本發(fā)明屬于生物技術領域，具體涉及一種戊唑醇農(nóng)藥降解菌和基于該菌的土壤生物修復菌劑及其應用，其是利用微生物的技術降解化學農(nóng)藥殘留，適用于現(xiàn)代農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中綠色無公害農(nóng)產(chǎn)品的生產(chǎn)與加工。

背景技術：

戊唑醇是一種羥乙基三唑類衍生物，該化合物是由德國拜耳公司于1986年最先開發(fā)成功的新一代高效廣譜型內(nèi)吸性殺菌劑，是用于重要經(jīng)濟作物的種子處理或葉面噴灑的高效、低毒、內(nèi)吸性殺菌劑，可有效防治禾谷類作物的多種銹病、根腐病、赤霉病、紋枯病、稻曲病及多種黑穗病等。

然而，在廣泛使用過程中必然伴隨其在環(huán)境中的殘留，當其長期大量使用時必然會引起環(huán)境污染。自然界中存在許多種能夠降解環(huán)境中殘留農(nóng)藥的微生物。其具有安全、低廉、高效等特點，能有效的降解環(huán)境中殘留的農(nóng)藥且不會對環(huán)境造成危害，因此篩選出對戊唑醇具有高效穩(wěn)定降解效果的菌株，對戊唑醇農(nóng)藥的降解有著重要的意義。為此，本發(fā)明從長期受戊唑醇農(nóng)藥污染嚴重的淤泥及土壤環(huán)境中分離到戊唑醇降解菌，并對其降解效果進行試驗，為其實際應用提供技術支持。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的之一是提供一種戊唑醇農(nóng)藥殘留降解菌，其分類命名為粘質(zhì)沙雷氏菌H2(Serratia marcescens H2)，該菌株是一株革蘭氏染色反應陰性菌，保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)(地址是：中國湖北省武漢市武漢大學，武漢市武昌珞珈山，郵編：430072)，保藏編號是CCTCC NO：M 2016478，保藏日期2016年9月13日。

該戊唑醇農(nóng)藥殘留降解菌菌株在平板培養(yǎng)基上生長的菌落形態(tài)為凸起，中心不透明，邊緣不規(guī)則，大小為1～2.5mm，均產(chǎn)生紅色色素，可產(chǎn)生樹枝狀向左旋的菌落；菌體為短桿菌，大小為(1～1.3)μm×(0.7～1.0)μm，周生鞭毛、有動力，無莢膜、無芽孢。該菌株16SrDNA的Genbank登陸號為KX827591。

所述平板培養(yǎng)基的配方是：NaCl 10g、蛋白胨10g、牛肉膏5g、瓊脂15～20g，蒸餾水1000mL，調(diào)pH為7。

本發(fā)明的另一個目的是提供一種基于上述戊唑醇農(nóng)藥殘留降解菌H2的土壤生物修復菌劑，其由如下步驟制備：

1)用接種環(huán)沾少許戊唑醇農(nóng)藥殘留降解菌H2菌體接種于平板培養(yǎng)基上，在恒溫箱中30℃培養(yǎng)48h；然后再用接種環(huán)沾少許菌體接種于LB培養(yǎng)基中，30℃振蕩培養(yǎng)至對數(shù)期；所述LB培養(yǎng)基是：NaCl 10g、酵母粉浸粉5g、胰蛋白胨10g，加入1000mL蒸餾水，pH 7.0；

2)將上述步驟培養(yǎng)好的菌種接入種子瓶，用量為5～10mL菌種/1000mL種子瓶培養(yǎng)基，振蕩培養(yǎng)至對數(shù)期，1000mL種子瓶培養(yǎng)基的重量百分含量是：蔗糖0.2～0.7％、K₂HPO₄0.1～0.2％、KH₂PO₄ 0.05～0.15％、MgSO₄·7H₂O 0.02～0.04％、NH₄NO₃ 0.1～0.2％、CaCl₂·2H₂O 0.002～0.003％、Fe₂(SO4)₃ 0.0005～0.001％，余量為水，pH 7.0；

3)將上述步驟培養(yǎng)好的菌種，加入到由麥麩、聚乙烯醇、海藻酸鈉、活性炭組成的發(fā)酵培養(yǎng)基中，用量為15～20mL菌種/1000g發(fā)酵培養(yǎng)基，同時把15～20mL的營養(yǎng)液加入到上述1000g發(fā)酵培養(yǎng)基中，在30℃下進行通風發(fā)酵48h，并將發(fā)酵物在30℃下進行通風干燥，粉碎后進行包裝，即得到基于戊唑醇農(nóng)藥殘留降解菌H2的土壤生物修復菌劑；

每1000g發(fā)酵培養(yǎng)基的組成按重量百分比是：麥麩55～60％、聚乙烯醇15～20％、海藻酸鈉10～15％、活性炭5～10％；

每100mL營養(yǎng)液組成按重量百分比是：蔗糖0.5～0.7％、KH₂PO₄ 0.1～0.15％、MgSO₄·7H₂O 0.02～0.04％、K₂HPO₄ 0.1～0.2％、NaCl 0.1～1％、酵母浸粉0.1～0.2％、余量為水，pH自然；

本發(fā)明的另一個目的，是提供上述土壤生物修復菌劑在土壤生物修復中的應用。

具體實驗如下，首先稱取土壤1000g，加入由戊唑醇原藥制成的水溶液，使土壤中戊唑醇的濃度為200mg/kg(即配制成被戊唑醇污染的土壤)，將本發(fā)明所述土壤生物修復菌劑按重量百分比為10％施于該土壤中，充分混勻，放于30℃的黑暗培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng)，定時取樣測定戊唑醇在土壤中的殘留。結果參見圖1。

選取黃瓜種子為供試作物。分別配制含戊唑醇濃度為50mg/kg、100mg/kg、200mg/kg的含藥土壤(每盆1000g土壤)，使含水量為20％左右，將本發(fā)明所述土壤生物修復菌劑按重量百分比為10％比例散施在上述土壤中充分混合，同時分別設空白組(不加戊唑醇、不加修復菌劑的土壤)和加藥組(加戊唑醇、不加修復菌劑的土壤)做為對照組，取清水浸種催芽萌發(fā)一致的黃瓜種子，播種于不同處理土壤中，每盆20粒，置于室內(nèi)培養(yǎng)7d，適時噴水保濕，測量不同處理黃瓜的株高、根長。結果參見圖2、圖3。

本發(fā)明的有益效果如下：

1、本發(fā)明提供了一種戊唑醇的降解菌，土壤降解實驗表明，對戊唑醇降解率可達88％。該菌劑具有生產(chǎn)成本低、降解效果好、使用方便等優(yōu)點。適用于消除土壤中的農(nóng)藥殘留，對保護生態(tài)環(huán)境和食品安全具有重要意義。

2、生物修復實驗表明，以黃瓜做為供試作物，戊唑醇濃度為50mg/kg、100mg/kg、200mg/kg的含藥土壤中分別施加該菌劑后，根長分別提高19％、22％、30％，株高分別提高16％、25％、32％。

附圖說明

圖1：本發(fā)明所述土壤生物修復菌劑對土壤中戊唑醇降解的影響曲線；

圖2：本發(fā)明所述土壤生物修復菌劑對黃瓜株高的影響曲線；

圖3：本發(fā)明所述土壤生物修復菌劑對黃瓜根長的影響曲線；

圖4：不同pH條件下H2菌株對戊唑醇的降解曲線；

圖5：不同溫度條件下H2菌株對戊唑醇的降解曲線；

圖6：不同初始濃度下H2菌株對戊唑醇的降解曲線；

圖7：誘導作用對菌株H2對戊唑醇的影響。

具體實施方式

實施例1：戊唑醇降解菌的富集、分離、純化及菌懸液的制備

取5g土壤樣品(多年使用戊唑醇)加入盛有100mL無機鹽培養(yǎng)基的三角瓶中，從配制濃度為10000mg/L的戊唑醇的甲醇溶液中取1mL直接加到該三角瓶中作為微生物生長的唯一碳源(100mg/L)，在搖床上培養(yǎng)7d(30℃，150r/min)后轉接至含戊唑醇200mg/L的無機鹽培養(yǎng)基中培養(yǎng)7d后，再分別依次轉接至含戊唑醇300mg/L、500mg/L、800mg/L和900mg/L無機鹽培養(yǎng)基中培養(yǎng)，每個含藥濃度培養(yǎng)7d后，然后在含戊唑醇為400mg/L的平板培養(yǎng)基上接入上述培養(yǎng)基0.1mL，涂布后于30℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2d，挑出單菌落在平板培養(yǎng)基上重復轉接劃線4次進行純化，將純化后菌株用接種環(huán)沾取少許接種于100mL的LB液體培養(yǎng)基中，30℃、150r/min的搖床中振蕩培養(yǎng)48h，取適量菌液離心，棄去上清液，用無菌水洗滌沉淀2次，用等量的無菌水懸浮，得H2菌懸液備用。

所述的無機鹽培養(yǎng)基配方是：K₂HPO₄ 1.5g，KH₂PO₄ 1g，NH₄NO₃ 1g，MgSO₄·7H₂O 0.3g，CaCl₂·2H₂O 25mg，F(xiàn)e₂(SO4)₃ 8mg，pH自然，加1000mL蒸餾水。

從上述純化好的菌株中獲得一株戊唑醇降解菌，該降解菌為粘質(zhì)沙雷氏菌(Serratia marcescens)的H2菌株。其在CCTCC的保藏編號是M 2016478。該降解菌菌株革蘭氏陰性，在平板培養(yǎng)基上生長的菌落形態(tài)為凸起，中心不透明，邊緣不規(guī)則，大小為1～2.5mm，均產(chǎn)生紅色色素。可產(chǎn)生樹枝狀向左旋的特別菌落；菌體為短桿菌，大小為(1～1.3)μm×(0.7～1.0)μm，周生鞭毛，有動力，無莢膜，無芽孢。該菌株16SrDNA的Genbank登陸號為KX827591。

實施例2：降解條件

1、pH對菌株H2降解戊唑醇的影響

按體積百分比為4％接菌量，將實施例1制備的H2菌懸液接入戊唑醇濃度為200mg/L的無機鹽培養(yǎng)基中，分別用鹽酸和氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的pH值為3、5、7、9、11，在30℃、150rpm搖床振蕩培養(yǎng)，分別在1、2、4、6、8d測定戊唑醇的含量。

所述無機鹽培養(yǎng)基配方是：K₂HPO₄ 1.5g，KH₂PO₄ 1g，NH₄NO₃ 1g，MgSO₄·7H₂O0.3g，CaCl₂·2H₂O 25mg，F(xiàn)e₂(SO4)₃ 8mg，pH自然，1000mL蒸餾水。

pH對菌株降解戊唑醇的實驗結果表明，當pH為7.0時，6d降解率最高達到91.25％，隨著pH值升高或降低，戊唑醇降解效率逐漸下降。表明該菌能適應中性的培養(yǎng)基。結果參照圖4。

2、溫度對菌株H2降解戊唑醇的影響

溫度實驗中，選用五種不同溫度20℃、25℃、30℃、35℃、40℃，在戊唑醇濃度為200mg/L無機鹽培養(yǎng)基中，按體積百分比為4％接入實施例1制備的H2菌懸液，150rpm搖床震蕩培養(yǎng)，分別在1、2、4、6、8d取樣測定戊唑醇的含量。

所述無機鹽培養(yǎng)基配方是：K₂HPO₄ 1.5g，KH₂PO₄ 1g，NH₄NO₃ 1g，MgSO₄·7H₂O0.3g，CaCl₂·2H₂O 25mg，F(xiàn)e₂(SO4)₃ 8mg，pH自然，1000mL蒸餾水。

在20～40℃培養(yǎng)條件下，分別測定菌株H2對戊唑醇的降解率。菌株H2降解戊唑醇的最適溫度為30℃，該菌對戊唑醇的最佳降解溫度為30℃，6d降解率達到92.25％。而20℃和40℃降解率只有13.71％～42.36％。表明低溫或高溫影響菌株對戊唑醇的降解能力。結果參照圖5。

3、戊唑醇的初始濃度對菌株H2降解戊唑醇的影響

在無機鹽培養(yǎng)基中加入戊唑醇溶液，使其終濃度分別為50mg/L、100mg/L、200mg/L、300mg/L、500mg/L，以體積百分比為4％的接菌量接入實施例1制備的H2菌懸液，30℃、150rpm搖床震蕩培養(yǎng)，分別在1、2、3、4、5、6、7、8d取樣，測定戊唑醇的降解率。結果參見圖6和表1。

表1 H2菌株降解戊唑醇一級動力學方程

實驗結果表明，H2對100～300mg/L戊唑醇降解效果較好，都達到50％以上。尤其戊唑醇濃度200mg/L時降解率最高達到90％以上，當戊唑醇濃度50mg/L和500mg/L時，降解率有所下降只有22.6％～34.2％。由表1可以看出，當戊唑醇濃度分別為50，100，200，300，500mg/L時，其降解動態(tài)符合農(nóng)藥降解動力學方程C＝C₀*e^-kt(C時間t時的農(nóng)藥濃度，C0初始濃度，t降解時間，k降解的速率常數(shù))，當戊唑醇濃度為200mg/L時，降解的速率常數(shù)是0.685，半衰期是1.01d，說明200mg/L是最佳降解濃度。

所述無機鹽培養(yǎng)基配方是：K₂HPO₄ 1.5g，KH₂PO₄ 1g，NH₄NO₃ 1g，MgSO₄·7H₂O 0.3g，CaCl₂·2H₂O 25mg，F(xiàn)e₂(SO4)₃ 8mg，pH自然，1000mL蒸餾水。

4、誘導作用對戊唑醇降解的影響

將菌株H2分別接種在不含戊唑醇的LB液體培養(yǎng)基和含戊唑醇濃度為200mg/L的LB液體培養(yǎng)基，分別培養(yǎng)48h，然后離心棄去上清液，用無菌水洗滌沉淀2次，用等量的無菌水稀釋制成菌懸液，并按體積百分比為4％定量接種于戊唑醇濃度為200mg/L無機鹽培養(yǎng)基中，30℃、150rpm搖床振蕩培養(yǎng)，分別在1、2、4、6、8d后取樣，測定戊唑醇濃度。

所述無機鹽培養(yǎng)基配方是：K₂HPO₄ 1.5g，KH₂PO₄ 1g，NH₄NO₃ 1g，MgSO₄·7H₂O 0.3g，CaCl₂·2H₂O 25mg，F(xiàn)e₂(SO4)₃ 8mg，pH自然，1000mL蒸餾水。

菌株H2在LB培養(yǎng)基上培養(yǎng)后，將其接種到含有戊唑醇的無機鹽培養(yǎng)液中培養(yǎng)6天，戊唑醇的降解能力顯著下降，僅為57.39％，而經(jīng)過戊唑醇誘導后菌株培養(yǎng)6天，戊唑醇降解率達到90.17％。這說明底物戊唑醇對其菌株H2降解活性具有誘導作用，在不含有戊唑醇的環(huán)境中長期培養(yǎng)，所獲得的菌株則可能會喪失其對戊唑醇的降解代謝活性，說明降解菌H2能以戊唑醇為唯一碳源。結果參照圖7。

綜上研究表明，環(huán)境溫度和pH值對H2菌株的降解特性影響較大，當pH值為7.0、溫度為30℃時，H2菌株對戊唑醇的降解率最高，超過這個范圍，降解率明顯下降。研究發(fā)現(xiàn)，H2菌株的降解能力由戊唑醇誘導而產(chǎn)生，戊唑醇誘導的最適合濃度為200mg/L。在此條件下，6d降解率可達90％以上。當戊唑醇濃度50mg/L和500mg/L時，菌株降解戊唑醇能力有所下降。這是由于高濃度的戊唑醇對降解菌產(chǎn)生了抑制作用，而低濃度時農(nóng)藥無法提供充足的碳源而影響菌體生長所致。當戊唑醇初始濃度為50mg/L、100mg/L、200mg/L、300mg/L、500mg/L時，符合農(nóng)藥降解動力學方程。菌株H2對戊唑醇的降解能力是符合一級動力學方程。

實施例3：土壤生物修復菌劑的制備

在戊唑醇降解菌H2的斜面試管菌種中用接種環(huán)沾少許菌體接種于平板培養(yǎng)基上，30℃培養(yǎng)48h后，再用接種環(huán)沾少許菌體接種于LB培養(yǎng)基中，30℃振蕩培養(yǎng)至對數(shù)期，所述平板培養(yǎng)基的配方按重量百分含量是：NaCl 10g、蛋白胨10g、牛肉膏5g、瓊脂15g，加入1000mL蒸餾水；所述LB培養(yǎng)基是：NaCl 10g、酵母浸粉5g、胰蛋白胨10g，加入1000mL蒸餾水；將培養(yǎng)好的菌種10mL接入種子瓶，振蕩培養(yǎng)至對數(shù)期；1000mL的種子瓶培養(yǎng)基為：蔗糖2g，K₂HPO₄ 1.5g，KH₂PO₄ 1g，MgSO₄·7H₂O 0.3g，NH₄NO₃ 1g，CaCl₂·2H₂O 25mg，F(xiàn)e₂(SO4)₃ 8mg，pH 7.0，1000mL蒸餾水。

將上述培養(yǎng)好的菌種15mL加入到由麥麩、聚乙烯醇、海藻酸鈉、活性炭組成的1000g的發(fā)酵培養(yǎng)基中，同時加入營養(yǎng)液15mL，在30℃下進行通風發(fā)酵48h，將發(fā)酵物在30℃下進行通風干燥，粉碎后進行包裝，包裝制成產(chǎn)品，即得到基于上述H2菌株的土壤生物修復菌劑。

1000g發(fā)酵培養(yǎng)基配方是：麥麩600g、聚乙烯醇200g、海藻酸鈉150g、活性炭50g；1000mL營養(yǎng)液配方是：蔗糖5g，KH₂PO₄ 1g，MgSO₄·7H₂O 0.3g，K₂HPO₄1.5g，NaCl 1g，酵母浸粉2g，余量為水，pH自然。

實施例4：生物修復

降解菌菌劑的生物修復作用對敏感作物影響

黃瓜種子作為供試作物，選取經(jīng)清水浸種催芽萌發(fā)一致的黃瓜種子備用。配制戊唑醇溶液放入花盆中(每盆1000g土)，加入適量的水，使含水量為20％左右，將實施例3制備的土壤生物修復菌劑施在土壤中。處理一：取風干土(過20目篩)1.0kg，加入適量的水，使含水量為20％。處理二：分別取風干土(過20目篩)1.0kg，加入戊唑醇溶液，充分拌勻后制成戊唑醇濃度分別為50mg/kg、100mg/kg、200mg/kg的含藥土壤，再加入重量百分比為10％的基于上述H2菌株的生物修復菌劑，混勻。處理三：取風干土(過20目篩)1.0kg，加入戊唑醇溶液，充分拌勻后制成戊唑醇濃度分別為50mg/kg、100mg/kg、200mg/kg的含藥土壤。

從已經(jīng)浸種催芽的種子中選取萌發(fā)一致的黃瓜種子，播種于不同處理土壤中，在25℃室內(nèi)培養(yǎng)7d。同時觀察記錄不同處理土壤黃瓜的株高、根長。

降解菌固體菌劑的生物修復作用對敏感作物的影響：實驗結果表明含藥土壤施用菌劑后可以明顯提高黃瓜株高、根長。當土壤中戊唑醇濃度分別為50mg/kg，、100mg/kg、200mg/kg時，加入質(zhì)量分數(shù)為10％的菌劑后，黃瓜的株高和根長明顯高于未施用菌劑處理培養(yǎng)的黃瓜，株高分別提高16％、25％、32％，根長分別提高19％、22％、30％，表明H2菌劑對土壤中戊唑醇有較好的降解作用，提高黃瓜株高、根長。同時土壤中戊唑醇的殘留對黃瓜的生長有明顯的抑制作用，施用H2菌劑后黃瓜的藥害作用明顯減輕，加菌處理含藥土壤中黃瓜株高、根長均明顯高于未加菌處理植株。表明H2菌劑對黃瓜的生長有明顯的解除藥害的作用。結果參照圖2和圖3。