行系統(tǒng)的環(huán)境安全評價。轉基因植物在環(huán)境釋放和商業(yè)化中仍有許多問題還沒有答案。

我國農(nóng)業(yè)部(MOA)在1996年實施了轉基因法規(guī)，在商業(yè)化前，所有實驗研究、田間試驗和環(huán)境釋放的相關的生物安全評價都要求由轉基因生物安全委員會進行評估。

到目前為止，許多的轉基因植物已經(jīng)進行了田間試驗，并且，有些已經(jīng)商業(yè)化；然而，評估轉基因青蒿在環(huán)境釋放中的實驗仍未見報道研究。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種轉基因青蒿的環(huán)境安全評價方法，從形態(tài)學差異性、抗逆性以及基因漂移三個方面建立評估參數(shù)體系，本發(fā)明從以上三個方面建立的評價體系操作簡單，易于實現(xiàn)，直觀性強，結果準確性高，為轉基因青蒿品種的商業(yè)化種植及評估提供了技術支撐。

為了達到上述目的，本發(fā)明提供如下技術方案：

一種轉基因青蒿的環(huán)境安全評價方法，包括以下步驟：

1)農(nóng)藝性狀形態(tài)學測定

將轉基因青蒿植株從溫室內(nèi)移栽至大田種植區(qū)域內(nèi)，移植3-4個月后，測定植株的形態(tài)學參數(shù)，同時，以野生型青蒿作對照；

2)抗逆性評價

在溫室中進行轉基因青蒿的鹽脅迫、干旱脅迫、除草劑耐受以及越冬能力評價，同時，以野生型青蒿作對照；

3)基因漂移測定

設置矩形實驗場來進行基因漂移試驗，其面積不低于5畝，含外源基因的轉基因青蒿種植于中心點及其4-7個同心圓中，同心圓的半徑從內(nèi)到外以0.8-1.4m逐個增加，矩形實驗場的最短邊長應是同心圓最大半徑的4-9倍，同心圓外種植野生型青蒿，同時，在該矩形實驗場周圍設置物理隔離區(qū)；

在野生型受體青蒿種植區(qū)內(nèi)，沿同心圓的8個以上方向設置不少于72個測試點，呈米字形，收獲各測試點的青蒿種子，測定種子發(fā)芽率、并進行卡那霉素抗性篩選，對于抗卡那霉素的植株利用PCR方法進一步驗證其是否含有插入的外源基因。

進一步，步驟1)所述的生長形態(tài)參數(shù)為株高、冠幅、莖粗、種子發(fā)芽率、葉片干重、千粒重和葉片形狀。

又進一步，所述步驟1)中的生長形態(tài)參數(shù)中，對于株高、冠幅和莖粗，在植株的營養(yǎng)生長早期和中期分別測定；對于種子發(fā)芽率的測定過程為：取等量的轉基因青蒿種子，清洗后分別播種至基質(zhì)、水以及無菌培養(yǎng)基中，培養(yǎng)7-15天，按下式統(tǒng)計種子發(fā)芽率；

種子發(fā)芽率＝(發(fā)芽種子數(shù)/播種種子數(shù))×100。

又，步驟1)所述農(nóng)藝性狀形態(tài)學參數(shù)中，千粒重的測定過程為：收集30-50株植株的種子，數(shù)出1000粒并測定種子的千粒重。

進一步，步驟2)中，鹽脅迫測定中，測定了葉片的相對含水量、過氧化物酶活性、游離脯氨酸和丙二醛含量；干旱脅迫實驗在添加了PEG脅迫中進行，測定干旱脅迫中青蒿葉片中的游離脯氨酸、株高和復葉數(shù)差值；除草劑耐受性中所述的除草劑為非選擇性除草劑和選擇性除草劑。

優(yōu)選地，步驟3)中所述的矩形實驗場的寬度不低于長度的1/2，在該矩形實驗場周圍種植玉米隔離帶作為物理隔離區(qū)。

進一步，步驟3)中，一個方向由內(nèi)到外設置8～14個測試點，其中，測試點1～5之間每兩點間隔0.8m，測試點6～10之間每兩點間隔2.4m，測試點11～14之間每兩點間隔4.8米。

又優(yōu)選地，步驟3)中，收獲的青蒿種子來自植株的頂部、中部和下部，均勻采收。

進一步，步驟3)中，抗卡那霉素的植株被移植到穴盤壯苗后，生長15-25天后，從每株幼苗上選取3-5片葉片進行DNA的提取。

進一步，步驟3)中，導入了外源基因CYP71AV1和CPR的轉基因青蒿的基因漂移距離為29.2m。

通過基因工程提高青蒿中青蒿素的含量時，使參與青蒿素生物合成的限速酶基因進行過量表達是必不可少的，在提高了青蒿素產(chǎn)量的轉基因青蒿植物中，CYP71AV1和CPR基因進行了過量表達，然而，轉基因青蒿對于環(huán)境的影響是未知的，因此，本發(fā)明從農(nóng)藝性狀、抗逆性以及基因漂移等幾個方面，來探討轉基因青蒿GYR和野生型受體是否具有相似的生存競爭能力。

本發(fā)明中，依據(jù)個案分析原則，設置了形態(tài)學農(nóng)藝性狀差異性比較、耐鹽性、耐旱性、耐除草劑、越冬能力，以及基因漂移方法測定，系統(tǒng)的評價了轉基因青蒿的環(huán)境釋放后帶來的問題，設置的參數(shù)涵蓋了轉基因青蒿和其野生型受體差異性的各指標，為轉基因青蒿的環(huán)境釋放建立了模型，在說明兩者實質(zhì)等同性上具有重要意義，評估結果說明轉基因青蒿和其野生型受體具有實質(zhì)等同性，為其商業(yè)化生產(chǎn)奠定了基礎。

青蒿是異花授粉植物且自交的不親和性，使得外源基因是很容易被檢測出來。因此，轉基因和傳統(tǒng)植物之間的基因漂移應該同時評估。

本發(fā)明的評估方法中，在基因漂移方法的測定中，將轉基因青蒿植株作為一個花粉源栽培在圓圈中，可以有效捕捉由于風力或昆蟲的攜帶等帶來的各個方向的基因漂移，在監(jiān)測基因漂移距離上有很好的示范作用。

與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明的有益效果：

本發(fā)明通過對轉基因青蒿和其野生型受體的形態(tài)學差異性、生存競爭能力、以及基因漂移等幾個方面進行了轉基因植物的環(huán)境風險評估，為轉基因藥用植物青蒿的環(huán)境安全評價平臺的建立提供了參考。

本發(fā)明涵蓋了轉基因青蒿從實驗室層次進入商業(yè)化生產(chǎn)的環(huán)境釋放這個必經(jīng)過程，并且，在進行安全性評價的過程中，遵從了轉基因植物環(huán)境安全評價的原則。即進一步評價了轉基因青蒿對環(huán)境的影響；又根據(jù)個案分析原則，評價了其形態(tài)學農(nóng)藝性狀差異性、與環(huán)境適應能力、生存競爭能力、成為雜草的可能性以及其外源基因遺傳物質(zhì)向其他植物發(fā)生轉移的可能性及其后果。為其它轉基因植物的安全性評價體系的建立，提供了有益的參考模型，旨在為轉基因青蒿環(huán)境安全性評價提供依據(jù)。

附圖說明

圖1為本發(fā)明實施例中轉基因青蒿與野生型受體青蒿的株高評價結果。

圖2為本發(fā)明實施例中轉基因青蒿與野生型受體青蒿的莖粗評價結果。

圖3為本發(fā)明實施例中轉基因青蒿與野生型受體青蒿的冠幅評價結果。

圖4為本發(fā)明實施例中轉基因青蒿與野生型受體青蒿的發(fā)芽率評價結果。

圖5為本發(fā)明實施例中轉基因青蒿與野生型受體青蒿的葉片干重評價結果。

圖6為本發(fā)明實施例中轉基因青蒿與野生型受體青蒿的種子千粒重評價結果。

圖7為本發(fā)明實施例中轉基因青蒿與野生型受體青蒿的鹽脅迫下葉片含水量的測定結果。

圖8為本發(fā)明實施例中轉基因青蒿與野生型受體青蒿的鹽脅迫下過氧化物酶含量的測定結果。

圖9為本發(fā)明實施例中轉基因青蒿與野生型受體青蒿的鹽脅迫下丙二醛的測定結果。

圖10為本發(fā)明實施例中轉基因青蒿與野生型受體青蒿的鹽脅迫下脯氨酸含量的測定結果。

圖11為本發(fā)明實施例中轉基因青蒿與野生型受體青蒿的干旱脅迫下脯氨酸含量的測定結果。

圖12為本發(fā)明實施例中轉基因青蒿與野生型受體青蒿的干旱脅迫下復葉數(shù)差值的測定結果。

圖13為本發(fā)明實施例中轉基因青蒿與野生型受體青蒿的干旱脅迫下株高差值的測定結果。

圖14為本發(fā)明實施例中的基因漂移種植圖。

圖15為本發(fā)明實施例中的外源基因漂移點電泳圖。

圖16為本發(fā)明實施例中的基因漂移距離頻率圖。

圖17為本發(fā)明實施例中的基因漂移距離圖。

具體實施方式

以下結合具體實施例對本發(fā)明作進一步說明。

轉基因青蒿GYR品系由上海交通大學的唐克軒教授友情提供，農(nóng)桿菌介導轉化的青蒿由唐教授的實驗室采自重慶(Wang et al.,2012)，并且，野生型受體的青蒿野生型受體被用作對照。

轉基因青蒿GYR和野生型受體種于在上海農(nóng)業(yè)科學院的白鶴轉基因植物環(huán)境釋放試驗基地，對轉基因植物的環(huán)境風險評估是經(jīng)中國農(nóng)業(yè)部授權的。該基地位于上海的西北部青浦地區(qū)。它有亞熱帶季風氣候，四季分明，充足的日照和雨量，適合青蒿植株的生長。該基地周圍有混凝土墻，確保物理隔離。

溫室部分在上海農(nóng)業(yè)部的轉基因作物的環(huán)境安全監(jiān)督檢驗測試中心進行試驗，并且溫度維持在25℃。土壤介質(zhì)包含比例為7：2：1的有機質(zhì)、蛭石和珍珠巖。在這個溫室中沒有其它的轉基因植物。整個實驗室由一名保安進行監(jiān)督，并在實驗結束后燒毀所有的實驗材料。

實施例一種轉基因青蒿的環(huán)境安全評價方法，包括以下步驟：

1.準備農(nóng)藝性狀評估用實驗場地

按照中國轉基因生物安全評估法規(guī)，青蒿被種植在一個矩形實驗場地中，覆蓋面積約0.3公頃，其中長100m，寬30m；野生型受體玉米被種植在每個區(qū)域的周圍用來隔離GYR和野生型受體；所有植物在相應區(qū)域根據(jù)常規(guī)方法進行栽培，每個區(qū)域約種2304株(行間距為1.25m)。

2.檢測農(nóng)藝性狀

轉基因青蒿GYR和野生型受體在溫室生長2個月，然后移植至大田內(nèi)繼續(xù)生長，移植后，對死亡幼苗的數(shù)量進行計算。移植三個月后，對轉基因青蒿GYR和野生型受體植株的生長和形態(tài)進行比較，記錄其株高、冠幅、莖粗、發(fā)芽率、葉片干重、千粒重和葉片形狀，具體如下：

2.1株高、冠幅和莖粗

對青蒿的田間試驗，采用一個完全隨機區(qū)組的單因素設計。在每個區(qū)域中隨機抽取40株青蒿，用來確定營養(yǎng)生長早期和中期階段(兩個階段間隔1個月)的株高、冠幅和莖粗。

兩種青蒿在田間環(huán)境下移栽后基本上都順利成活，移栽存活率無顯著差異。轉基因青蒿GYR品系移栽后的生長發(fā)育進程與其野生型受體相似，均可分為緩苗期、營養(yǎng)生長盛期、花芽分化與初蕾期、盛蕾與初花期、盛花期和結實期6個階段。

兩種青蒿在八月份九月份生長最快，在青蒿營養(yǎng)生長后期，株高、冠幅、莖粗均快速增長，參見圖1-圖3。

由圖1-圖3可以看出，GYR的株高顯著高于野生型受體，莖粗顯著低于其野生型受體。然而，這兩個品種的生長趨勢是一致的。

2.2發(fā)芽率

發(fā)芽率的測定過程為：將兩種青蒿品種的種子先用洗滌劑洗，再用蒸餾水徹底沖洗，轉基因青蒿和野生型受體青蒿各取100粒種子，播種在裝有基質(zhì)的托盤中(所述基質(zhì)為：土壤：蛭石：珍珠巖＝7：3：1)，另取100粒種子播種在蒸餾水中，并且，還有100粒種子播種在無菌培養(yǎng)基中。在25℃培養(yǎng)7天后，用下式計算不同發(fā)芽環(huán)境下每個品種的發(fā)芽率：

種子發(fā)芽率(％)＝(發(fā)芽種子數(shù)/全部種子數(shù))×100。

結果參見圖4，可見，三種方式的發(fā)芽試驗中無菌培養(yǎng)發(fā)芽率最低，水培和土培高于無菌發(fā)芽方式，均在85％以上。但同一種培養(yǎng)方式下，轉基因青蒿的發(fā)芽率與其受體的發(fā)芽率相似的，無差異性。

2.3葉片干重

葉片干重的測定為：在開花階段，隨機挑選10片植物頂端的葉片，然后放在105℃烘箱中0.5h，迅速烘干水分。最后，葉片在70℃被干燥得到一個恒定的重量，并記錄這一干重數(shù)，這個步驟重復3次，參見圖5。

由圖5可見，兩種植物的葉片干重有明顯的差異，GYR葉片干重遠高于野生型受體，可能是由于GYR葉片較肥厚且大的原因造成的。兩種類型的青蒿葉片形狀均為三回櫛齒狀羽狀分裂，并且葉片的形態(tài)學沒有改變。

2.4千粒重

為了比較種子的千粒重，將30株植物的種子收集起來進行測定，因為青蒿的種子太小以至于很難收集，故使用20目的篩網(wǎng)進行雜質(zhì)過濾，再進行沖洗，最后進行千粒重數(shù)測，參見圖6。

由圖6可知，兩株植物間的千粒重并無明顯差異。

農(nóng)藝性狀測試結果說明，轉基因青蒿GYR和傳統(tǒng)的野生型受體植物間在形態(tài)學(株高，冠幅，莖粗)方面沒有明顯的不同，可以推斷插入的基因沒有改變青蒿的農(nóng)藝性狀。

3.測試抗逆性

在在溫室中進行抗逆性實驗，對轉基因青蒿進行鹽脅迫、干旱脅迫、除草劑耐受性以及越冬能力測定，同時，以野生型受體青蒿作對照，具體如下：

3.1鹽脅迫測試

設置五個脅迫組，每組6個植株，在植株5周時開始，用添加了NaCl的鹽溶液進行澆灌，濃度為0，0.4，0.8，1.2和1.6％(w/w)，9天之后，用下述公式對兩組脅迫中的植物葉片的相對含水量進行測量，結果參見圖7：

葉片相對含水量(％)＝[(鮮重-干重)/鮮重]×100。

從圖7可以看出，轉基因青蒿GYR和野生型受體兩種青蒿葉片的相對含水量(RWC)均比較高，范圍在94％～87％內(nèi)。增加鹽濃度，相對含水量沒有改變。用濃度0.8％(W/W)NaCl處理時，兩種青蒿葉片的葉片含水量最低，然而，鹽脅迫1.6％(W/W)時，GYR較野生型受體高。相對含水量的結果和葉片干重相吻合。

由此說明，鹽處理使這兩種青蒿均產(chǎn)生了一定的生理脅迫。大部分青蒿的葉片呈現(xiàn)出不同程度的萎蔫現(xiàn)象。兩種葉片的含水量在鹽脅迫下均無差異性。

過氧化物酶(POD)活性、游離脯氨酸和丙二醛(MDA)含量也被測定，測定結果參見圖8-圖10。

圖8中，隨著NaCl濃度的升高，兩種轉基因青蒿POD含量出現(xiàn)先上升后下降的趨勢。在1.2％NaCl時，POD含量最高，并且GYR的POD含量明顯低于野生型受體植物的含量(高達4600OD mg^-1.FW.min^-1)。然而，當NaCl低于0.4％時，GYR青蒿的POD含量顯著高于野生型受體。

從圖9可以看出，兩種轉基因青蒿的MDA含量出現(xiàn)先逐漸上升的趨勢，然而沒有明顯的差異，其中1.6％的NaCl脅迫時MDA含量是無脅迫的2.5倍，兩種青蒿葉片的MDA含量差異極顯著(P＜0.001)。這可能與模式過氧化程度不一樣相關。

脯氨酸能夠提高植物的吸水能力，這是植物在逆境下的一種自我調(diào)節(jié)機制，但是，當鹽濃度超過其自身調(diào)節(jié)范圍，其植物體內(nèi)的平衡也將打破，從而導致植物萎蔫。

由圖10可見，兩種轉基因青蒿的脯氨酸含量出現(xiàn)先上升后下降的趨勢。兩種青蒿在沒有鹽脅迫時，雖然GYR的脯氨酸含量高于野生型受體，但差異并不顯著。鹽脅迫存在時，觀察到的結果相反。在0.4-1.6％Nacl時，GYR脯氨酸的含量低于野生型受體，并且，當NaCl增加到1.6％時明顯不同。

3.2干旱脅迫測試

因PEG6000的分子量大，從而很難被完好無損的根系吸收，因此是干旱脅迫試驗中常用的脅迫劑，本實施例測定了在PEG模擬干旱脅迫下葉片脯氨酸的含量。

選取5周齡的植物來評估干旱脅迫影響，PEG6000添加到營養(yǎng)液中誘導干旱脅迫，每個青蒿品種的6株植物被濃度分別為0g/L、50g/L、100g/L、150g/L和300g/L的PEG6000進行脅迫，對干旱脅迫植物的游離脯氨酸含量、植物株高和復葉數(shù)差值行了測量，參見圖11-圖13。

由圖11可以看出，在無PEG脅迫時，GYR的脯氨酸含量高于野生型受體，差異不顯著。在PEG脅迫5天后，隨著PEG濃度的增加，青蒿葉片中的脯氨酸含量只有少許增加。15天后，脯氨酸整體水平升高，高濃度的PEG脅迫，脯氨酸含量升高顯著。其中，PEG濃度為300g/L時，GYR的脯氨酸含量高于野生型受體，但并不顯著(P>0.05)，且是200g/L野生型受體的2.7倍。15-25天期間，脯氨酸含量變化不明顯。25d時，在300g/L PEG脅迫下，GYR葉片的脯氨酸含量達到532.598μg/g(W/FW)，是未受脅迫時的7.97倍。在野生型受體植物中，高達8.51倍。整個實驗時期，兩種葉片的脯氨酸含量差異均不顯著。

高濃度PEG(300g/L)處理25d后，可以明顯看到植株底部的葉片出現(xiàn)葉片發(fā)黃、卷縮、枝干萎縮的現(xiàn)象，甚至底部枯死。但是低中濃度PEG(100和200g/L)處理后，并未顯著影響青蒿的生長，說明青蒿是一種較為耐旱的植物。

圖12-圖13顯示，沒有脅迫時，兩種青蒿植物表現(xiàn)出了相似的株高差值和復葉數(shù)差值，并都能夠保持自己的平衡。隨著PEG濃度的增加，株高差值表現(xiàn)出不同，生物量與復葉也不同。然而，在脅迫耐受性中轉基因青蒿GYR沒有表現(xiàn)出比野生型受體更強的生長勢，并且沒有顯著差異。當PEG濃度增加到300g/L時，株高和復葉增量下降。

3.3除草劑耐性

兩種除草劑購買于先正達公司(上海，中國)，非選擇性除草劑百草枯和選擇性芽前除草劑金都爾，用在青蒿的幼葉時期(真葉數(shù)≥15)。將百草枯噴到5周齡的植物上，金都爾被噴灑到播種3天后的GYR和野生型受體上。

在噴灑百草枯兩小時內(nèi)，所有的轉基因植株和對照植物都被殺死。金都爾是選擇性的芽前除草劑，并且在種子萌發(fā)前噴灑。兩種青蒿都沒有發(fā)芽，然而，沒有噴灑金都爾的對照組青蒿發(fā)芽，并且幼苗長勢很好。不管是否噴灑金都爾，轉基因和對照植物的表現(xiàn)是相似的，這表明，對于兩種常見的除草劑，轉基因組和對照組的耐受性是相同的。

3.4越冬能力觀察

在冬季，將轉基因青蒿和野生型受體青蒿種子播種在室外(最低溫度-8℃)，進行越冬性實驗觀察，比較下一代幼苗的生存率和在冬季生存的競爭力。

盡管GYR的越冬能力稍弱于野生型受體植物，但可以在上海的初冬環(huán)境下順利越冬(2℃-5℃)。這可以說明插入的基因?qū)η噍锏脑蕉芰]有影響。

4.測試基因漂移

在長80m，寬50m的矩形實驗場內(nèi)進行基因漂移實驗，轉基因青蒿種植于中心點及其5個同心圓中，同心圓的半徑從內(nèi)到外以1.2m逐個增加，其余面積用來種植青蒿野生型受體植株，當青蒿被種植后，將玉米種植在實驗場區(qū)的周圍作為物理隔離區(qū)，參見圖14。

在野生型受體青蒿種植區(qū)內(nèi)，沿同心圓的8個方向設置98個測試點，呈米字形，一個方向上設置8～14個測試點，其中，測試點1～5之間每兩點間隔0.8m，測試點6～10之間每兩點間隔2.4m，測試點11～14之間每兩點間隔4.8米，參見表1。

采用獨立樣本t檢驗用SPSS 16.0和GraphPadPrism v5.0軟件對所有數(shù)據(jù)進行比較分析。

測試種子發(fā)芽率：收獲各測試點的青蒿種子，青蒿種子收獲自植物的頂部，中部和更低的地方，將每個點上收獲的種子混合并帶到實驗室進行后續(xù)分析。

從試驗地點隨機抽取100粒種子，在培養(yǎng)皿中萌發(fā)。重復3次，10天后，用SPSS16.0進行數(shù)據(jù)分析，參見表2。

從表2中可以看出，發(fā)芽率比較均勻，且相對較高，可能是新采收種子營養(yǎng)充分，具有較高的發(fā)芽率，整個實驗的平均發(fā)芽率為82.7％。

測試卡那霉素抗性：對于每個試驗點，將發(fā)芽后的種子隨機選取100棵放入帶有卡那霉素的1/2MS(Murashige和Skoog)培養(yǎng)基中，進行苗期抗性篩選鑒定試驗。在對卡那霉素抗性濃度由25-150mg/L篩選后，發(fā)現(xiàn)100mg/L的濃度對青蒿具有較好的選擇性，故選用100mg/L作為篩選濃度，將發(fā)芽的100棵青蒿幼苗放入1/2MS固體培養(yǎng)基上3d后，幼苗出現(xiàn)不同程度的變黃，6d后，葉子邊緣開始出現(xiàn)枯死，10d時最終整株腐爛，可以斷定枯死的幼苗為野生型受體幼苗。統(tǒng)計每個試驗點100棵中未枯死幼苗數(shù)量(統(tǒng)計結果見表3)，得到卡那霉素抗性篩選后成活率。

通過PCR進行分子鑒定：存活的抗卡那霉素的植株被移植到穴盤壯苗，生長20天后，從每株幼苗上選取3-5片葉片進行DNA提取，進行PCR擴增反應，獲得擴增產(chǎn)物條帶580bp，即為轉基因青蒿，參見圖15和表4。

當花粉源的距離增加時，在轉基因青蒿中的外源基因漂移頻率迅速下降，基因漂移距離急劇下降，轉基因青蒿GYR品系的基因漂移頻率隨距離的增加呈線性下降，參見圖16-17。

由圖16可以看出，在6.8m處基因漂移頻率最大，為2.5％，下風口(西方)只有在距離花粉源24.4m處(C-10)能夠檢測出，但到達29.2m處時則任何一個方向均不能檢測到基因漂移。

圖17中，測試點C-11的基因漂移是最高的，比頻率最低的測試點G-3高7倍，這和秋季上海青浦地區(qū)經(jīng)常刮東北風有關。

由于在距離24.4m的點可以檢測到轉基因青蒿，29.2m處則不能檢測到，因此，可以推出轉基因青蒿GYR品系最遠漂移距離為24.4m。

通過本發(fā)明，可以得知，隨著轉基因花粉源的距離增加，空氣中花粉的密度逐漸降低，同時，野生型受體花粉源的存在大大稀釋了轉基因花粉源，這也可能導致基因漂移頻率快速下降。此外，一些物理因素也可以影響基因漂移頻率，包括花粉的運動，風向，風速和縱向分散系數(shù)。

同時，在不同的方向，基因漂移的頻率是不同的，轉基因青蒿可以被栽培在下風口或者使用隔離區(qū)隔離，以限制基因漂移。

此外，可以通過調(diào)整轉基因和野生型受體植物的開花期，使這兩種植物不同時開花，大大減少發(fā)生基因漂移的可能性，對于轉基因青蒿的大規(guī)模商業(yè)化種植，需要使用物理和生物的隔離來防止花粉的傳播。