本發(fā)明涉及一株同時降解精氨酸和尿素的發(fā)酵乳桿菌，屬于微生物技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

氨基甲酸乙酯(Ethyl Carbamate，EC)是一種2A類致癌物，被認(rèn)為是食品中繼黃曲霉毒素之后的又一重要污染物。很多研究者在許多酒飲料和食品中檢測到了氨基甲酸乙酯的存在。自此，發(fā)酵食品中氨基甲酸乙酯的含量受到廣泛關(guān)注。已有報道檢測了不同香型成品白酒中EC的含量，結(jié)果顯示白酒中EC平均含量約為100μg·L^-1，低于150μg·L^-1的國際限量標(biāo)準(zhǔn)。其中，清香型、醬香型、藥香型及特香型白酒中EC含量較低，而濃香型、芝麻香型、鳳香型等白酒中EC含量偏高。

已有報道顯示尿素與乙醇反應(yīng)可以生成EC；同時發(fā)現(xiàn)葡萄汁發(fā)酵過程中EC的主要來源是由精氨酸分解而來的尿素。范文來、徐巖等也發(fā)現(xiàn)酒醅中尿素和EC的變化趨勢類似，二者之間具有一定的相互關(guān)系。

對發(fā)酵食品中乳酸菌的精氨酸代謝途徑研究，發(fā)現(xiàn)了乳酸菌的精氨酸脫亞胺途徑(arginine deiminasepathway，簡稱ADI途徑)，如下所示。最近，國外許多研究者對葡萄酒MLB的編碼ADI途徑酶的基因(編碼ADI、OTC、CK的基因分別為arcA、arcB、arcC)進(jìn)行了克隆、測序和表達(dá)研究。利用arc基因簇的簡并引物合成的特異性標(biāo)記探針與MLB的基因進(jìn)行雜交,檢測到arc基因簇的菌株能降解精氨酸，而缺少arc基因簇的菌株不能降解精氨酸。

L-Arginine+H₂O→L-citrulline+NH₃(ADI)

L-Citrulline+Pi→carbamyl phosphate+L-Ornithine(OTC)

Carbamyl phosphate+ADP→ATP+NH₃+CO₂(CK)

Ough等研究了精氨酸、瓜氨酸、氨、尿素和谷氨酸在葡萄酒發(fā)酵過程中對氨基甲酸乙酯形成方面的影響，發(fā)現(xiàn)由氨甲酰磷酸形成的EC含量很少，大部分EC是由精氨酸分解產(chǎn)生的尿素形成的，因此認(rèn)為尿素是形成氨基甲酸乙酯的主要前體物質(zhì)。Wang等的研究表明相同條件下，相同時間內(nèi)同濃度尿素比瓜氨酸生成更多EC，且隨著發(fā)酵時間延長，這種差異更大。

采用MiSeq測序技術(shù)和Real-time PCR方法研究醬香型白酒發(fā)酵中乳酸菌群落結(jié)構(gòu)組成及變化規(guī)律。研究表明乳酸菌是白酒發(fā)酵過程中的優(yōu)勢細(xì)菌。共得到8個乳酸菌屬，包含31個乳酸菌種，其中22個屬于乳桿菌屬。發(fā)酵酒醅中的乳酸菌群結(jié)構(gòu)中乳桿菌屬的比例達(dá)到了90％以上，甚至在發(fā)酵中后期尤其是中下層酒醅中超過了99％。乳酸菌可以直接貢獻(xiàn)乳酸、提供白酒中乳酸乙酯的主要前體。此外，乳酸菌的抑制作用可防止微生物過量生長，有助于穩(wěn)定釀造微生物區(qū)系平衡。然而，針對國內(nèi)對白酒中乳酸菌的研究還僅限于分離鑒定到單菌種、單菌種純培養(yǎng)條件下的發(fā)酵特性研究等，并未有關(guān)于乳酸菌在發(fā)酵過程中對食品安全作用的更深入研究。

因此，獲取能同時降解精氨酸和尿素的乳酸菌，對于以乳酸菌作為主要功能微生物的發(fā)酵食品的生產(chǎn)就顯得尤為重要，對于食品安全具有重要貢獻(xiàn)。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

為了解決上述問題，本發(fā)明提供了一株能夠同時高效降解精氨酸和尿素的發(fā)酵乳桿菌。

所述發(fā)酵乳桿菌，已于2016年06月28日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC NO.12716，保藏地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號。

所述發(fā)酵乳桿菌CGMCC NO.12716是從白酒酒醅中篩選得到的。

所述發(fā)酵乳桿菌CGMCC NO.12716具有如下特性：

(1)本發(fā)明的發(fā)酵乳桿菌在高粱汁培養(yǎng)基中對尿素的降解能力高達(dá)1.96mmol·L^-1；

(2)本發(fā)明的發(fā)酵乳桿菌在高粱汁培養(yǎng)基中對精氨酸降解能力高達(dá)0.86mmol·L^-1且僅生成極少量的尿素；

(3)代謝物中酸類、醇類、酮類、酚類物質(zhì)的種類豐富；其中雙乙酰、3-羥基-2-丁酮、2-甲氧基苯酚的含量均大于30μg·L^-1，而雙乙酰、3-羥基-2-丁酮、2-甲氧基苯酚在白酒呈香中發(fā)揮一定的作用；其中乙酸、丁酸、己酸、辛酸、2-壬醇和2-十一醇的含量均大于50μg·L^-1，而這些飽和脂肪酸和飽和脂肪醇作為重要的風(fēng)味化合物都曾在白酒中檢測到。

(4)CGMCC NO.12716于MRS培養(yǎng)基、30℃厭氧發(fā)酵2d后進(jìn)入穩(wěn)定期，菌體濃度可達(dá)OD＝2.4，發(fā)酵液pH 4.3左右，乳酸含量為12g/L左右；發(fā)酵3d的乙酸產(chǎn)量可達(dá)6g/L。

本發(fā)明的第二個目的是提供含有所述CGMCC NO.12716菌株的微生物菌劑。

在本發(fā)明的一種實施方式中，所述微生物菌劑含有CGMCC NO.12716菌體的活細(xì)胞、冷凍干燥得到的CGMCC NO.12716干菌體、固定化的CGMCC NO.12716細(xì)胞、CGMCCNO.12716的液體菌劑、CGMCC NO.12716的固體菌劑，或者以其他任何形式存在的CGMCCNO.12716菌株。

在本發(fā)明的一種實施方式中，所述微生物菌劑中還含有任何可以應(yīng)用于食品或者食品制備的任意種屬的菌株，比如地衣芽孢桿菌、釀酒酵母、枯草芽孢桿菌等等。

在本發(fā)明的一種實施方式中，所述微生物菌劑中還含有任意能用于食品的載體。

本發(fā)明的第三個目的是提供所述微生物菌劑在食品技術(shù)領(lǐng)域的應(yīng)用，尤其是應(yīng)用于發(fā)酵食品技術(shù)領(lǐng)域。

本發(fā)明的第四個目的是提供所述CGMCC NO.12716菌株的應(yīng)用，是應(yīng)用于食品技術(shù)領(lǐng)域，尤其是發(fā)酵食品技術(shù)領(lǐng)域。

在本發(fā)明的一種實施方式中，所述應(yīng)用，是應(yīng)用于釀造酒、蒸餾酒等方面，比如白酒、葡萄酒、黃酒、果酒方面。

在本發(fā)明的一種實施方式中，所述應(yīng)用，是將CGMCC NO.12716菌株添加到白酒、葡萄酒、黃酒或者果酒釀造過程中。

本發(fā)明的有益效果：

本發(fā)明的發(fā)酵乳桿菌，在高粱汁培養(yǎng)基中對尿素的降解能力高達(dá)1.96mmol·L^-1；對精氨酸降解能力高達(dá)0.86mmol·L^-1且僅生成極少量的尿素；是目前能同時降解精氨酸和尿素且降解效果最好的發(fā)酵乳桿菌。同時還能夠代謝酸類、醇類、酮類、酚類等物質(zhì)，為白酒提供重要的風(fēng)味化合物；其于MRS培養(yǎng)基、30℃厭氧發(fā)酵2d后進(jìn)入穩(wěn)定期，菌體濃度可達(dá)OD₆₀₀＝2.4，發(fā)酵液pH 4.3左右，乳酸含量為12g/L左右；發(fā)酵3d的乙酸產(chǎn)量可達(dá)6g/L。

生物材料保藏

本發(fā)明所提供的發(fā)酵乳桿菌，分類學(xué)命名為發(fā)酵乳桿菌Lactobacillusfermentum，已于2016年06月28日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC NO.12716，保藏地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號。

附圖說明

圖1：生長曲線；

圖2：生長過程中pH變化趨勢；

圖3：生長過程中乳酸變化趨勢。

具體實施方式

EC含量測定參照文獻(xiàn)：頂空固相微萃取(HS-SPME)和氣相色譜-質(zhì)譜(GC-MS)聯(lián)用定量蒸餾酒中氨基甲酸乙酯[J].食品工業(yè)科技,2012,33(14):60-63。

酒醅中尿素含量的測定參照文獻(xiàn)：Jimenez-Martin E,Ruiz J,Perez-Palacios T,et aL.Gas chromatography-mass spectrometry method for the determination of free amino acids as their dimethyl-tert-butylsilyl(TBDMS)derivatives in animal source food[J].Journal ofAgricultural and Food Chemistry,2012,60(10):2456-2463。

實施例1：本發(fā)明的乳酸菌對精氨酸、尿素的降解情況

根據(jù)酒醅中精氨酸和尿素檢測結(jié)果設(shè)計代謝實驗中精氨酸添加量為300mg L^-1(高粱汁培養(yǎng)基中本身含有一定的精氨酸，額外添加300mg L^-1后總精氨酸含量約690mg/L，接近真實酒醅中精氨酸含量)，尿素添加量為200mg L^-1。發(fā)酵采用高粱汁對實驗菌株L.diolivorans2-10、L.buchneri N5、L.casei X1、Lpontis JSB7、P.acidilactici JJB1、Lfermentum JSA30及L.plantarum JD19進(jìn)行精氨酸、尿素的代謝實驗。

實驗及對照組設(shè)定：

空白1：高粱汁培養(yǎng)基按2％接種量接種，不添加精氨酸及尿素；

實驗組1：添加300mg L^-1精氨酸的高粱汁培養(yǎng)基按2％接種量接種；

實驗組2：添加200mg L^-1尿素的高粱汁培養(yǎng)基按2％接種量接種；

其中，實驗菌株是按2％接種量接種到培養(yǎng)基中，30℃下靜置培養(yǎng)72h。測定發(fā)酵起點、發(fā)酵終點的發(fā)酵液中精氨酸、瓜氨酸、鳥氨酸、尿素的含量以及活菌數(shù)。

高粱汁培養(yǎng)基：將高粱:水＝1:4(M:V)，加淀粉酶蒸煮液化，60℃加糖化酶糖化，過濾離心，調(diào)節(jié)糖度至10°Bx。

醬香型白酒發(fā)酵過程中篩選得到了多株乳酸菌，其中的7株優(yōu)勢乳酸菌對精氨酸都有一定的代謝能力，但有強有弱，具體結(jié)果見表1。其中L.pontis JSB7、L.fermentum JSA30、L.plantarum JD19、L.buchneri N5、L.casei X1和P.acidilactici JJB1對精氨酸的降解能力較強，均超過0.5mmol·L^-1，而L.diolivorans 2-10對精氨酸的降解能力較弱，只有0.06mmol·L^-1。其中JSA30、JSB7和N5均為專性異型發(fā)酵乳酸菌(Obligatory heterofermentative)，都可以降解精氨酸，存在ADI途徑中的關(guān)鍵酶基因arcA、arcB、arcC，具體見表2。表1中可以看到JD19和X1均能很好的利用精氨酸，且存在arcA基因。JJB1對精氨酸的降解能力雖然也較強，但是其不能降解尿素。

發(fā)明人考察了上述白酒中篩到的對精氨酸和/或尿素代謝能力相對較強的優(yōu)勢乳酸菌對精氨酸和尿素的降解能力。從表1中看出L.fermentum JSA30表現(xiàn)出了突出的尿素降解能力，其次是L.plantarum JD19，L.buchneri N5對尿素的降解能力明顯弱于L.fermentum JSA30和L.plantarum JD19。

表1 7株乳酸菌對精氨酸和尿素的代謝能力

注：“–”表示幾乎沒有含量變化。

表2 7株乳酸菌arc基因存在情況

注：“+”表示在樣品中有檢出相應(yīng)基因的存在，“–”表示沒有檢測到該基因的存在。

其中L.fermentum JSA30，已于2016年06月28日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC NO.12716，保藏地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號。

L.plantarum JD19，已于2016年06月28日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC NO.12717，保藏地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號。實施例2：乳酸菌生理生化特征

將發(fā)酵乳桿菌L.fermentum JSA30接種于MRS培養(yǎng)基，于30℃厭氧發(fā)酵2d后，兩株乳酸菌進(jìn)入穩(wěn)定期。如圖1所示，發(fā)酵2d后，L.fermentum JSA30的生物量OD₆₀₀可達(dá)2.4。

MRS液體培養(yǎng)基：蛋白胨10.0g·L^-1，牛肉膏10.0g·L^-1，酵母膏5.0g·L^-1，檸檬酸氫二銨2.0g·L^-1，葡萄糖20.0g·L^-1，吐溫801.0mL·L^-1乙酸鈉5.0g·L^-1，磷酸氫二鉀2.0g·L^-1，硫酸鎂0.58g·L^-1，硫酸錳0.25g·L^-1，瓊脂18.0g·L^-1。

乳酸菌生長代謝導(dǎo)致環(huán)境pH下降，可能對于釀造體系中其他不耐酸微生物的生長產(chǎn)生抑制，尤其是抑制雜菌生長，從而達(dá)到調(diào)控釀造環(huán)境的作用，維持正常發(fā)酵。圖2為乳酸菌生長過程中pH變化趨勢。

酸是白酒中的重要呈味物質(zhì)，它與其他香味物質(zhì)共同構(gòu)成白酒所特有的芳香。含酸量小的酒，酒味寡淡，后味短。適量的酸在酒中能起到緩沖的作用，可消除飲后上頭和口味不諧調(diào)等現(xiàn)象。酸還能促進(jìn)酒質(zhì)的甜味感。乙酸和乳酸是白酒中含量最大的，其含量對白酒口感影響很大。

兩株乳酸菌主要代謝產(chǎn)物是乳酸，L.fermentum JSA30在生長過程中也產(chǎn)生大量的乳酸。乳酸是白酒主要酸之一，不但影響到白酒的口感，而且也是白酒風(fēng)味物質(zhì)-乳酸乙酯的前體物質(zhì)，對白酒的品質(zhì)影響重大。由圖3可知，L.fermentum JSA30發(fā)酵2d、3d后乳酸含量分別達(dá)12g/L、14g/L。

L.fermentum JSA30是異型乳酸菌，發(fā)酵糖類除產(chǎn)乳酸外，還能夠產(chǎn)生乙酸、CO₂等其他代謝產(chǎn)物。L.fermentum JSA30發(fā)酵3d后乙酸產(chǎn)量為6g/L。

實施例3：菌株的應(yīng)用

固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基的制備：稱250g高粱，加入350mL蒸餾水，于70-80℃培養(yǎng)箱中浸泡24h。將水瀝干，稱取500g高粱于真空袋中，再加入25mL蒸餾水。121℃，滅菌20min。加酶糖化1d。

對照組：在固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中接種10wt％的高溫大曲，30℃恒溫培養(yǎng)箱中靜置發(fā)酵6d。

實驗組：將保藏編號為CGMCC NO.12716的發(fā)酵乳桿菌的種子液以終濃度10⁷CFU/g酒醅的接種量接種至固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中，并接種10wt％的大曲，放置30℃恒溫培養(yǎng)箱中靜置發(fā)酵6d。

結(jié)果顯示，實驗組得到的發(fā)酵物中，尿素的降低量為對照組的2倍以上，精氨酸的降低量遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于對照組。而且，實驗組得到的產(chǎn)品風(fēng)味更佳優(yōu)良。

可以理解的是，對本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來說，可以根據(jù)本發(fā)明的技術(shù)方案及其發(fā)明構(gòu)思加以等同替換或改變，而所有這些改變或替換都應(yīng)屬于本發(fā)明所附的權(quán)利要求的保護(hù)范圍。