本發(fā)明屬于生物技術(shù)領域，具體地說，本發(fā)明涉及一種以凋亡信號調(diào)節(jié)激酶1(ASK1,Apoptosis signal-regulated kinase 1)N端二聚化為靶點的篩選模型的建立，并將篩選得到的ASK1N端二聚化抑制劑應用于制備預防、緩解和/或治療脂肪性肝炎疾病的藥物中。

背景技術(shù)：

凋亡信號調(diào)節(jié)激酶1(ASK1,Apoptosis signal-regulated kinase 1)是有絲分裂原激活的蛋白激酶激酶激酶(MAPKKK)家族成員之一。ASK1蛋白包含1375個氨基酸殘基，分子量約為160kDa^[1]。ASK1的蛋白結(jié)構(gòu)分為5部分，其中N端的46-277號氨基酸為硫氧還蛋白(Trx)結(jié)合區(qū)，297-324號氨基酸為N端卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域，384-655號氨基酸為TRAF結(jié)合區(qū)，687-945號氨基酸為ASK1的激酶結(jié)構(gòu)域，而1239-1295號氨基酸則為C端卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域^[2]。在正常狀態(tài)下，ASK1通過C端的卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域進行同源寡聚反應，形成分子量約為1500-2000kDa的高分子量復合體，同時Trx結(jié)合在ASK1的N端的Trx結(jié)合區(qū)，形成ASK1信號小體。Trx的特異性結(jié)合可抑制TRAF2、TRAF6與ASK1結(jié)合，從而抑制ASK1的活性。當受到如TNF-α、LPS、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)壓力、氧化壓力等刺激時，Trx迅速被激活并與ASK1分離，TRAF2、TRAF6被募集并結(jié)合到ASK1的TRAF結(jié)合區(qū)上，ASK1的激酶結(jié)構(gòu)域被磷酸化，使ASK1激活，誘導SEKI2-JNK及MKK3/MKK6-p38信號級聯(lián)反應^[3]。ASK1對于多種疾病均具有重要的調(diào)控作用，其可促進AngⅡ誘導的心肌肥厚、心臟重構(gòu)、間質(zhì)纖維化以及冠狀動脈重構(gòu)等^[4]；可促進腦缺血再灌注后神經(jīng)元-小神經(jīng)膠質(zhì)細胞的死亡，從而惡化腦卒中疾病的發(fā)展^[5]；在缺血再灌注誘導的急性腎損傷模型中，ASK1被顯著激活^[6]。基于ASK1的激活機制以及其對多種疾病的調(diào)控作用，目前已有多種研究致力于研發(fā)可調(diào)控ASK1信號級聯(lián)反應的藥物，以達到治療疾病的目的。

肝臟是機體的一個主要的調(diào)控糖代謝以及脂肪代謝的組織器官，而以肝細胞脂質(zhì)聚集以及肝臟脂肪變性為病理表現(xiàn)的脂肪性肝炎，由于其在世界范圍內(nèi)的高發(fā)病率，已經(jīng)成為人類的一個主要的健康問題。其可進一步損害消化系統(tǒng)功能、降低人體免疫力、減弱解毒功能、影響激素代謝等，嚴重影響了人們的身體健康和生活質(zhì)量，也給社會帶來沉重負擔。因此，如何有效治療脂肪性肝炎，如何高效的篩選能有效治療脂肪性肝炎這一疾病的藥物成為現(xiàn)階段亟待解決的問題。有研究表明，在高脂飲食誘導的Ⅱ型糖尿病以及肝臟脂肪變性模型中，ASK1起到了明顯的促進作用^[7]。但ASK1的作用機制還有必要進行進一步的研究，從而找到肝臟脂肪變性調(diào)節(jié)的良好靶點。

參考文獻

[1]Ichijo H,Nishida E,Irie K,et al.Induction of apoptosis by ASK1,a mammalian MAPKKK that activates SAPK/JNK and p38 signaling pathways[J].Science,1997,275(5296):90-94.

[2]Fujino G,Noguchi T,Matsuzawa A,et al.Thioredoxin and TRAF family proteins regulate reactive oxygen species-dependent activation of ASK1 through reciprocal modulation of the N-terminal homophilic interaction of ASK1[J].Molecular and cellular biology,2007,27(23):8152-8163.

[3]T.Noguchi,K.Takeda,A.Matsuzawa,K.Saegusa,H.Nakano,J.Gohda,J.Inoue,H.Ichijo,Recruitment of tumor necrosis factor receptorassociated factor family proteins to apoptosis signal-regulating kinase 1 signalosome is essential for oxidative stress-induced cell death,J.Biol.Chem.280(2005)37033–37040.

[4]Izumiya Y,Kim S,Izumi Y,et al.Apoptosis signal-regulating kinase 1 plays a pivotal role in angiotensin II–induced cardiac hypertrophy and remodeling[J].Circulation Research,2003,93(9):874-883.

[5]Shi Y,Pu H,Hu X,et al.Aberrant Activation of ASK1 Mediates Proinflammatory and Neurotoxic Microglial Responses After Cerebral Ischemia/Reperfusion[J].Stroke,2016,47(Suppl 1):A147-A147.

[6]Terada Y,Inoshita S,Kuwana H,et al.Important role of apoptosis signal-regulating kinase 1 in ischemic acute kidney injury[J].Biochemical and biophysical research communications,2007,364(4):1043-1049.

[7]Yamamoto E,Dong Y F,Kataoka K,et al.Olmesartan prevents cardiovascular injury and hepatic steatosis in obesity and diabetes,accompanied by apoptosis signal regulating kinase-1inhibition[J].Hypertension,2008,52(3):573-580.

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，提供一種凋亡信號調(diào)節(jié)激酶1的用途，以凋亡信號調(diào)節(jié)激酶1N端二聚化為靶點篩選預防、緩解和/或治療脂肪性肝炎的藥物，所述的藥物能夠抑制凋亡信號調(diào)節(jié)激酶1N端二聚化。

在本發(fā)明的第二方面，提供一種以凋亡信號調(diào)節(jié)激酶1N端二聚化為靶點篩選預防、緩解和/或治療脂肪性肝炎的藥物的方法，包括如下步驟：

(a)將含有凋亡信號調(diào)節(jié)激酶1N端的體系和候選物質(zhì)進行接觸；所述的含有凋亡信號調(diào)節(jié)激酶1N端的體系是含有凋亡信號調(diào)節(jié)激酶1N端的細胞，或是含含有凋亡信號調(diào)節(jié)激酶1N端的溶液；

(b)觀察候選物質(zhì)對于凋亡信號調(diào)節(jié)激酶1N端二聚化的影響；

其中，若所述候選物質(zhì)可抑制凋亡信號調(diào)節(jié)激酶1N端二聚化，則表明該候選物質(zhì)是預防、緩解和/或治療脂肪性肝炎的潛在物質(zhì)。

在另一優(yōu)選例中，包括如下步驟：

步驟(a)包括：在測試組中，將候選物質(zhì)加入到含有凋亡信號調(diào)節(jié)激酶1N端的體系中；和/或

步驟(b)包括：檢測測試組的體系中凋亡信號調(diào)節(jié)激酶1N端的二聚化作用，并與對照組比較，其中所述的對照組是不添加所述候選物質(zhì)的含有凋亡信號調(diào)節(jié)激酶1N端的體系；

其中，如果測試組中檢測結(jié)果顯示凋亡信號調(diào)節(jié)激酶1N端二聚化受抑制，就表明該候選物質(zhì)是預防、緩解和/或治療脂肪性肝炎的潛在物質(zhì)。

在另一優(yōu)選例中，

步驟(a)包括：

(1)選用CheckMate^TM哺乳動物雙雜交系統(tǒng)，分別將編碼凋亡信號調(diào)節(jié)激酶1N端1-678aa的DNA連接至編碼DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域的pBIND載體以及轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域的pACT載體中，并將兩種載體轉(zhuǎn)染至動物細胞中，構(gòu)建凋亡信號調(diào)節(jié)激酶1N端二聚化哺乳動物雙雜交篩選系統(tǒng)；若凋亡信號調(diào)節(jié)激酶1的N端正常二聚化，則當上述細胞繼續(xù)轉(zhuǎn)染入pG5luc載體后，螢火蟲熒光素酶報告基因高水平表達；若凋亡信號調(diào)節(jié)激酶1的N端二聚化被抑制，則pG5luc載體上的螢火蟲熒光素酶報告基因不表達；通過Dual-Luciferase雙熒光素酶報告基因檢測系統(tǒng)可分析凋亡信號調(diào)節(jié)激酶1的N端二聚化情況；

其中，編碼凋亡信號調(diào)節(jié)激酶1N端1-678aa的氨基酸序列如SEQ NO：1所示，DNA序列如SEQ NO：2所示；

(2)將候選多肽的核苷酸片段分別連接至psi-Flag載體中，將候選多肽質(zhì)粒psi-flag-Peptides與pG5luc質(zhì)粒同時轉(zhuǎn)染上述已構(gòu)建的用于凋亡信號調(diào)節(jié)激酶1N端二聚化篩選的動物細胞；

步驟(b)包括：轉(zhuǎn)染成功的細胞在培養(yǎng)24小時后檢測螢火蟲熒光素酶以及Renilla熒光素酶的RLU，并計算二者比值，根據(jù)得到的比值來比較不同樣品間多肽抑制作用的程度。

在另一優(yōu)選例中，上述篩選方法的步驟(a)所用動物細胞選自HEK-293T、L02、Hela、Huh7、Hepg2、A549、3T3、MEFs、H9C2。

在另一優(yōu)選例中，上述篩選方法的步驟(a)所用動物細胞選自HEK-293T。

在另一優(yōu)選例中，

步驟(a)包括：

(1)分別將權(quán)利要求5所述的編碼凋亡信號調(diào)節(jié)激酶1N端1-678氨基酸的DNA連接至pcDNA5-HA以及pcDNA5-Myc質(zhì)粒中，構(gòu)建HA-ASK1_N和Myc-ASK1_N質(zhì)粒，并分別或同時轉(zhuǎn)染動物細胞；

(2)將候選多肽的DNA分別連接至psi-Flag載體中，將psi-flag-Peptides質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染至同時含有HA-ASK1_N和Myc-ASK1_N質(zhì)粒的動物細胞中；

步驟(b)包括：轉(zhuǎn)染成功的細胞在培養(yǎng)24h后通過免疫共沉淀及Western blot實驗檢測免疫沉淀反應后的蛋白溶液中HA-ASK1_N和Myc-ASK1_N的含量；

免疫共沉淀采用anti-HA將目標蛋白與protein A/G瓊脂糖珠相連，Western blot采用anti-Myc作為一抗，如果同時轉(zhuǎn)染HA-ASK1_N、Myc-ASK1_N和某一候選物質(zhì)的psi-flag-Peptide的動物細胞組與僅轉(zhuǎn)染HA-ASK1_N或Myc-ASK1_N的對照組相同，未檢測到明顯Myc蛋白條帶，則該候選物質(zhì)是預防、緩解和/或治療脂肪性肝炎的潛在物質(zhì)。

在另一優(yōu)選例中，上述篩選方法的步驟(a)所用動物細胞選自HEK-293T、L02、Hela、Huh7、Hepg2、A549、3T3、MEFs、H9C2。

在另一優(yōu)選例中，上述篩選方法的步驟(a)所用動物細胞選自HEK-293T。

在另一優(yōu)選例中，還包括對獲得的潛在物質(zhì)進行進一步的細胞實驗和/或動物試驗，以選出抑制凋亡信號調(diào)節(jié)激酶1N端二聚化的物質(zhì)，用于預防、緩解和/或治療脂肪性肝炎。

本發(fā)明利用腺相關(guān)病毒AAV8這種肝臟靶向的基因治療載體，介導篩選到的潛在物質(zhì)多肽S1在食蟹獼猴肝臟組織中過表達，通過高脂飲食誘導的肥胖模型(diet induced obesity，DIO)研究多肽S1的功能，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與AAV8-GFP對照組食蟹獼猴相比，AAV8-S1組獼猴體重、BMI指標無顯著差異。通過血脂含量測定以及反應肝功能的酶(ALT、AST)活性測定結(jié)果表明AAV8-S1組獼猴血清中甘油三脂和低密度膽固醇含量顯著降低，高密度膽固醇含量增加，ALT酶活性顯著降低；肝臟組織病理染色結(jié)果表明AAV8-S1組獼猴肝臟組織中脂質(zhì)蓄積明顯減少，肝臟脂肪變性顯著減輕。這表明在獼猴中，多肽S1同樣能夠抑制脂肪肝的發(fā)生。

在本發(fā)明的第三方面，提供一種凋亡信號調(diào)節(jié)激酶1的用途，用于制備抑制肝臟脂肪變性的組合物。

在本發(fā)明的第四方面，提供一種體外調(diào)節(jié)肝臟細胞脂肪變性的方法，所述方法包括：調(diào)節(jié)細胞內(nèi)凋亡信號調(diào)節(jié)激酶1N端二聚化。

本發(fā)明的主要優(yōu)點在于：

本發(fā)明人通過對ASK1在高脂飲食誘導的Ⅱ型糖尿病以及肝臟脂肪變性模型中起到的明顯的促進作用的機制研究，首次發(fā)現(xiàn)ASK1的N端二聚化對于ASK1的磷酸化激活以及ASK1-JNK信號通路具有重要意義，對于肝臟細胞脂肪變性具有重要的調(diào)控作用，可促進肝臟脂肪變性的發(fā)展。以ASK1的N端二聚化為靶點，通過檢測候選物質(zhì)是否抑制ASK1的N端二聚化，可以篩選新型預防、緩解和/或治療脂肪性肝炎的藥物。

附圖說明

圖1是螢火蟲熒光素酶與Renilla熒光素酶RLU的比值結(jié)果；

圖2是轉(zhuǎn)染不同質(zhì)粒的HEK-293T細胞的裂解液以及裂解液經(jīng)免疫共沉淀后得到的蛋白溶液的Western blot檢測結(jié)果；

圖3是轉(zhuǎn)染不同多肽質(zhì)粒的L02細胞經(jīng)PA刺激1h后細胞內(nèi)ASK1-JNK1信號通路的Western blot檢測結(jié)果；

圖4是轉(zhuǎn)染不同多肽質(zhì)粒的L02細胞經(jīng)PA刺激12h后油紅O染色圖及細胞內(nèi)甘油三酯含量定量檢測結(jié)果。

圖5是腺相關(guān)病毒AAV8介導的食蟹獼猴肝臟中多肽S1過表達效率檢測結(jié)果

a為生理鹽水對照組、AAV8-GFP對照組和AAV8-S1組食蟹獼猴肝臟組織中病毒轉(zhuǎn)染效率結(jié)果；b為AAV8-GFP對照組和AAV8-S1組在門靜脈注射病毒載體后食蟹獼猴肝臟組織S1多肽表達情況檢測結(jié)果。

圖6是AAV8-GFP和AAV8-S1組食蟹獼猴體重以及BMI指標結(jié)果圖

a為體重結(jié)果圖，b為BMI指標結(jié)果圖。

圖7是AAV8-GFP和AAV8-S1組食蟹獼猴血脂含量以及肝功能測定結(jié)果圖

a為血清甘油三酯含量測定結(jié)果圖，b為血清總膽固醇含量測定結(jié)果圖，c為血清高密度膽固醇含量測定結(jié)果圖，d為血清低密度膽固醇含量測定結(jié)果圖，e為谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)含量測定結(jié)果圖，f為谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)含量測定結(jié)果圖(*：p＜0.05vs AAV8-GFP組)。

圖8是AAV8-GFP和AAV8-S1組食蟹獼猴肝臟組織HE和油紅O染色結(jié)果圖。

具體實施方式

通過以下詳細說明結(jié)合附圖可以進一步理解本發(fā)明的特點和優(yōu)點。所提供的實施例僅是對本發(fā)明方法的說明，而不以任何方式限制本發(fā)明揭示的其余內(nèi)容。

實驗方法

(1)細胞培養(yǎng)

HEK-293T細胞來源于人胚胎腎臟細胞，培養(yǎng)于DMEM高糖培養(yǎng)基(含10％FBS，1％青霉素-鏈霉素)中；L02細胞來源于人正常肝細胞，培養(yǎng)于DMEM高糖培養(yǎng)基(含10％FBS，1％青霉素-鏈霉素)中，保證培養(yǎng)箱內(nèi)的空氣濕度，5％的CO₂含量，37℃培養(yǎng)。

(2)載體構(gòu)建

1)哺乳動物雙雜交檢測載體pACT-ASK1_N和pBIND-ASK1_N的構(gòu)建

利用CheckMate^TM哺乳動物雙雜交系統(tǒng)(Promega,E2440)，構(gòu)建ASK1_N二聚化檢測載體：

①利用上游引物1：5’-CGGGATCCGGATGAGCACGGAGGCGGACGA-3’，下游引物1：5’-TGATGTCATTCTGGTGCTCCTCGCCCTCGC-3’，從ASK1(NCBI：BC088829)基因cDNA中PCR擴增得到ASK1_N1片段；

②利用上游引物2：5’-GGAGCACCAGAATGACATCAGGAAAGCTCG-3’，下游引物2：5’-GCTCTAGATCAATCATATTCATAGTCATACTCCAGC-3’，從ASK1(NCBI：BC088829)基因cDNA中PCR擴增得到ASK1_N2片段；

③利用上游引物1：5’-CGGGATCCGGATGAGCACGGAGGCGGACGA-3’，下游引物2：5’-GCTCTAGATCAATCATATTCATAGTCATACTCCAGC-3’，從ASK1_N1和ASK1_N2混合模板中，搭橋PCR擴增得到ASK1_N片段；

④pACT載體和pBIND載體分別利用BamH I+Xba I酶切后與擴增得到的目標基因連接，得到pACT-ASK1_N和pBIND-ASK1_N載體；

2)用于免疫共沉淀驗證目標多肽對ASK1N端二聚化的抑制作用的HA-ASK1_N和Myc-ASK1_N載體的構(gòu)建

HA-ASK1_N載體的構(gòu)建：利用上游引物：5’-CGGGATCCATGAGCACGGAGGCGGACGA-3’，下游引物：5’-TGCGGCCGCTCAATCATATTCATAGTCATACTCCAGC-3’，擴增ASK1(NCBI：BC088829)基因N端序列，將擴增得到的產(chǎn)物以及pcDNA5-HA載體用限制性內(nèi)切酶BamHI(NEB，R0136L)和NotI(NEB，R0189L)酶切連接，得到HA-ASK1_N載體。

Myc-ASK1_N載體的構(gòu)建：利用上游引物：5’-GAAGATCTATGAGCACGGAGGCGGACGA-3’，下游引物：5’-CATGCCATGGTCAATCATATTCATAGTCATACTCCAGC-3’，擴增ASK1(NCBI：BC088829)基因N端序列，將擴增得到的產(chǎn)物以及pcDNA5-Myc載體用限制性內(nèi)切酶BgIII(NEB，R0144L)和NcoI(NEB，R0193L)酶切連接，得到Myc-ASK1_N載體。

3)構(gòu)建候選多肽質(zhì)粒

所用多肽氨基酸序列如下：

Peptide1：

LHNGRSKEQRLKEQLGAQQEPVKKSIQESEAFLPQSIPEERYKMKSKPLGICLIIDCI

Peptide2：

MSAEVIHQVEEALDTDEKEMLLFLCRDVAIDVVPPNVRDLLDILRERGKLSVGDLAEL

Peptide3：

MVSKGEELFTGVVPILVELDGDVNGHKFSVSGEGEGDATYGKLTLKFICTTGKLPVPW

Peptide4：

GVQCFSRYPDHMKQHDFFKSAMPEGYVQERTIFFKDDGNYKTRAEVKFEGDTLVNRIE

①利用上游引物：5’-CGGGATCCCTCCATAATGGGAGAAG-3’，下游引物：5’-GCTCTAGAAATGCAATCGATTATC-3’，從cFLIP(NCBI：NM_003879.5)基因cDNA中PCR擴增得到Peptide1片段；

②利用上游引物：5’-CGGGATCCATGTCTGCTGAAGTC-3’，下游引物：5’-GCTCTAGATCACAGTTCAGCCAAGTC-3’，從cFLIP(NCBI：NM_003879.5)基因cDNA中PCR擴增得到Peptide2片段；

③利用上游引物：5’-CGGGATCCATGGTGAGCAAGGGCG-3’，下游引物：5’-GCTCTAGATCACCAGGGCACGGGCAG-3’，從GFP(NCBI：KX130867.1)基因DNA中PCR擴增得到Peptide3片段；

④利用上游引物：5’-CGGGATCCGGCGTGCAGTGCTTC-3’，下游引物：5’-GCTCTAGATCACTCGATGCGGTTCAC-3’，從GFP(NCBI：KX130867.1)基因DNA中PCR擴增得到Peptide4片段；

⑤psi-Flag載體分別利用BamH I+Xba I酶酶切后與擴增得到的目標基因連接，得到psi-flag-peptides(Flag-peptides)載體。

(3)構(gòu)建ASK1_N二聚化哺乳動物雙雜交篩選系統(tǒng)

①將上述構(gòu)建得到的ASK1_N哺乳動物雙雜交檢測載體在HEK-293T細胞中包裝病毒72h，收集細胞培養(yǎng)液，用于感染；

②慢病毒感染前18-24小時，將HEK-293T貼壁細胞鋪到6孔板中。使細胞在慢病毒感染時的數(shù)量為2×10⁵/孔左右；

③第二天，用含有6μg/ml polybrene的2ml新鮮培養(yǎng)基替換原培養(yǎng)基，加入適量病毒懸液；

④繼續(xù)培養(yǎng)48小時后，用新鮮培養(yǎng)基替換含有病毒的培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)染待篩選多肽質(zhì)粒。

(4)目標多肽質(zhì)粒瞬時轉(zhuǎn)染

①按照以下步驟配置轉(zhuǎn)染溶液：

a取0.5μg psi-Flag-Peptides+0.5μg pG5luc質(zhì)粒加至200μl無血清的DMEM培養(yǎng)基中，渦旋震蕩混勻；

b輕微渦旋震蕩混勻TurboFect轉(zhuǎn)染試劑，加入2μl至a的培養(yǎng)基中，立即吹打混勻，室溫靜置20min；

②將上述轉(zhuǎn)染溶液加入至鋪有穩(wěn)定表達ASK1_N二聚化哺乳動物雙雜交篩選系統(tǒng)的24孔培養(yǎng)皿中，搖晃混勻，37℃培養(yǎng)24h。

(5)Luciferase檢測熒光

①裂解細胞：將培養(yǎng)了一段時間后的目標細胞吸盡細胞培養(yǎng)液，直接加入報告基因細胞裂解液；充分裂解后，10,000-15,000g離心3-5min，取上清液用于測定；

②溶解螢火蟲熒光素酶檢測試劑和Renilla熒光素酶檢測緩沖液，并達到室溫，將Renilla熒光素酶檢測底物(100X)置于冰浴或冰盒上備用；

③按照每個樣品需100μl的量，取適量Renilla熒光素酶檢測緩沖液，按照1:100加入Renilla熒光素酶檢測底物(100X)配制成Renilla熒光素酶檢測工作液；

④開啟熒光測定儀，將測定間隔設為2s，測定時間設為10s；

⑤每個樣品測定時，取樣品20-100μl，加入100μ升螢火蟲熒光素酶檢測試劑，用槍打勻混勻后測定RLU(relative light unit)，以報告基因細胞裂解液為空白對照；

⑥完成測定螢火蟲熒光素酶步驟后，加入100μl Renilla熒光素酶檢測工作液，用槍打勻混勻后測定RLU(relative light unit)；

⑦在以Renilla熒光素酶為內(nèi)參的情況下，用螢火蟲熒光素酶測定得到的RLU值除以Renilla熒光素酶測定得到的RLU值。根據(jù)得到的比值來比較不同樣品間多肽抑制作用的程度。

(6)免疫共沉淀

①將上述構(gòu)建的HA-ASK1_N和Myc-ASK1_N質(zhì)粒，分別或同時轉(zhuǎn)染HEK-293T細胞。之后將psi-flag-Peptides質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染至同時含有HA-ASK1_N和Myc-ASK1_N質(zhì)粒的HEK-293T細胞中。

②轉(zhuǎn)染24小時后收獲細胞，加入適量細胞裂解緩沖液(含蛋白酶抑制劑)，冰上裂解30min，細胞裂解液于4攝氏度，用最大轉(zhuǎn)速離心30min后取上清液；

③取少量裂解液以備Western blot分析，剩余裂解液加1μg anti-HA抗體(Sigma，#H6908)，4℃緩慢搖晃孵育過夜；

④取10μl protein A/G瓊脂糖珠(11719394001and 11719386001,Roche)，用適量裂解緩沖液洗3次，每次3,000rpm離心3min；

⑤將預處理過的10μl protein A/G瓊脂糖珠加入到和抗體孵育過夜的細胞裂解液中4℃緩慢搖晃孵育2-4h，使抗體與protein A/G瓊脂糖珠偶連；

⑥免疫沉淀反應后，在4℃以3,000rpm速度離心3min，將瓊脂糖珠離心至管底；將上清小心吸去，瓊脂糖珠用1ml裂解緩沖液洗3-4次；最后加入15μl的2×SDS上樣緩沖液，沸水煮5分鐘；

⑦SDS-PAGE,Western blot分析。

(7)Western blot

1)蛋白質(zhì)提取

細胞加入裂解液，運用BCA Protein Assay Kit定量收集蛋白樣品。

2)上樣與電泳

①將配制好的凝膠板架在電泳槽中，加入電泳內(nèi)液和電泳外液，每個電泳槽需200ml電泳內(nèi)液，電泳外液需要灌滿電泳槽體積的2/3。

②把蛋白樣品上樣到SDS-PAGE膠加樣孔內(nèi)，點樣完成后開始電泳。

3)轉(zhuǎn)膜

①按要求配制轉(zhuǎn)膜液于4℃預冷。

②按8cm×5.9cm裁剪好PVDF膜并在一角剪個缺口作為膜的左上角，使用前在甲醇中浸泡15秒后放入轉(zhuǎn)膜液中備用。

③將夾板左右攤開，負極向右。黑色的一邊為負極，白色為正極，兩邊各鋪上2張海綿和5張濾紙(海綿和濾紙預先用轉(zhuǎn)移緩沖液浸濕)。

④取出凝膠板中的凝膠，去除多余部分，用轉(zhuǎn)膜液洗滌凝膠，將凝膠平鋪在負極的濾紙上，趕走氣泡，將PVDF膜覆蓋其上，剪缺口的地方應與大Marker的一角對齊，趕走氣泡后覆蓋上左邊的濾紙及海綿(不能有氣泡)，夾上夾板。

⑤將夾板放入轉(zhuǎn)膜槽中，轉(zhuǎn)膜槽的負極(黑色面)應與夾板的負極(黑色面)放在一起，灌滿轉(zhuǎn)膜液以淹沒凝膠。

⑥轉(zhuǎn)膜槽接通電源，電壓設為250V，電流設為0.2A。開始電泳轉(zhuǎn)移，起始電壓應大于100V，如果低于100V，可適當調(diào)高電流至所需電壓，轉(zhuǎn)移1.5小時。

⑦轉(zhuǎn)移結(jié)束后，取出PVDF膜。

4)封閉

把蛋白膜放置到預先準備好的TBS中，洗去膜上的轉(zhuǎn)膜液。蛋白膜放入封閉液中，在搖床上緩慢搖動，室溫封閉1-4小時。

5)一抗孵育

①用TBST洗滌蛋白膜3次，每次5分鐘。

②封口機將薄膜封入雜交袋中，加上一抗，封口，盡可能不留空氣。

③將雜交袋放入4℃搖床中，過夜。

6)二抗孵育

①將薄膜取出用TBST洗滌3次，每次5分鐘，回收一抗。

②將膜放入對應的加有二抗的二抗稀釋液中，避光孵育1小時。

7)蛋白檢測

孵育后用TBST洗滌3次，每次5min。利用Bio-Rad Chemi Doc XRS+凝膠成像系統(tǒng)檢測目的條帶。

【實施例1】篩選可抑制ASK1的N端二聚化的多肽

穩(wěn)定表達ASK1_N二聚化檢測質(zhì)粒的HEK-293T分為5組，分別標記為A、B、C、D、E，其中A組在目標多肽瞬時轉(zhuǎn)染時只添加pG5luc質(zhì)粒而不添加psi-flag-Peptide質(zhì)粒，B、C、D、E組分別用psi-flag-Peptide1、2、3、4質(zhì)粒與pG5luc質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK-293T細胞，即5組分別為：

A:HEK-293T細胞(pACT-ASK1_N+pBIND-ASK1_N)+pG5luc

B:HEK-293T細胞(pACT-ASK1_N+pBIND-ASK1_N)+psi-flag-Peptide1+pG5luc

C:HEK-293T細胞(pACT-ASK1_N+pBIND-ASK1_N)+psi-flag-Peptide2+pG5luc

D:HEK-293T細胞(pACT-ASK1_N+pBIND-ASK1_N)+psi-flag-Peptide3+pG5luc

E:HEK-293T細胞(pACT-ASK1_N+pBIND-ASK1_N)+psi-flag-Peptide4+pG5luc

添加轉(zhuǎn)染溶液后，細胞于37℃培養(yǎng)24h，之后收集細胞，進行Luciferase熒光檢測。

熒光檢測結(jié)果如圖1所示，A組不添加psi-flag-Peptide質(zhì)粒，ASK1的N端正常二聚化，螢火蟲熒光素酶RLU值除以Renilla熒光素酶RLU值約為1.9；當添加psi-flag-Peptide1質(zhì)粒時(B組)，螢火蟲熒光素酶RLU值除以Renilla熒光素酶RLU值相比于無多肽組顯著降低，即Peptide1抑制了ASK1的N端二聚化；而當分別添加psi-flag-Peptide 2/3/4(C、D、E組)時，比值結(jié)果相比于A組無顯著變化，即Peptide2、3、4不影響ASK1的N端二聚化。

【實施例2】免疫共沉淀驗證多肽對ASK1的N端二聚化的抑制作用

HEK-293T細胞分為7組，編號為A、B、C、D、E、F、G，A組以及B組細胞分別只轉(zhuǎn)染HA-ASK1_N或Myc-ASK1_N質(zhì)粒，C、D、E、F、G組細胞同時轉(zhuǎn)染HA-ASK1_N和Myc-ASK1_N兩種質(zhì)粒，48小時后篩選陽性細胞。所得細胞如下：

A組：HEK-293T細胞(HA-ASK1_N)

B組：HEK-293T細胞(Myc-ASK1_N)

C、D、E、F、G組：HEK-293T細胞(HA-ASK1_N+Myc-ASK1_N)

之后進行目標多肽質(zhì)粒瞬時轉(zhuǎn)染，A、B、C三組細胞中只加入同等量的不含目標多肽質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染溶液，D、E、F、G組細胞分別加入含psi-flag-Peptide1/psi-flag-Peptide2/psi-flag-Peptide3/psi-flag-Peptide4質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染溶液，即7組分別為：

A：HEK-293T細胞(HA-ASK1_N)

B：HEK-293T細胞(Myc-ASK1_N)

C：HEK-293T細胞(HA-ASK1_N+Myc-ASK1_N)

D：HEK-293T細胞(HA-ASK1_N+Myc-ASK1_N)+psi-flag-Peptide1

E：HEK-293T細胞(HA-ASK1_N+Myc-ASK1_N)+psi-flag-Peptide2

F：HEK-293T細胞(HA-ASK1_N+Myc-ASK1_N)+psi-flag-Peptide3

G：HEK-293T細胞(HA-ASK1_N+Myc-ASK1_N)+psi-flag-Peptide4

轉(zhuǎn)染24小時后收獲細胞，進行免疫共沉淀分析，驗證目標多肽對ASK1的N端二聚化的影響。Western blot分析分析中所用一抗信息：HA(Sigam，#H6908)，Myc(MBL，#M192-3)，F(xiàn)lag(Sigma，#F3165)，所需二抗信息：HRP AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG(H+L)(Jackson，#111-035-003)，Biotin AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG(H+L)(Abbkine，A21210)。

在免疫共沉淀過程中，protein A/G瓊脂糖珠通過HA抗體與細胞裂解液中的HA-ASK1_N相結(jié)合，若ASK1的N端正常二聚化，則免疫沉淀反應后得到的上樣蛋白溶液中含有HA-ASK1_N以及Myc-ASK1_N，Western blot分析結(jié)果可見HA-ASK1_N和Myc-ASK1_N兩條條帶；若ASK1的N端二聚化被抑制，則Myc-ASK1_N不會被檢測到。

Western blotting分析結(jié)果如圖2所示，細胞裂解液的Western blotting分析顯示在B-G組細胞中，Myc-ASK1_N均正常表達，且表達量一致；在D-G組細胞中，不同多肽表達含量一致。免疫共沉淀后Western blotting結(jié)果表明A組可見清晰HA-ASK1_N條帶；B組無明顯條帶；C組可清晰檢測到兩條條帶；E、F、G組的檢測結(jié)果與C組相同，即ASK1的N端二聚化不被抑制；而在D組中，當含有Peptide1時，Myc-ASK1_N的檢測條帶明顯變?nèi)酰琀A-ASK1_N條帶強弱不變，這一結(jié)果進一步驗證了Peptide1可抑制ASK1的N端二聚化。

【實施例3】抑制ASK1的N端二聚化可抑制ASK1-JNK1信號通路

通過Western blot分析來檢測ASK1的N端二聚化被抑制后對細胞內(nèi)JNK1信號通路的影響。所需一抗信息：p-ASK1(Cell Signaling Technology，#3765)，ASK1(GeneTex，#GTX107921)，p-MKK7(Aviva Systems Biology，#OAAF05547)，MKK7(Cell Signaling Technology，#4172)，p-JNK1(NOVUS，#NB100-82009)，JNK1(Abcam，#ab199380)，F(xiàn)lag(Sigma，#F3165)；所需二抗信息：HRP AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG(H+L)(Jackson,#111-035-003),Biotin AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG(H+L)(Abbkine,A21210)。

L02細胞分5組于培養(yǎng)皿中培養(yǎng)，編號為A、B、C、D、E，37℃培養(yǎng)至細胞密度為70％，A組細胞轉(zhuǎn)染psi-flag質(zhì)粒作為對照，B、C、D、E組分別轉(zhuǎn)染psi-Flag-Peptides1、2、3、4，轉(zhuǎn)染24h后，各組的一部分細胞培養(yǎng)基中加棕櫚酸酯(PA)刺激1h，同時各組的另一部分細胞培養(yǎng)基中加入BSA處理1h作為對照。收集細胞，Western blot分析細胞內(nèi)ASK1-JNK1信號通路中涉及的各蛋白表達含量變化。結(jié)果如圖3所示，其中Flag蛋白表達含量在各組中無明顯變化，說明B、C、D、E 4組在多肽質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后多肽表達量基本一致。與其他組相比，僅B組p-ASK1、p-MKK7、p-JNK1蛋白含量顯著降低，即ASK1的N端二聚化被抑制后，會抑制MKK7、JNK1的磷酸化，抑制ASK1-JNK1信號通路。

【實施例4】抑制ASK1的N端二聚化可促進細胞脂質(zhì)代謝，抑制脂肪性肝炎。

L02細胞分5組于培養(yǎng)皿中培養(yǎng)，編號為A、B、C、D、E，A組細胞轉(zhuǎn)染psi-flag質(zhì)粒作為對照，B、C、D、E組分別轉(zhuǎn)染psi-flag-Peptides1、2、3、4。轉(zhuǎn)染24h后，各組一部分細胞的培養(yǎng)基中加入PA處理12h，同時另一部分用BSA處理12h作為對照在(Ctl)。之后進行油紅O染色，并用甘油三酯(Triglyceride)分析試劑盒(比色法)(Cayman，10010303)檢測細胞內(nèi)甘油三酯的含量，以A組BSA對照組細胞甘油三酯檢測值為1，計算其余各組檢測結(jié)果的相對值，得到各組細胞甘油三酯相對含量。油紅O染色步驟如下：

(1)樣品組和對照組用1X PBS洗滌2次，加入300μl 3％多聚甲醛固定20min；

(2)加入1x PBS洗滌2次后，加入60％異丙醇漂洗10s；

(3)加入1x PBS洗滌2次，通風櫥吹干；

(4)每孔500μl加入油紅O染色1h；

(5)加入1x PBS洗滌2次，60％異丙醇進行分選，再加入1x PBS洗2次；鏡檢，拍照；

結(jié)果如圖4所示，A為油紅O染色圖，可見A組大量細胞呈紅色，表明PA刺激12h后，細胞內(nèi)出現(xiàn)明顯的脂質(zhì)沉積；C、D、E組細胞染色結(jié)果與A組相似，均呈現(xiàn)大面積紅色；而在B組中，當細胞內(nèi)表達多肽1時，經(jīng)PA刺激12h后，被油紅O染紅的細胞較少，且細胞內(nèi)著色面積較小。B為細胞內(nèi)相對甘油三酯含量測定結(jié)果，經(jīng)BSA處理的對照組細胞內(nèi)甘油三酯含量均較低，且5組細胞甘油三酯含量無顯著性差異，而經(jīng)PA處理12h后，相比于各組的對照組，細胞內(nèi)甘油三酯含量顯著增加，但轉(zhuǎn)染Flag-Peptide1的B組細胞內(nèi)甘油三酯含量的增加程度顯著低于其他組。上述結(jié)果表明Peptide1可通過抑制ASK1的N端二聚化抑制肝細胞脂肪變性，ASK1的N端二聚化對篩選治療脂肪性肝炎的藥物具有重要意義，其可作為一個新的治療靶點，應用于脂肪性肝炎疾病的治療中。

【實施例5】構(gòu)建多肽S1過表達腺相關(guān)病毒載體系統(tǒng)(AAV8-S1/AAV8-GFP)

本實施例所述的多肽S1為實施例1-4篩選出來的Peptide1。

AAV8為一種肝臟靶向的基因治療載體，本發(fā)明中使用AAV8介導S1多肽在食蟹猴肝臟中的過表達，以研究多肽S1過表達對非酒精性脂肪肝的影響。

(1)用引物PX458-HindIII-F(CCCAAGCTTGGTACCACTAGTGTCGACgaattcGGCAGTGGAGAGGG)和PX458-BgLII-R(GGAAGATCTTTACTTGTACAGCTCGTCCATGCC)從質(zhì)粒PX458(Addgene，48138)中擴增T2A-EGFP片段，連接至使用HindIII(NEB，R0104L)和BgLII(NEB，R0144L)雙酶切的AAV載體pAAV-MCS中，構(gòu)建pAAV-T2A-EGFP載體。為了便于以后使用，再合成MCS-Oligo1-SacI(CtctagactcgagaccggtCTTAAGGCTAGCGATATCGGATCCAAGCTTGGTAC)和MCS-Oligo2-KpnI(CAAGCTTGGATCCGATATCGCTAGCCTTAAGACCGGTCTCGAGTCTAGAGAGCT)，通過變性，融合之后連入經(jīng)SacI(NEB，R0156L)和KpnI(NEB，R0142L)酶切的上述pAAV-T2A-EGFP載體中，構(gòu)建pAAV-MCS-T2A-EGFP載體。

(2)利用上游引物：5’-GCTCTAGAgccaccATGCTCCATAATGGGAGAAG-3’，下游引物：5’-CGGGATCCCTTGTCATCGTCGTCCTTGTAATCAATGCAATCGATTATC-3’，從cFLIP(NCBI：NM_003879.5)基因cDNA中PCR擴增得到S1肽段的編碼序列；將S1肽段的編碼序列用XbaI(NEB，R0145L)和BamHI(NEB，R0136L)雙酶切，然后克隆到經(jīng)同樣酶切的pAAV-MCS-T2A-EGFP載體中，得到pAAV-S1-T2A-EGFP載體，此載體中S1片段與EGFP在同一讀碼框內(nèi)，在表達S1肽段的同時表達EGFP，便于切片觀察。

(3)將三質(zhì)粒轉(zhuǎn)染系統(tǒng)(pAAV-S1-T2A-EGFP，pAAV-Helper和pAAV-2/8)用PEI(Polysciences cat#24765)共轉(zhuǎn)染至AAV293細胞中，轉(zhuǎn)染72h后收集細胞，超聲裂解后去除細胞碎片(AAV8-GFP對照組三質(zhì)粒轉(zhuǎn)染系統(tǒng)為：pAAV-MCS-T2A-EGFP，pAAV-Helper和pAAV-2/8)。

(4)用氯化銫梯度離心的方法純化病毒液，用1x PBS+5％Sorbitol-in Slide-A-Lyzer dialysis cassettes透析純化的病毒液，去除氯化銫，獲得腺相關(guān)病毒AAV8-S1和AAV8-GFP。

(5)熒光定量PCR檢測病毒滴度，具體步驟如下：

a.取10μL純化后的病毒液，加入100μL DNase裂解液(10mM Tris·Cl,pH 7.5、10mM MgCl₂、2mM CaCl₂、50U/ml DNase I)，37℃孵育1小時。

b.加入0.5M的EDTA，混合均勻后70℃孵育10分鐘，加入終濃度為50μg/ml的蛋白酶K，50攝氏度過夜孵育。

c.在99℃下孵育10分鐘，徹底滅活蛋白酶K。加入滅菌雙蒸水至1ml，取出2μL補水至400μL用作熒光定量PCR的模板。

d.按照9.1×10¹¹個1000bp的雙鏈DNA分子計算，將pAAV-S1-T2A-EGFP/pAAV-MCS-T2A-EGFP質(zhì)粒稀釋至5×10¹至5×10⁸八個濃度梯度，制成標準品。

e.分別取2μL樣品和標準品，用GFP特異性的引物Forward 5’-AGCAGCACGACTTCTTCAAGTCC；和Reverse 5’-TGTAGTTGTACTCCAGCTTGTGC做熒光定量PCR。根據(jù)標準品指定標準曲線，計算出病毒中的載體拷貝數(shù)(病毒滴度)。

【實施例6】腺相關(guān)病毒(AAV8-S1)介導的肝臟S1多肽過表達食蟹獼猴模型的構(gòu)建

本實施例所述的多肽S1為實施例1-4篩選出來的Peptide1。

腺相關(guān)病毒載體通過門靜脈注射至食蟹獼猴體內(nèi)，在肝臟中過表達多肽S1。

食蟹獼猴高脂飼料(購自北京華阜康生物科技有限公司，#5043，熱量百分比：蛋白質(zhì):17.86％；碳水化合物:58.8％；脂肪:22.34％)喂養(yǎng)2天后，隨機分為三組(每組6-8只，分別注射AAV8-S1、AAV8-GFP、生理鹽水)。門靜脈注射需要開腹手術(shù)，術(shù)前禁食10-14小時，禁水6小時。術(shù)前先肌肉注射阿托品0.05mg/kg(減少術(shù)中腺體的分泌)，約10分鐘后肌肉注射舒眠寧Ⅱ0.1mL/kg。待實驗猴麻醉后稱量體重，備皮，將獼猴以仰臥位固定于手術(shù)臺上，連接心電監(jiān)護儀，監(jiān)測血氧飽和度、血壓、心率，用碘酒消毒手術(shù)區(qū)域3遍。手術(shù)及助手洗手消毒穿手術(shù)衣，給實驗猴消毒鋪巾，準備手術(shù)。沿腹中線分層劃開皮膚，打開腹腔，找到門靜脈后緩慢將含有AAV8-S1病毒載體(滴度5.88E+08Tu/mL，血清型AAV2/8)1mL的緩沖液注射入門靜脈內(nèi)，注射完成后用無菌小紗布塊按壓止血，檢查無出血情況后準備縫合。同時靜脈勻速滴注青霉素400萬單位，預防感染。分層關(guān)閉腹腔，穿好腹帶防止手術(shù)后切口張力過大和減少腹腔內(nèi)出血(AAV8-GFP、生理鹽水組分別注射同等體積的含同等量AAV8-GFP病毒以及同等體積的生理鹽水，其方法與AAV8-S1組相同)。高脂飼養(yǎng)20周后，穿刺活檢術(shù)取出組織通過免疫熒光以及Western blot檢測腺相關(guān)病毒介導的多肽S1的過表達。

食蟹獼猴通過高脂飼料#5043飼養(yǎng)30周，并每天供應150g時令水果。所有動物均自由飲水。

【實施例7】食蟹獼猴肝臟過表達多肽S1抑制高脂飼養(yǎng)引起的脂肪肝發(fā)生

本實施例所述的多肽S1為實施例1-4篩選出來的Peptide1。

所有實驗猴每兩周檢測生理指標，包括體重，體溫，呼吸，心率，血壓，腰圍，臀圍，坐高等指標。每4周進行腹部超聲檢測。第0周及30周時采集血液5mL分離血清后進行空腹肝臟脂質(zhì)(甘油三酯、總膽固醇、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白)及肝功能(ALT、AST)檢測。通過穿刺活檢術(shù)取出組織通過GFP熒光檢測以及Western blot檢測腺相關(guān)病毒介導的多肽S1的過表達。

1、熒光檢測以及肝臟組織Western blot分析

制作肝臟組織冰凍切片，在熒光顯微鏡下觀察GFP的綠色熒光強度，以確定腺相關(guān)病毒的感染效率；肝臟組織Western blot分析檢測肝臟組織中多肽S1的表達情況。

(1)肝臟組織冰凍切片

將活體穿刺取出的組織置于并動機中包埋，包埋完成后使用冰凍切片機切片(切片厚度5μm)，用載玻片接近組織片，將其粘貼于載玻片上。冰凍切片置于熒光顯微鏡下觀察綠色熒光強度。

(2)Western blot檢測多肽S1表達

1)蛋白質(zhì)提取

①于-80℃取出肝臟組織樣本，放入干冰中。每個EP管放入3-4顆鋼珠，放入干冰中預冷。用眼科剪剪下所需樣本放入對應的EP管，稱重并記錄每個樣本的重量。

②裂解液中加入PMSF，混勻，加入相應量的裂解液到樣品中，迅速搖勻。

③于-80℃預冷研磨儀適配器中研磨樣品，研磨參數(shù)設置為30Hz/秒，90秒。

④研磨結(jié)束后，冰上放置10分鐘，取出鋼珠。

⑤超聲裂解儀裂解樣本5KHz/次，每次1秒，間隔1秒，重復10次。超聲完成后冰上放置10分鐘。

⑥樣本放入4℃預冷的離心機中離心，4℃，12000轉(zhuǎn)/分鐘離心30min。

⑦吸取上清轉(zhuǎn)移到新的EP管中，4℃，14000轉(zhuǎn)/分鐘離心10min。

⑧吸取上清轉(zhuǎn)移到新的EP管中繼續(xù)離心，4℃，14000轉(zhuǎn)/分鐘離心5min。準確吸取清液并利用BCA Protein Assay Kit(Pierec^TM，23225)進行蛋白定量。

2)配置SDS-PAGE凝膠并進行上樣與電泳

①將配制好的凝膠板架在電泳槽中，加入電泳內(nèi)液和電泳外液。每個電泳槽需200ml電泳內(nèi)液。電泳外液需要灌滿電泳槽體積的2/3。

②把蛋白樣品上樣到SDS-PAGE膠加樣孔內(nèi)，點樣完成后開始電泳。

3)轉(zhuǎn)膜

①按要求配制轉(zhuǎn)膜液于4℃預冷。

②按8cm×5.9cm裁剪好PVDF膜并在一角剪個缺口作為膜的左上角，使用前在甲醇中浸泡15秒后放入轉(zhuǎn)膜液中備用。

③將夾板左右攤開，負極向右。黑色的一邊為負極，白色為正極，兩邊各鋪上2張海綿和5張濾紙(海綿和濾紙預先用轉(zhuǎn)移緩沖液浸濕)。

④取出凝膠板中的凝膠，去除多余部分，用轉(zhuǎn)膜液洗滌凝膠，將凝膠平鋪在負極的濾紙上，趕走氣泡，將PVDF膜覆蓋其上，剪缺口的地方應與大Marker的一角對齊，趕走氣泡后覆蓋上左邊的濾紙及海綿(不能有氣泡)，夾上夾板。

⑤將夾板放入轉(zhuǎn)膜槽中，轉(zhuǎn)膜槽的負極(黑色面)應與夾板的負極(黑色面)放在一起，灌滿轉(zhuǎn)膜液以淹沒凝膠。

⑥轉(zhuǎn)膜槽接通電源，電壓設為250V，電流設為0.2A。開始電泳轉(zhuǎn)移，起始電壓應大于100V，如果低于100V，可適當調(diào)高電流至所需電壓，轉(zhuǎn)移1.5小時。

⑦轉(zhuǎn)移結(jié)束后，取出PVDF膜。

4)封閉

把蛋白膜放置到預先準備好的TBS中，洗去膜上的轉(zhuǎn)膜液。蛋白膜放入封閉液中，在搖床上緩慢搖動，室溫封閉1-4小時。

5)一抗(anti-Flag(Sigma，#F3165))孵育

①用TBST洗滌蛋白膜3次，每次5分鐘。

②封口機將薄膜封入雜交袋中，加上一抗，封口，盡可能不留空氣。

③將雜交袋放入4℃搖床中，過夜。

6)二抗(Biotin AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG(H+L)(Abbkine，A21210))孵育

①將薄膜取出用TBST洗滌3次，每次5分鐘，回收一抗。

②將膜放入對應的加有二抗的二抗稀釋液中，避光孵育1小時。

7)蛋白檢測

孵育后用TBST洗滌3次，每次5min。利用Bio-Rad Chemi Doc XRS+凝膠成像系統(tǒng)檢測目的條帶。

2、生理生化指標檢測

(1)生理指標檢測

禁食10-14小時，禁水6小時，鹽酸氯胺酮10mg/kg肌肉注射麻醉，檢測以上生理指標并記錄相關(guān)實驗數(shù)據(jù)。

(2)生化指標檢測

實驗前禁食10-14小時，禁水6小時，鹽酸氯胺酮10mg/kg肌肉注射麻醉，靜脈采血后收集血液5mL，分離學清后送公司檢測(武漢迪安)脂質(zhì)及肝功能情況。

3、肝臟組織病理染色相關(guān)實驗

制作冰凍、石蠟切片，并進行HE和油紅O染色。

(1)肝臟脫水，透明，浸蠟

活體穿刺取出的肝臟組織標本置于甲醛固定液中固定，取固定好的部分肝葉組織于標記的包埋框內(nèi)，在小流量流水沖洗30分鐘以上。按照以下流程在機器上設置以下程序，①脫水：75％酒精(45分鐘)→75％酒精(45分鐘)→85％酒精(45分鐘)→85％酒精(45分鐘)→95％酒精(45分鐘)→95％酒精(45分鐘)→無水酒精(1小時)→無水酒精(1小時)；②透明：二甲苯(1小時)→二甲苯(1小時)；③浸臘(65℃)：石蠟(1小時)→石蠟(1小時)。待組織沖洗完畢后，將包含組織的包埋框裝進機器籃筐內(nèi)，啟動上述程序。上述程序完成后，取出組織包埋框送病理室包埋組織，同時清洗機器備用。

(2)肝臟組織切片

使用切片機切片(切片厚度5μm)。

(3)肝臟組織蘇木精-伊紅(HE)染色

將肝臟組織石蠟切片放入65℃烘箱(30分鐘)→二甲苯中(5分鐘×3次)→100％酒精(1分鐘)→90％酒精(1分鐘)→70％酒精(1分鐘)→蒸餾水洗→蘇木素(5分鐘)→自來水洗去切片上的浮色→1％鹽酸酒精(1至3秒)→自來水洗數(shù)下→Scott促藍液(碳酸氫鈉0.35g，硫酸鎂2g，蒸餾水100mL)(1分鐘)→自來水洗數(shù)下→伊紅(1分鐘)→蒸餾水洗去切片上的浮色→70％酒精一下→90％酒精一下→100％酒精(30秒×3次)→二甲苯(2分鐘×3次)→在二甲苯未干時封片，拍照。

(4)肝臟組織油紅O染色

①將冰凍肝臟組織切片在通風櫥中風干30分鐘，4％多聚甲醛固定10分鐘。置于雙蒸水中稍洗10分鐘，以除去組織表明的多聚甲醛。

②以60％異丙醇處理1分鐘。

③用油紅O(公司sigma，貨號O0625，濃度0.5克/100mL 100％異丙醇)染色30分鐘。

④之后以60％異丙醇漂洗1分鐘×3次，直至背景干凈。

⑤用Mayer’s蘇木素染液(5滴)淡染細胞核。

⑥水漂洗，稀碳酸鋰水溶液中促藍，充分水洗，水洗至細胞核藍化。

⑦用甘油明膠封片，拍照。

4、檢測結(jié)果

熒光檢測結(jié)果如圖5a，AAV8-GFP以及AAV8-S1組獼猴肝臟組織在熒光顯微鏡下均可見明顯綠色熒光，且兩組之間熒光強度無顯著差異，說明AAV8病毒載體在兩組獼猴肝臟組織中轉(zhuǎn)染率相同。肝臟組織Western blot檢測S1多肽表達結(jié)果如圖5b所示，可見在AAV8-GFP中未見Western blot條帶，即未檢測到S1表達，而在AAV8-S1組中可見明顯條帶，即AAV8-S1門靜脈注射組獼猴肝臟中S1多肽表達顯著。

獼猴體重及BMI測定結(jié)果如圖6所示。AAV8-GFP以及AAV8-S1組食蟹獼猴從實驗開始直至高脂飼養(yǎng)30周，兩組動物體重均無顯著差異(圖6a)，且其BMI結(jié)果也無明顯差異(圖6b)。

血脂以及ASL、AST檢測結(jié)果如圖7所示。在高脂飼料飼養(yǎng)30周后，AAV8-S1組獼猴血清甘油三酯含量顯著低于AAV8-GFP對照組(圖7a)；兩組動物血清總膽固醇含量無明顯差異(圖7b)，但AAV8-S1組獼猴血清高密度膽固醇含量高于AAV8-GFP組(圖7c)，低密度膽固醇含量低于AAV8-GFP組(圖7d)。兩組獼猴AST酶含量無顯著差異但AAV8-S1組ALT酶含量顯著低于AAV8-GFP組(圖7e、f)。這些結(jié)果表明，多肽S1抑制了高脂飲食引起的肝功能的惡化以及脂肪肝的發(fā)生。

肝臟組織病理染色結(jié)果如圖8所示，高脂飼料飼養(yǎng)30周后的AAV8-GFP組獼猴肝臟切片經(jīng)HE染色后可見明顯空泡化且融合連成片狀，肝臟細胞形態(tài)被破壞，AAV8-S1組空泡化較AAV8-GFP組明顯減輕(圖8上)；油紅O染色結(jié)果可見AAV8-GFP組獼猴的肝門靜脈周圍呈大面積紅色，提示有大量脂質(zhì)沉積，而AAV8-S1組紅色面積顯著減少，脂質(zhì)沉積量降低(圖8下)。病理染色結(jié)果表明多肽S1過表達顯著減輕了食蟹獼猴由高脂飲食導致的肝臟脂肪變性以及肝臟脂質(zhì)沉積。多肽S1可抑制食蟹獼猴脂肪肝疾病的發(fā)生。

上述結(jié)果顯示，多肽S1的過表達可顯著減輕HFD誘導下發(fā)生的脂肪肝病變。多肽S1對改善脂肪肝具有顯著的作用。多肽S1可有望成為一種治療脂肪肝的新型藥物。

上述實施例為本發(fā)明較佳的實施方式，但本發(fā)明的實施方式并不受上述實施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。

SEQUENCE LISTING

<110> 武漢大學

<120> 一種以凋亡信號調(diào)節(jié)激酶1

N端二聚化為靶點篩選用于治療脂肪性肝炎藥物的方法

<160> 24

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 678

<212> PRT

<213> 人類

<400> 1

Met Ser Thr Glu Ala Asp Glu Gly Ile Thr Phe Ser Val Pro Pro Phe

1 5 10 15

Ala Pro Ser Gly Phe Cys Thr Ile Pro Glu Gly Gly Ile Cys Arg Arg

20 25 30

Gly Gly Ala Ala Ala Val Gly Glu Gly Glu Glu His Gln Leu Pro Pro

35 40 45

Pro Pro Pro Gly Ser Phe Trp Asn Val Glu Ser Ala Ala Ala Pro Gly

50 55 60

Ile Gly Cys Pro Ala Ala Thr Ser Ser Ser Ser Ala Thr Arg Gly Arg

65 70 75 80

Gly Ser Ser Val Gly Gly Gly Ser Arg Arg Thr Thr Val Ala Tyr Val

85 90 95

Ile Asn Glu Ala Ser Gln Gly Gln Leu Val Val Ala Glu Ser Glu Ala

100 105 110

Leu Gln Ser Leu Arg Glu Ala Cys Glu Thr Val Gly Ala Thr Leu Glu

115 120 125

Thr Leu His Phe Gly Lys Leu Asp Phe Gly Glu Thr Thr Val Leu Asp

130 135 140

Arg Phe Tyr Asn Ala Asp Ile Ala Val Val Glu Met Ser Asp Ala Phe

145 150 155 160

Arg Gln Pro Ser Leu Phe Tyr His Leu Gly Val Arg Glu Ser Phe Ser

165 170 175

Met Ala Asn Asn Ile Ile Leu Tyr Cys Asp Thr Asn Ser Asp Ser Leu

180 185 190

Gln Ser Leu Lys Glu Ile Ile Cys Gln Lys Asn Thr Met Cys Thr Gly

195 200 205

Asn Tyr Thr Phe Val Pro Tyr Met Ile Thr Pro His Asn Lys Val Tyr

210 215 220

Cys Cys Asp Ser Ser Phe Met Lys Gly Leu Thr Glu Leu Met Gln Pro

225 230 235 240

Asn Phe Glu Leu Leu Leu Gly Pro Ile Cys Leu Pro Leu Val Asp Arg

245 250 255

Phe Ile Gln Leu Leu Lys Val Ala Gln Ala Ser Ser Ser Gln Tyr Phe

260 265 270

Arg Glu Ser Ile Leu Asn Asp Ile Arg Lys Ala Arg Asn Leu Tyr Thr

275 280 285

Gly Lys Glu Leu Ala Ala Glu Leu Ala Arg Ile Arg Gln Arg Val Asp

290 295 300

Asn Ile Glu Val Leu Thr Ala Asp Ile Val Ile Asn Leu Leu Leu Ser

305 310 315 320

Tyr Arg Asp Ile Gln Asp Tyr Asp Ser Ile Val Lys Leu Val Glu Thr

325 330 335

Leu Glu Lys Leu Pro Thr Phe Asp Leu Ala Ser His His His Val Lys

340 345 350

Phe His Tyr Ala Phe Ala Leu Asn Arg Arg Asn Leu Pro Gly Asp Arg

355 360 365

Ala Lys Ala Leu Asp Ile Met Ile Pro Met Val Gln Ser Glu Gly Gln

370 375 380

Val Ala Ser Asp Met Tyr Cys Leu Val Gly Arg Ile Tyr Lys Asp Met

385 390 395 400

Phe Leu Asp Ser Asn Phe Thr Asp Thr Glu Ser Arg Asp His Gly Ala

405 410 415

Ser Trp Phe Lys Lys Ala Phe Glu Ser Glu Pro Thr Leu Gln Ser Gly

420 425 430

Ile Asn Tyr Ala Val Leu Leu Leu Ala Ala Gly His Gln Phe Glu Ser

435 440 445

Ser Phe Glu Leu Arg Lys Val Gly Val Lys Leu Ser Ser Leu Leu Gly

450 455 460

Lys Lys Gly Asn Leu Glu Lys Leu Gln Ser Tyr Trp Glu Val Gly Phe

465 470 475 480

Phe Leu Gly Ala Ser Val Leu Ala Asn Asp His Met Arg Val Ile Gln

485 490 495

Ala Ser Glu Lys Leu Phe Lys Leu Lys Thr Pro Ala Trp Tyr Leu Lys

500 505 510

Ser Ile Val Glu Thr Ile Leu Ile Tyr Lys His Phe Val Lys Leu Thr

515 520 525

Thr Glu Gln Pro Val Ala Lys Gln Glu Leu Val Asp Phe Trp Met Asp

530 535 540

Phe Leu Val Glu Ala Thr Lys Thr Asp Val Thr Val Val Arg Phe Pro

545 550 555 560

Val Leu Ile Leu Glu Pro Thr Lys Ile Tyr Gln Pro Ser Tyr Leu Ser

565 570 575

Ile Asn Asn Glu Val Glu Glu Lys Thr Ile Ser Ile Trp His Val Leu

580 585 590

Pro Asp Asp Lys Lys Gly Ile His Glu Trp Asn Phe Ser Ala Ser Ser

595 600 605

Val Arg Gly Val Ser Ile Ser Lys Phe Glu Glu Arg Cys Cys Phe Leu

610 615 620

Tyr Val Leu His Asn Ser Asp Asp Phe Gln Ile Tyr Phe Cys Thr Glu

625 630 635 640

Leu His Cys Lys Lys Phe Phe Glu Met Val Asn Thr Ile Thr Glu Glu

645 650 655

Lys Gly Arg Ser Thr Glu Glu Gly Asp Cys Glu Ser Asp Leu Leu Glu

660 665 670

Tyr Asp Tyr Glu Tyr Asp

675

<210> 2

<211> 2034

<212> DNA

<213> 人類

<400> 2

atgagcacgg aggcggacga gggcatcact ttctctgtgc cacccttcgc cccctcgggc 60

ttctgcacca tccccgaggg cggcatctgc aggaggggag gagcggcggc ggtgggcgag 120

ggcgaggagc accagctgcc accgccgccg ccgggcagct tctggaacgt ggagagcgcc 180

gctgcccctg gcatcggttg tccggcggcc acctcctcga gcagtgccac ccgaggccgg 240

ggcagctctg ttggcggggg cagccgacgg accacggtgg catatgtgat caacgaagcg 300

agccaagggc aactggtggt ggccgagagc gaggccctgc agagcttgcg ggaggcgtgc 360

gagacagtgg gcgccaccct ggaaaccctg cattttggga aactcgactt tggagaaacc 420

accgtgctgg accgctttta caatgcagat attgcggtgg tggagatgag cgatgccttc 480

cggcagccgt ccttgtttta ccaccttggg gtgagagaaa gtttcagcat ggccaacaac 540

atcatcctct actgtgatac taactcggac tctctgcagt cactgaagga aataatttgc 600

cagaagaata ctatgtgcac tgggaactac acctttgttc cttacatgat aactccacat 660

aacaaagtct actgctgtga cagcagcttc atgaaggggt tgacagagct catgcaaccg 720

aacttcgagc tgcttcttgg acccatctgc ttacctcttg tggatcgttt tattcaactt 780

ttgaaggtgg cacaagcaag ttctagccag tacttccggg aatctatact caatgacatc 840

aggaaagctc gtaatttata cactggtaaa gaattggcag ctgagttggc aagaattcgg 900

cagcgagtag ataatatcga agtcttgaca gcagatattg tcataaatct gttactttcc 960

tacagagata tccaggacta tgattctatt gtgaagctgg tagagacttt agaaaaactg 1020

ccaacctttg atttggcctc ccatcaccat gtgaagtttc attatgcatt tgcactgaat 1080

aggagaaatc tccctggtga cagagcaaaa gctcttgata ttatgattcc catggtgcaa 1140

agcgaaggac aagttgcttc agatatgtat tgcctagttg gtcgaatcta caaagatatg 1200

tttttggact ctaatttcac ggacactgaa agcagagacc atggagcttc ttggttcaaa 1260

aaggcatttg aatctgagcc aacactacag tcaggaatta attatgcggt cctcctcctg 1320

gcagctggac accagtttga atcttccttt gagctccgga aagttggggt gaagctaagt 1380

agtcttcttg gtaaaaaggg aaacttggaa aaactccaga gctactggga agttggattt 1440

tttctggggg ccagcgtcct agccaatgac cacatgagag tcattcaagc atctgaaaag 1500

ctttttaaac tgaagacacc agcatggtac ctcaagtcta ttgtagagac aattttaata 1560

tataagcatt ttgtgaaact gaccacagaa cagcctgtgg ccaagcaaga acttgtggac 1620

ttttggatgg atttcctggt cgaggccaca aagacagatg ttactgtggt taggtttcca 1680

gtattaatat tagaaccaac caaaatctat caaccttctt atttgtctat caacaatgaa 1740

gttgaggaaa agacaatctc tatttggcac gtgcttcctg atgacaagaa aggtatacat 1800

gagtggaatt ttagtgcctc ttctgtcagg ggagtgagta tttctaaatt tgaagaaaga 1860

tgctgctttc tttatgtgct tcacaattct gatgatttcc aaatctattt ctgtacagaa 1920

cttcattgta aaaagttttt tgagatggtg aacaccatta ccgaagagaa ggggagaagc 1980

acagaggaag gagactgtga aagtgacttg ctggagtatg actatgaata tgat 2034

<210> 3

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

cgggatccgg atgagcacgg aggcggacga 30

<210> 4

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

tgatgtcatt ctggtgctcc tcgccctcgc 30

<210> 5

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

ggagcaccag aatgacatca ggaaagctcg 30

<210> 6

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

gctctagatc aatcatattc atagtcatac tccagc 36

<210> 7

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

cgggatccgg atgagcacgg aggcggacga 30

<210> 8

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

gctctagatc aatcatattc atagtcatac tccagc 36

<210> 9

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

cgggatccat gagcacggag gcggacga 28

<210> 10

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

tgcggccgct caatcatatt catagtcata ctccagc 37

<210> 11

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

gaagatctat gagcacggag gcggacga 28

<210> 12

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

catgccatgg tcaatcatat tcatagtcat actccagc 38

<210> 13

<211> 58

<212> PRT

<213> 人類

<400> 13

Leu His Asn Gly Arg Ser Lys Glu Gln Arg Leu Lys Glu Gln Leu Gly

1 5 10 15

Ala Gln Gln Glu Pro Val Lys Lys Ser Ile Gln Glu Ser Glu Ala Phe

20 25 30

Leu Pro Gln Ser Ile Pro Glu Glu Arg Tyr Lys Met Lys Ser Lys Pro

35 40 45

Leu Gly Ile Cys Leu Ile Ile Asp Cys Ile

50 55

<210> 14

<211> 58

<212> PRT

<213> 人類

<400> 14

Met Ser Ala Glu Val Ile His Gln Val Glu Glu Ala Leu Asp Thr Asp

1 5 10 15

Glu Lys Glu Met Leu Leu Phe Leu Cys Arg Asp Val Ala Ile Asp Val

20 25 30

Val Pro Pro Asn Val Arg Asp Leu Leu Asp Ile Leu Arg Glu Arg Gly

35 40 45

Lys Leu Ser Val Gly Asp Leu Ala Glu Leu

50 55

<210> 15

<211> 58

<212> PRT

<213> 人類

<400> 15

Met Val Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val Val Pro Ile Leu

1 5 10 15

Val Glu Leu Asp Gly Asp Val Asn Gly His Lys Phe Ser Val Ser Gly

20 25 30

Glu Gly Glu Gly Asp Ala Thr Tyr Gly Lys Leu Thr Leu Lys Phe Ile

35 40 45

Cys Thr Thr Gly Lys Leu Pro Val Pro Trp

50 55

<210> 16

<211> 58

<212> PRT

<213> 人類

<400> 16

Gly Val Gln Cys Phe Ser Arg Tyr Pro Asp His Met Lys Gln His Asp

1 5 10 15

Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro Glu Gly Tyr Val Gln Glu Arg Thr Ile

20 25 30

Phe Phe Lys Asp Asp Gly Asn Tyr Lys Thr Arg Ala Glu Val Lys Phe

35 40 45

Glu Gly Asp Thr Leu Val Asn Arg Ile Glu

50 55

<210> 17

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 17

cgggatccct ccataatggg agaag 25

<210> 18

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 18

gctctagaaa tgcaatcgat tatc 24

<210> 19

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 19

cgggatccat gtctgctgaa gtc 23

<210> 20

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 20

gctctagatc acagttcagc caagtc 26

<210> 21

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 21

cgggatccat ggtgagcaag ggcg 24

<210> 22

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 22

gctctagatc accagggcac gggcag 26

<210> 23

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 23

cgggatccgg cgtgcagtgc ttc 23

<210> 24

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 24

gctctagatc actcgatgcg gttcac 26