本發(fā)明屬于抗菌生物材料領(lǐng)域，具體涉及一種兩親性嵌段抗菌肽的合成及其組裝體的制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

目前，由于抗生素的長(zhǎng)期濫用，導(dǎo)致超級(jí)耐藥細(xì)菌的產(chǎn)生及大范圍傳播，致使抗生素使用效力降低，甚至有些細(xì)菌已經(jīng)很難被抗生素殺死，如攜帶MCR‐1基因的細(xì)菌。因此，尋求新的抗菌劑代替?zhèn)鹘y(tǒng)抗生素已刻不容緩。無(wú)機(jī)抗菌劑如Ag及其金屬氧化物等雖然具有較好的抗菌性，但其生物相容性限制了其廣泛應(yīng)用于人體中；而有機(jī)抗菌劑如季銨鹽類、鹵代胺、雙胍類及殼聚糖類等，也因?yàn)樯锵嗳菪圆罨蚩咕Ч惶硐氲热毕菹拗屏似鋺?yīng)用。抗菌肽是一類具有抑制、殺滅細(xì)菌、真菌甚至病毒等微生物性能的多肽分子，目前，抗菌肽的制備主要有兩種方式：一是通過(guò)生物體內(nèi)誘導(dǎo)分離獲得，如華南農(nóng)業(yè)大學(xué)黃自然教授的研究團(tuán)隊(duì)從柞蠶蛹中經(jīng)人工誘導(dǎo)和提取得到抗菌肽；二是通過(guò)化學(xué)合成法合成，如液相合成法、固相合成法及NCA開(kāi)環(huán)聚合法，周春才等人用過(guò)渡金屬引發(fā)劑引發(fā)NCA開(kāi)環(huán)制備了一系列抗菌肽。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，首要目的是提供一種兩親性嵌段抗菌肽。

本發(fā)明的第二個(gè)目的在于提供一種兩親性嵌段抗菌肽的合成。

本發(fā)明的第三個(gè)目的在于提供一種組裝體的制備方法和應(yīng)用。

為達(dá)到上述目的，本發(fā)明的解決方案是：

一種兩親性嵌段抗菌肽，其結(jié)構(gòu)式如下：

其中，X的取值范圍為1‐100中的整數(shù)，Y的取值范圍為1‐100中的整數(shù)，Z的取值范圍為0‐100中的整數(shù)，n的取值范圍為1‐5中的整數(shù)，R₁和R₃是親水性氨基酸的親水基團(tuán)，R₂是疏水性氨基酸的疏水基團(tuán)；X、Y和Z分別代表各嵌段聚多肽的聚合度，n表示R₁和R₂所代表的兩親性共聚物的重復(fù)數(shù)目，A表示引發(fā)劑。

一種上述的兩親性嵌段抗菌肽的制備方法，其包括如下步驟：

(1)、將含有氨基保護(hù)基團(tuán)的親水性氨基酸和三光氣于有機(jī)溶劑中反應(yīng)，得到親水性氨基酸‐N‐羧基‐α‐氨基酸酐單體，將疏水性氨基酸和三光氣于有機(jī)溶劑中反應(yīng)，得到疏水性氨基酸‐N‐羧基‐α‐氨基酸酐單體；

(2)、將0.200‐1.000mmol引發(fā)劑和0.200‐100.000mmol親水性氨基酸‐N‐羧基‐α‐氨基酸酐單體于有機(jī)溶劑中混合，在真空下反應(yīng)，得到：

其中A表示引發(fā)劑，Z’表示氨基保護(hù)基團(tuán)；

(3)、繼續(xù)加入疏水性氨基酸‐N‐羧基‐α‐氨基酸酐單體并在真空下反應(yīng)，得到：

(4)、重復(fù)執(zhí)行步驟(2)和(3)n‐1次，提純后得到：

(5)、繼續(xù)加入親水性氨基酸‐N‐羧基‐α‐氨基酸酐單體并在真空下反應(yīng)，得到：

(6)將兩親性嵌段抗菌肽：

脫去保護(hù)基團(tuán)Z’，得到：

優(yōu)選地，步驟(6)中的脫保護(hù)反應(yīng)包括如下步驟：

(a)、向兩親性嵌段抗菌肽：

中加入脫保護(hù)劑反應(yīng)，得到混合液；

(b)、將混合液滴加至沉淀劑中，取沉淀作為粗產(chǎn)物；

(c)、將粗產(chǎn)物洗滌，透析，干燥，得到兩親性嵌段抗菌肽：

優(yōu)選地，親水性氨基酸為精氨酸、賴氨酸和組氨酸中的一種。

優(yōu)選地，疏水性氨基酸為異亮氨酸、亮氨酸、纈氨酸、絡(luò)氨酸和苯丙氨酸中的一種。

優(yōu)選地，有機(jī)溶劑為四氫呋喃、N,N‐二甲基甲酰胺、N,N‐二甲基乙酰胺或二甲基亞砜中的一種以上。

優(yōu)選地，引發(fā)劑選自正己胺、二異丙基乙胺、正丁胺、異丁胺和苯胺中的一種。

優(yōu)選地，親水性氨基酸與三光氣的摩爾比為2.3:1。

優(yōu)選地，疏水性氨基酸與三光氣的摩爾比為2.3:1。

優(yōu)選地，引發(fā)劑與親水性氨基酸‐N‐羧基‐α‐氨基酸酐單體的摩爾比為1:1‐100。

優(yōu)選地，親水性氨基酸‐N‐羧基‐α‐氨基酸酐單體與疏水性氨基酸‐N‐羧基‐α‐氨基酸酐單體的摩爾比為1:100‐100:1。

優(yōu)選地，親水性氨基酸‐N‐羧基‐α‐氨基酸酐單體和疏水性氨基酸‐N‐羧基‐α‐氨基酸酐單體的交替重復(fù)添加的次數(shù)為0‐4。

優(yōu)選地，兩親性嵌段抗菌肽的嵌段數(shù)為2‐11。

優(yōu)選地，步驟(1)中，反應(yīng)溫度為40‐60℃，反應(yīng)時(shí)間為3‐12h。

優(yōu)選地，步驟(2)中，真空反應(yīng)時(shí)間為2‐12h，溫度為40‐60℃。

優(yōu)選地，步驟(3)中，真空反應(yīng)時(shí)間為2‐12h，溫度為40‐60℃。

優(yōu)選地，步驟(5)中，真空反應(yīng)時(shí)間為2‐12h，溫度為40‐60℃。

優(yōu)選地，脫保護(hù)劑為三氟乙酸、含33wt％HBr的乙醇溶液和含33wt％HBr的乙酸溶液中的一種。

優(yōu)選地，沉淀劑選自水、正己烷、環(huán)己烷、丙酮、甲醇、乙醇、丙醇或丁醇中的一種以上。

優(yōu)選地，步驟(a)中，反應(yīng)溫度為35‐55℃，反應(yīng)時(shí)間為3‐5h。

一種組裝體，其由上述的兩親性嵌段抗菌肽自組裝形成。

一種上述的組裝體的制備方法，其包括如下步驟：

將兩親性嵌段抗菌肽：

溶于有機(jī)溶劑中，得到懸濁液；在懸濁液里滴加去離子水，透析，得到組裝體。

優(yōu)選地，有機(jī)溶劑為四氫呋喃、二氧六環(huán)和二甲基亞砜中的一種。

優(yōu)選地，滴加去離子水的時(shí)間為5‐30min，透析時(shí)間為12‐24h。

一種上述的組裝體在藥物的封裝及運(yùn)輸、靶向釋放、合成納米粒子和化學(xué)微反應(yīng)器等方面應(yīng)用。

由于采用上述方案，本發(fā)明的有益效果是：

第一、本發(fā)明制備的兩親性二嵌段抗菌肽具有廣譜和優(yōu)異的抗菌性能。

第二、本發(fā)明的原料便宜易得，成本低廉；本發(fā)明的合成路線簡(jiǎn)單，條件可控。

第三、本發(fā)明制備的兩親性二嵌段抗菌肽是一種經(jīng)濟(jì)、低毒和穩(wěn)定的生物材料，具有廣泛的應(yīng)用前景及價(jià)值。

附圖說(shuō)明

圖1為本發(fā)明的組裝體的多分散性指數(shù)圖。

圖2為本發(fā)明的組裝體(K₃₀‐b‐F₁₅)的TEM圖。

圖3為本發(fā)明的組裝體(K₃₀‐b‐F₃₀)的TEM圖。

圖4為本發(fā)明的組裝體(K₃₀‐b‐F₄₅)的TEM圖。

圖5為本發(fā)明的組裝體(K₃₀‐b‐F₄₅)的細(xì)胞毒性圖。

具體實(shí)施方式

本發(fā)明提供了一種兩親性嵌段抗菌肽的合成及其組裝體的制備方法和應(yīng)用。

<兩親性嵌段抗菌肽>

一種兩親性嵌段抗菌肽，其結(jié)構(gòu)式如下：

其中，X的取值范圍為1‐100中的整數(shù)，Y的取值范圍為1‐100中的整數(shù)，Z的取值范圍為0‐100中的整數(shù)，n的取值范圍為1‐5中的整數(shù)，R₁和R₃是親水性氨基酸的親水基團(tuán)，R₂是疏水性氨基酸的疏水基團(tuán)；X、Y和Z分別代表各嵌段聚多肽的聚合度，n表示R₁和R₂所代表的兩親性共聚物的重復(fù)數(shù)目，A表示引發(fā)劑。

R₁和R₃選自親水性氨基酸的親水基團(tuán)中的一種，例如：精氨酸的胍基、賴氨酸的氨基和組氨酸的咪唑基。R₁和R₃可以相同，也可以不同。

R₂選自疏水性氨基酸的疏水基團(tuán)中的一種，例如：異亮氨酸的甲基、亮氨酸的甲基、纈氨酸的甲基、絡(luò)氨酸的酚基和苯丙氨酸的苯基。

當(dāng)n＝1，Z＝0時(shí)，兩親性嵌段抗菌肽為兩親性二嵌段抗菌肽。

當(dāng)n＝1，Z＝1時(shí)，兩親性嵌段抗菌肽為兩親性三嵌段抗菌肽。

當(dāng)n＝2，Z＝0時(shí)，兩親性嵌段抗菌肽為兩親性四嵌段抗菌肽。

當(dāng)n＝2，Z＝1時(shí)，兩親性嵌段抗菌肽為兩親性五嵌段抗菌肽；以此類推。

抗菌肽是一類具有抑制、殺滅細(xì)菌和真菌甚至病毒等微生物性能的多肽分子，其作為生物體內(nèi)非特異免疫系統(tǒng)組成成分之一，具有快速、廣譜抗菌等特性。

其中，抗菌肽由N‐羧基‐α‐氨基酸酐(N‐carboxy‐α‐anhydride，NCA)開(kāi)環(huán)聚合而成?？咕碾y以產(chǎn)生細(xì)菌耐藥性，這是得益于其作用機(jī)理為膜破壞殺菌機(jī)制，即抗菌肽分子鏈上的正電荷與帶有負(fù)電荷的細(xì)菌細(xì)胞膜通過(guò)靜電吸附相結(jié)合，而其疏水鏈段可插入細(xì)菌內(nèi)部，破壞細(xì)菌結(jié)構(gòu)，造成膜內(nèi)的內(nèi)容物外流，從而導(dǎo)致細(xì)菌死亡。

<兩親性嵌段抗菌肽的制備方法>

一種上述的兩親性嵌段抗菌肽的制備方法，其包括如下步驟：

(1)、將含有氨基保護(hù)基團(tuán)的親水性氨基酸和三光氣于有機(jī)溶劑中反應(yīng)，得到親水性氨基酸‐N‐羧基‐α‐氨基酸酐單體，將疏水性氨基酸和三光氣于有機(jī)溶劑中反應(yīng)，得到疏水性氨基酸‐N‐羧基‐α‐氨基酸酐單體；

(2)、將0.200‐1.000mmol引發(fā)劑和0.200‐100.000mmol親水性氨基酸‐N‐羧基‐α‐氨基酸酐單體于20‐50mL有機(jī)溶劑中混合，在真空下反應(yīng)，得到：

其中A表示引發(fā)劑，Z’表示氨基保護(hù)基團(tuán)；

(3)、繼續(xù)加入疏水性氨基酸‐N‐羧基‐α‐氨基酸酐單體并在真空下反應(yīng)，得到：

(4)、重復(fù)執(zhí)行步驟(2)和(3)n‐1次，提純后得到：

(5)、繼續(xù)加入親水性氨基酸‐N‐羧基‐α‐氨基酸酐單體并在真空下反應(yīng)，得到：

(6)將兩親性嵌段抗菌肽：

脫去保護(hù)基團(tuán)Z’，得到：

其中，親水性氨基酸‐N‐羧基‐α‐氨基酸酐單體可以為賴氨酸‐N‐羧基‐α‐氨基酸酐單體(Lysine‐N‐carboxy‐α‐amino‐anhydride；Lys‐NCA)，疏水性氨基酸‐N‐羧基‐α‐氨基酸酐單體可以為苯丙氨酸‐N‐羧基‐α‐氨基酸酐單體(Phenylalanine‐N‐carboxy‐α‐amino‐anhydride；Phe‐NCA)。

若所選用的親水性氨基酸含有一個(gè)以上的氨基基團(tuán)，如賴氨酸和精氨酸等，則選用的親水性氨基酸中的一個(gè)氨基需用芐氧羰基保護(hù)基或叔丁氧羰基保護(hù)基保護(hù)起來(lái)。

(a)、向兩親性嵌段抗菌肽：

中加入50‐100mL脫保護(hù)劑反應(yīng)，得到混合液；

(b)、將混合液滴加至500‐1000mL沉淀劑中，取沉淀作為粗產(chǎn)物；

(c)、將粗產(chǎn)物洗滌，透析，干燥，得到兩親性嵌段抗菌肽：

其中，親水性氨基酸可以為精氨酸、賴氨酸和組氨酸中的一種。

疏水性氨基酸可以為異亮氨酸、亮氨酸、纈氨酸、絡(luò)氨酸和苯丙氨酸中的一種。

有機(jī)溶劑可以為四氫呋喃(THF)、N,N‐二甲基甲酰胺(DMF)、N,N‐二甲基乙酰胺或二甲基亞砜中的一種以上。

引發(fā)劑可以選自正己胺、二異丙基乙胺、正丁胺、異丁胺和苯胺中的一種。

脫保護(hù)劑可以為三氟乙酸、含33wt％HBr的乙醇溶液和含33wt％HBr的乙酸溶液中的一種。

沉淀劑可以選自水、正己烷、環(huán)己烷、丙酮、甲醇、乙醇、丙醇或丁醇中的一種以上。

在步驟(1)中，反應(yīng)溫度可以為40‐60℃，優(yōu)選為40℃，反應(yīng)時(shí)間可以為3‐12h，優(yōu)選為3h。

在步驟(2)中，真空反應(yīng)時(shí)間可以為2‐12h，優(yōu)選為12h，溫度可以為40‐60℃，優(yōu)選為50℃。

在步驟(3)中，真空反應(yīng)時(shí)間可以為2‐12h，優(yōu)選為12h，溫度可以為40‐60℃，優(yōu)選為50℃。

在步驟(5)中，真空反應(yīng)時(shí)間可以為2‐12h，優(yōu)選為12h，溫度可以為40‐60℃，優(yōu)選為50℃。

由于親水性氨基酸‐N‐羧基‐α‐氨基酸酐單體開(kāi)環(huán)聚合的引發(fā)劑是胺類引發(fā)劑，在親水性氨基酸‐N‐羧基‐α‐氨基酸酐單體的聚合反應(yīng)完成后，整個(gè)親水性聚多肽的N‐端又能繼續(xù)引發(fā)疏水性氨基酸‐N‐羧基‐α‐氨基酸酐單體進(jìn)行聚合反應(yīng)，即：整個(gè)聚多肽在加熱、真空的反應(yīng)體系中本身就是一個(gè)大分子引發(fā)劑，繼續(xù)進(jìn)行聚合反應(yīng)。

在步驟(5)中，同理，第(4)步得到的聚多肽在反應(yīng)體系中又可以作為一個(gè)大分子引發(fā)劑，引發(fā)R₃所代表的親水性氨基酸‐N‐羧基‐α‐氨基酸酐單體進(jìn)行開(kāi)環(huán)聚合。

在步驟(a)中，反應(yīng)溫度可以為35‐55℃，優(yōu)選為40℃，反應(yīng)時(shí)間可以為3‐5h，優(yōu)選為4h。

親水性氨基酸與三光氣的摩爾比可以為2.3:1。

疏水性氨基酸與三光氣的摩爾比可以為2.3:1。

引發(fā)劑與親水性氨基酸‐N‐羧基‐α‐氨基酸酐單體的摩爾比可以為1:1‐100，優(yōu)選為1:30。

親水性氨基酸‐N‐羧基‐α‐氨基酸酐單體與疏水性氨基酸‐N‐羧基‐α‐酸酐單體的摩爾比可以為1:100‐100:1，優(yōu)選為2:1。

交替重復(fù)添加的親水性氨基酸‐N‐羧基‐α‐氨基酸酐單體和疏水性氨基酸‐N‐羧基‐α‐氨基酸酐單體的次數(shù)可以為0‐4。

兩親性嵌段抗菌肽的嵌段數(shù)可以為2‐11，優(yōu)選為2。

<組裝體>

一種組裝體，其由上述的兩親性嵌段抗菌肽自組裝形成。

自組裝是指基本結(jié)構(gòu)單元基于非共價(jià)鍵相互作用，如氫鍵、疏水作用、范德華力和π‐π鍵堆積等，自發(fā)形成的穩(wěn)定或亞穩(wěn)定而具有一定規(guī)則幾何結(jié)構(gòu)的過(guò)程。

其中，組裝體可以有棒狀膠束、囊泡和蠕蟲(chóng)狀等形貌，粒徑為300‐800nm，粒子多分散性指數(shù)(Polydispersity index，PDI)可以為0.005‐0.3。

<組裝體的制備方法>

一種上述的組裝體的制備方法，其包括如下步驟：

將兩親性嵌段抗菌肽：

溶于2.0‐5.0mL有機(jī)溶劑中，得到懸濁液；在懸濁液里滴加5.0‐10.0mL去離子水，透析，得到組裝體。

其中，有機(jī)溶劑可以為四氫呋喃、二氧六環(huán)和二甲基亞砜中的一種，優(yōu)選為四氫呋喃。

滴加去離子水的時(shí)間可以為5‐30min，優(yōu)選為10min，透析時(shí)間可以為12‐24h，優(yōu)選為24h。

<組裝體的應(yīng)用>

一種上述的組裝體可以在藥物的封裝及運(yùn)輸、靶向釋放、合成納米粒子和化學(xué)微反應(yīng)器等方面應(yīng)用。

以下結(jié)合附圖所示實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說(shuō)明。

實(shí)施例1：

第一步：兩親性二嵌段抗菌肽的制備方法

本實(shí)施例的兩親性二嵌段抗菌肽的制備方法，其包括如下步驟：

(1)、將30.000g(107.14mmol)芐氧羰基‐賴氨酸和13.790g(46.43mmol)三光氣在40mLDMF中通過(guò)親核反應(yīng)，溫度為40℃，時(shí)間為3h，得到Z’‐Lys‐NCA單體(Z’表示芐氧羰基保護(hù)基)，將30.000g(181.18mmol)苯丙氨酸和23.400g(78.78mmol)三光氣在40mL DMF中通過(guò)親核反應(yīng)，溫度為40℃，時(shí)間為3h，得到Phe‐NCA單體；

(2)、將0.022mL(0.217mmol)異丁胺(作為引發(fā)劑)與2.000g(6.540mmol)Z’‐Lys‐NCA單體(Z’表示芐氧羰基保護(hù)基)溶解于20mL(260mmol)DMF中進(jìn)行開(kāi)環(huán)聚合，真空下反應(yīng)12h，溫度為50℃，得到聚合度為30的親水性氨基酸嵌段；

(3)、繼續(xù)在聚氨基酸溶液中加入0.624g(3.27mmol)Phe‐NCA單體在真空下反應(yīng)12h，溫度為50℃，得到聚合度為15的疏水性氨基酸嵌段；

(4)、按照步驟(2)和(3)的反應(yīng)條件繼續(xù)交替重復(fù)添加Z’‐Lys‐NCA單體(Z’表示芐氧羰基保護(hù)基)和Phe‐NCA單體0次，真空下旋蒸除去過(guò)量的DMF，加入去離子水進(jìn)行沉淀，得到第一粗產(chǎn)物，繼續(xù)用去離子水多次洗滌第一粗產(chǎn)物，進(jìn)一步除掉DMF，最后在真空下旋蒸除掉去離子水，得到兩親性二嵌段抗菌肽(Z’‐Lys)₃₀‐b‐Phe₁₅(Z’表示芐氧羰基保護(hù)基)；

(5)、向兩親性二嵌段抗菌肽(Z’‐Lys)₃₀‐b‐Phe₁₅(Z’表示芐氧羰基保護(hù)基)中加入50mL的含33wt％HBr的乙酸溶液(作為脫保護(hù)劑)，充分?jǐn)嚢璺磻?yīng)4h，溫度為40℃，全部溶解后得到混合液；將混合液滴加至500mL丙酮(作為沉淀劑)中，使粗產(chǎn)物沉淀出來(lái)，得到第二粗產(chǎn)物；將第二粗產(chǎn)物溶于去離子水中，用透析袋(Mn＝3500)透析24h，期間每隔2h換一次水，最后在真空下旋蒸除掉去離子水，得到兩親性二嵌段抗菌肽K₃₀‐b‐F₁₅(其中K為賴氨酸，F(xiàn)為苯丙氨酸)。

其中，Z’‐Lys‐NCA單體(Z’表示芐氧羰基保護(hù)基)的結(jié)構(gòu)式為：

Phe‐NCA單體的結(jié)構(gòu)式為：

親水性氨基酸可以為精氨酸、賴氨酸和組氨酸中的一種。

疏水性氨基酸可以為異亮氨酸、亮氨酸、纈氨酸、絡(luò)氨酸和苯丙氨酸中的一種。

有機(jī)溶劑可以為四氫呋喃(THF)、N,N‐二甲基甲酰胺(DMF)、N,N‐二甲基乙酰胺或二甲基亞砜中的一種以上。

引發(fā)劑可以選自正己胺、二異丙基乙胺、正丁胺、異丁胺和苯胺中的一種。

脫保護(hù)劑可以為三氟乙酸、含33wt％HBr的乙醇溶液和含33wt％HBr的乙酸溶液中的一種。

沉淀劑可以選自水、正己烷、環(huán)己烷、丙酮、甲醇、乙醇、丙醇或丁醇中的一種以上。

在步驟(1)中，反應(yīng)溫度在40‐60℃之內(nèi)，反應(yīng)時(shí)間在3‐12h之內(nèi)是可以的。

在步驟(2)中，真空反應(yīng)時(shí)間在2‐12h之內(nèi)，溫度在40‐60℃之內(nèi)是可以的。

在步驟(3)中，真空反應(yīng)時(shí)間在2‐12h之內(nèi)，溫度在40‐60℃之內(nèi)是可以的。

在步驟(5)中，脫保護(hù)反應(yīng)溫度在35‐55℃之內(nèi)，反應(yīng)時(shí)間在3‐5h之內(nèi)都是可以的。

引發(fā)劑與親水性氨基酸‐N‐羧基‐α‐氨基酸酐單體的摩爾比在1:1‐100之內(nèi)是可以的。

親水性氨基酸‐N‐羧基‐α‐氨基酸酐單體與疏水性氨基酸‐N‐羧基‐α‐氨基酸酐單體的摩爾比在1:100‐100:1之內(nèi)是可以的。

兩親性嵌段抗菌肽的嵌段數(shù)在2‐11之內(nèi)是可以的。

第二步：自組裝形成抗菌肽棒狀膠束組裝體

本實(shí)施例的抗菌肽棒狀膠束組裝體的制備方法，其包括如下步驟：

將5.0mg(7.294×10^‐4mmol)K₃₀‐b‐F₁₅溶于2.0mL(24.7mmol)THF中，充分?jǐn)嚢?h，得到懸濁液；在懸濁液里逐滴緩慢加5.0mL去離子水，時(shí)間為10min，滴加完畢后過(guò)夜攪拌，攪拌完成后，用透析袋(Mn＝3500)透析24h，期間每隔2h換一次水，除去THF，得到K₃₀‐b‐F₁₅抗菌肽棒狀膠束組裝體。

其中，組裝體可以為棒狀膠束、囊泡和蠕蟲(chóng)狀囊泡等形貌。

有機(jī)溶劑為四氫呋喃、二氧六環(huán)和二甲基亞砜中的一種是可以的。

滴加去離子水的時(shí)間在5‐30min之內(nèi)，透析時(shí)間在12‐24h之內(nèi)均是可以的。

實(shí)施例2：

第一步：兩親性二嵌段抗菌肽的制備方法

本實(shí)施例的兩親性二嵌段抗菌肽的制備方法，其包括如下步驟：

(1)、將30.000g(107.14mmol)芐氧羰基‐賴氨酸和13.790g(46.43mmol)三光氣在40mL DMF中通過(guò)親核反應(yīng)，溫度為40℃，時(shí)間為3h，得到Z’‐Lys‐NCA單體(Z’表示芐氧羰基保護(hù)基)，將30.000g(181.18mmol)苯丙氨酸和23.400g(78.78mmol)三光氣在40mL DMF中通過(guò)親核反應(yīng)，溫度為40℃，時(shí)間為3h，得到Phe‐NCA單體；

(2)、將0.022mL(0.217mmol)異丁胺(作為引發(fā)劑)與2.000g(6.540mmol)Z’‐Lys‐NCA單體(Z’表示芐氧羰基保護(hù)基)溶解于20mLDMF中進(jìn)行開(kāi)環(huán)聚合，在真空下反應(yīng)12h，溫度為50℃，得到聚合度為30的親水性氨基酸嵌段；

(3)、繼續(xù)在聚氨基酸溶液中加入1.25g(6.55mmol)Phe‐NCA單體在真空下反應(yīng)12h，溫度為50℃，得到聚合度為30的疏水性氨基酸嵌段；

(4)、按照步驟(2)和(3)的反應(yīng)條件繼續(xù)交替重復(fù)添加Z’‐Lys‐NCA單體(Z’表示芐氧羰基保護(hù)基)和Phe‐NCA單體0次，真空下旋蒸除去過(guò)量的DMF，加入去離子水進(jìn)行沉淀，得到第一粗產(chǎn)物，繼續(xù)用去離子水多次洗滌第一粗產(chǎn)物，進(jìn)一步除掉DMF，最后在真空下旋蒸除掉去離子水，得到兩親性二嵌段抗菌肽(Z’‐Lys)₃₀‐b‐Phe₃₀(Z’表示芐氧羰基保護(hù)基)；

(5)、向兩親性二嵌段抗菌肽(Z’‐Lys)₃₀‐b‐Phe₃₀(Z’表示芐氧羰基保護(hù)基)中加入50mL的含33wt％HBr的乙酸溶液(作為脫保護(hù)劑)，充分?jǐn)嚢璺磻?yīng)4h，溫度為40℃，全部溶解后得到混合液；將混合液滴加至500mL丙酮(作為沉淀劑)中，使粗產(chǎn)物沉淀出來(lái)，得到第二粗產(chǎn)物；將第二粗產(chǎn)物溶于去離子水中，用透析袋(Mn＝3500)透析24h，期間每隔2h換一次水，最后在真空下旋蒸除掉去離子水，得到兩親性二嵌段抗菌肽K₃₀‐b‐F₃₀(其中K為賴氨酸，F(xiàn)為苯丙氨酸)。

第二步：自組裝形成抗菌肽囊泡組裝體

本實(shí)施例的抗菌肽囊泡組裝體的制備方法，其包括如下步驟：

將5.0mg(5.3590×10^‐4mmol)K₃₀‐b‐F₃₀溶于2.0mL THF中，充分?jǐn)嚢?h，得到懸濁液；在懸濁液里逐滴緩慢加5.0mL去離子水，時(shí)間為10min，滴加完畢后過(guò)夜攪拌，攪拌完成后，用透析袋(Mn＝3500)透析24h，期間每隔2h換一次水，除去THF，得到K₃₀‐b‐F₃₀抗菌肽囊泡組裝體。

實(shí)施例3：

第一步：兩親性二嵌段抗菌肽的制備方法

本實(shí)施例的兩親性二嵌段抗菌肽的制備方法，其包括如下步驟：

(1)、將30.000g(107.14mmol)芐氧羰基‐賴氨酸和13.790g(46.43mmol)三光氣在40mL DMF中通過(guò)親核反應(yīng)，溫度為40℃，時(shí)間為3h，得到Z’‐Lys‐NCA單體(Z’表示芐氧羰基保護(hù)基)，將30.000g(181.18mmol)苯丙氨酸和23.400g(78.78mmol)三光氣在40mL DMF中通過(guò)親核反應(yīng)，溫度為40℃，時(shí)間為3h，得到Phe‐NCA單體；

(2)、將0.022mL(0.217mmol)異丁胺(作為引發(fā)劑)與2.000g(6.540mmol)Z’‐Lys‐NCA單體(Z’表示芐氧羰基保護(hù)基)溶解于20mL DMF中進(jìn)行開(kāi)環(huán)聚合，在真空下反應(yīng)12h，溫度為50℃，得到聚合度為30的親水性氨基酸嵌段；

(3)、繼續(xù)在聚氨基酸溶液中加入1.87g(9.80mmol)Phe‐NCA單體在真空下反應(yīng)12h，溫度為50℃，得到聚合度為45的疏水性氨基酸嵌段；

(4)、按照步驟(2)和(3)的反應(yīng)條件繼續(xù)交替重復(fù)添加Z’‐Lys‐NCA單體(Z’表示芐氧羰基保護(hù)基)和Phe‐NCA單體0次，真空下旋蒸除去過(guò)量的DMF，加入去離子水進(jìn)行沉淀，得到第一粗產(chǎn)物，繼續(xù)用去離子水多次洗滌第一粗產(chǎn)物，進(jìn)一步除掉DMF，最后在真空下旋蒸除掉去離子水，得到兩親性二嵌段抗菌肽(Z’‐Lys)₃₀‐b‐Phe₄₅(Z’表示芐氧羰基保護(hù)基)；

(5)、向兩親性二嵌段抗菌肽(Z’‐Lys)₃₀‐b‐Phe₄₅(Z’表示芐氧羰基保護(hù)基)中加入50mL的含33wt％HBr的乙酸溶液(作為脫保護(hù)劑)，充分?jǐn)嚢璺磻?yīng)4h，溫度為40℃，全部溶解后得到混合液；將混合液滴加至500mL丙酮(作為沉淀劑)中，使粗產(chǎn)物沉淀出來(lái)，得到第二粗產(chǎn)物；將第二粗產(chǎn)物溶于去離子水中，用透析袋(Mn＝3500)透析24h，期間每隔2h換一次水，最后在真空下旋蒸除掉去離子水，得到兩親性二嵌段抗菌肽K₃₀‐b‐F₄₅(其中K為賴氨酸，F(xiàn)為苯丙氨酸)。

第二步：自組裝形成抗菌肽蠕蟲(chóng)狀囊泡組裝體

本實(shí)施例的抗菌肽蠕蟲(chóng)狀囊泡組裝體的制備方法，其包括如下步驟：

將5.0mg(4.235×10^‐4mmol)K₃₀‐b‐F₄₅溶于2.0mL THF中，充分?jǐn)嚢?h，得到懸濁液；在懸濁液里逐滴緩慢加5.0mL去離子水，時(shí)間為10min，滴加完畢后過(guò)夜攪拌，攪拌完成后，用透析袋(Mn＝3500)透析24h，期間每隔2h換一次水，除去THF，得到K₃₀‐b‐F₄₅抗菌肽蠕蟲(chóng)狀組裝體。

實(shí)施例4：

本實(shí)施例的兩親性三嵌段抗菌肽的制備方法，其包括如下步驟：

(1)、將30.000g(107.14mmol)芐氧羰基‐賴氨酸和13.790g(46.43mmol)三光氣在40mL DMF中通過(guò)親核反應(yīng)，溫度為40℃，時(shí)間為3h，得到Z’‐Lys‐NCA單體(Z’表示芐氧羰基保護(hù)基)，將30.000g(181.18mmol)苯丙氨酸和23.400g(78.78mmol)三光氣在40mL DMF中通過(guò)親核反應(yīng)，溫度為40℃，時(shí)間為3h，得到Phe‐NCA單體；

(2)、將0.022mL(0.217mmol)異丁胺(作為引發(fā)劑)與2.000g(6.540mmol)Z’‐Lys‐NCA單體(Z’表示芐氧羰基保護(hù)基)溶解于20mL(260mmol)DMF中進(jìn)行開(kāi)環(huán)聚合，真空下反應(yīng)12h，溫度為50℃，得到聚合度為30的親水性氨基酸嵌段；

(3)、繼續(xù)在聚氨基酸溶液中加入0.624g(3.27mmol)Phe‐NCA單體在真空下反應(yīng)12h，溫度為50℃，得到聚合度為15的疏水性氨基酸嵌段；

(4)、按照步驟(2)和(3)的反應(yīng)條件繼續(xù)交替重復(fù)添加Z’‐Lys‐NCA單體(Z’表示芐氧羰基保護(hù)基)和Phe‐NCA單體0次，并于該反應(yīng)體系中繼續(xù)加入2.168g(6.510mmol)Z’‐Arg‐NCA單體(Z’表示芐氧羰基保護(hù)基)，在真空下反應(yīng)12h，溫度為50℃，得到聚合度為30的親水性精氨酸嵌段；

(5)真空下旋蒸除去過(guò)量的DMF，加入去離子水進(jìn)行沉淀，得到第一粗產(chǎn)物，繼續(xù)用去離子水多次洗滌第一粗產(chǎn)物，進(jìn)一步除掉DMF，最后在真空下旋蒸除掉去離子水，得到兩親性三嵌段抗菌肽(Z’‐Lys)₃₀‐b‐Phe₁₅‐b‐(Z’‐Arg)₃₀(Z’表示芐氧羰基保護(hù)基)；

(6)向兩親性三嵌段抗菌肽(Z’‐Lys)₃₀‐b‐Phe₁₅‐b‐(Z’‐Arg)₃₀(Z’表示芐氧羰基保護(hù)基)中加入50mL的含33wt％HBr的乙酸溶液(作為脫保護(hù)劑)，充分?jǐn)嚢璺磻?yīng)4h，溫度為40℃，全部溶解后得到混合液；將混合液滴加至500mL丙酮(作為沉淀劑)中，使粗產(chǎn)物沉淀出來(lái)，得到第二粗產(chǎn)物；將第二粗產(chǎn)物溶于去離子水中，用透析袋(Mn＝3500)透析24h，期間每隔2h換一次水，最后在真空下旋蒸除掉去離子水，得到兩親性三嵌段抗菌肽K₃₀‐b‐F₁₅‐b‐A₃₀(其中K為賴氨酸，F(xiàn)為苯丙氨酸，A為精氨酸)。

<實(shí)驗(yàn)>

以上述實(shí)施例的兩親性二嵌段抗菌肽和組裝體為產(chǎn)品進(jìn)行如下實(shí)驗(yàn)。

<實(shí)驗(yàn)1>

本實(shí)驗(yàn)是為了驗(yàn)證兩親性二嵌段抗菌肽在革蘭氏陽(yáng)性菌(金黃色葡萄球菌)和革蘭氏陰性菌(大腸桿菌)的抗菌性能。

最小抑菌濃度(MIC)是評(píng)估抗菌劑抗菌性能的重要參數(shù)。本實(shí)驗(yàn)分別使用革蘭氏陰性菌(大腸桿菌)和革蘭氏陽(yáng)性菌(金黃色葡萄球菌)來(lái)測(cè)定兩親性二嵌段抗菌肽的抗菌性能。實(shí)驗(yàn)步驟如下：

(1)在培養(yǎng)皿中加入10mL的LB骨肉湯；

(2)在96孔板的第一行第一格內(nèi)加入160μL的LB骨肉湯，后面的每格均加入100μL的LB骨肉湯。接著在第一格中加入40μL濃度為5mg/mL的兩親性二嵌段抗菌肽水溶液，充分混合，取100μL該混合液加入到96孔板第一行第二格中，混合均勻，然后再取100μL該混合液到該行第三格，以此類推；

(3)將10μL已活化好的細(xì)菌加入到步驟(1)中的10mL LB骨肉湯中，然后從中各取100μL加入步驟(2)中的每一個(gè)混合液的格子里。

加入100μL細(xì)菌液后(金黃色葡萄球菌或大腸桿菌)，96孔板的混合液中兩親性二嵌段抗菌肽濃度分別為500μg/mL、250μg/mL、125μg/mL、62.5μg/mL、31.25μg/mL、15.63μg/mL、7.81μg/mL、3.90μg/mL、1.95μg/mL和0.98μg/mL，并于18小時(shí)后進(jìn)行讀數(shù)。兩親性二嵌段抗菌肽與天然抗菌肽的測(cè)試結(jié)果如表1所示。

表1：兩親性二嵌段抗菌肽與天然抗菌肽的MIC值

其中，MIC(Minimum inhibitory concentration)為最低抑菌濃度，即MIC值越小，其抗菌性能越好。

從上表可以看出，本發(fā)明制備的兩親性二嵌段抗菌肽的MIC值(2‐16)比天然抗菌肽的MIC值小，且對(duì)大腸桿菌(革蘭氏陰性菌)以及金黃色葡萄球菌(革蘭氏陽(yáng)性菌)均具有很好的殺菌活性，因此，說(shuō)明本發(fā)明制備的兩親性二嵌段抗菌肽具有廣譜和優(yōu)異的抗菌性能。

<實(shí)驗(yàn)2>

本實(shí)驗(yàn)的目的在于研究組裝體的組裝情況。

組裝體粒徑分布情況用粒子多分散性指數(shù)PDI(Polydispersed index)表示，當(dāng)PDI小于0.3時(shí)，則表示組裝體的粒徑分散均勻。研究人員先將已經(jīng)組裝好的組裝體分別各取1.5mL放入玻璃皿中，然后放入Zetasizer Nano系列納米粒度和Zeta電位儀中進(jìn)行動(dòng)態(tài)光散射測(cè)試。

組裝體K_n‐b‐F_m(n＝30，m＝15、30和45)的粒子多分散性指數(shù)PDI值如圖1所示，其中，(a)n：m＝2:1，(b)n：m＝1:1；(c)n：m＝2:3。

由圖1可知，組裝體的粒徑在450‐700nm之間，且PDI值均小于0.3，說(shuō)明了本發(fā)明制備的組裝體粒子的粒徑均勻，分散良好，可初步判定組裝成功。

組裝體的透射電鏡形貌圖如圖2‐圖4所示：

研究人員將自組裝好的兩親性二嵌段抗菌肽水溶液在室溫下稀釋至200μg/mL，取10μL滴在銅網(wǎng)上，在室溫下干燥后用磷鎢酸(PTA，1.0wt％)溶液進(jìn)行染色。取一滴PTA溶液滴在疏水膜上，將銅網(wǎng)已裝載樣品的一面放置在PTA液滴頂端，浸潤(rùn)1min，用濾紙吸附多余的PTA溶液后，將銅網(wǎng)在室溫下干燥一夜，即可進(jìn)行透射電子顯微鏡測(cè)試。

組裝體K_n‐b‐F_m(n＝10‐50，m＝10‐100)的TEM圖如圖2‐圖4所示，其中，(a)n：m＝2:1；(b)n：m＝1:1；(c)n：m＝2:3。

由圖2‐圖4可知，兩親性二嵌段抗菌肽K₃₀‐b‐F₁₅，K₃₀‐b‐F₃₀和K₃₀‐b‐F₄₅在組裝成納米顆粒之后其形貌分別為棒狀膠束、囊泡和蠕蟲(chóng)狀囊泡。

<實(shí)驗(yàn)3>

本實(shí)驗(yàn)的目的在于研究?jī)捎H性二嵌段抗菌肽K₃₀‐b‐F₄₅的蠕蟲(chóng)狀囊泡組裝體對(duì)L02細(xì)胞的毒性。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)CCK‐8試劑盒來(lái)測(cè)定對(duì)于L02(正常人體肝細(xì)胞)的毒性。研究人員使用96孔鋪板，每孔加入100μL細(xì)胞懸液(4000個(gè))和培養(yǎng)基在37℃、5％的相對(duì)濕度的培養(yǎng)箱中一起培養(yǎng)24h，培養(yǎng)箱中充滿CO₂；然后在各個(gè)孔的細(xì)胞懸液中分別加入31.25μg/mL、62.5μg/mL、125μg/mL、250μg/mL、500μg/mL和1000μg/mL的兩親性二嵌段抗菌肽囊泡溶液再繼續(xù)培養(yǎng)24h。使用未與抗菌肽溶液處理的細(xì)胞作為空白對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組培養(yǎng)完成之后，在每一個(gè)小孔內(nèi)均加入CCK‐8染色劑，在37℃下培養(yǎng)1h。研究人員通過(guò)酶標(biāo)儀，使用雙波長(zhǎng)法測(cè)量實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的樣品在450nm和630nm處的吸光度。實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)量四次，根據(jù)正常肝細(xì)胞存活量與對(duì)照組肝細(xì)胞總量的比值計(jì)算得到細(xì)胞存活率，測(cè)試結(jié)果如圖5所示，其中，橫坐標(biāo)表示蠕蟲(chóng)狀囊泡濃度(Vesicle concentration)，縱坐標(biāo)表示細(xì)胞存活率(Relative cell viability)。

由圖5可知，當(dāng)兩親性二嵌段抗菌肽溶液的濃度為31.25μg/mL時(shí)，細(xì)胞存活率仍有85％以上，即：在最低抑菌濃度為2μg/mL(革蘭氏陽(yáng)性菌)和8μg/mL(革蘭氏陰性菌)時(shí)，人體肝細(xì)胞存活率可達(dá)到85％以上，因此，本發(fā)明制備的兩親性二嵌段抗菌肽K₃₀‐b‐F₄₅的蠕蟲(chóng)狀囊泡對(duì)細(xì)胞的毒性是很低的。

上述對(duì)實(shí)施例的描述是為了便于該技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員能理解和使用本發(fā)明。熟悉本領(lǐng)域技術(shù)人員顯然可以容易的對(duì)這些實(shí)施例做出各種修改，并把在此說(shuō)明的一般原理應(yīng)用到其他實(shí)施例中，而不必經(jīng)過(guò)創(chuàng)造性的勞動(dòng)。因此，本發(fā)明不限于上述實(shí)施例。本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)本發(fā)明的原理，不脫離本發(fā)明的范疇所做出的改進(jìn)和修改都應(yīng)該在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。